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TITRE "Préparation à base d'interféron et son procédé d'e fabrication" (Inventeurs : JARVIS Jr. Allan P. et KOSOWSKY David I.)
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La présente invention concerne L : ne nouvelle composition tion de matière (appelée dans la suite du présent mémoire "interféron epsilon"ou"IFN-e"'utile par exemple dans des cultures de cellules humaines ou autres comme agent antiviral et/ou de lutte contre la prolifération, ainsi que des procédés de fabrication d'une telle composition et des procédés de traitement de cellules épithéliales humaines afin qu'elles résistent aux infections virales.
Les-interférons sont des matières qui possèdent des propriétés antivirales. On les prépare à l'aide de certains types de cellules qui ont été stimulées par exposition à'un virus, à certains acides nucléiques et à des complexes antigènes-mitogènes. Les interférons sont des produits pharmaceutiques extrêmement puissants qui sont très prometteurs comme agents cliniques antiviraux et antitumeurs.-
Il existe actuellement trois types connus d'interférons humains : l'interféron alpha (IFN-a), préparé à partir des leucocytes humains ou de cellules lymphoblastpides, l'interféron béta (IFN-P], préparé à partir de fibroblastes, et l'interféron gamma (IFN-y), préparé à partir de lymphoeytes T humains.
Ces trois interférons sont secrétés par les cellules respectives après stimulation de celles-ci par virus, certains acides nucléiques ou des complexes antigènesmitogènes. Des indications récentes montrent que ces interférons peuvent comprendre un mélange de protéines à structure liée, et non une seule protéine. Les interférons humains peuvent être différenciés les uns des autres par leur niveau différent d'activité sur des cultures de ce] Jules humaines et bovines. Une analyse utilisée pour la mesure de l'activité peut être réalisée comme décrit dans The Interferon System, William E. Stewart, Springer Verlr3p'Co., New York, 1978, qui est une variante de la méthode de Ho et Enders, The Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume 45, pages 385-389, 1959.
IFN-a a un niveau d'activité antivirale sur les cultures de cellules de reins de boeufs qui est de 1 à 5 fois son activité sur des cultures de
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fibroblastes humains. IFN-P a un niveau d'activité antivirale sur des cultures de cellules de reins de boeufs de 1/100 à 2/1 00 fois son activité sur des-cultures de fibroblastes humains. IFN-y a une activité sur des cultures de cellules de boeufs inférieure à 1/100fois son activité sur des cultures de fibroblastes humains.
Dans le procédé le plus productif de fabrication de IFN-a à partir de leucocytes humains, une unité environ d'interféron est produite par 50 cellules. IFN-y est préparé à partir des lymphocytes T humains avec un rendement d'environ 1 unité pour 1000 cellules. IFN-ss préparé à partir de fibroblastes humains a un rendement optimal d'environ 1 unité pour 15 cellules.
Une unité antivirale d'interféron correspond à la concentration qui protège la moitié des cellules d'une' culture de fibroblastes humains soumises à la compétition du virus de stomatite vésiculaire à une concentration normalisée ou standard (un pfu/cellule).
On a détecté une activité antivir ] r ; d. ins de ; milieux provenant d'autres cellules d'origine humaine et animale. Une interférence sur la multiplication du virus de la yrippe a été détectée d'abord par Issacs et Lindenman zwans des cultures de membrane chorioallantoique de poulet. Un autre exemple est la série de cellules de Hela qui est une cellule cancéreuse transformée d'origine épithéliale (cervicale) comme indiqué par G. Gey et al., Cancer Research, Vol. 12, p. 264-165, 1952. L'activité de l'interféron a été détectée dans diverses séries de cellules transformées ou néoplasiques tirées à l'origine du tissu épithélial humain, comme décrit dans Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines, Jameson et al, Archives of Virology 62, 209-219 (1979).
On a observé que des préparations connues U'interfuron humjin possédaient une activité antivirale dons des cultures de cellules humaines.
L'invention concerne la découverte et la produc- tion d'un nouveau type de matière antivirale, appelée "interféron E". Cette nouvelle matière qui, comme les autres
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interférons, paraît être composée d'au moins deux protéines reliées fonctionnellement, peut être produite par exemple par traitement de cellules épithéliales humaines normales par une technique d'induction d'interféron, puis par incubation des cellules dans des conditions qui favorisent la production du nouvel interféron. IFN-E, contrairement aux substances alpha, béta et gamma connues, a un niveau d'activité antivirale dans des cultures de cellules de reins de boeufs, compris entre 1/4 et 1/2 fois environ son activité dans des cultures humaines.
IFN-E ne présente pas dc leacti- vité mutuelle notable avec des antisérums préparés en opposition à IFN-a, IFN-P, ou IFN-y dans des analyses par neutralisation. Il est stable à pH 2. Sa'production par des cellules épithéliales est éliminée par introduction d'inhibiteurs de synthèse d'"ARN"ou d'inhibiteurs de synthèse de protéines dans la culture. L'activité antivirale de préparation contenant IFN-E est détruite par des protéases.
IFN-E peut être préparé par tout type de cellules épithéliales diploides humaines primaires. Des cultures e cellules humaines d'épiderme et de tissus conjonctif, vaginal et d'oesophage ont aussi été utilisées avec succès.
Des exemples non limitatifs d'autres types de tissus épithéliaux qui peuvent être utilisés sont les tissus du nez, du pharynx, des bronches, de la plèvre et de l'intestin.
On a découvert de façon avantageuse que des cellules épithéliales primaires peuvent subir une induction afin qu'elles produisent un interféron-E, à l'aide des techniques déjà utilisées de manière connue pour la production d'autres types d'interférons à partir de leucocytes, de lymphoblastes et de fibroblastes. Dans une technique avantageuse d'induction mettant en oeuvre le Virus de la Maladie de Newcastle (souche Bankowski) ou le Virus Sendai, il faut 100 à 500 cellules épithéliales pour la production d'une unité de IFN-E.
Comme indiqué précédemment, IFN-E est préparé par des cellules épithéliales diploldes primaires d'origine humaine. L'expression l'cellules épithéliales diploldes primaires
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humaines", ou des cultures de telles cellules, désigne dans le présent mémoire des cellules échantillonnées dans un tissu humain sain ou une culture de telles cellules préparées par exemple selon le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 016 036. Ces types de cultures de cellules doivent être distingués des cellules non humaines, des cellules humaines d'origine autre que épithélialc, et des cellules épithéliales transformées ou néoplasiques.
Le nouvel interféron peut aussi être produit dans des cellules eucaryotes transformées naturellement ou artificiellement, contenant la partie de l'acide nucléique épithélial humain responsable de la production de IFN-E et dans des cellules modifiées par les'techrliqu8s d'ADN recombinant.
On a aussi découvert qu'un interféron préparé'. à partir d'un type donné de cellules humaines, par exemple de cellules épithéliales, possédait une plus grande activité antivirale sur ce type particulier de cellules que sur d'autre ? types de cellules humaines. Air15i, l'interféron8cpsiluil a accru les possibilités antivirales et antitumeurs dans le traitement du tissu épithélial soumis a une tumeur ou une infection virale, par rapport à son efficacité relative à d'autres types de cellules humaines.
Ainsi, l'invention concerne un nouveau type de substance antivirale utile par exemple pour la protection des cellules humaines contre l'attaque des virus. Elle concerne aussi un procédé de fabrication d'interféron du type indigène au tissu épithélial humain sain normal.
Elle concerne aussi un procédé de traitement de in croissance de tumeur ou d'infection virale dans un type particulier de tissu par exposition à un interféron tiré du même type de tissu. Elle concerne aussi un type d'interféron qui est plus actif sur des cellules épithéliales humaines que sur d'autres types de cellules humaines, par exemple les fibroblastes humains.
De façon générale, des cellules épithéliales humaines normales peuvent être cultivées in vitro (par exemple,
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selon la méthode décrite'dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No. 4 016 036) sous forme d'une monocouche, dans des microcapsules par mise en oeuvre du procédé décrit dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique No. 243 586 déposée le 14 mars 1981 par Jarvis et al., ou par d'autres procédés, lors de la préparation d'interféron E.
Les cellules sont alors soumises à une-technique d'induction de IFN par exposition à certains virus ou acides nucléiques.
Par exemple, le milieu de culture peut être remplacé par un milieu contenant un inducteur connu d'IFN du type viral ou acide nucléique. Après une courte incubation, par exemple de l'ordre de une heure, l'agent inducteur est retiré, et les cellules sont placées dans un milieu normal neuf de culture ou d'entretien et incubent par exemple pendant 24 heures. L'exposition des cellules à l'agent inducteur déclenche l'expression du code d'ADN des cellules pour la production d'interféron epsilon. Pendant l'incubation ultérieure, la cellule synthétise et secrète IFN-E.
A ce moment, la culture est récoltée et, si elle. est analysée par exemple par la méthode de Ho et Enders (Proceedings of the National Academy of Science, Volume 45, pages 385-389, 1959), on constate qu'elle possède une activité antivirale de IFN-E.
Le produit qui est obtenu par ce procédé ne présente pas une réactivité mutuelle importante avec un anticorps de IFN-a, IFN-P ou IFN-y dans des expériences de neutralisation. Il est stable à pH 2 et est de nature protéinique. Des expériences d'immunoabsorption indiquent que des antisérums anti-IFN-p réagissent avec une partie de l'interféron produit par des cellules épithéliales ayant subi l'induction. Le nouvel interféron présente aussi un profil d'activité, dans les cellules des mammifères, qui est différent de celui du type connu d'interféron.
Ces caractéristiques chimiques montrent bien que IFN-E est une substance originale.
IFN-E est fabriqué de façon satisfaisante actuellement par des cellules épithéliales normales tirées
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de l'épiderme, du tissu conjonctif, du tissu vaginal et de l'oesophage humain, par"induction normale" (Field et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 58, p. 1004-1009,1967) et"superinduction" (Havell et Vilcek, Antimicrobial Agents in Chemotherapy, Vol. 2, p. 476-484, 1972) avec l'acide nucléique, poly I'C (Miles Laboratories), avec le Virus de la Maladie de Newcastle (Baron et Issacs, British Medical J., Vol. 56, p. 18-20 1962) et avec le virus Sendai (paragrippe-1, Gresser, Proceedings of the
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Society of Expérimental and Biological p. 303-307, 1961).
Les résultats des analyses montrent que toutes les techniques d'induction et tous les types dift'crontLts cultures de cellules upruuvùus .
Les niveaux de production varient avec la nuture du l'n nnt inducteur utilisé et avec les diverses modifications des'. techniques d'induction. Le virus de la maladie de Newcastle donne de bons résultats. D'autres virus qui peuvent être utilisés sont indiqués dans le tableau qui suit.
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TABLEAU I
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<tb>
<tb> Virus <SEP> Références
<tb> Grippe <SEP> A <SEP> Gresser <SEP> et <SEP> Dull <SEP> (1964) <SEP> ;
<tb> Andrews <SEP> (1961)
<tb> Paragrippe-3 <SEP> Chany <SEP> (1960)
<tb> Rougeole <SEP> Petralli, <SEP> Merigan, <SEP> et <SEP> Wilbur
<tb> (1965a) <SEP> ; <SEP> DeMaeyer <SEP> et <SEP> Enders <SEP> (1961)
<tb> Parotidite <SEP> épidermique. <SEP> Cantell <SEP> (1961) <SEP> ;
<SEP> Waddell, <SEP> Wilbur,
<tb> et <SEP> Merigan <SEP> (1968)
<tb> Rubéole'Neva <SEP> et <SEP> Weller <SEP> (1964]
<tb> Syncytium <SEP> respiratoire <SEP> Ray, <SEP> Gravelle, <SEP> et <SEP> Chin <SEP> (1967) <SEP> ;
<tb> Moehring <SEP> et <SEP> Forsyth <SEP> (1971)
<tb> Virus <SEP> de <SEP> la <SEP> rage <SEP> WiKtor <SEP> et <SEP> al. <SEP> (1972)
<tb> Stomatite <SEP> vésiculaire <SEP> Marcus <SEP> et <SEP> Sekellick <SEP> (1977) <SEP> ;
<tb> Wilcek, <SEP> Yamazaki <SEP> et <SEP> Havell <SEP> (1977)
<tb> Chikungunya <SEP> Zimmermann <SEP> et <SEP> al. <SEP> (1972)
<tb> Sindbis <SEP> Gresser <SEP> et <SEP> Enders <SEP> (1962)
<tb> Encéphalite <SEP> équine <SEP> Luby, <SEP> S@nders, <SEP> et <SEP> Sulkin <SEP> (1971)
<tb> occidentale
<tb> Fièvre'jaune <SEP> Wheelock <SEP> et <SEP> Sibley <SEP> (1965) <SEP> ;
<SEP>
<tb> Wheelock <SEP> et <SEP> Edelman <SEP> (1969) <SEP>
<tb> Poliovirus-Type <SEP> 1 <SEP> Gresser, <SEP> Chany, <SEP> et <SEP> Enders <SEP> (1965)
<tb> Poliovirus-Type <SEP> 2 <SEP> Smorodintsev <SEP> et <SEP> al. <SEP> (1970) <SEP> ;
<tb> Ho <SEP> et <SEP> Enders <SEP> (1959a, <SEP> b)
<tb> Encephalomyocardite <SEP> Stewart <SEP> II, <SEP> Gosser, <SEP> et <SEP> Lockart
<tb> (1971a)
<tb> Rhinovirus-2 <SEP> Smorodintsev <SEP> et <SEP> al. <SEP> (1971a) <SEP> ;
<tb> Fiala <SEP> (1972)
<tb> Rhinovirus-12 <SEP> Gatmaitan, <SEP> Stanley, <SEP> et <SEP> Jackson
<tb> (1973)
<tb> Reovirus-2 <SEP> Oie, <SEP> Loh, <SEP> et <SEP> Rotnayake <SEP> (1973)
<tb> Langue <SEP> bleue <SEP> du <SEP> mouton <SEP> Jameson <SEP> et <SEP> Grossberg <SEP> (1977)
<tb> Adenovirus <SEP> Lysov <SEP> et <SEP> al. <SEP> (1971)
<tb> Varicelle <SEP> Vaczi, <SEP> Horvath, <SEP> et <SEP> Hadhazy <SEP> (1965)
<tb> Cytomégalovirus <SEP> humain <SEP> Vaczi, <SEP> Horvath, <SEP> et <SEP> Hadhazy <SEP> (1965) <SEP> ;
<tb> Glasgow <SEP> (1974)
<tb> Herpes <SEP> simplex <SEP> Rasmussen <SEP> et <SEP> ale
<tb> Vaccine <SEP> Wheelock <SEP> (1964) <SEP> ;
<SEP> Epstein,
<tb> Stevens, <SEP> et <SEP> Merigan <SEP> (1972)
<tb>
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On a aussi constaté que des interférons fabriqués à partir d'un type choisi de cellules humaines telles que épithéliales, fibroblastes, vasculaires, hépatiques, rénales, etc., sont particulièrement efficaces comme agents antiviraux ou antitumeurs pour le traitement des tissus humains formés du type choisi de cellules.
Ainsi, IFN-E est surtout efficace lorsqu'il est utilisé pour le traitement des cellules épithéliales, et on-constate qu'il a une plus
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faible activité lorsqu'il est utilisé pour le traitement d'autres de cellules humainus. nL pour origine des fibroblastes humains) est plus efficace pour le traitement des tissus ou fibroblastes humains et a donc des propriétés antitumeurs et antivirales plus faibles vis-à-vis des cellules d'autres types de tissus humains.
Ainsi, on peut utiliser le procédé suivant pour la protection d'un tissu ou d'un type donné de cellules contre l'infection virale, afin que la multiplication d'un virus qui a infecté un tissu ou un type donné de cellules soit arrêtée, ou que la croissance d'une tumeur dans un tissu donné soit arrêtée.
Une culture de cellules du type considéré est d'abord formée par croissance par la mise en oeuvre des techniques classiques telles que (dans le cas des cellules épithéliales) la technique de Green décrite dans le brevet précité des Etats-Unis d'Amérique n 4 016 036. Les cellules de la culture sont alors traitées afin qu'elles induisent l'expression de la partie de son code ADN responsable de la production de l'interféron. L'operation peut être réalisée par exemple par les techniques d'induction de IFN décrites dans la suite du présent mémoire.
Le produit est alors récolté, par exemple dans le milieu après incubation. Le produit peut être utilisé comme substance antivirale ou antitumeur efficace pour le traitement des cellules ou du type des tissus en question.
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Des cultures de cellules in vitro sont protégées contre 3 l'attaque virale par addition de 2 à 5 unités de IFN-E/cm3.
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Cette concentration est efficace pour la protection de cellules épithéliales ayant une densité de 0, 5. 105 à 2, 5. 10 cellules/cm.
Des quantités notables de cette substance antivirale nouvelle peuvent aussi être fabriquées par deux techniques cellulaires supplémentaires actuellement connues.
La première met en oeuvre des types de-cellules eucaryotes transformées spontanément, vir-alement ou chimiquement, analogues à celles utilisées antérieurement pour la production de IFN-a à partir de séries de cellules lymphoblastoides humaines. La seconde technique met en oeuvre des techniques connues d'ADN recombinant, analogues à celles qui sont couramment utilisées actuellement pour la production de IFN-a et IFN-ss.
Selon le premier procédé, des cellules transformées capables de produire IFN-E peuvent être obtenues par utilisation de l'une des deux techniques : in vivo ou in vitro. La première technique (in vivo) implique l'isolement direct à partir de tissu frais de. type de cellules transformées, la seconde technique (in vitro) implique une opération de sélection dans laquelle une souche de cellules diploides humaines normales est cultivée à long terme jusqu'à ce qu'un nombre faible mais détectable de la population subisse une transformation spontanée ou la souche initiale est traitée pendant une courte période avec un virus ou un mutagène connu tel que EMS, MMS, ou MNNG afin que la fréquence de transformation soit accrue.
Certaines des cellules transformées par l'un ? de r ? s deux techniques in vitro contient une partie du code ADN des cellules épithéliales responsables de la production IFN-E.
Des cultures transformées ainsi obtenues peuvent subir une induction afin qu'elles produisent IFN-E par utilisation des techniques classiques d'induction telles que décrites précédemment pour les cellules épithéliales diploldes humaines normales.
Dans la seconde technique, le mARN synthétisé dans les cellules épithéliales à la suite de l'induction de IFN
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est extrait des cellules, est purifié éventuellement par ultracentrifugation ou analogue afin que la fraction mARN obtenue ait une spécificité accrue, et l'extrait est utilisé comme calibre pour la synthèse d ADN complémentaire (cADN). Le cADN peut être préparé à l'aide de l'enzyme transcriptase inverse Avian Myoblastosis.
Le produit finalrésultant de l'opération, ADN complémentaire standard double (dscADN) qui contient le codage de séquence pour la synthèse de IFN-E, et un vecteur eucaryote ou bactérien sont alors traités avec une enzyme restrictive qui provoque un clivage d'ADN et donne des sites de liaison par lesquels le dscADN et le vecteur peuvent être fixés. Le vecteur et ADN sont alors mélangés, recuits et liés par des liaisons covalentes à l'aide d'un enzyme ligase. A ce moment, la préparation de vecteur recombinant est utilisée pour la transformation d'une cellule bactérienne ou eucaryote.
Les cellules transformées contiennent ainsi ADN complémentaire de la totalité ou d'une partie de ARN contenu à l'origine dans les cellules épithéliales pendant leur étape de production dn TFN-E.'
Ces vecteurs recombinant sont alors incubés avec un type approprié de cellules qui permet l'opération du vecteur. Il apparaît alors une population de cellules qui contient des cellules individuelles capables de synth8tiser et de secréter IFN-E. La population de cellules est alors analysée systématiquement afin qu'elle donne une sous-population de cellules produisant IFN-E, et cette sous-population est cultivée afin qu'elle donne une série de cellules capables de produire des quantités relativement grandes de IFN-E.
D'autres caractéristiques de cette technique mettant en oeuvre ADN recombinant figurent par exemole clans les documents suivants :
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1. Brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 237 224 Cohen et al"Process for producing biologically functional molecular chimeras" ;
2. Scheller, R. et al, 1977, Clones of individual repetitive sequences from sea urchins DNA constructed with synthetic eco R1 sites, Science, Vol. 196, p. 197-200 ;
3. Blattner, F. et al, (1977), Charon Phages : Safer derivatives of bacteriophage lambda for DNA cloning, Science, Vol. 196, p. 161-169 ;
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4. Broach, J. R., et J. D., 0, )) tion and recombination functions associated with yeast plasmid, 2 micron circle, Cell, Vol. 21, p. 501-508 ; et
5.
Hamer, D. 1981, Synthesis processing and secretion of eukaryotic protcinsin thé SV40 - Monkey cell system, Recombinant DNA Abstracts, Vol. 1, p. 4.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre d'exempLes non limitatifs donnés à titre purement illustratif.
'Exemple 1
On cultive une culture de cellules épithéliales d'épiderme humain provenant du laboratoire de Howard Green, Massachusetts Institute of Technology jusqu'à une densité
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5 2 de cellules de 1 à par dans un milieu essentiel minimal (MEM,"Gibco") contenant 10% de sérum foetus de veau inactivé thermiquement (incubé à 56 C pendant 30 minutes : HIFCS). On expose quatre cultures équivalentes incubées dans MEM et 2% de HIFCS pendant 1 heure à 37 C à poly (I. C) - (9S) qui est un acide nucléique de masse moléculaire élevée disponible dans le commerce auprès de PL Laboratories (Milwaukee, Wisconsin), en quantité égale à 0,1, 10 et 100'microgrammes/cm3 (technique d'induction précédente de Field et al.).
On lave alors deux fois les cultures avec MEM et on les fait incuber dans le même milieu avec addition de 2% de HIFCS pendant 24 heures.
Le milieu est collecté et analysé par la méthode de Stewart II, The Interferon System, p. 17-18. On n'observe aucune activité
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antivirale détectable dans les cultures avec 0 et 3 3 1 g/cm3 de poly (I. On détecte environ 10 de IFN-E dans les échantillons obtenus à partir de cultures ayant subi une induction avec 10 et 100 lig de poly (I-C).
Exemple 2
On répète le procédé de l'exemple 1, mais on utilise une technique modifiée de"superinduction" (Havell and Vilcek, supra) afin d'essayer d'augmenter la production de IFN-#. On incorpore 50 g/cm de cyclohexamide (inhibiteur de synthèse de protéine) avec l'acide poly (I-C). Après incubation d'une heure, on lave les cellules et on les fait incuber pendant 3 heures supplémentaires dans MEM contenant 3 2% de HIFCS et 50 g/cm de cyclohexamide. On lave alors à nouveau les cellules et on les fait incuber avec MEM
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3 3 contenant. 50 g/cm3 de cyclohexamide et 5, 0 g/cm3 d'actino'- mycine D (inhibiteur de synthèse d'ARN) pendant 2 heures supplémentaires.
A la fin de cette incubation, on lave
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deux ciihç-i- à 370C dans un milieu normal. La culture du milieu et l'analyse comme indiqué dans l'exemple 1 ne permettent la production d'aucune quantité détectable de IFN-E dans les cultures
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g induites avec 0 et 1 de poly (I-C). La culture 3 3 induite avec 10 g/cm3 de poly (I-C) donne 100 3 de IFN-E. Les cultures induites par 100 g/cm3 de poly (I-C) g assurent la production de plus de 330 de lig/cmExemple 3
On utilise une culture de cellules épithéliales d'origine épidermique contenant 1 à 2 . 105 cellules (exemple 1) pour la préparation de IFN-E à l'aide de la méthode d'induction par le virus de la maladie de Newcastle (NDV) (Baron and Issacs, supra).
Le virus utilisé était la souche Odnkowski de NDV disponible auprès de Poultry Heoith Laboratn'ies, Davis, Californie. On prépare quatre échantillons de 1 cm de MEM contenant 2% de HIFCS et assez de Nil\/pOull uue la concentration finale soit respectivement de 0, 100-200, 25-50 et 1-16 virus pfu/cellule dans les échantillons.
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3 On ajoute alors 0, 2 cm des préparations respectives de virus 3 de 1 (agent inducteur virus) dans les cultures des cellules qui sont alors secouées-pendant 30 minutes à intervalles de 5 minutes à 37 C. La partie restante de 0, 8 des pré- parations de NDV est alors ajoutée et les cultures subissent une incubation pendant 30 minutes supplémentaires. Les cultures de cellules sont alors lavées-deux fois avec un
EMI14.2
3 milieu normal, 1 de milieu est ajouté à chaque culture, et les cultures subissent une incubation do 24 heures.
Le milieu est alors récolté, acidifié à pH 2 avec HCl 0,1 N et conservé à 4 C pendant 5 à 6 jours afin que NDV devienne inactif. Ensuite, le milieu récolté est neutralisé avec NaOH 0,1 N et la présence de IFN- est analysée.
Dans l'échantillon ne contenant pas de virus NDV (témoin), toute activité antivirale est absente. L'échantillon ayantsubi une induction avec 100 à 200 particules de virus par
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3 cellule NDV contient environ 500 à 1000 unités de .
La culture induite avec la préparation de NDV contenant 25 à 50'particules de virus par cellule çontient environ" 3 170 à 330 unités de IFN-E/cm. La culture induite avec la préparation de NDV contenant 1 à 16 particules de virus
EMI14.4
3 par cellule contient environ 50 à 170 unités de .
Comme l'indique cette expérience, une culture de cellules contenant 1 à '10 cellules/cm3 peut donner
3 environ 500 à 1000 unités de IFN-E/cm3. Le rendement est ainsi de l'ordre de 1 unité de IFN-E produite pour 100 à 500 cellules de la culture.
Exemple 4
On répète le procédé de l'exemple 3, mais on utilise le virus de paragrippe-1 (Sandai). à diverses con- centrations, comme agent inducteur à la pt. tce du virus NDV (voir Gresser, supra). Le virus Sendai tel qu'il est acheté (Flow Laboratories) contient 10 000 à 40 000 unités hc-
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l.
magglutinantes
Dans une culture dans laquelle la préparation commerciale de virus est diluée 1 à 3 fois, on prépare
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3 1000 unités/cm de Une dilution de 1 à 10 donne
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TABLEAU II Résultats d'expériences d'interféron
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<tb>
<tb> Type <SEP> des <SEP> cellules <SEP> Méthode <SEP> d'induction <SEP> Unités <SEP> IFN-e/cm <SEP> Unités <SEP> IFN-#/cellule
<tb> Conjonctif <SEP> humain <SEP> poly <SEP> I-C* <SEP> 33 <SEP> 3,3 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb> " <SEP> " <SEP> poly <SEP> I.C+ <SEP> 330 <SEP> 3,3 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> " <SEP> " <SEP> néant <SEP> (témoin) <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Epiderme <SEP> humain <SEP> poly <SEP> I.C* <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> " <SEP> " <SEP> Sendai++ <SEP> 330 <SEP> 3,3 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> ""NDV <SEP> ** <SEP> 1000 <SEP> 1,
<SEP> 0 <SEP> x <SEP> 10' <SEP>
<tb> " <SEP> " <SEP> néant <SEP> (témoin) <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
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3 * Induction de l'exemple 1 avec 100 pg/cm poly 1.
3 + Procédé d'induction de l'exemple 2 avec 100 flg/cm3 de poly I.
** Procédé d'induction de l'exemple 3 avec dilution 1/3 de NDV (1C-21 particules de virjs/cellule] ++ Procédé d'induction ae l'exemple 4 avec dilution 1/4 de la s
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3 200 unités/cm3et une dilution de 1 à 33 Aucune activité antivirale ne peut être détectée dans la culture témoin dont le virus a été omis.
Le tableau II ci-avant résume les résultats des expériences des exemples 1 à 4 effectués avec des cultures de cellules de tissu conjonctif humain et de cultures de cellules d'épiderme humain. avec diverses techniques d'induction.
Exemple 5
Comme on a montré de façon classique que les interférons étaient par définition des protéines, on a éprouvé des échantillons de IFN-E afin. de déterminer si l'activité antivirale présente dans les échantillons était due à un composant à base de protéine. Les expériences sont réalisées par incubation d'échantillons de IFN-a (standard NIH), de IFN-P (standard NIH), et de IFN-E (tiré de kératinocytes épithéliaux induits par NDV) en présence d'enzymes protéolytiques connus, puis par nnrilyr. f de la matière traitée afin que l'activité antivirale restante sait déterminée.
On fait incuber à 37 C pendant 1 h des échantillons de IFN-a (16 unités/cm3), de IFN- (16
EMI16.2
3 3 et de IFN-E (32 dans MEM, en présence soit de trypsine (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) ou de Pronase (Sigma) à des concentrations de
EMI16.3
3 3, 3-100 ug/cm. la fin de la réaction, l'activité
Aprèsprotéolytique restante dans les échantillons est neutralisée par addition de HIFCS jusqu'à concentration finale de 33% (volume/volume). Les échantillons sont alors analysés afin que l'activité antivirale restante induite par IFN soit déterminée par microtitrage sur des cellules GM-2767.
Les résultats sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 17>
SENSIBILITE PROTEOLYTIQUE DE IFN-E
EMI17.1
<tb>
<tb> Enzyme <SEP> Concentration
<tb> protéolytique <SEP> d'enzyme <SEP> Activité <SEP> antivirale <SEP> IFN <SEP> restante
<tb> ( g/cm ) <SEP> IFN-α
<SEP> IFN-ss <SEP> IFN-# <SEP>
<tb> Trypsine <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 33 <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 1-2 <SEP> 4
<tb> 3,3 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 16
<tb> 0 <SEP> 16 <SEP> 1 <SEP> Li <SEP> 3-- <SEP>
<tb> Pronase. <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 3,3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 32
<tb>
Ces résultats montrent que l'activité antivirale observée dans les échantillons de IFN-E est due u la présence d'un ou plusieurs composants sous forme de protéines, étant donnée l'élimination totale de l'activité par le traitement par les enzymes protéolytiques. Le caractère. protéinique de IFN-# apparaît aussi dans le fait que les inhibiteurs de synthèse de protéines et d'ARN bloquent la production de IFN-E.
Exemple 6
Cet exemple montre la stabilité de IFN-E pour les pH acides. On prépare IFN-E par induction de cellules d'épiderme humain à l'aide de NDV selon l'exemple 3.
Lorsque le milieu est récolté, il est divisé en trois parties. Le virus est inactivé dans la première partie
EMI17.2
comme décrit dans l'exemple 3, par acidification à pH 2 avec HC1. La seconde partie est filtrée pendant 5 jours sur un filtre "Millipore 01310 (limite de masse moléculaire 100 000, Millipore Corp., Bedford, MA) afin que le virus soit extrait. La troisième partie est filtrée par un filtre "Millipore" PTMK01310, ayant une'limite de masse moléculaire de 100 000, imprégné préalablement pendant 4 heures dans une solution à 1% de BSA.
<Desc/Clms Page number 18>
Dans tous les cas, le milieu résultant est analysé afin que la présence de IFN et de virus résiduel soit déterminée. Les résultats sont les suivants :
Stabilité de IFN-# à pH acide
EMI18.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Titre <SEP> initial <SEP> Titre-Final <SEP> iitre <SEP> d'IFN <SEP>
<tb> de <SEP> IFN-de <SEP> virus <SEP> de <SEP> virus
<tb> (pfu/cm3) <SEP> (pfu/m3) <SEP> (u/cm) <SEP>
<tb> pH <SEP> 2,5 <SEP> jours <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> . <SEP> 108 <SEP> 0 <SEP> 128
<tb> Filtré <SEP> par
<tb> PTHK01310 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> ? <SEP> S <SEP>
<tb> Filtré <SEP> par
<tb> PSVP01310 <SEP> 1, <SEP> 1. <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 128
<tb>
Aucun des échantillons n'a montre une activité virale qu. elconque et tous les échantillons avaient la même quantité d'activité de IFN-E.
Ce résultat montre que l'activité de IFN-E est stable à un pH acide.
Exemple 7
On compare les propriétés immunologiques de IFN-# (préparé par induction par NDV de cellules d'épiderme humain comme décrit dans l'exemple 3), de IFN-a, de IFN- (NIH) et de IFN-y (obtenus auprès de S. Baron, University of Texas Medical School, Galveston, Texas). On effectue des titrages par neutralisation de chaque interféron à l'aide d'anti- IFN-a (NIH), d'anti-IFN-ss (NIH et Y. H. Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada), d'anti-IFN-y (S. Baron), et de mélanges de ces antisérums. Des dilutinns en snrie d'un facteur 2 des antisérums appropriés sont effectués dans MEM avec une plaque de microtitrage à 98 cuves.
EMI18.2
3 On ajoute dans les cuves des dilutions allant de 32 à 3 2 de chaque préparation de IFN et on fait incuber les plaques d'abord à 37 C pendant 1 heure, puis à 4 C pendant 1 heure afin que le complexe anticorps-IFN puisse
EMI18.3
se former. On ensemence alors avec des fibiohiastuu (dépôt de cellules mutantes humaines à raison A de 2. cellules par cuve, et, après 20 à 24 heures
<Desc/Clms Page number 19>
humdinsd'incubation à 37 C, elles sont soumises à une dose étalon Je virus de stomatite vésiculaire (1 pfu/cellule).
Après 24 à 48 heures à 37 C, on observe toutes les cuves au nicroscope afin que l'inhibition transmise par l'interferon Je l'effet cytopathique induit par le virus soit déterminée (CPE). Les résultats sont les suivants :
Quantité d'antisérum nécessaire à la neutralisation de IFN 3 (unité de neutralisation par cm )
EMI19.1
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Conc. <SEP> Anti-αa <SEP> Anti-ssa <SEP> Anti-αa
<tb> unités/cm <SEP> Anti-ssa
<tb> IFN-a <SEP> 16 <SEP> N. <SEP> D. <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
(NIH <SEP> Std) <SEP> 8 <SEP> N. <SEP> D. <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> N. <SEP> D.
<tb>
4 <SEP> 62 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 125
<tb> IFN-ss <SEP> 8 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 375 <SEP> 750
<tb> (NIH <SEP> std) <SEP> 4 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 188 <SEP> 750
<tb> 2 <SEP> > <SEP> 3000 <SEP> 188 <SEP> 47
<tb> IFN-# <SEP> 8 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 188
<tb> AR-IVb <SEP> 4 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 375 <SEP> 188
<tb> 2 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 375 <SEP> 47
<tb> IFN-E <SEP> 16 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 375
<tb> AOB <SEP> 8 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 375
<tb> c <SEP> 2 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> 94
<tb>
Le sérum témoin de mouton vis-à-vis de IFN de fibroblastes n'a pas d'activité neutralisante. N.
D. = non déterminé
EMI19.2
a avec des moutons respectifs b-dérives dekératinocytes d'épiderme, non obligatoirement dépourvus de fibroblastes (induits par NDV) c - dérivés de kératinocytes épidermjcjues dépourvus de fibroblastes (induits par NDV).
On peut voir d'après les tableaux qui précèdent que :
<Desc/Clms Page number 20>
a) IFN-a est neutralisé à la fois par les antisérums anti-a et anti-a/anti-P en mélange. Comme prévu, il faut deux fois plus de mélange anti-α/ss que d'anti-α pour la neutralisation de la même quantité de IFN-a.
(Des quantités analogues d'antisérums neutralisent des quantités analogues de IFN-a). b) IFN-ss est neutralisé à. la fois par les antisérums anti- et anti-a/anti-. en mélange. Il faut encore 2 fois plus d'antisérum anti-a/ss que d'antisérum antipour la neutralisation de la même quantit de JTN-p. c) Il faut moins de la moitié du mélange d'antisérum. anti-a/anti-ss par rapport à l'antisérum anti-ss pour la neutralisation de la même quantité de IFN-E.
IFN-E ne réagit pas avec les antisérums dirigés contre IFN-y.
Cet exemple montre que IFN-e est distinct immunologiquement de IFN-a et IFN-P, et IFN-y et est donc chimiquement distinct de ces interférons humains connus.
Exemple 8
En plus des indications sérologiques présentées dans l'exemple 7, on utilise IFN-E qui a subi une immunoprécipitation partielle, dans une expérience de neutrali- sation. On ajoute, à des échantillons de cet interféron. du anti-S IFN (polyclonal obtenu à partir de NIH ou monoclonal obtenu à partir de Y. H. Tan). Le mélange incube pendant 1 h à 350C puis 1 heure à 4 C afin que le complexe IFN-anticorps puisse se former, et le complexe, avec l'excès éventuel d'anticorps, est retiré par incubation des antisérums complexés et non complexés en présence de "S'3pharfJse" A de protéines (Sigma) avec un rapport de 30 lil à 1,5 pi du mélange réactionnel.
IFN non complexé et restant est soumis à un second stade d'immunoprécipitation et les échantillons sont analysés afin que l'activité de IFN soit déterminée comme décrit, à l'aide de l'analyse d'inhibition CPE. Les résultats sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 21>
EMI21.1
<tb>
<tb> 0Echantillon <SEP> Titre <SEP> 1ère <SEP> précip. <SEP> Titre <SEP> 2ème <SEP> précip. <SEP> Titre
<tb> IFN <SEP> original <SEP> IFN <SEP> d'anticorps <SEP> d'IFN <SEP> d'anticorps <SEP> d'IFN
<tb> unités/cm3 <SEP> avec <SEP> :-après <SEP> avec <SEP> :
<SEP> après
<tb> 1e <SEP> 20 <SEP>
<tb> AOB-IFN-E <SEP> 1024 <SEP> Anti-ss <SEP> 256 <SEP> Anti-ss <SEP> 256
<tb> polyclonal <SEP> polyclonal
<tb> AOB-1FN-E <SEP> 1024 <SEP> Anti-ss <SEP> 1024 <SEP> Anti-ss <SEP> 1024
<tb> monoclonal <SEP> monoclonal <SEP>
<tb> AOB-IFN-E <SEP> 1024 <SEP> Anti-ss <SEP> 1024 <SEP> Anti-ss <SEP> 1024
<tb> monoclonal <SEP> polyclonal
<tb> AOB-IFN-# <SEP> 1024 <SEP> Anti- <SEP> 256 <SEP> Anti-ss <SEP> 256
<tb> polyclonal <SEP> monoclonal
<tb>
Lorsque AOB-IFN-# ayant précipité préalablement est utilisé dans l'essai de neutralisation, réalisé exactement comme indiqué dans l'exemple 7, on obtient les résultats suivants :
Quantité d'antisérum nécessaire à la neutralisation de IFN (unités de neutralisation)
EMI21.2
...
EMI21.3
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Concentration <SEP> IFN <SEP> Anti-ss <SEP> Mélange <SEP> d'anti-a/ss
<tb> u <SEP> Icm3 <SEP>
<tb> AOB <SEP> IFN-E <SEP> 16 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 500
<tb> absorbé <SEP> avec <SEP> 8 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 375
<tb> antisérum <SEP> 4 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 94
<tb> anti-ss
<tb> AOB <SEP> IFN-C <SEP> 16 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 500
<tb> 1 <SEP> absorbé <SEP> avec <SEP> 8 <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 188 <SEP>
<tb> anti <SEP> sérum <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> 94
<tb> témoin
<tb> AOB <SEP> IFN-e <SEP> > <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP>
<tb> non <SEP> absorbé <SEP> 4 <SEP> 375 <SEP> 94
<tb> 1 <SEP> 12 <SEP> 24
<tb> NIH <SEP> IFN-P <SEP> 16 <SEP> 750 <SEP> 750
<tb>
8 <SEP> 188 <SEP> 375
<tb> 4 <SEP> 94 <SEP> 188 <SEP>
<tb>
Le sérum témoin de mouton de IFN de fibroblastes n'a pas d'activité neutralisante.
<Desc/Clms Page number 22>
Les résultats des tableaux qui précèdent montrent qu'une partie de la préparation de IFN-# ne peut pas être neutralisée par l'antisérum anti-ss même lorsque deux anticorps différents anti- sont utilisés. Cependant, même après précipitation poussée par les antisérums anti-ss, une partie supplémentaire de IFN- peut être précipitée
EMI22.1
avec un mélange d'antisérums anti-a/P Ces résultats montrent aussi que IFN-E est distinct immunologiquement et chimiquement des autres interférons humains connus.
Exemple 9
IFN-E produit par induction de cellules d'épiderme humain avec NDV comme indiqué dans l'exemple 3, peut être purifié et concentré par chromatographie par affinité sur un certain nombre de ligands immobilisés. Ceux-ci comprennent notamment, à titre non limitatif, l'agarose rouge réactif, la phényl-"Sepharose" (Sigma Chemical Co., St. Louis, no.), l'agarose rouge Procion, le phényl agarose
EMI22.2
(BRL, Gaithersburg, Md.), le Glycogel B, le .. propionyl) aminodécane (CPAO) agarose et le N-pyromellityl- N- (3-carboxy-aminodécane (PMAD) agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, . Ill.).
EMI22.3
3 On applique 8 de contenant 3 900 unités de IFN-E dans une colonne de 0, 5 d'agarose 3 rouge réactif. On lave la colonne avec 10 d'un tampon phosphaté 20mM (pH 7, 4). IFN est alors élué avec trois 3 quantités égales à 2 d'éthylène glycol à 50% dans un tampon phosphaté 20mM contenant du chlorure de sodium 1M.
Chaque fraction est collectée dans un volume égal de tampon phosphaté 20mM afin que l'éthylène glycol soit dilué.
La colonne est lavée finalement avec 5 cm supplémentaires de tampon phosphaté 20mM. Les concentrations des protéines sont mesurées pur absorption à 280 nm (OD-2UU).
Les résultats figurent dans le tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
.
1-' (U U 0) bu 1-.
QJ bU : 1-.
QJ In 0 1-. bu (U 0) D QJ o "ri fa 0) - ( < j r Z LL QJ Q) C o - lu 0) U - ri 4- - 1-.
I] CL
EMI23.2
<tb>
<tb> 4-c
<tb> l
<tb> - <SEP>
<tb> 4-41 <SEP> Co <SEP> C <SEP> :)n
<tb> - <SEP> : <SEP> CD
<tb> -'
<tb> E
<tb> ri <SEP> 0 <SEP>
<tb> rq <SEP> -i
<tb> r) <SEP>
<tb> F-1 <SEP> 4J <SEP> 1-0
<tb> C)
<tb> O <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
Les deux premières fractions d'éthylène glycol sont combinées et la fraction résultante contient tout IFN-E appliqué sur la colonne, présentant une purification de facteur 6 par rapport à la matière originale.
EMI24.1
Dans d'autres expériences analogues, on applique 3 jusqu'à 68 de IFN-E sur la colonne et on récupère IFN 3 dans un volume final de 8 Ceci représente une concen- tration de 8,5 fois de la matière.
Lorsque IFN-E est appliqué à au moins deux ligands immobilisés successivement, on peut obtenir une purification plus grande. Par exemple, on applique un échantillon de IFN- à une colonne de CPAD et on fait subir une élution comme décrit dans le procédé précédent. Les fractions combinées contenant IFN indiquent une purification d'environ 9 fois et subissent une dialyse avec un tampon phosphaté 20mM afin'. que l'éthylène glycol soit extrait. L'échantillon est alors appliqué sur une colonne de PMAD agarose, développée de la même manière. IFN-E est récupéré avec un rendement de 70 2 100% et une purification supplémentaire de 5 fois pal rapport- à la protéine totale.
Cet exemple montre que IFN-E peut être purifié par des ligands immobilisés divers à considérer seuls ou en combinaison.
Exemple 10
On fait subir d'abord une centrifugation à IFN-e non fractionné à 300g pendant 20 minutes. La matière qui surnage est mélangée par retournement sur un appareil Fischer Rotarack avec un verre de porosité contrôlée (C. P. G.)
EMI24.2
(Electronucleonics, Inc.) à 4 C. On utilise 0, 28g de verre 3 de porosité contrôlée pour 30 de culture qui surnage. cmAprès 3 heures, la matière qui surnage est extraite et les perles de verre de porosité réglée sont entassées dans une colonne (2,5 x 3,1 cm).
La colonne est d'abord lavée avec 4 volumes de colonne de PBS, puis 4 volumes de colonne de NaCl 1, U M-tampon phosphaté 20mM à pH 7,4. IFN-# est alors élue avec 4 volumes de colonne de 50% d'éthylène glycol en volume/volume-NaCl 1,0 M-tampon phosphaté 20mM à pH 7,4,
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
lSl u < C riD m Q) fa f-.
+- > ID TJ TI Q) Q) Q) Oü M 'Q) 'CD .
UJ o o el CL TI QJ CD [-.
[-.
> QJ CD QJ CD 'o - 'n tW 1 Z LL H CD TI C o - +- > m u - 4- - ri [-.
: CL
EMI25.2
<tb>
<tb> < : <SEP> : <SEP> t1
<tb> pi <SEP>
<tb> 0lu)
<tb> U
<tb> CD
<tb> CD
<tb> pu
<tb>
<tb> rD <SEP>
<tb> mi <SEP> H <SEP> CO <SEP> CD <SEP> I <SEP> ura <SEP> 0 <SEP> or
<tb> 1 <SEP>
<tb> CN <SEP> O <SEP> rs <SEP> CO <SEP> ar <SEP> I <SEP> CN <SEP> eDCD <SEP> 1
<tb> 1
<tb> E
<tb> U
<tb> 9 <SEP>
<tb> o <SEP> ^0
<tb> i <SEP>
<tb> ¯ <SEP>
<tb> d, <SEP>
<tb> o <SEP> 4J <SEP> tXt <SEP> z <SEP> Q <SEP> O <SEP> I <SEP> h <SEP> UM.
<tb>
D <SEP>
<tb> o <SEP>
<tb> E <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
puis est collecté dans un volume égal de NaCl 1, phosphaté 20mM afin que la concentration finale d'éthylène glycol soit de 25%. La fraction contenant IFN-E est concen- 3 trée par ultrafiltration à 1, 0-1, 6 et est appliquée
1à une colonne de polyacrylamide-agarose ("Ultragel" AcA54) (1,6 x 85 cm) équilibrée par 25% d'éthylène glycol (en volume/volume)-NaCl 1,0 M-tampon phosphaté 20mM à pH 7,4.
EMI26.2
IFN-E est alors élué avec une solution tampon d'équilibrage 3 3 à un débit de 6, 0 cm/h. On collecte des fractions de et on analyse la présence de IFN et la teneur en protéine (analyse Loury).
Les résultats sont donnés dans le tableau ci-avant. t
Exemple 11
On soumet les préparations de IFN-E, IFN-a et IFN-ss, contenant de la matière brute partiellement purifiée selon l'exemple 10 (p-IFN-E) et p-IFN-E absorbé-interféron anti-souris, à une analyse des masses moléculaires par électrophorèse sur gel SOS. selon le procédé de Lamelli.
Les échantillons subissent une incubation à température ambiante pendant 1 heure en présence de 1, 0% de SOS, de tampon de tris-HCl 0,05 M (pH 6, 8), de glycérol à 10% (en volume/volume) et de bleu de bromophénol à 0,001%, chargé sur des gels de polyacrylamide à 12,5%, et les essais durent environ 16 heures. Après électrophorèse, les zones allongées contenant les références de masse moléculaire sont ensemencées. Les régions contenant IFN sont découpées en tranches de 3 mm et extraites pal secouage
3 avec 0,5 cm de PBS contenant 0,5% de SOS pendant 20 heures à température ambiante. L'analyse de ces fractions est réalisée sur des cellules GM-2767 et la masse moléculaire de chaque pic d'activité est calculée par comparaison avec la position sur le gel par rapport aux références de masse moléculaire.
Les résultats'sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 27>
0Masse moléculaire de IFN
EMI27.1
<tb>
<tb> M. <SEP> M. <SEP> des <SEP> maxima <SEP> d'activité <SEP> (". <SEP> d'activité <SEP>
<tb> INF <SEP> récupérée)
<tb> a <SEP> 18 <SEP> K <SEP> (27,6) <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> K <SEP> (44,8) <SEP> 22,5 <SEP> K <SEP> (27,6)
<tb> ss <SEP> - <SEP> (1, <SEP> 83).
<SEP> - <SEP> - <SEP> 22, <SEP> 0 <SEP> K <SEP> (98,2)
<tb> # <SEP> (brut) <SEP> 17,5 <SEP> K <SEP> (41, <SEP> 0) <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> K <SEP> (7,4) <SEP> 22,0 <SEP> K <SEP> (51,6)
<tb> p-IFN-E <SEP> 17, <SEP> 5 <SEP> K <SEP> (35,4) <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> K <SEP> (2, <SEP> 53) <SEP> 22,0 <SEP> K <SEP> (62,0)
<tb> p-IFN-E <SEP> non <SEP> lié <SEP> 17,5 <SEP> K <SEP> (9,2) <SEP> 20,0 <SEP> K <SEP> 0 <SEP> 22,0 <SEP> K <SEP> (90,8)
<tb> p-IFN-E <SEP> lié <SEP> 17, <SEP> 5 <SEP> K <SEP> (68,0) <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> K <SEP> (15, <SEP> 3) <SEP> 22,0 <SEP> K <SEP> (16,8)
<tb>
Les trois fractions obtenues avec les échantillons de IFN-# présentent une activité antivirale sur les cellules GM-2767.
La fraction de poids moléculaire 22, 0. 103 obtenue à partir de IFN-E ne présente pas d'activité sur des cellules de reins de boeufs (MDBK). Les deux autres fractions de IFN- (17, 5K, ! O, OK) ont une activité d'environ 25%, sur les cellules MDBK comme sur les cellules GM-2767.
Exemple 12
Le pouvoir antiviral de IFN-# (produit par induction par NDV à partir de cellules d'épiderme humain comme dans l'exemple 3), IFN-a (obtenu auprès de National Institute of Health, NIH), et IFN-P (NIH) est comparé dans des cultures de cellules d'épiderme humain normal, par rapport à des fibroblastes diploides humains normaux.
Des dilutions en série des trois préparations de TFN sont ajoutées dans les cuves d'une plaque de microtitrage avec des cultures de référence de cellules d'épiderme humain normal et de fibroblastes humains normaux. Après 18 à 24 heures d'incubation à 37 C, les cellules de chaque cuve sont soumises à l'action d'une dose standard de virus de stomatite vésiculaire (1 pfu/cellule). Après 36 à 96 h (lorsque des témoins indiquent une mort des cullulc de 100%), chaque cellule est observée au microscope sin que la résistance au virus soit déterminée.
Les résultats sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 28>
TABLEAU III
EMI28.1
<tb>
<tb> - <SEP> 3 <SEP>
<tb> Unités <SEP> d'activité/cm <SEP> de <SEP> IFN <SEP> sur <SEP> : <SEP>
<tb> Interféron <SEP> Fibroblastes <SEP> (FS-4) <SEP> Epithélium
<tb> IFN-e <SEP> 32-64 <SEP> 512-7048 <SEP>
<tb> IFN-a <SEP> 128-512'64 <SEP>
<tb> IFN-P <SEP> 32-256 <SEP> 8-32
<tb>
a-fibroblastes diploldes humains normaux obtenus auprès de J. Vilcek (N. Y. U., N. Y., N. Y.).
Comme l'indique le tableau qui précède, IFN-E produit par le code d ADN des cellules épithéliales a un pouvoir bien supérieur (d'un facteur de l'ordre de 16) comme agent antiviral par rapport aux cellules épithéliales que par rapport aux fibroblastes. IFN-a préparé à partir aucode ADN tire des leucocytes humains et des cellules lymphoblastoides, a un pouvoir supérieur (d'un facteur pouvant atteindre 8) par rapport aux fibroblastes que par rapport aux cellules épithéliales, et IFN-P, produit à partir du code ADN des fibroblastes a un plus grand pouvoir (pouvant atteindre 30x) vis-à-vis des fibroblastes que vis-à-vis des cellules épithéliales.
Exemple 13
On utilise le procédé de l'Exemple 11 pour l'analyse de l'activité antivirale relative des interférons et E sur les cellules de reins de boeufs (cellules MDBK ATCC CCL22), par rapport aux fibroblastes trisomiques humains (3 copies du chromosome 21-dépôt de cellules mutantes humaines GM-2767 47, XX, t21).
Les résultats de l'analyse sont les suivants :
EMI28.2
<tb>
<tb> 3
<tb> Unités <SEP> d'activité/cm <SEP> de <SEP> IFN <SEP> sur
<tb> Type <SEP> IFN <SEP> MDBK <SEP> GM-2767
<tb> a <SEP> 512 <SEP> 512 <SEP>
<tb> ss <SEP> 0 <SEP> 12ss <SEP>
<tb> y <SEP> 0-128 <SEP>
<tb> E <SEP> 8-16 <SEP> 32 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 29>
EMI29.1
Les résultats obtenus pour IFN a, sset y sont conformes aux résultats déjà indiqués. Les résultats de IFN-E que ce nouvel interféron a une'activité de 2 à 4 fois environ plus importante sur les cellules GM-2767 que sur les cellules de reins de boeufs.
Exemple 14
Le nouvel interféron présente aussi une activité contre la prolifération, comme peut l'indiquer l'inhibition de la multiplication des cellules lymphoblastoïdes humaines (cellules de Daudi). 10 000 cellules lymphoblastoldps humaines environ sont revêtues de 200 microlitres de milieu
EMI29.2
dans chaque cuve d'une plaque de microtitrage. On ajoute alors diverses dilutions de IFN a, ss et E d chaque cuve et le nombre de cellules viables est complu api'L 1, 2 et d jours. Les résultats figurent dans le tableau qui suit :
ANALYSE DES CELLULES DE DAUDI - 4 Nombre de cellules viables/cuve (x1D).
EMI29.3
<tb>
<tb>
Type <SEP> et <SEP> concentration <SEP> d'IFN <SEP> Jour <SEP> 1 <SEP> Jour <SEP> 2 <SEP> Jour <SEP> 4
<tb> 100u <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 4,8 <SEP> 6,8
<tb> 10 <SEP> u <SEP> 4,8 <SEP> 5,2 <SEP> 6,0
<tb> ss <SEP> - <SEP> 100 <SEP> u <SEP> 7,2 <SEP> 9,6 <SEP> 6,4
<tb> 10 <SEP> u <SEP> 5,2 <SEP> 9,6 <SEP> 18,4
<tb> # <SEP> - <SEP> 100 <SEP> u <SEP> 6,0 <SEP> 5,2 <SEP> 4,8
<tb> 10 <SEP> u <SEP> 5,6 <SEP> 5,2 <SEP> 6,0
<tb> Témoin <SEP> (sans <SEP> IFN) <SEP> 8,0 <SEP> 21, <SEP> 5 <SEP> 67
<tb>
Ces résultats montrent que 10 unités de INF-e peuvent supprimer la croissance des cellules de Daudi pour plus de 90%.
<Desc/Clms Page number 30>
Exemple 15
On met en équilibre des échantillons de IFN-a, P et # avec une solution saline tamponnée au phophate (PBS), du dodécyl sulfate de sodium (SOS), et un mélange de SDS, de
EMI30.1
p et d'urée à 100 C. Le détergent SOS dénature de manière connue les protéines par altération de leur conformation, et BME réduit les liaisons bisulfure. On constate que INF-a. ss et -diffèrent de façon très nette par leur sensibilité à ces réactifs.
Plus précisément, INF-o. est stable dans SOS seul, mais est rendu notablement inactif en présence d'un mélange de SOS, d'urée et de BME ; IFN-P est pratiquement inactivé dans SOS seul mais est stable dans un mélange de SOS, d'urée et de BME, et INF-E est relativement stable dans SOS seul et dans le mélange de SOS et. de BME-urée. Dans PBS, à 100 C, il reste moins de 5% de l'activité des trois interférons.
Dans des expériences analogues, on détermine que INF-a. qui a été précédemment inactivé par le mélange SOS-BME, peut être réactivé parmi son équilibre à 100 C avec un. mélange de SDS-PBS, que INF-ss qui a été antérieurement inactivé dans SOS seul peut être réactivé dans un mélange de SDS-BME-urée-PBS, et que IFN-S qui a été inactivé antérieurement dans PBS peut être réactivé par mise en
EMI30.2
équilibre à 100 C en présence de PBS-SOS, avec ou sans BME-urée. Ces observations montrent encore l'originalité de la préparation de IFN-E selon l'invention.
Exemple 16
Cette expérience concerne la comparaison des propriétés de liaison et d'élution de IFS-C et IFN-P sur une colonne de "Sepharose" bleue (Pharmcia). Les colonnes sont préparées selon les instrucli-oiis fa- bricants et chargées à température ambiante d'échantillons IFN-ss ou IFN-E dans PBS. Les élutions sont réalisées avec NaCl 1, OM dans PBS et de l'éthlyène glycol à 50% (en volume/volume) dans un tampon de phosphate sodique 20mM.
Chaque préparation d'interféron est traitée sur deux colonnes
EMI30.3
contenant des lots différents de"Sepharose"bleue, et on obtient les résultats suivants
<Desc/Clms Page number 31>
EMI31.1
Liaison des interférons à la"Sepharose"bleue
EMI31.2
<tb>
<tb> :% <SEP> d'activité <SEP> récupéré <SEP> avec
<tb> Fraction
<tb> IFN-P <SEP> IFN-E <SEP>
<tb> Traversant <SEP> colonne
<tb> + <SEP> 20mM <SEP> de <SEP> tampon <SEP> phosphaté <SEP> 44, <SEP> 0-44, <SEP> 2 <SEP> 2,5-10, <SEP> 2
<tb> Elution <SEP> avec <SEP> NaCl <SEP> 1, <SEP> OM <SEP> 2, <SEP> 7- <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 19, <SEP> 3-30
<tb> Elution <SEP> avec <SEP> éthylène <SEP> glycol
<tb> 50%/NaCl <SEP> 1, <SEP> OM <SEP> dans <SEP> 20mM <SEP> de
<tb> tampon <SEP> phosphaté <SEP> 51,9-52, <SEP> 3 <SEP> 60,0-78,
<SEP> 2
<tb>
Cet exemple montre que les interférons E et ss ont des affinités différentes à la"Sepharose"bleue et des comportements différents lors de l'élution. La"Sepharose" bleue fixe environ 90 à 97% de l'activité de INF-E mais seulement 60% environ de INF-e sont liés dans les mêmes conditions. En outre, alors que 20 à 30% de INF- sont récupérés avec NaCl 1,0 M 3 à 4% seulement de l'activité de IFN-E sont récupérés dans des conditions analogues.
Enfin, une quantité pouvant atteindre 80% environ de l'activité de INF-ss est éluée avec une combinaison d'éthylène glycol à 50% et NaCl 1,0% alors que 50% environ seulement de l'activité de INF-E sont récupérés dans des conditions analogues.