CH664575A5 - Verfahren zur herstellung eines interferonpraeparates mit antiviraler aktivitaet. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Interferonpräparates mit antiviraler Aktivität (das im folgenden als Interferon Epsilon oder IFN-e bezeichnet wird), das z.B. in menschlichen und anderen Zellkulturen als antivirales Mittel brauchbar ist.

Interferone sind Substanzen mit antiviralen Eigenschaften. Sie werden von Zellen bestimmter Typen erzeugt, die durch Einwirkung eines Virus, bestimmter Nucleinsäuren und/oder Antigen/Mitogen-Komplexe stimuliert worden sind. Interferone sind ausserordentlich wirksame Arzneimittel, die als klinische antivirale und Antitumormittel sehr vielversprechend sind.

Zurzeit sind drei Typen von menschlichem Interferon bekannt: Interferon Alpha (IFN-a), das von menschlichen Leukozyten oder lymphoblastoiden Zellen erzeugt wird, Interferon Beta (IFN-ß), das von Fibroblasten erzeugt wird, und Interferon Gamma (IFN-y), das von menschlichen T-Lymphozyten erzeugt wird. Alle drei Interferone werden von den betreffenden Zellen ausgeschieden, nachdem die Zellen durch einen Virus, bestimmte Nucleinsäuren oder Antigen/ Mitogen-Komplexe stimuliert worden sind. Neuere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Interferone aus einem

Gemisch von strukturell verwandten Proteinen und nicht aus einem einzigen Protein bestehen.

Antivirale Aktivität wurde in Medien aus anderen Zellen von menschlichem und tierischem Ursprung nachgewiesen. Die Interferenz bei der Vervielfachung von Grippevirus wurde von Issacs und Lindemann (1957) zuerst in Kulturen der chorioallantoischen Membran von Hühnern nachgewiesen. Ein anderes Beispiel ist die Hela-Zellinie, die eine transformierte Krebszelle von epithelialem (cervicalem) Ursprung ist, wie G. Gey et al. in Cancer Research, Band 12, Seiten 264 bis 265 (1952) berichten. Interferonaktivität wurde in verschiedenen transformierten oder neoplastischen Zellinien nachgewiesen, die ursprünglich aus menschlichem Epithelgewebe stammten («Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines», Jameson et al., Archives of Virology 62,209-219 [1979]). Es wurde beobachtet, dass menschliche Interferonpräparate nach dem Stand der Technik in menschlichen Zellkulturen antivirale Aktivität haben.

Eine antivirale Substanz eines neuen Typs, die als Interferon Epsilon bezeichnet wird, wurde nun aufgefunden und erzeugt. Diese neue Substanz, die, wie die anderen Interferone, aus mindestens zwei hinsichtlich ihrer Wirkungsweise verwandten Proteinen zusammengesetzt zu sein scheint, wird erfindungsgemäss hergestellt, indem man

A. eine Kultur von lebenden Zellen, die einen Teil des DNS-Codes von menschlichen Epithelzellen enthalten, erzeugt,

B. die Zellen in einem Medium unter Bedingungen, die die Synthese von Interferon begünstigen, bebrütet und

C. eine an dem Interferon reiche Fraktion aus den Zellen erntet.

IFN-e zeigt keine signifikante Kreuzreaktivität in Neutralisationstests mit Antiseren, die gegen IFN-a, IFN-ß oder IFN-y hergestellt wurden. Es ist bei pH = 2 beständig. Seine Erzeugung durch Epithelzellen wird durch Einführung von RNS-Syntheseinhibitoren oder Proteinsyntheseinhibitoren in die Kultur beseitigt. Die antivirale Aktivität von Präparaten, die IFN-s enthalten, wird durch Proteasen zerstört.

IFN-e kann aus primären menschlichen diploiden Epithelzellen erzeugt werden. Vorteilhafterweise wurde festgestellt, dass primäre Epithelzellen unter Anwendung der gleichen Techniken, die nach dem Stande der Technik für die Erzeugung von Interferonen anderer Typen aus Leukozyten, Lymphoblasten und Fibroblasten angewandt werden, dazu gebracht werden können, Interferon Epsilon zu erzeugen. Bei einer bevorzugten Induktionsmethode unter Verwendung von Newcastle-Disease-Virus (Bankowski-Stamm) oder Sendai-Virus sind 100 bis 500 Epithelzellen erforderlich, um eine Einheit IFN-e zu erzeugen.

Wie oben erwähnt, wird IFN-e z.B. von primären, diploiden Epithelzellen menschlichen Ursprungs erzeugt. Der hier verwendete Ausdruck «primäre, diploide menschliche Epithel-Zellen oder -Zellkulturen bezieht sich auf Zellen, die aus gesundem menschlichem Gewebe oder einer Kultur derartiger Zellen, die beispielsweise gemäss der in der US-PS Nr. 4 016 036 von Green et al. beschriebenen Verfahrensweise erzeugt worden sind, entnommen wurden.

Das neue Interferon kann auch in natürlich oder künstlich transformierten eukaryotischen Zellen, die den Teil der menschlichen Epithelnucleinsäure enthalten, der für die Erzeugung von IFN-e verantwortlich ist, und in Zellen, die durch DNS-Rekombinationsmethoden modifiziert worden sind, erzeugt werden.

Demgemäss ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, eine antivirale Substanz eines neuen Typs zur Verfügung zu stellen, die z.B. zum Schutz von menschlichen Zellen gegen Virusbefall brauchbar ist. Dies wurde durch die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung eines Interferons des Typs,

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der normalem, gesundem, menschlichem Epithelgewebe angeboren ist, erreicht. Der erhaltene Interferontyp ist in bezug auf menschliche Epithelzellen wirksamer als in bezug auf andere menschliche Zelltypen, z.B. menschliche Fibrobla-stenzellen.

Zur Erzeugung.von IFN-e können normale menschliche Epithelzellen in vitro (z.B. gemäss dem Verfahren von Green et al.) innerhalb von Mikrokapseln gemäss dem Verfahren, das von Jarvis et al. in der US-Patentanmeldung Nr. 243 586, die am 14. März 1981 angemeldet wurde, beschrieben wurde, oder nach anderen Verfahren in einer Monoschicht gezüchtet werden. Die Zellen können dann durch Einwirkung bestimmter Viren oder Nucleinsäuren einer Interferoninduktionstechnik unterworfen werden. Zum Beispiel kann das Wachstumsmedium durch ein Medium ersetzt werden, das einen bekannten Interferoninduktor zum Typ der Viren oder Nucleinsäuren enthält. Nach einer kurzen Bebrütung, im typischen Falle in der Grössenordnung von einer Stunde, kann der Induktor entfernt werden, und die Zellen können in ein normales, frisches Wachstums- oder Erhaltungsmedium gebracht und bebrütet werden, z.B. 24 Stunden lang. Die Einwirkung des Induktors auf die Zellen löst die Transkription des DNS-Codes der Zellen für die Erzeugung von Interferon Epsilon aus. Während der anschliessenden Inkubation synthetisiert die Zellen IFN-e und scheidet es aus.

Das Produkt, das man bei dieser Verfahrensweise enthält, zeigt in Neutralisationsexperimenten keine signifikante Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen IFN-a, IFN-ß oder IFN-y. Es ist bei pH = 2 beständig und hat einen Proteincharakter.

IFN-e wurde erfolgreich aus normalen Epithelzellen erzeugt, die aus der menschlichen Epidermis, Conjunctiva und Vagina und dem menschlichen Ösophagus stammen, wobei die «normale Induktion» (Field et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Band 58, Seiten 1004 bis 1009 [1967]) und die «Superinduktion» (Havell und Vilcek, Antimicrobial Agents in Chemotherapy, Band 2, Seiten 476 bis 484 [1972]) mit der Nucleinsäure Poly I ■ C (Miles Laboratories), mit Newcastle-Disease-Virus (Baron und Issacs, British Medicai J., Band 56, Seiten 18 bis 20 [1962]) und mit Sen-dai-Virus (Parainfluenza-1, Gresser, Proceedings of the Society of Expérimental and Biological Medicine, Band 108, Seiten 303 bis 307 [1961]) angewandt wurde. Die Produktionsmengen hängen von dem Typ des verwendeten Induktors und von den verschiedenen Abwandlungen der Induktionsmethoden ab. Das Newcastle-Disease-Virus wirkt gut. Andere Viren, die verwendet werden können, sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Tabelle I

Virus

Literaturstelle

Virus

Literaturstelle

Influenza-A

Parainfluenza-3 Masern

Mumps Röteln

Atmungszellverband

Tollwutvirus Vesikuläre Stomatitis

Chikungunyafieber

Sindbisfieber 5 Westliche Pferdeenzephalitis Gelbfieber

Poliovirus-Type 1 io Poliovirus-Type 2

Encephalomyocarditis

Rhinovirus-2

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Rhinovirus-2

Reovirus-2 «Blue tongue» 20 Adenoviren Varicella-Zoster Menschliches Cytomegalovirus Herpes simplex 25 Vaccinia

Gresser und Enders (1962)

Luby, Sanders und Sulkin (1971) Wheelock und Sibley (1965); Wheelock und Edelman (1969) Gresser, Chany und Enders (1965) Smorodintsev et al. (1970); Ho und Enders (1959a,b)

Stewart II, Gosser und Lockarf (1971a)

Smorodintsev et al. (1971a); Fiala

(1972)

Gatmaitan, Stanley und Jackson

(1973)

Oie, Loh und Ratnayake (1973) Jameson und Grossberg (1977)

Lysov et al. (1971)

Vaczi, Horvath und Hadhazy (1965) Vaczi, Horvath und Hadhazy (1965); Glasgow (1974)

Rasmussen et al. (1974)

Wheelock (1964); Epstein, Stevens und Merigan (1972)

Gresser und Dull (1964); Andrews (1961)

Chany (1960)

Petraiii, Merigan und Wilbur (1965a); DeMaeyer und Enders (1961)

Cantell (1961); Waddell, Wilbur und

Merigan (1968)

Neva und Weller (1964)

Ray, Gravelle und Chin (1967);

Moehringünd Forsyth (1971)

Wiktor et al. (1972)

Marcus und Sekellick (1977); Vilcek,

Yamazaki und Havell (1977)

Zimmermann et al. (1972)

Demgemäss kann die folgende Verfahrensweise ange-30 wandt werden, um eine Zelle oder ein Gewebe eines gegebenen Typs gegen Virusinfektionen zu schützen oder die Vervielfachung eines Virus, der eine Zelle oder ein Gewebe eines gegebenen Typs infiziert hat, zu stoppen.

Zunächst wird eine Kultur von Zellen nach herkömmli-35 chen Methoden gezüchtet, wie der oben erwähnten Green-Methode. Die Zellen der Kultur werden dann behandelt, um die Transkription desjenigen Teiles ihres DNS-Codes, der für die Erzeugung von Interferon Epsilon verantwortlich ist, auszulösen. Dies kann z.B. mit Hilfe der im folgenden diskutier-40 ten Interferoninduktionsmethoden geschehen. Das Produkt wird dann geerntet, im typischen Falle aus dem Medium nach der Bebrütung. Das Produkt kann als wirksame antivirale oder Antitumorsubstanz für die Behandlung der Zellen oder des Gewebes des fraglichen Typs verwendet werden. 45 Signifikante Mengen dieser neuen antiviralen Substanz können auch mit Hilfe von zwei weiteren bekannten Methoden erzeugt werden. Die erste davon umfasst die Verwendung von chemisch, viral oder spontan transformierten eukaryoti-schen Zelltypen, die denjenigen ähnlich sind, die früher bei 50 der Herstellung von IFN-a aus menschlichen lymphoblastoi-den Zellinien verwendet wurden. Das zweite Verfahren verwendet bekannte DNS-Rekombinationsmethoden, die denjenigen ähnlich sind, die bei der Herstellung von IFN-a und IFN-ß angewandt werden.

55 Bei dem ersten Verfahren können transformierte Zellen, die IFN-e zu erzeugen vermögen, unter Anwendung der In-vivo-Methode oder der In-vitro-Methode erhalten werden. Die erste Methode (in vivo) umfasst die direkte Isolierung von transformierten Zelltypen aus frischem Gewebe; die bo zweite Methode (in vitro) umfasst ein Selektionsverfahren, bei dem ein Stamm von normalen menschlichen diploiden Zellen entweder lange Zeit gezüchtet wird, bis eine kleine, aber nachweisbare Anzahl der Population spontane Transformation erfährt, oder der ursprüngliche Stamm wird kurze Zeit 65 mit einem Virus oder einem bekannten Mutagen, wie EMS, MMS oder MNNG, behandelt, um die Häufigkeit der Transformation zu erhöhen. Gewisse Zellen, die mittels einer der beiden beschriebenen In-vitro-Methoden transformiert wor

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den sind, enthalten einen Teil des DNS-Codes von Epithelzellen, der für die Erzeugung von IFN-e verantwortlich ist.

So erhaltene transformierte Kulturen können unter Anwendung von normalen Induktionsmethoden, wie sie vorstehend für normale menschliche diploide Epithelzellen beschrieben wurden, dazu gebracht werden, IFN-e zu erzeugen.

Bei der zweiten Methode wird die mRNS, die in Reaktion auf die Interferoninduktion in Epithebellen synthetisiert worden ist, aus den Zellen extrahiert, gegebenenfalls durch Ultra-zentrifugieren oder dergleichen gereinigt, um eine mRNS-Fraktion von erhöhter Spezifizität zu erhalten, und der Extrakt wird als Matrize für die Synthese von komplementärer DNS (kDNS) verwendet. Die kDNS kann unter Verwendung des reversen Transkriptaseenzyms von «Avian Myobla-stosis» erzeugt werden. Das resultierende Endprodukt dieses Verfahrens, komplementäre DNS von doppeltem Standard (dskDNS), die die Sequenz enthält, die die Synthese von IFN-e codiert, und ein bakterieller oder eukaryotischer Vektor werden dann mit einem Einschnürungsenzym behandelt, das die DNS spaltet und Bindestellen erzeugt, durch die die dskDNS und der Vektor gebunden werden können. Der Vektor und die DNS werden dann miteinander gemischt, «annea-led» und unter Verwendung eines Ligaseenzyms kovalent gebunden. In diesem Zeitpunkt wird das rekombinierende Vektorpräparat verwendet, um entweder eine bakterielle oder eine eukaryotische Zelle zu transformieren. Die transformierten Zellen enthalten somit während ihres IFN-e-Produktions-stadiums die DNS, die zu der gesamten ursprünglich in den Epithelzellen enthaltenen RNS oder einem Teil derselben komplementär ist.

Diese rekombinierenden Vektoren werden dann mit einem geeigneten Zelltyp bebrütet, der dem Vektor erlaubt zu wirken. Dies führt zu einer Zellpopulation, die einzelne Zellen enthält, die IFN-e zu synthetisieren und auszuscheiden vermögen. Aus der Zellpopulation wird dann eine Unterpopulation von Zellen, die IFN-e erzeugen, selektiert, und diese Unterpopulation wird gezüchtet, um eine Zellinie herzustellen, die verhältnismässig grosse Mengen IFN-e zu erzeugen vermag.

Weitere Einzelheiten dieser DNS-Rekombinationsmethode finden sich z.B. in den folgenden Literaturstellen:

1. US-PS Nr. 4 237 224 von Cohen et al. mit dem Titel «Process for Producing Biologically Functional Molecular Chimeras».

2. Scheller, R. et al., 1977, «Clones of Individuai Repeti-tive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Syn-thetic Eco Ri Sites», Science, Band 196, Seiten 197 bis 200;

3. Blattner, F. et al., 1977, «Charon Phages: Safer Derivatives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning», Science, Band 196, Seiten 161 bis 169;

4. Broach, J.R., und Hicks, J.B., 1980, «Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle», Cell, Band 21, Seiten 501 bis 508; und

5. Hamer, D., 1981, «Synthesis Processing and Sécrétion of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell System», Recombinant DNA Abstracts, Band 1, Seite 4.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Epithelzellenkultur, die aus der Epidermis stammte und 1 bis 2 x 105 Zellen enthielt, wurde verwendet, um IFN-e unter Anwendung der Newcastle-Disease-Virus (NDV)-Induktionsmethode (Baron und Issacs, oben) herzustellen. Das verwendete Virus war der Bankowski-Stamm von NDV, der von Poultry Health Laboratories, Davis, California, erhältlich ist. Vier Proben von je 1 ml MEM, die 2% durch Hitze inaktiviertes fötales Kälberserum (HIFCS) und genügend NDV, dass sich eine Endkonzentration von 0 bzw. 100 bis 200 bzw. 25 bis 50 bzw. 1 bis 16 Virus-pfu/Zelle in den Testproben ergab, wurden hergestellt. 0,2 ml der betreffenden 1-ml-Viruspräparate (Virusinduktor) wurden dann zu den Zellkulturen zugesetzt, die in Abständen von 5 Minuten 30 Minuten lang bei 37 ° C geschüttelt wurden. Die restlichen 0,8 ml der NDV-Präparate wurden dann zugesetzt, und die Kulturen wurden weitere 30 Minuten lang bebrütet. Die Zellkulturen wurden dann zweimal mit normalem Medium gewaschen, jeder Kultur wurde 1 ml frisches Medium zugesetzt, und die Kulturen wurden 24 Stunden lang bebrütet.

Das Medium wurde dann geerntet, mit 0,1-normaler Salzsäure bis pH = 2 angesäuert und 5 bis 6 Tage lang bei 4 °C aufbewahrt, um das NDV zu inaktivieren.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Beständigkeit von IFN-e bei sauren pH-Werten. IFN-e wurde durch Induktion von menschlichen Epidermiszellen mit NDV gemäas Beispiel 1 erzeugt. Als das Medium geerntet war, wurde es in drei Portionen aufgeteilt. Das Virus wurde in der ersten Portion wie in Beispiel 1 beschrieben durch Ansäuern bis pH = 2 mit Salzsäure inaktiviert. Die zweite Portion wurde 5 Tage lang durch ein Millipore 01310-Filter (Molekulargewichtsgrenze 100 000, Millipore Corp., Bedford, MA) filtriert, um das Virus zu entfernen. Die dritte Portion wurde durch ein Millipore PTMK01310-Filter (Molekulargewichtsgrenze 100 000), das vorher 4 Stunden lang in einer l%igen Lösung von BSA eingeweicht worden war, filtriert.

In jedem Falle wurde das resultierende Medium sowohl auf Interferon als auch auf das Vorhandensein von restlichem Virus analysiert.

Keine der Proben zeigten irgendwelche virale Aktivität, und jede Probe enthielt die gleiche Menge IFN-e-Aktivität. Dies zeigt, dass die IFN-e-Aktivität bei saurem pH beständig ist.

Beispiel 3

IFN-e, das durch Induktion von menschlichen Epidermiszellen mit NDV hergestellt wurde, kann durch Affinitätschromatographie auf einer Anzahl von immobilisierten Liganden gereinigt und eingeengt werden. Dazu gehören unter anderem «Reactive Red Agarose», Phenylsepharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), «Procion red agarose», Phenylagarose (BRL, Gaithersburg, Md.), Glycogel B, N-(3-Carboxypropio-nyl)-aminodecan (CPAD)-Agarose und N-Pyromellitylamino-decan (PMAD)-Agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, III.).

Dieses Beispiel zeigt, dass IFN-e durch einen immobilisierten Liganden oder eine Kombination solcher Liganden gereinigt werden kann.

Beispiel 4

Unfraktioniertes IFN-e wird zunächst bei 300 x g 20 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird «end over end» auf einem Fisher Rotarack mit «controlied pore glass» (C.P.G.) (Electronucleonics, Inc.) bei 4 °C gemischt. 0,28 g «controlied pore glass» werden pro 30 ml der überstehenden Kulturflüssigkeit verwendet. Nach 3 Stunden wird die überstehende Flüssigkeit entfernt, und die Perlen von «controlied pores glass» werden in eine Säule (2,5 x 3,1 cm) gefüllt. Die Säule wird zuerst mit 4 Säulenvolumen PBS und dann 4 Säulenvolumen 1,0-molarem Natrium-chlorid-20-millimolarem Phosphatpuffer vom pH = 7,4 gewaschen. Das IFN-e wird mit 4 Säulenvolumen 50-vol.-%igem Ethylenglycol-1,0-molarem Natriumchlorid-20-millimolarem Phosphatpuffer vom pH = 7,4 eluiert und in einem gleichen Volumen 1,0-molarem Natriumchlorid-20-millimolarem

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Phosphatpuffer gesammelt, so dass sich eine Endkonzentration an Ethylenglycol von 25% ergibt. Die IFN-e enthaltende Fraktion wird durch Ultrafiltration auf 1,0 bis 1,6 ml eingeengt und auf eine Polyacrylamid-Agarose (Ultragel AcA54)-Säule (1,6 x 85 cm) aufgebracht, die mit 25-vol.-%igem Ethy-

lenglycol-1,0-molarem Natriumchlorid-20-millimolarem Phosphatpuffer vom pH = 7,4 äquilibriert ist. Das IFN-e wurde dann mit dem Äquilibrierungspuffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 6,0 ml pfo Stunde eluiert.

Claims (10)

664 575 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Interferonpräparates mit antiviraler Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. eine Kultur von lebenden Zellen, die wenigstens den Teil des DNS-Codes von menschlichen Epithelzellen enthalten, der für die Synthese von Interferon codiert, erzeugt,

B. die Zellen in einem Medium unter Bedingungen, die die Synthese von Interferon begünstigen, bebrütet und

C. eine an dem Interferon reiche Fraktion aus den Zellen erntet, wobei das Interferon dadurch gekennzeichnet ist, dass i) das Interferon bei pH = 2 beständig ist,

ii) seine antivirale Aktivität durch proteolytische Enzyme zerstört wird und iii) das Interferon keine signifikante Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen Interferon-a oder Interferon-y zeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von lebenden Zellen eine menschliche Epithelzellenkultur ist und dass man vor der Stufe B ein Virus verwendet, um die Zellen dazu zu bringen, das Interferon zu erzeugen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von Stufe A transformierte eukaroytische Zellen aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von Stufe A Zellen aufweist, bei denen der genannte Teil des DNS-Codes in die Zellen durch DNS-Rekombinationsmethoden eingeführt worden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus Newcastle-Disease-Virus oder Sendai-Virus ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus der Bankowski-Stamm des Newcastle-Disease-Virus ist.

7. Interferonpräparat mit antiviraler Aktivität, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 1.

8. Interferonpräparat nach Anspruch 7, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 2.

9. Interferonpräparat nach Anspruch 7, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 3.

10. Interferonpräparat nach Anspruch 7, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 4.