NL8401911A - Antiviraal proteine, werkwijze voor het produceren daarvan, en farmaceutische preparaten die dit proteine bevatten. - Google Patents

Description

5 . i »

Br/ar/13-Rega -1-

Antiviraal proteine, werkwijze voor het produceren daarvan, en farmaceutische preparaten die dit proteïne bevatten.

De uitvinding betreft een nieuw anti viraal proteïne, dat gewonnen is uit de cultuurvloeistof van door mito-genen gestimuleerde leukocyten. Tevens betreft zij methoden voor het produceren van dit proteine en farmaceutische prepa-5 raten die dat proteine bevatten.

Het is bekend dat leukocyten in een kweekmedium door zogenaamde mitogene stoffen tot groei en celdeling kunnen worden gestimuleerd. Verder is het bekend dat de cul-tuur-vloeistof van de zo gestimuleerde leukocyten een zekere 10 antivirale activiteit bezit, want als deze cultuurvloeistof wordt gebruikt voor het behandelen van cellen in een weefselkweek, worden zulke cellen resistent tegen latere virusinfecties. Als drager van de antivirale activiteit in de genoemde cultuurvloeistof is in de eerste plaats interferon-gamma ge-15 vonden, een glycoproteine met een molecuulgewicht van circa 45.000 dalton. Daarnaast heeft men nog een ander proteine-achtig materiaal, genaamd 22K,gevonden. Dit laatste kan door gelfiltratie van interferon-gamma worden gescheiden, waarbij het migreerde op de plaats waar normaal moleculen van 22.000 20 dalton migreren. Tot op heden werd de actieve component van 22K echter nog niet voldoende zuiver verkregen om de moleculaire structuur en de daarmee verband houdende biologische eigenschappen ondubbelzinnig vast te stellen. Zie J. van Damme et al., Eur. J. Immunol. JJ_, 937-942 (1981 ).

25 Bij voortgezet onderzoek is nu gebleken 8401911 ί » -2- dat deze component met chromatografische methoden kan worden afgezonderd en dat het daarbij gaat om een proteïne met een molecuul-gewicht van circa 17.000 dalton.

Dit proteïne, dat IMP werd genoemd, blijkt voldoende 5 zuiver en homogeen te zijn voor het vaststellen van zijn moleculaire structuur. Zo heeft men kunnen vaststellen dat de aminozuursequentie (eerste 9 aminozuren, gerekend vanaf het eindstandige aminozuur met de vrije aminogroep) van; N.B.-proline-valine-glutamine-fenylalanine-threonine-N.B.-10 alanine-threonine (waarbij N.B. = niet bepaald). Verder blijkt het produkt IMP duidelijke antivirale eigenschappen te hebben, die gelijken op, maar enigszins verschillen van die van interferon-beta. Dit feit betekent dat een nieuwe bron voor het bestrijden van virusziekten ter beschikking 15 staat.

Het is mogelijk, dat in de toekomst nog varianten en modificaties van IMP zullen worden gevonden, die eenzelfde, een sterkere of een selectievere antivirale werking hebben. Daarom worden ook dergelijke varianten en 20 modificaties door de uitvinding omvat.

De uitvinding verschaft derhalve in de eerste plaats een antiviraal proteine, genaamd IMP en gekenmerkt door een molecuulgewicht van circa 17.000 dalton (bepaald door elektrophorese in een natrium-dodecylsulfaat-bevattend 25 polyacrylamidegel), en door een aminozuursequentie (eerste 9 aminozuren gerekend vanaf het eindstandige aminozuur met de vrije aminogroep) van: N.B.-proline-valine-glutamine-f enylalanine-threonine-N. B . -alanine-threonine (waarbij N.B. = niet bepaald), alsmede varianten en modifica-30 ties van dat proteine. Verder verschaft de uitvinding ook methoden voor het produceren van IMP en farmaceutische preparaten die IMP bevatten.

8401911 . * * -3-

Het proteine IMP volgens de uitvinding kan in principe op diverse wijzen worden bereid. Een eerste bereidingswijze, die momenteel nog de voorkeur geniet, bestaat hierin dat men leukocyten kweekt in tegenwoordigheid 5 van mitogene stoffen en de daarbij verkregen kweekvloeistof aan een concentratie- en zuiveringsbehandeling onderwerpt.

De uitvinding is daar echter niet toe beperkt, aangezien nog diverse andere methoden denkbaar zijn.

De voorkeursmethode voor het bereiden van 10 IMP (kweken van leukocyten onder stimulering met mitogene stoffen, gevolgd door een concentratie- en zuiveringsbehandeling van de cultuurvloeistof) zal thans eerst in detail worden beschreven.

Als uitgangsmateriaal kan elk type leuko-15 cyten of mengsel van leukocyten worden gebruikt, mits zij door mitogene stoffen gestimuleerd kunnen worden. De voorkeur gaat uit naar leukocyten uit perifeer bloed, die gemakkelijk uit de in bloedtransfusiecentra verzamelde bloeddonaties kunnen worden geïsoleerd. Bij de isolering dient een schei-20 ding tussen leukocyten en erythrocyten plaats te vinden,_ hetgeen met bekende methoden kan geschieden, bijvoorbeeld door behandeling met een amoniumchloride-oplossing, gevolgd door centrifugeren; door verdunning met een amylopectine-derivaat en een gebufferde zoutoplossing, eveneens gevolgd 25 door centrifugeren? of anders door centrifugeren in een speciaal plasmapherese-apparaat? of dergelijke. De verkregen leukocyten bestaan dan uit een mengsel van diverse celtypen, dat zich goed door mitogene stoffen laat stimuleren. Overigens zou men de leukocyten ook kunnen afzonderen uit de 30 menselijke milt, of zo men het analoge IMP van dieren zou wensen, uit de milt of de thymus van de desbetreffende diersoort .

Als mitogene stoffen zijn diverse stoffen mogelijk, zoals plantlectinen, waaronder Concanavaline A

35 84 0 1 9 1 1 -4- t 4 * (Con-A), Phytohemagglutinine (PHA-P), "pokeweed mitogen", linzen-lectine en erwten-lectine; en bacterie-extracten waaronder staphylococcen-enterotoxine en staphylococcen-cultuurmedium/ en dergelijke. Sommige mitogene stoffen werken 5 alleen stimulerend op bepaalde typen leukocyten;bij leuko-cytenmengsels zal daarentegen elke mitogene stof bruikbaar zijn.

De leukocyten en de mitogene stoffen kunnen worden samengebracht in elk geschikt medium voor celkweek 10 of weefselkweek. De voorkeur gaat uit naar het medium RPMI 1640, ontwikkeld in het Rosswell Park Memorial Institute, dat anorganische zouten (NaCl, NaHCO^NagHPO^, etc.), glucose, diverse aminozuren en diverse vitaminen bevat.

(zie J. Amer.Med.Ass., 199, 519 524 (1967)). Aan dit kweek-15 medium kunnen naar keuze nog diverse andere stoffen worden toegevoegd, bijvoorbeeld foetaal kalverserum; chemische stoffen als N-2-hydro 2?yp iperazine-N-2-ethaansulfonzuur (HEPES) en N-Tris(hydroxymethyl)-methylglycine (Tricine); en dergelijke (zie voor laatstgenoemde stoffen N.E. Good et 20 al, Biochemistry, 5, 467-477 (1966) .

Nadat de leukocyten in een kweekmedium met een mitogene stof zijn samengevoegd, worden zij enige tijd bij geschikte temperatuur (37°C voor humane leukocyten geïncubeerd. De incubatieduur kan 0-5 dagen zijn, met een 25 optimum rond 48 uren. Daarha kan de cultuurvloeistof worden gewonnen en aan de noodzakelijke concentratie- en zuiverings-behandeling worden onderworpen. Bij het zuiveren en concentreren van de cultuurvloeistof kunnen doorgaans verschillende trappen worden onderscheiden. Zo kan een eerste trap of 30 serie trappen dienen om de meeste onzuiverheden te verwijderen en tevens het vloeistofvolume sterk te verminderen. Men houdt dan een gezuiverde vloeistof over met een hoge concentratie aan antivirale activiteit. Een volgende stap kan dienen om de aanwezige antivirale stoffen (in dit geval 35 interferon-gamma en IMP-houdend materiaal) van elkaar te 8401911 -5- # * scheiden, terwijl een derde trap voor verdere fractionering van het IMP-houdende materiaal dient en tot het zuivere produkt IMP leidt.

Het verwijderen van de meeste onzuiverheden 5 onder gelijktijdige vermindering van het volume kan het beste met chromatografische methoden geschieden. Hiervoor zijn in principe diverse methoden mogelijk. Goed voldaan heeft een zuivering in twee trappen, namelijk eerst chroma-tografie op kiezelzuur, gevolgd door behandeling met 10 DEAE-Sephacel (met agarose verknoopt diethylaminoethyl-dextran). De ruwe cultuurvloeistof wordt in dat geval bij neutrale pH met kiezelzuur in contact gebracht ter adsorptie van gewenste stoffen uit de vloeistof,waarna deze stoffen van het kiezelzuur kunnen worden geëlueerd, bijvoorbeeld 15 met een gebufferde oplossingvan ethyleenglycol,een gebufferde oplossing van tetraetir/laninoniuraacetaat, een oplossing van glycine-BCl, of dergelijke. Vervolgens kan het eluaat bij een pH van circa 8,0 in contact worden gebracht met DEAE-Sephacel ter adsorptie van onzuiverheden aan dat materiaal. Na afscheiden van het vaste materiaal 20 kan dan een sterk gezuiverde en geconcentreerde vloeistof worden gewonnen. Verder concentreren is mogelijk door tussentijdse of later dialyse, meestal tegen een gebufferde oplossing van polyethyleenglycol.

De scheiding tussen interferon-gamma en 25 IMP-houdend materiaal kan in principe op elke geschike wijze geschieden, maar bij voorkeur past men hierbij een gelfiltratie toe. De gezuiverde vloeistof wordt dan bijvoorbeeld op een kolom van een moleculaire zeef gebracht, waarna de kolom kan worden geëlueerd met een waterige 30 ethyleenglycoloplossing. Indien men het eliiaat gefractio-neerd opvangt en alle fracties op anti-virale werking test, kunnen gemakkelijk twee pieken in antivirale activiteit worden onderscheiden, die respectievelijk van het interferon-gamma en van het IMP houdende materiaal afkomstig zijn. Ver-35 volgens kunnen de bij deze pieken behorende fracties in groepen worden verzameld.

8401911 s » -6-

Een andere mogelijkheid tot scheiding is adsorptie op een lectine-kolom. Het interferon-gamma zal door een dergelijke kolom worden geadsorbeerd, maar het IMP niet, zodat de na contact met de lectine kolom overblijvende 5 vloeistof een IMP houdend materiaal zal zijn.

De fractionering van het IMP houdende materiaal kan in het algemeen eveneens op elke geschikte wijze geschieden. Momenteel wordt de voorkeur gegeven aan "Fast Liquid Protein Chromatography" waarbij het vloeibare materiaal 10 onder betrekkelijk hoge druk door een kolom kationenwisselaar wordt gevoerd. Dankzij het werken onder druk kan deze methode betrekkelijk snel verlopen, hoewel het werken bij normale druk in principe ook mogelijk is. De elutie kan hier geschieden met een concentratiegradient van een 15 keukenzoutoplossing. Indien de verkregen fracties op anti-virale werking worden getest, zullen de mediane fracties een duidelijke werkingspiek, afkomstig van het IMP vertonen. Door samenvoegen van deze fracties wordt dan een gezuiverde oplossing van IMP verkregen.

20 De hier beschreven zuivering in vier trappen (chromatografie op kiezelzuur, adsorptie aan DEAE-Sephacel, fractionering door gelfiltratie en fractionering door FPLC) wordt in de navolgende voorbeelden geïllustreerd. Het zal overigens duidelijk zijn dat dit slechts een voorkeurs-25 methode betreft en dat vele varianten daarop denkbaar zijn.

Een gewijzigde zuiveringsmethode wordt mogelijk indien men beschikt over anti-IMP-antistoffen. In dat geval kan de fractionering door FPLC worden vervangen door chromatografie aan een kolom die dergelijke antistoffen 30 in geïmmobiliseerde vorm bevat. Het IMP zal dan aan de kolom worden geadsorbeerd en kan vervolgens met een geschikte buffer-oplossing worden geëlueerd. De overige trappen kunnen in het algemeen dezelfde blijven, al kan de chromatografie op kiezelzuur wellicht door een chromatografie op poreuze 35 glasparels (controlled pore glass) vervangen worden.

8401911

# V

-7-

Wellicht is zelfs een inkorting van de zuiveringsbehandeling tot een tweetrapsmethode (bijvoorbeeld chromatografie op poreuze glasparels of kiezelzuur, gevolgd door chromatografie op geïmmobiliseerde anti-IMP-antistoffen) of inkorting 5 tot een één-trapsmethode (chromatografie op geïmmobiliseerde monoklonale anti-IMP-antistoffen) mogelijk.

De anti-IMP-antistoffen kunnen polyklonaal of monoklonaal zijn. Polyklonale antistoffen kunnen worden verkregen door het produkt IMP bij een proefdier in te 10 spuiten, vervolgens bloed af te tappen en daaruit met geschikte zuiveringsmethoden een antistoffen-houdend serum te winnen. Monoklonale antistoffen vereisen een meer gecompliceerde methode, waarbij men het produkt IMP bijvoorbeeld eerst bij een proefdier inspuit, uit het proefdier een 15 suspensie van miltcellen wint, de miltcellen fuseert met tumorcellen, uit het fusiemengsel door kloneren en sub-kloneren onder voortdurend testen op antistofwerking een bepaalde cellijn van hybride cellen kweekt en ten slotte de cellijn gebruikt voor antistofproduktie in weefselkweek 20 of in muizen. Uiteraard zijn ook hier varianten mogelijk.

Hoewel het kweken van leukocyten in tegenwoordigheid van mitogene stoffen, gevolgd door zuiveren en concentreren van de verkregen cultuurvloeistof momenteel de voorkeur geniet, kan het produkt IMP ook op andere 25 wijzen worden bereid.

Bij ëên zo'n andere bereidingswijze wordt eerst een continue cellijn van hybride cellen, afgeleid uit leukocyten en tumorcellen gemaakt, waarna men de hybride cellen in een geschikt voedingsmedium bij aanwezigheid van 30 mitogene of andere stoffen (bijvoorbeeld phorbolesters) kweekt en de daarbij verkregen cultuurvloeistof aan een zuiverings- en concentratiebehandeling onderwerpt. Het maken van de continue cellijn kan op gebruikelijke wijze geschieden door de leukocyten (bijvoorbeeld uit perifeer bloed of uit de 35 milt) aan celfusie met geschikte tumorcellen in polyethyleen- 8401911 i -8- glycol te onderwerpen en uit het fusiemengsel door kloneren en subkloneren een continue cellijn met gewenste eigenschappen te kweken.

Het zuiveren van de cultuurvloeistof van 5 de hybride cellen kan op soortgelijke wijze geschieden als bij de cultuurvloeistof van leukocyten, maar zal iets eenvoudiger zijn omdat het uitgangsmateriaal homogener is.

Bij een volgende andere bereidingswijze wordt gebruik gemaakt van recombinant-DNA-methoden. Uit 10 leukocyten wordt het gen voor de produktie van IMP afgezonderd, dat vervolgens via een gerichte vector wordt ingébracht in een bepaald expressiesysteem. Dit expressiesysteem kan naar keuze bestaan uit prokaryotische cellen (bijvoorbeeld cellen van Escherichia coli), eukaryotische micro-organismen 15 (bijvoorbeeld gisten of schimmels), of eukaryotische cellen van hogere dieren (bijvoorbeeld zoogdiercellen, vogelcellen of menselijke tumorcellen). De zo verkregen cellen kunnen dan in een geschikt kweekmedium worden voortgekweekt, waarna de verkregen cultuurvloeistof aan een zuiverings- en concen-20 tratiebehandeling kan worden onderworpen. De zuiveringsbehan-deling kan in dit geval langs dezelfde lijnen als hierboven of langs andere lijnen verlopen.

Het gebruik van recombinant-DNA-methoden bevat ook de mogelijkheid om varianten en modificaties van 25 IMP te verkrijgen, omdat men door het aanbrengen van mutaties op specifieke plaatsen van het IMP-producerende gen bepaalde wijzigingen in het IMP-molecuul kan teweegbrengen. Dergelijke wijzigingen kunnen bijvoorbeeld tot eenzelfde antivirale werking bij kortere molecuulketen, een versterkte 30 werking of een selectievere werking leiden.

Het proteine IMP volgens de uitvinding heeft een duidelijke antivirale werking, die tot uiting komt bij diverse celtypen, bijvoorbeeld huid- of spiercellen en ook bij bepaalde sublijnen van een menselijke osteosarcoom-35 cellijn (MG-63). De werking gelijkt op die van interferon doordat zij wel specifiek voor een bepaalde celsoort maar 8401911 -9- niet specifiek voor een bepaald virus is. Deze antivirale werking is bestand tegen behandeling met zuur (pH i 2}, natriumdodecylsulfaat (0,1%), ribonuclease en DNA-ase, maar wordt opgeheven door behandeling met trypsine. Verder 5 wordt de antivirale werking opgeheven door voorafgaande behandeling van het celsubstraat met antisera die specifiek tegen het IMP zijn gericht, maar niet door voorafgaande incubatie met antisera tegen interferon-alpha of interferon-gamma. De werking kan ook worden geremd door antisera tegen 10 interferon-beta, vooral als het antiserum tezamen met het IMP op het celsubstraat aanwezig is. Deze eigenschappen wijzen op een zekere overeenkomst met interferon-beta, zonder dat het IMP overigens daaraan gelijk is.

Op grond hiervan kan het proteïne IMP met « 15 voordeel voor het bereiden van farmaceutische preparaten en voor het behandelen van virusziekten worden gebruikt.

Farmaceutische preparaten die het proteine IMP als actief bestanddeel bevatten, kunnen de vorm van poeders, suspensies, oplossingen, emulsies maar ook van zalven 20 en pasta's hebben en kunnen worden gebruikt voor parenterale (intradermale, intramusculaire, intrathecale en dergelijke) injecties, voor orale, rectale, intravaginale en intranasale toediening of voor topicale toediening (bijvoorbeeld op een beschadigde huid, slijmvliezen of ogen). Deze preparaten kunnen 25 worden bereid door het actieve bestanddeel te combineren met farmaceutische aanvaardbare excipientia welke gewoonlijk voor dit doel worden gebruikt. Deze excipientia kunnen waterige of niet-waterige oplosmiddelen, stabilisatoren, suspendeermiddelen, dispergeermiddelen, bevochtigings-30 middelen en dergelijke omvatten en zullen aan de deskundige op farmaceutisch gebied bekend zijn. Verder kan het preparaat elk geschikt toevoegsel zoals polyethyleenglycol en desgewenst kleurstoffen, reukstoffen en dergelijke bevatten.

De farmaceutische preparaten zullen gewoon-35 lijk ten minste 0,1 gewichts/volume% van hët actieve bestanddeel bevatten. De werkelijke concentratie zal afhangen 8401911 4 -10- van de virusziekte en van de gekozen wijze van toediening.

In het algemeen zal deze concentratie tussen 0,1 procent en 100 procent liggen.

De navolgende voorbeelden betreffen: 5 de bereiding van een kweekvloeistof uit door mitogenen gestimuleerde leukocyten (I), de zuivering en concentratie van een dergelijke kweekvloeistof (II en III), en

de antivirale werking van het verkregen IMP

10 (IV en V) .

VOORBEELD I

Bereiding van een kweekvloeistof uit door mitogenen gestimuleerde leukocyten.

Als uitgangsmateriaal diende een leukocyten 15 preparaat (buffy coats) verkregen als spontaan sediment uit menselijk donorbloed. Dit preparaat had een volume van 1520ml, o en een gehalte van 110 x 10 aan leukocyten (98% levende cellen). Het werd verdund met 1520 ml fosfaat-gebufferde keukenzout-oplossing (PBS) (vergelijk R. Dulbecco et al., Journ. Exp.

20 Med. 9J3, 167-182, 1954) en 1520 ml Plasmasteril (een oplossing van 60 g/1 O-(2-hydroxyethyl)- amylopectine-hydrolysaat en 9 g/1 NaCl, verkregen bij Fresenius AG, Bad Homburg, B.R.D.

Het mengsel werd in cylinders van 10 cm diameter en 40cm hoogte gebracht en 30 minuten bij 37°C stationair daarin 25 gehouden totdat een duidelijke scheiding in twee lagen was verkregen. De onderste laag bevatte rode bloedcellen, terwijl de leukocyten zich in de bovenste laag bevonden. De bovenlaag werd door afzuiging gewonnen en daarna gecentrifugeerd (1000rpm 10 minuten) waarna de heldere bovendrijvende vloeistof door 30 decanteren werd verwijderd.

Het celsediment werd tweemaal gewassen door suspenderen in 1000 ml PBS, en opnieuw gesedimenteerd door centrifugeren (900rpm, 10 minuten).

Het gewassen sediment werd opnieuw gesus-35 pendeerd in 166 ml PBS en 83 ml Plasmasteril, door centrifu- 84 0 1 9 1 1 -11- » geren (900 rpm, 10 minuten) gesedimenteerd, opnieuw gesuspendeerd in 100 ml kweekmedium RPMI-1640 (concentratie 96 x q 10 cellen; 98% levende cellen), en daarna verdeeld over drie kweekvaten van het type "Spinner Vessel" die elk 4000 ml 5 RPMI-1640 bevatten, waaraan 2 procent foetaal kalverserum, 6mM N-2-hydroxypiperazine-N-2-ethaansulfonzuur (HEPES) en 13mM N-tris (hydroxymethyl)-methylglycine (Tricine) was toegevoegd. De pH bedroeg 7,4.

De cellen werden gestimuleerd door aan het 10 medium 10y*g/ml Concanavaline A toe te voegen, waarna de cellen onder mild roeren 44 uren bij 37°C werden geïncubeerd.

Na het kweken van de cellen werd de kweekvloeistof gewonnen en door centrifugeren (2000 rpm, 20 minu·» ten) geklaard. De antivirale sterkte van deze kweekvloeistof 15 bedroeg 10^*^ AVE/ml bij een test op'MG-63-cellen en 10^'^ AVE/ml bij een test op HEp-2 cellen (Am.Type Cult. Coll. no. CCL-23) (AVE=antivirale eenheden). De vloeistof werd niet bewaard, maar onmiddellijk aan een zuiverings- en concentra-tiebehandeling onderworpen.

20 VOORBEELD II

Zuivering en concentratie van kweekvloeistof (eerste deel).

Het uitgangsmateriaal voor de zuivering bestond uit 9000 ml kweekvloeistof van door mitogenen gestimu-25 leerde leukocyten, verkregen op de wijze van Voorbeeld I. Na toevoeging hieraan van 90 gram droog Jciezelzuur werd de vloeistof 2 uren bij 4°C doorgeroerd, vervolgens gecentrifugeerd (3000 rpm, 10 minuten) en gedecanteerd.

Het kiezelzuursediment werd uitgeschud met 30 2000 ml PBS, opnieuw gecentrifugeerd (3000 rpm, 5 minuten), gedecanteerd, geschud met 1000 ml 1M-NaCl in PBS, en opnieuw gesedimenteerd door centrifugeren (3000 rpm, 5 minuten).

Het zo gewassen kiezelzuursediment werd 4 malen geëlueerd met een tetraethylamoniumacetaatbuffer (DEAC). 35 Elke elutie omvatte de volgende stappen:suspenderen in 125ml 0,4M TEAC in PBS, waaraan 0,5 mg/ml menselijke plasma-proteine 8401911 -12- fractie (HPPF) (cohn-fractie V) was toegevoegd, 30 minuten roeren bij 4 °C, gevolgd door centrifugeren (2,5 minuten, 3000 rpm) en winnen van de heldere bovendrijvende vloeistof. De zo gewonnen 5 vloeistoffen werden samengevoegd tot 500 ml "TEAC-eluaat".

Vervolgens werd het kiezelzuursediment 4 malen geelueerd met een glycine-buffer. Elke elutie omvatte de volgende stappen: suspenderen in 80 ml 0,3M glycine-HCl van pH = 2, waaraan 10 0,5 mg/ml HPPF was toegevoegd, 30 minuten roeren bij 4 °c, gevolgd door 2,5 minuten centrifugeren bij 3000rpm en winnen van de heldere bovendrijvende vloeistof.

De zo verkregen vloeistoffen werden samengevoegd tot 320 ml "glycine-eluaat".

15 Het "TEAC-eluaat" en het "glycine-eluaat" werden afzonderlijk aan de volgende behandeling onderworpen: -dialyse gedurende 16uren tegen 5000ml polyethyleen glycol-oplossing (15% PEG in 20 mM Tris-HCl, pH = 8,0), 20 met als resultaat 82 ml "TEAC-concentraat" en 40 ml "glycine-concentraat", -dialyse gedurende 6 uren tegen 2 x 5000 ml Tris-oplossing (20mM Tris- HC1, pH 8,0).

-20 minuten roeren bij 4 °C met 10% 25 (v/v) DEAE-Sephacel in 20mM Tris-HCl (pH 8,0), -centrifugeren (4000 rpm, 20 minuten), en winnen van de bovendrijvende vloeistof.

Nadat monsters waren genomen voor het testen van de antivirale werking werd de verkregen oplossing bij 30 -70 °c bewaard.

Van alle vloeistoffen tijdens deze zuiveringsbehandeling werd het volume, de totale hoeveelheid antivirale activiteit en de totale hoeveelheid proteïne bepaald. De bepaling van de antivirale activiteit 35 geschiedde door meting van de remming van het cytopathisch effect (zie voorbeeld IV) en de bepaling van de hoeveelheid proteine geschiedde met de "BIO-RAD protein Assay", zoals voorgesteld door BIO-RAD Laboratories, München, B.R.D. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 1.

8401911 -13-

Tabel 1

Fractie Volume Totale Antivirale Totale activiteit (AVE) hoeveelheid _proteïne (mg)

Kweekvloeistof 9000 28.800.000 18.900

Vloeistof na · kiezelzuur- behandeling 9000 7.200.000 14.400 "TEAC-eluaat" 500 12.500.000 300 ,,Glycine-eluaath 320 3.200.000 224 ‘'TEAC-concentraat* 82 10.250.000 328

Glycine-concentraat" 40 2.560.000 204 "TEAC-concentraat" na Sephacel behandeling 82 8.200.000 16 « n Glycine-concentraat'1 na Sephacel behandeling 40 2.000.000 4 8401911

VOORBEELD III

-14- • t l

Concentratie en zuivering (tweede deel).

Het uitgangsmateriaal was een gedeeltelijk gezuiverde kweekvloeistof, verkregen op de wijze van voorbeeld II met als uitzondering dat het kiezelzuur was geelueerd met een oplossing van 50 % (v/v) ethyleenglycol in g 1,4 M NaCl/PBS bij pH = 7,4, en dat de vloeistof was opgenomen in 45 ml Tris-HCl van pH = 8,0. De vloeistof werd tot 5 ml geconcentreerd door dialyse tegen 15% polyethyleenglycol in PBS.

De geconcentreerde vloeistof werd op een -jQ kolom (2,6 cm diameter x 100 cm hoogte) van een moleculaire zeef (ültrogel AcA-54 van Rëactifs IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrijk) gebracht, waarna de kolom werd geelueerd in 5 ml porties met een oplossing· van 18% (v/v) ethyleenglycol in 1,55 M NaCl van pH * 7,2.

15 Alle verkregen fracties werden geanalyseerd op proteinegehalte en antivirale werking. De fracties 66 tot 76, die een piek van antivirale werking bij een molgewicht rond 22.000 dalton bevatten werden tot 50 ml samengevoegd, vervolgens geconcentreerd 2q door dialyse tegen 500 ml 15% polyethyleenglycol in 50mM natriumformiaat van pH » 4,0, en verder geconcentreerd door dialyse tegen 2 x 500 ml van dezelfde buffer-oplossing zonder polyethyleenglycol. Dit leverde 8 ml gezuiverd materiaal.

25 Het gezuiverde materiaal werd onderworpen aan Fast Protein Liquid Chromatography, door het onder druk op een kolom kationen-uitwisselaar, (Mono-<y vanpharmacia, üppsala, Zweden), te brengen.

De elutie geschiedde met 50 porties van 1 ml elutiemiddel 3Q dat een gradient van NaCl (0 tot 0,65M) in 50 mM natriumformiaat van pH 4,0 bevatte. De fracties 35 tot 38 werden samengevoegd tot 54 ml produkt (IMP).

84 0 1 9 1 1 -15-

Van alle vloeistoffen tijdens deze zuiverings-behandeling (de uitgangsoplossing, het materiaal na gel-filtratie en het produkt na FPLC) werd het volume, de totale antivirale activiteit en de totale hoeveelheid proteïne 5 bepaald. De bepaling van de antivirale activiteit geschiedde op de wijze van Voorbeeld IV en de bepaling van de hoeveelheid proteine geschiedde met de "BIO-RAD protein assay". De resultaten zijn weergegeven in tabel 2, waarin "N.D." betekent: niet waarneembaar (de hoeveelheid IMP bedroeg minder dan 0,01 10 mg/ml). Bij de waarde voor de antivirale activiteit van de uitgangsoplossing dient men in aanmerking te nemen dat deze niet alleen IMP maar ook interferon-gamma bevatte.

• Ter bepaling van het molecuulgewicht werd de totale hoeveelheid van 4 ml IMP verder geconcentreerd 15 en vervolgens aan elektroforese op een natriumdodecyl-sulfaat-houdend polyacrylamidegel onderworpen (zie Nature 227, 680-685 (1970)). Daarbij blijkt dat de antivirale werking en ook het vermogen om door Coomassie-blauw gekleurd te worden waren geconcentreerd in een enkele band met 20 molecuulgewicht 17.000 dalton.

De aminozuursequentie van de eerste 10 aminozuren, uitgaande van een eindstandige aminogroep, werd bepaald door stapsgewijze afbraak volgens Edman in een gasfase sequenator en bedroeg (eerste 9 aminozuren, gere-25 kend vanaf het eindstandige aminozuur met de vrije aminogroep) van: N.B.-proline-valine-glutamine-fenylalanine-threonine-N.B.-alanine-threonine (waarbij N.B. = niet bepaald). Bij deze bepaling werd ondubbelzinnig de genoemde frequentie verkregen, waarmee het bewijs werd geleverd dat het produkt 30 moleculair homogeen was.

84 0 1 9 1 1 - . * -16-

Tabel 2

Volume Totale Antivirale Totale activiteit (AVE) hoeveelheid _proteïne (mg)

Uitgangsoplossing 5 1.600.000 5.5

Materiaal na $ gelfiltratie 50 1.000.000 0.1

Produkt (IMP) na FPLC 4 160.000 N.D.

84 0 1 9 1 1 • /“x • ¥ -17-

VOORBEELD IV

Bepaling antivirale werking.

In dit voorbeeld werd de antivirale activiteit van het produkt gemeten door remming van het cytopatische effect (CPE), dat wil zeggen door gebruikmaking van het vermogen van het produkt om vernietiging van 5 gevoelige cellen door een virusinfectie te voorkomen.

Een IMP-preparaat, gezuiverd op de wijze van de voorgaande voorbeelden, werd stapsgewijs (met stappen van 0,5 logio) verdund. De verdunde preparaten werden toegevoegd aan menselijke diploide fibroblast-cellen in de 10 cups (0,6 cm diameter) van een microtiterplaat. Na 16 uren incubatie bij 37 °C werd een testvirus toegevoegd.

Het optreden van een cytopatisch effect werd , door microscopische waarneming nagegaan. Zodra dit effect optrad in cellen die niet met het IMP-preparaat 15 waren behandeld, werden alle cellen gedurende 2 uren gekleurd met een geschikte kleurstof (neutraal rood, 0.17 g/100 ml, verdund 1/30 in PBS). Na verwijdering van de overmaat kleurstof werden de cellen geextraheerd met een mengsel van zuur en alcohol (natriumcitraat-buffer 20 van pH = 4,2, met ethanol in de verhouding 50: 50 (v/v)), waarna de optische dichtheid van de extracten werd gemeten bij een golflengte van 540 nM. De resultaten werden grafisch uitgezet tegen de verdunning, waarna de "omslagpuntverdunning" werd bepaald door de 25 punten van 50% kleurstofopname van de curven te projecteren op de as, waarlangs de verdunning volgens een logaritmische schaal was uitgezet. Het antivirale vermogen werd uitgedrukt in antivirale eenheden/ml (AVE/ml), waarbij logio AVE/ml * -logiQ "omslagpunt 30 verdunning". De resultaten zijn weergegeven in tabel 3, waarbij ter positieve controle ook de waarden voor monsters van interferon-alpha, interferon-beta en interferon-gamma zijn opgenomen.

Als testvirus werden virussen uit drie 35 8401911 -18- verschillende families gebruikt namelijk: vesiculair stomatitisvirus (VSV, familie Rhabdoviridae),

Semliki-Porest virus (SFV, familie Togaviridae), alsmede enengovirus en encephalomvocarditis-5 virus (Mengo en EMC, familie Picornaviridae).

Uit de tabel blijkt dat het IMP-preparaat evenals de diverse interferon typen actief was tegen alle virussen. Bovendien blijkt SFV, dat het minst gevoelig is voor interferon, 10 ook het minst gevoelig voor IMP te zijn.

VOORBEELD V

15 Bepaling van de antivirale werking.

In dit voorbeeld werd de antivirale werking vaii een IMP-preparaat bepaald aan de hand van het vermogen om de synthese van virus-RNA te remmen. Dit werd gedaan 20 door de synthese van cel-eigen RNA specifiek te blokkeren door toevoeging van actinonycine D en vervolgens de opname van -^H-uridine in het met zuur te precipiteren materiaal te meten.

Een IMP-preparaat uit de voorgaande 25 voorbeelden werd verdund met stappen van 0,5 logiQ·

De verkregen verdunningen werden toegevoegd aan menselijke diploide fibroblast cellen die zich bevonden in de cups (0,6cm diameter) van een microtiter-plaat. Na 16 uren incubatie bi.j 37 °C werd een test-30 virus toegevoegd (gemiddeld 10 levende virusdeeltjes per cel)in tegen woordigheid van 1 jig/ral actinom ycine D. Na 3 uren incubatie werd 5 jagCi/ml ^a-uridine toegevoegd, waarna 3 uren later de opname van ^H-uridine werd gemeten.

Als "omslagpunt-verdunning" werd de verdunning genomen, 35 die de opname van ^a-uridine verminderde tot 50% van de opname in niet met IMP behandelde cellen.

Het antivirale vermogen van de monsters werd uitgedrukt in AVE/ml, waarbij log-jo AVE/ml = -log-jo "omslagpunt-verdunning·" De resultaten voor vier verschillende test-40 virussen zijn eveneens weergegeven in tabel 3, waarbij 8401911 -19- wederom interferon-alpha, interferon-beta en interferon-gamma ter vergelijking zijn gebruikt.

Uit de tabel blijkt dat het antivirale effect van IMP bij alle vier testvirussen (die tot 5 drie verschillende taxonomische families behoorden) aanwezig was.

8401911

. -*·„ V

-20-

Tabel 3

Gemeten effect Virus Antivirale werking (log1oAVE/ml)

HulFN-<* HulFN-£ HuIFN-y IMP

Remming CPE VSV 4.0 4.8 3.0 3.2 (Voorbeeld IV) EMC 3.8 4.7 3.0 3.5

Mengo 3.7 4.4 2.8 1.8 SFV 2.8 3.5 2.0 1.5

Vermindering VSV 3.3 4.0 2.9 3.9 virus-RNA EMC 3.5 4.2 2.9 4.4 produktie Mengo 3.4 4.2 3.0 4.3 (Voorbeeld V) SFV 3.6 4.1 3.2 4.1 8401911

Claims (16)

1. Een antiviraal proteïne, genaamd IMP en gekenmerkt door een molecuulgewicht van circa 17.000 dalton (bepaald door elektrophorese in een natrium-dodecylsulfaat-bevattend polyacrylamidegel), en door een aminozuursequentie 5 (eerste 9 aminozuren, gerekend vanaf het eindstandige aminozuur met de vrije aminogroep) van: N.B.-proline-valine-glutamine-fenylalanine-threonine-N.B.-alanine-threonine (waarbij N.B. = niet bepaald), alsmede varianten en modificaties van dat proteine.

2. Antiviraal proteine volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de antivirale werking bestand is tegen behandeling met zuur, natriumdodecylsulfaat, ribonuclease en DNA-ase, maar wordt opgeheven door behandeling met trypsine.

3. Werkwijze voor het bereiden van IMP, met 15 het kenmerk, dat men leukocyten kweekt in tegenwoordigheid van mitogene stoffen en de daarbij verkregen kweekvloeistof aan een concentratie- en zuiveringsbehandeling onderwerpt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de leukocyten afkomstig zijn uit perifeer bloed.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de mitogene stoffen bestaan uit plantlectinen of bacterie-extracten.

6. Werkwijze volgens conclusie 3-5, met het kenmerk, dat het concentreren en zuiveren van de cultuur- 25 vloeistof in een aantal trappen geschiedt.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de concentratie- en zuiveringsbehandeling ëën of meer trappen voor het verwijderen van de meeste onzuiverheden, een trap voor het scheiden van de aanwezige antivirale 30 stoffen, en een trap voor het winnen van zuiver IMP omvat.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de trap voor het scheiden van de antivirale stoffen wordt uitgevoerd door gelfiltratie.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, met het ken- 35 merkt, dat de trap voor het winnen van het zuivere IMP wordt uitgevoerd door "Fast Protein Liquid Chromatography". 8401911 -22-

10. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de trap van het winnen van zuiver IMP wordt uitgevoerd door chromatografie 5 aan geïmmobiliseerde anti-IMP-antistoffen.

11. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de zuiveringsbehandeling een trap ter verwijdering van de meeste onzuiverheden en een trap ter winning van zuiver IMP door 10 chromatografie op geïmmobiliseerde anti-IMP-anti stoffen omvat.

12. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de concentratie- en zuiveringsbehandeling wordt uitgevoerd door chromatografie 15 aan geïmmobiliseerde monoklonale anti-IMP-anti- stoffen.

13. Werkwijze voor het bereiden van * IMP, met het kenmerk, dat men hybride cellen, afgeleid uit leukocyten en tumorcellen, in tegen-20 woordigheid van mitogenen of andere stoffen kweekt en de verkregen cultuurvloeistof aan een concentratie- en zuiveringsbehandeling onderwerpt.

14. Werkwijze voor het bereiden van IMP, met het kenmerk, dat men cellen van een 25 expressiesysteem, waarin het IMP-producerende gen van leukocyten is opgenomen, al dan niet in tegenwoordigheid van mitogene of andere stoffen, in een geschikt voedingsmedium kweekt, en de verkregen cultuurvloeistof aan een concentratie- en zuiverings- 30 behandeling onderwerpt. t

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men door modificatie van het genoemde gen een variant of modificatie van het IMP bereidt.

16. Farmaceutisch preparaat met antivirale 35 werking, gekenmerkt door een effectieve hoeveelheid IMP, al dan niet tezamen met een farmaceutisch aanvaardbaar excipiens. 8401911