KR970009890B1

KR970009890B1 - 혈소판감소증치료제

Info

Publication number: KR970009890B1
Application number: KR1019890001511A
Authority: KR
Inventors: 후미마로 다까꾸; 카주오 모또요시
Original assignee: 수야마 다다가즈; 가부시끼가이샤 미도리주지; 오오나 아기라; 모리나가 뉴교 가부시끼가이샤
Priority date: 1988-02-10
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1997-06-19
Also published as: KR890012664A; EP0328132A2; CA1332149C; DE68907933D1; US5114710A; EP0328132A3; JPH0611705B2; DE68907933T2; EP0328132B1; JPH01207244A; ES2042818T3

Abstract

내용 없음.

Description

혈소판 감소증 치료제

제1도는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)시 수득된, 본 발명에 따른 CSF의 전기영동 유형이며, 여기에서, A내지 E는 환원되지 않은 물질(이량체)이고, F 및 G는 분자량 표지 단백질이며, H 내지 L은 환원된 물질(아단위)이다.

제2도 및 제3도는 각각 본 발명에 따른 CSF의 내부자외선 CD 스펙트럼 및 자외선 흡수 스펙트럼이다.

본 발명은 다양한 유발원에 의해 유도된 조혈기능장애로 인한 혈소판감소증을 치료하는 약제에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 활성성분으로서 사람 조혈인자증 하나인, 사람 단핵 세포-대식세포 콜로니 자극 인자를 포함함을 특징으로 하는 혈소판감소량 치료제에 관한 것이다.

혈소판 수혈은 혈소판 수의 현저한 감소 또는 다양한 형태의 조혈기능 장애로 야기된 조혈기능의 감소로 인한 심한 출혈로부터 실제로 고통받고 있거나 높은 위험에 직면한 환자를 치료하기 위한 효능 높은 방법이다. 그러나, 의학 업무의 관점에서 볼 때, 현재워 상황은 혈소판 제제가 충분한 양으로 즉시 입수가능하지가 않다. 더욱이, 혈소판 혈시 환자가 ATL(성인 T세포 백혈병) 또는 AIDS(후천성 면역 결핍증)과 같은 병원성 바이러스에 감염될 위험율은 현저하게 높다.

백혈병 또는 악성 종양의 화학치료 또는 방사능치료 과정시 심한 출혈로 고통받고 있거나 높은 위험에 직면한 환자, 또는 재생불량성빈혈로 고통받고 있는 환자에 있어서 혈소판 형성을 증진시키는 방법을 발견하기 위해 시도된 연구 결과로서, 본 발명자는 화학치료 과정시 활성성분으로서 특정한 사람 단핵세포-대식세포 콜로니 자극인자(CSF)를 함유한 제제를 투여하면 정상 혈소판 수준으로 신속히 회복됨을 밝혀내고 이를 근거로 하여 본 발명을 완성시켰다.

본 발명에 따른 치료제의 필수 활성성분으로서 사용될 당단백질인 콜로니 자극 인자(“CSF”로 후술됨)는 유럽 특허원 제276,551호(본 특허원의 양수인중 하나에 의해 출원됨)에 기술되어 있다. 이 인자는 포유동물 단핵세포-대식세포 계열의 세포에 대하여 콜로니 자극 활성을 가지며, 하기 방법으로 생성될 수 있다.

건강한 사람 기원의 뇨를 pH8.0 내지 9.0으로 조절시켜, 점성 물질을 침전시킨 다용 이를 제거한다.

상등액을 농축시키고 10,000 내지 50,000달톤의 분자량을 갖는 물질의 통과를 허용하는 한외여과막을 사용하여 탈염시킨다.

적어도 200배 농축[단백질 농도면에 있어서는 적어도 1%(W/V)]시킨 후, 농축액을 pH 6.5 내지 7.5로 조절시키고 바이러스등을 불활성화하기 위하여 60℃에서 10시간 열-처리시킨다. 생성된 침전물질을 원심분리시켜 제거한 다음, 활성성분을 음이온 교환기, 예를 들면 DEAE-셀룰로오즈상에 흡착되도록 한다.

상기 이온 교환기를 0.05 내지 0.1M 완충액(pH 6.5 내지 7.5)으로 세척한 다음, 활성성분을 0.2 내지 0.4M 완충액(pH 6.5 내지 7.5)으로 용출시틴다. 필요할 경우, 용출액을 한외여과막으로 농축시킨다. 용출액을 세파크릴 ,(Sephacryl) S-300(Pharmacia 제조원)과 같은 겔 여과 매질을 사용하여 겔여과시키고, 1 내지 4M 농도의, 황산 암모늄 또는 염화나트룸과 같은 염을 함유한 완충액(pH 6.5 내지 7.5)으로 평형이 되게 하며, 70,000 내지 150,000달톤의 분자량을 갖는 분획을 회수한다. 그 다음, 상기 분획을 CSF에 대해 친화성을 갖는 소수성 물질, 예를 들면 페니-세파로오즈,(Pharmacia)상에 흡착시키기 위해 처리시킨다. 0.5 내지 1.0M 농도의 염을 함유한 완충액(pH 6.5 내지 7.5)으로 용출을 수행한다. 용출액을 한외여과막으로 농축시키고, TSKG-3000SW(Tosoh Corporation 제조원)과 같은 고-속 액체 걸 여과 컬럼을 사용하여 겔 여과시키기며, 70,000 내지 150,000달톤의 분자량을 갖는 분획을 회수한다. 상기 분획을 재농축시키고 하이-포어,(Hi-Pore,) 게-304(Bio-Red)과 같은 역-상 고-성능 액체 크로마그래피 컬럼상에서 흡착시켜 처리하며, 0.1% 트리플루오로아세트 산(TFA)용액(pH 1 내지 2)으로 평형이 되게 한다. 선형 농도 구배 용출 기술에 의해 0.1% TFA를 함유한 아세토니트릴 또는 이소프로필 알코올과 같은 용매로 용출을 수행한다. 이로써 수득된 CSF은 특히 활성이 1×10⁸단위/단백질 ㎎이상인 순수한 물질이다.

본 발명에 따른 CSF는 또한 M-CSF-생성 세포주 또는 재조합 DNA 기술에 의해 M-CSF 유전자를 암호화하는 DNA가 삽입되어 있는 M-CSF-생성 세포의 배양 배지로부터 분리시킴으로써 생성될 수 있다.

이로써 생성된 본 발명에 따른 CSF는 CSF와 특이적 항체와의 반응을 이용하여 정제시킬 수 있다.

이러한 생성 방법은 3가지 단계로 이루어지며, 하기에 한 단계씩 기술하였다.

[1]콜로니 자극 당단백질에 대한 특이적 항체(“항-CSF 항체”로 후술됨)의 제조

상기-기술된 제1의 생성 방법 또는 그의 변형에 의해 수득된 바와 같은 본 발명에 따른 CSF를 사용하여 포유동물, 예를 들면 토끼, 염소, 양 또는 말을 면역시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 CSF를 0.1 내지 1.0㎎/㎖ 농도의 생리 염수증에 용해시키고, 이 용액을 동용적의 완전한 프로인드 형(Freund's) 보조제와 혼합시키며, 혼합물을 표유동물에게 4 내지 8주동안 주 1회 내지 2회 피하 투여한다. 이로써 면역화시킨 동물이 증가된 혈액 항체 역가를 나타낼 경우, 부우스터(booster) 용량을 상기 동물에게 정맥내 또는 피하주사하고, 주사한지 3 내지 7일 후에 혈액을 수집하며, CSF에 대한 항혈청을 분리시킨다.

이로써 수득된 CS에 대한 항혈청의 항체 역가는 CSF 생물학적 효능을 중화시키는 후술할 시험으로 측정한다. 항-CSF 항체 각각의 ㎖가 CSF의 생물학적 효능의 5×10⁶단위 이상을 중화시킬 수 있을 정도로 항-CSF 항체 역가를 가지는 항혈청을 선택함이 바람직하다. 수집된 항혈청을 황산암모늄에 이어서 DEAE-셀룰로오즈 크로마토그래피 등으로 염석시키는 것을 2회 반복함으로써 정제하여 면역글로블린 G 또는 M 분획으로서의 항-CSF 항체를 수득한다. 필요할 경우, 항-CSF 항체를 라간드로서 CSF를 함유한 항원 컬럼에 적용시키거나 불순 단백질을 리간드로서 항-CSF 항체와 교차-반응시킴으로써 항-CSF 항체가 단독으로 상기 컬럼상에 흡수되게 하거나 불순 단백질이 적절한 컬럼상에 흡착되게 함으로써 상기 항체를 추가로 정제시킨다.

[2] 항체-결합 담체의 제조

항체 단백질의 NH₂- 또는 COOH-그룹과 화학적 결합을 형성할 수 있는 공지된 어떠한 불용성 담체라도 항-CSF 항체를 결합시키기 위한 불용성 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 시아노겐 브로마이드-활성화 또는 예폭시화 다당류 겔, 포르말화 다당류 겔, 및 아미노에틸화 또는 하이드라지화 중합체를 언급할 수 있다. 불용성 담체와 항-CSF 항체 사이의 결합 반응을 수행함에 있어서, 최적 반응조건은 선택된 불용성 담체의 결합 그룹에 따라 결정될 수 있기 때문에, 항체 용액을 상기 반응에 대해 동일한 최적 반응이 되도록 조절하여야만 한다. 예를 들어, 항체가 시아노겐 브로마이드 담체인 경우에는 pH 8 내지 10의 탄산염 완충액 중에, 에폭시화된 담체인 경우에는 적어도 pH 10 이상인 용액중에, 및 포르밀화된 담체인 경우에는 중성 용액중에 용해시켜야 한다. 상기 결합반응에 사용될 온도 조건은 또한 불용성 담쳉에 따라 가변적일 수 있다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 수행을 위한 결합 반응은 25℃를 초과하지 않는 저온에서 수행함이 바람직하다. 특히, 시아노겐 브로마이드-활성화 담체인 경우에, 반응은 4℃이하에서 수행해야만 한다. 결합된 항체의 양은 불용성 담체 g(습윤 중량)당 일반적으로 10 내지 50㎎, 바람직하게는 20 내지 30㎎이고, 결합 반응을 수행하는데 있어서 항체의 농도는 1 내지 4%(W/V)로 조절한다. 결합 반응의 완결 후, 항체를 결합하지 않은 담체상에 잔여하는 반응성 그룹은 적절한 처리방법에 의해 불활성화시킴으로써, 목적하는 항체-결합 담체를 수득한다.

[3] 항체-결합 담체를 사용한 CSF 정제

항체-결합 담체를 0.5 내지 1.0M의 농도로 염화나트륨과 같은 염을 함유한 pH 6 내지 8의 완충액으로 세척한다. 이렇게 세척한 항체-결합 담체를 컬럼내에 증진시키거나 완충액중에 현탁시킨다. 전자는 컬럼 크로마토그래피에 사용하고 후자는 배취형 크로마토그래피에 사용한다. 본 발명에 따른 CSF를 함유하고 정제될 용액은 예를 들면, 사람의 뇨 응축을, CSF-생성 세포 배양 상등액 또는 CSF 유전자-함유 재조합 세포 배양 상동액이다. 이러한 용액은 pH 6 내지 8로 조절시킨 후 항체-결합 담체를 세척하는데 사용된 상술한 완충액과 동일한 완충액으로 평형시키거나 염화나트륨으로 0.5 내지 1.0M의 농도까지 보충한다. 이렇게 처리된 용액을 항체-결합 담체와 접촉시킨다. 이 접촉은 컬럼 크로마토 그래피 또는 배취형 크로마토그래피의 방법으로 수행한다. 컬럼 크로마토그래피의 경우에는, 용액을 실온을 나넘지 않는 온도, 바람직하게는 10℃ 이하에서, 5 내지 20㎖/㎠/시간의 유동 속도로 컬럼을 통과시켜, CSF를 항체-결합 담체 컬럼상에 흡착시킨다. CSF를 항체-결합 담체 g(습윤 중량)당 500 내지 2×10⁷단위의 양으로 흡착시킴이 바람직하다. 흡착 처리후, 상술한 완충액은 불순 물질을 세척하고 제거하기 위해 컬럼을 통과시킨다. 배취형 크로마토그래피인 경우에는, 상기 처리된 용액을 실온을 넘지않는 온도, 바람직하게는 10℃ 이하에서 항체-결합 담체와 혼합하고, 이 혼합물을 상기 온도에서 1 내지 10시간동안 교반시킨다. 그 후, 항체-결합 담체를 유리 여과지등에 통과시켜 여과함으로써 회수한다. 언급한 항체-결합 담체는 상술한 완충액으로 세척하여 불순 물질로부터 완전히 유리시킨다. 항체-결합담체에 특이적으로 결합된 CSF는 항원-항체 복합체에 대한 분해 용액, 예를 들면 pH 2 내지 3인 아세테이느 완충액, 3 내지 4M 티오시아네이트 용액 또는 0.1 내지 0.2M 2,4-디-니트로페놀 용액을 사용하여 항체-결합 담체로부터 용출시킨다. 컬럼 크로마토그래피인 경우에는, CSF를 컬럼을 통해 상기 용출액을 통과시켜 용출시킨다. 배취형 크로마토그래피인 경우에는, 항체-결합 담체를 용출액중에 현탁시키고 이 혼함불을 교반시킴으로써, CSF를 용출시킨다. 이렇게 수득된 CSF는 불순물을 전혀 함유하지 않으며 CSF의 순수한 형태이다.

상기 방법으로 생성된 본 발명에 따른 CSF는 후술하는 물리화학적 특성을 가진다. 이들 물리화학적 특성을 시험함에 있어, 참조실시예 1의 방법으로 정제된 CSF를 사용한다.

a) 분자량

라엠리(Laemmli)의 방법[참조 : Nature, Vol. 227, pages 680-685, 1970]에 의한 모든 환원제의 부재하에서 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정된 분자량은 70,000 내지 90,000달톤이다.

0.2M 머캅토-에탄올을 사용하여 환원시킴을 제외하고는 동일한 반응으로 수행된 분자량 측정은 CSF가 각기 35,000 내지 45,000달톤의 분자량을 갖는 생물학적 활성을 보유하지 않는 아단위로 해리되었음을 나타낸다(제1도).

제1도는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동에서 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 CSF의 전기영동 유형을 나타낸다. 제1도에서, A 내지 E는 각기 환원되지 않은 형태(이량체)를 나타내고, F 및 G는 각기 분자량 표지 단백질을 나타내며, H 내지 L은 각기 환원된 형태(아단위)를 나타낸다. 수직선상의 숫자는 분자량(×10³달톤)을 나타낸다.

b) 아단위 단백질의 아미노산 서열

정제된 CSF를 중기-상 아미노산 서열기를 사용하는 통상적 방법으로 NH₂-말단 아미노산 서열에 대해 분석한다. 정제된 CSF를 이어서 6M 구아니딘으로 변성시키고 모노요도도 아세트산으로 알킬화하여 탈염한 후, 트립신으로 분해하여 시아노겐 브로마이드로 분해시킨다. 트립신-분해-시아노겐 브로마이드-분해 산물)펩티드 혼합물)을 Vydae C-18을 사용하여 역-상 고-성능 액체 크로마토그래피로 분별한다. 분리된 펩티드 분획을 각각의 펩티드 단편의 아미노산 서열을 결정하기 위해 중기-상 아미노산 서열기로 각기 분석한다. 각각의 트립신 분해-시아노겐 브로마이드 분해 산물 펩티드 단편의 아미노산 서열 및 본 발명에 의해 클론화된 mRNA의 염기 서열에 기초하여, 아단위 단백질의 일자 아미노산 구조를 결정한다. 서열화의 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.

NH₂-말단 아미노산(글루탐산)에서 149번째 아미노산(글루탐 산)사이의 서열은, 공지된 CSF이지만 150번째 아미노산에서 214 내지 238번째 아미노산 사이의 서열(65 내지 89개의 아미노산)이 공지된 CSF의 서열과느는 상당히 상이한 CSF-1의 서열과 동일하다.

COO-말단 아미노산으로서, 아단위 단백질의 분자량에 따라서 프롤린이 214번째 아미노산으로, 리신이 238번째 아미노산으로 검측되었다. 122번째 및 140번째 아미노산(아스파라간)은 각각 일반식 Asn-X-Ser/Thr(X는 임의의 아미노산이다)의 전형적인 N-글리코시드 결합 구조를 가지며, 이들 부위는 당쇄 결합부위인 것으로 추측된다.

c) 등전점

폴리아크릴아미드 겔 등전 포커싱(focusing) 및 슈크로오즈 밀도 구배 등전 포커싱 기술로 측정된 등전점(pI)은 약 3.1 내지 3.7이다.

d) 당쇄-구성 단당류

폴리펩티드에 결합된 당쇄내에 함유된 구성 성분 단당류는 고-성능 액체 크로마토그래피하에 분석하고 이어서 가수분해하여 유리시킨다. 알도스 및 시알산은 음이온 교환 컬럼상에, 헥소사민은 양이온 교환 컬럼상에서 분획화 한 후, 붕산염 완충액 농도 구배 용출 기술에 의해 용출시킨다. 이어서 구성성분을 시아노아세트아미드 또는 아르기닌으로 후(post)-컬럼 표지화하고 형광법으로 동정한다. CSF 분자내에 함유된 당쇄는 가변적이므로, 구성성분인 단당류로서 만노스, 갈락토오즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸뉴라민산이 동정된다 할지라도 이를 정량하기는 어렵다.

e) 순환 이색성(CD) 스펙트럼

내부 자외선 영역내에서의 CD 스펙트럼은 순환 이색성 분산계(JASCO, 모델 J-600)를 사용하여 측정한다(제2도).

제2도는 본 발명에 따른 CSF의 CD 스펙트럼을 나타낸다. 파장(nm)은 수평 축상에, 타원율(mdeg)은 수직축상에 나타났다. 최소 피크는 파장 208nm 및 222nm에서 관찰되었다. 그러므로, CSF의 2차 구조가 1-나선 구조를 함유하고 있음을 측정할 수 있다.

f) 열 안정성

CSF를 회 완충액(pH 7.0)중에 용해시켜 1g/㎖ 농도가 되게 하고, 용액을 60±0.5℃에서 60분간 가열시킨 후에 콜로니 자극 활성(본 명세서 후반에서 언급됨)에 관해 분석한다. 활성은 거의 감소되지 않았음이 관찰되었다.

g) 적외선 흡수 스펙트럼

푸우리에-변환(Fourier-transform) 적외선 분광 광도계(니콜렛 모델 5DXC)를 사용하여 투광법(KBr 창)에 의해 기록된 바와 같이 동결건조된 분말 형태인 CSF의 적외선 흡수 스펙트럼은 제3도에 나타낸 바와 같으며, 여기에서, 파수(㎝)는 수평선에, 투광도는 수직선상에 나타내었다.

CSF는 1650㎝, 1201㎝및 1133㎝에서 강하게 흡수되었고, 1537㎝, 1432㎝및 1068㎝에서 중간 정도로 흡수되는 것으로 나타났다.

상기 물리화학적 특성을 가지며, 포유동믈 단핵세포-대식세포 계열의 세포에 대하여 콜로니 자극 활성을 지닌 당단백질을 상술한 생성법 또는 본 원에 기술된 다른 방법에 의하여 사람의 뇨로부터 생성되며, 무균 조건하 바이알내에서 동결건조되고, 거기에서 분말 형태로 밀봉한다. 동결 건조되고, 거기에서 분말 형태로 밀봉한다. 동결 건조시키기 전에 사람 혈청 알부민(CSF 안정화제로서) 및 아미노산 또는 당(용해 보조제로서)을 함유하는 수용액을 CSF에 가할 수 있으며 혼합물을 여과로써 멸균시킨 후 무균 조건하에서 동결건조시킨다.

본 발명에 따른 CSF의 콜로니 자극 활성을 단일 충연질 아가 겔상에서 마우스 골수 세포의 콜로니 형성을 포함하는 방법을 사용하여 측정한다. 따라서, CSF 샘플을 0.3% 아가, 20% 태 송아지 혈청(FCS) 및 1×10마우스 골수 세포를 함유하는 1㎖의 McCoy's 5A 배지(GIPCO)와 혼합한다. 7.5% CO-함유 공기 스트림하 37℃에서 7일간 배양한다. 이어서, 50개 이상의 세포로 이루어진 세포 응집물을 콜로니로 결정하고 이를 계수한다. 콜로니 자극 활성은 단위로 나타낸다. 1단위는 하나의 콜로니를 형성하는데 요구되는 CSF의 양으로 정의한다. 특이 활성도는 CSF 단백질 1㎎당 형성된 콜로니(단위)의 수로 나타낸다. 이 결과, 본 발명에 따른 CSF는 단백질 1㎎당 1.4×10단위의 특이 활성도를 갖는 것으로 밝혀졌따. 형성된 콜로니의 형태학적 분류를 위해 헤마토크실린-에오신으로 염색한다. 형성된 콜로니의 95% 이상은 단핵세포-대식세포 콜로니인 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 제제는 예를 들어 CSF 농도가 10 내지 100㎎/㎖인 생리식염수 또는 주사용 증류수중의 용액 형태로, 정맥내, 근육내 또는 피하주사 또는 정맥내 적하(dirp)하여 투여된다. 알부민, 아미노산(예 : 글리신), 당(예 : 글루코오즈, 슈크로오즈), 당 알코올(예 : 만니롤), 무기염(예 : 염화나트륨)고 같은 첨가제를 CSF 조성물에 가할 수 있다.

용량은 일반적으로 1일 1회 내지 수회 투여시 체중 1㎏ 당 1,000 내지 150,000단위의 양이지만 증후에 따라 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.

화학 치료 또는 방사능치료후 조혈 기능장애가 개시될 것으로 예상되는 경우 상기 CSF를 투여하는 것이 권장된다. 혈액, 혈소판 수가 일정한 수중으로 복귀할 때까지 혈액 혈소판 수의 변화에 따라 수일간(2 내지 14일)에 걸쳐 1일 수회 투여할 수 있다.

투여 표적에는 조혈 기능 장애에 의해 유도된 모든 혈소판 감소증 환자가 포함되며, 특정한 제한은 없다.

본 발명에 따른 제를 임상 시험 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, 이러한 표적 환자에 투여하는 경우, 순환 혈액중에 혈소판 수준이 현저히 증가되었음이 관찰되었따. 투여에 기인하는 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 제제는 혈소판감소증에 대한 치료제로서 유용함을 제시한다.

하기 시험 실시예, 실시예 및 참조실시예는 각각 본 발명에 따른 제제의 독성 및 약리학적 효과 및 이의 전형적인 제조방법을 설명 또는 입증한다. 그러나, 이들 실시에는 결코 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 주의해야 한다.

시험 실시예 1(독성)

참조 실시예 10에서 제조된 당단백질의 CBL 마우스 숫컷내에서의 급성 독성은 리차드등의 방법[참조 : Richard et., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 90, page 99, 1949]으로 평가하였다.

수득된 결과는 표 2에 나타내었다.

실시예 1

악성 종양 환자를 화학적 치료(제1차 화학적 치료)후, 일정 기간 동안은 단순히 관측만을 하고(대조단계), 제2차 화학적 치료 후, 7일간 연속하여 활성성분으로서 참조실시예 1에서 제조된 제제를 함유하는 당단백질 제제 8×10단위를 정맥내 적하하여 투여한다(제제 투여단계). 혈과립구 및 혈소판을 간격을 두고 계수한다. 이들 매개 변수들의 변화를 표 3에 나타내었따. 대조 단계 및 제제 투여 단계서의 최소 혈소판 수 및 10/㎣ 이상의 수준으로 혈소판을 재수득하기에 필요한 시간(일)수를 표 4에 비교하여 나타내었다.

치료요법 : 1월 19일 CPA(사이클로포스파미드) 600㎎

ACR(아클라루비신) 60㎎

CDDP(시스플래티늄) 75㎎

2월 23일 CPA(사이클로포스파미드) 600㎎

ACR(아클라루비신) 60㎎

CDDP(시스플래티늄) 75㎎

2월 24일부터, CSF 제제(8×10⁶단위/일)을 7일 연속하여 일일 1회 투여한다.

주 : 기호, “_”은 “수를 측정하지 않음”을 의미한다.

실시예 2

10명의 악성 종양 환자를 제1차의 화학적 치료후, 일정기간동안 어떠한 치료도 없이 관측을 하고(대조 단계), 제2차 화학 치료 후, 7일 연속하여 활성성분으로서 참조실시예 1에서 제조된 CSF를 함유하는 당단백질 제제 8×10단위를 정맥내 적하하여 투여한다(제제 투여단계). 혈소판을 간격을 두고 계수한다. 대조 단계에서 및 제제 투여 단계에서의 최소 혈소판 수 및 10/㎣ 이상의 수준으로 혈소판을 재수득하기에 필요한 일수를 표 5에 비교하여 나타내었다.

⁸

() 처리되지 않은 사람 뇨는 CSF-억제 물질을 함유하므로, 정확한 활성도 검정은 불가능하다. 따라서 활성도 데이터는 DEAE-셀룰로오즈 처리 단계 및 연속 한 단계에 대하여만 나타내었다.

참조 실시예 2

참조 실시예 1에서 수득된 CSF로 면역시키고 충분히 증가된 항체 역가를 나타내는 10마리의 랫트로부터, 항-CSF항혈청을 수거하고, 상술한 방법(1)으로 처리하여 정제된 항-CSF 항체 약 4g을 수득한다. 항-CSF 항체를 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)에 대하여 투석시키고 농축물을 20㎎/㎖로 조절한다.

항체 용액(200㎖)을 우선 증류수 및 0.1M 인산염 완충액으로 세척한 포르밀-셀로핀 100g에 가하고, 이 혼합물을 2시간 동안 실온(약 25℃)에서 교반시키며, 나트륨 시아노 보로하이드라이드 700㎎을 가하고, 혼합물을 추가의 16시간 동안 교반한다. 포르밀-셀로핀에 대한 항-CSF 항체의 결합으로부터 생성된 항체-결합 담체를 제조한다. 결합생성물을 0.2M 트리스-염산염 완충액(pH 2.0)으로 세척하고, 이어서 나트륨 시아노보로하이드라이드 500㎎을 함유하는 트리스 완충액 200㎖을 추가로 가하여 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반시켜 반용되지 않은 그룹을 불활성화시킨다. 이어서 항체-결합된 담체를 0.5M 염화타느륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.0)으로 완전히 세척한다. 항체-결합된 담체의 각 g은 여기에 결합된 항-CSF 항체 29.5㎎을 함유한다. 독립적으로, 건강한 사람으로부터 수집한 뇨 1,000ℓ를 농축시키고 한외여과 농축기로 탈염시키며, DEAE-셀룰로오즈로 처리하여 활성 물질을 흡착시키고 비흡착 불순물을 제거시킨다. 용출은 0.3M 염화나트륨 용액으로 수행하고, 염화나트륨을 용출물에 가하여 0.5M로 농축시킴으로써 CSF-함유 용맥을 수득한다. CSF는 2×10단위/㎎의 특이 활성을 갖는다. 이 CSF-함유 용액(총 용적 500㎖)을 상술한 항체-결합 담체 100g에 가하고, 이 혼합물을 10℃ 또는 이 이하에서 배치형 크로마토그래피 처리하기 위하여 밤새(약 12시간) 교반시킨다. 그후, 항체-결합된 담체를 유리 여과기를 통해 여과시켜 회수하고 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.0)으로 완전히 세척한다. 세척 후, 0.2M 아세트산 완충액(pH 2.5) 500㎖을 가하고, CSF를 1시간 동안 10℃에서 혼합물을 교반시킴으로써 용출시킨다. 용출물을 pH 7.0으로 조절하고, 이어서 농축시키며, 한외여과막으로 탈염시켜 정제된 형태의 CSF 약 10㎎을 수득한다. 정제된 CSF는 5.2×10단위/㎎의 특이 활성을 지니며 SDS-PAGE방법으로 측정한 바와 같이 90% 이상의 순도를 갖는다.

본 발명을 이의 특정한 양태에 대한 참조와 함께 상세히 기술하였으나, 해당 분야의 전문가라면 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있음이 명백할 것이다.

Claims

활성성분으로서 사람 단핵세포-대식세포 콜로니자극 인자를 포함함을 특징으로 하는, 조혈기능 장애-유발된 혈소판감소증의 치료 및/또는 예방을 위해 투여될 혈소판감소증 치료제.
제1항에 있어서, 사람 단핵세포-대식세포 콜로니 자극인자가 두 개의 동일한 아단위로 이루어지며, 각각의 아단위는 214 내지 238개의 아미노산 잔기, 및 아스파라간 (Asn)-X-트레오닌(Thr)/세린(Ser)(여기서, X는 임의로 선택된 아미노산 잔기이다)으로 나타낼 수 있는 전형적인 N-글리코시드 결합부위를 각각 갖는 122번째 및 140본째 아미노산(아스파라긴 : Asn)을 함유함을 특징으로하는, 하기의 아미노산 서열을 갖는 치료제.

1
제1항 있어서, 사람 단핵세포-대식세포 콜로니자극인자가 하기의 물리화학 특성 a) 내지 f)를 갖는 치료제 :

a) 분자량

언급된 인자는 두 개의 동일한 아단위로 구성된 단독 이량체이고, 환원제로 해리시켜 수득되며 생물학적 활성을 상실하는 아단위의 분자량은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 측정시 35,000 내지 45,000달톤이다.

b) 등전점

폴리아크릴아미드 겔 등전 포커싱 및 슈크로오즈 밀도 구배 동전 포커싱 기술로 측정시 등전점(pI)은 3.1 내지 3.7이다.

c) 당 쇄-구성 단당류

고성능 액체 크로마토그래피에 이은 가수분해에 의해 동정된 당 쇄-구성 단당류는 만노스, 갈락토오즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 및 N-아세틸-뉴라민산이다.

d) 순환 이색성 스펙트럼

순환 이색성 분산계로 기록된 내부 자외선 CD 스펙트럼은 파장 208 및 222nm에서 최소 피크를 가지며, 이는 1-나선 구조가 함유되어 있음을 가리킨다.

e) 열안정성

60±0.5℃에서 60분동안 가열시킬때조차도 생물학적 활성이 상실되지는 않는다.

f) 적외선 흡수 스펙트럼

푸우리에 변환 적외선 분광광도계(니콜렛 모델 5DXC)를 사용하는 투광법(KBr 창)에 의한 동결건조된 분말의 형태에 대해 기록한 것으로서의 적외선 흡수 스펙트럼은 제3도에 도시된 바와 같다.