JPS6169797A - 蛋白質物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 る蛋白質物質、かかる蛋白質物質の分離および精製、お
よび腫瘍の処置におけるかかる蛋白質物質の使用に関す
る。

細胞毒素活性を有することが示された、単球、マクロフ
ァージおよびマクロファージ様細胞系の上澄中に存在す
る物質の存在について多くの報告がなされている。エン
ドトキシンの投与によって活性化されたラット腹腔細胞
は培地中で細胞に対し細胞毒素性の物質を放出すること
を示し、この物質はアルギナーゼとして同定された（ジ
ー・エム・カリ−の論文、ネイチャー第２７人巻、１９
７８年第７５８頁〜第７５９頁参照）。上澄中に見出さ
れた他の明らかに関連のない細胞毒素物質は中性プロテ
アーゼ（ディー・オー・アダニス等の論文、Ｊ，　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．第１２４巻１９８０年第２９３頁）および
ベルオキシド（シー・エフ・ナサン等の論文　Ｊ，Ｅｘ
ｐ。

Ｍｅｄ，第１４９巻１９７９年第１００頁）を含む。

しかしながらこれらの物質について生体内での抗腫瘍活
性は確立されていなかった。

バチルス・カルメツテ・クエ’Ｊ　７　（　ｂａｃｉｌ
ｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｃｕｅｒｉｎ　）　（　ＢＣ
Ｇ　）で感染し、次いでエンドトキシンで処理したマウ
スの血清は、腫瘍壊死および細胞毒素活性を有すること
が見出された（イー・ニー・カスウェル等の論文、Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，　ＵＳＡ　、第７２巻１９
７５年第３６６６頁〜第３６７０頁参照）。この血清は
腫瘍壊死血清と称される。これらの活性は論文発表者に
よって「＠瘍壊死ファクターＪ　（　ＴＮＦ　）に寄与
した。マウス血清からのＴＮＦの部分精製および予備特
性化はニス・グリーン等によって行なわれた（　Ｐｒｏ
ｃ，　Ｎａｔ．Ａｏａｄ．Ｓｏｉ，　ＵＳＡ　、第７３
巻１９７６年第３８１頁〜第３８５頁）、これによって
ＴＮＦは糖蛋白質含有シアル酸およびガラクト−スアミ
ンであることが示された。この糖蛋白質は約１５０００
０の分子量（ＭＷ）を有し、セルロースアセテートｚ気
泳動でαーグロプリンの電気泳動移動度を有する。

エフ・シー・クルーシュニアおよびピー・クアトレカサ
スはゲル濾過によってＦｌ瘍壊死血清を分別した（　Ｉ
工ｍｍｕｎｏｌ、第１２６巻１９８１年、第１２７９頁
〜第１２８３頁参照）。彼等は血清か多重形態を含有す
ること、列えば２２５０００〜１ｏｏｏｏｏのＭＹを有
する高ＭＹ画分および５００００のＭＹを有する低ＭＹ
画分を含有することを見出した。彼等は１６００００の
ＭＹを有する両分がマウスにおける皮内”ｆＲ＋％着床
の盾瘍壊死を誘起したこと、一方２２５０００〜５００
００分子ＩｔＩ！Ｓｉｉ分は＃瘍壊死を誘起しなかった
ことを見出した。

本発明者等は看白實物質がｔＷ在細胞毒素活性および生
体内腫瘍壊死活性を有する刺戟マウスマクロファージ様
細胞の上ばから蛋白質物質をここに分離した。この蛋白
質物質は全体的構造特長およびリンホトキシンに類似し
た生活性を有するが、その独特な構造か他の細胞毒素お
よび１瘍壊死性分子よりもすぐれた明確な治療利点を提
供しうる。

本発明は非スルフヒドリル結合自己集合しつる蛋白質サ
ブユニットの自己集合からなる蛋白質物質を提供する、
この蛋白質サブユニットは約１５０ｏ　ｏドルトンの分
子量詔よび４．６±０，３の等電点を有する。蛋白質物
質は、蛋白質サブユニットの自己集合またはマルチマー
に加えて、池の物質例えば結合性蛋白質および／または
補欠分子族を含有していてもよい。

潜在細胞毒素活性および生体内壊死活性を有する本発明
による蛋白質物質は、リポポリサッカライド°で刺戟さ
れたｆｆ　７７４．１細胞（ザ・アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＯ（１）　、メリーラ
ンＦ州ロックビルから公に入手しつるマウスマクロファ
ージ様細胞系）の血清不含、細胞不合上澄から分離でき
る。

猜製上筐は次のルートで作ることができる。

、７７７４．１細胞をインビトロで培養するとよい。

あるいは、７７７４．１細胞を宿主マウス中に腹腔内注
射し、適当な時間後、マウスから腹水細胞をとってもよ
い。インビトロまたはインビボの何れかで作った細胞は
次いで異質蛋白質を含まぬよう処理し、異質蛋白質を避
ける媒体中に懸濁し、リポポリサッカライド例えばニス
・チフィムリウム（Ｓ、ｔ７ｐｈｉｍｕｒｉｕａ＋　）
からのりボポリサツカライドで処理して培養する。次い
で粗製上澄をとる。粗製上澄は′情調処理、例えばイオ
ン交換と非変性電気泳動法の組合せで処理して少なくと
も部分的に精製された形での蛋白質材料を与える。

好ましい実施態様によれば、粗製上澄は超ｒ過によって
濃縮し、次いでアニオン交換樹脂と接触させる。次に吸
着された蛋白質物質をイオン交換樹脂から溶離し、非変
性分取電気泳動処理する。回収した部分精製した物質は
更にアニオン交換樹脂に付する。・ このＩｎ　Ｗ法から得られた物質（以後ホロトキシンと
称する）は、典型的には２０％以上の純度を有する、こ
れは約７００００〜５５０００ドルトンの見掛は分子量
を荷する球状蛋白質として対称ピークでゲル濾過したと
き移行し、上置蛋白質の大部分に対して陽性であるＲｆ
Ｏ，７を有する７、５％非斐性ポリアクリルアミドゲル
で移行する。更にドデシル硫酸ナトリウム（５Ｄ３）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動したときホロトキシン
は１５０００ドルトンの見掛は分子量で移行する。この
生成物の溶離は１５０００の分子量および４，６±０．
３のｐ工を有する蛋白質を生ずる。この蛋白質サブユニ
ットの見掛けの大きさはジサルファイド還元剤で完全還
元したとき１７０００１−’ルトンに増大する、これは
一つ以上の分子内ジサルファイド結合の存在を教示して
いる。

従って実質的にＳ粋な形、例えは９５％以上の細胞毒素
材料を得る方法を更に提供し、この方法は、少なくとも
部分的にＩＷ製した形（ホロトキシン）で本発明による
蛋白質物質をＳＤＳ　−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に付し、ゲル中で１５０００分子ｒ１１帯で移行する
材料を回収し、次いで回収した１５０００分子量材料を
一つ以上の自己集合を形成させることからなる。

集合は精製した１５０００ＭＷ材料の溶液を濃縮するこ
とによって進めることかできる。

この方法によって、Ｌ−Ｍ細胞上で測定したとき３２０
００単位／μノの最終値にまで８０００倍も大になった
比活性を有する生成物を得ることができる。この材料は
１〜１０００ヒコモルの範囲で他の培養した盾瘍細胞お
よび正常細胞に対して細胞毒素性である。

この自己集合１５０００ＭＷ材料のゲルｒ過時に、活性
は二つの位置、即ち７００００および５５０００ドルト
ンの分子量に相当する位置で対称的にそして鋭く極大を
示した。史に　　１放射性ラベル付は法を用いて４５０
００ドルトン種として移行する非常に少量の蛋白質を本
発明者等は検出した。例えば活性な形は、二量体、四斌
体そして可能ならば単量体の形の三量体であると認めら
れる。集合はスルフヒドリル結合はなかった。１５００
ＱＭＷ材料は均質である、何故ならそれは更に二次元電
気泳動によって分割できなかったからである。従ってこ
の１５０００分子量蛋白質は本発明の、ｉｌｌの目的を
形成する。

材料の集合が細胞毒素活性のために必要なことは、サブ
ユニット自体か細胞毒素活性でなし）ことから判った。

１５０００＋ｊルトンサブユツトの自己集合物はインビ
ボで１瘍壊死活性を潜在的に有していた。皮内繊碓肉暉
担持マウス１こ静脈内で注射した２ピコモルの集合物は
［４内で急速出血性壊死を誘起した。本発明者等は、非
集合１５０００ＭＷ蛋白質が生態系中に導入された後凝
集を受けることがあることから、これが壊死活性を有す
るのか知らない。

リポポリサッカライド（インターリュキンス、リンホキ
ンスおよびチトキンスのアカデミ−・プレ２１９８３年
第５１１頁〜第５２０頁）で刺戟したＲＡＷ　２６４．
７　（ＡＴＯＯより入手できる）と命名されたマウスマ
クロファージ様細胞糸からの上澄および腫瘍壊死血清（
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、第２６巻１９８１年第１２７９頁
〜第１２８３頁）はｔ気泳動および／またはゲルｅ過法
で多くの細胞毒素を含有することか明らかである。本発
明者等はこれらをＪ７７４．１上澄から分離したホロト
キシンと比較した。

本発明者等は次の方法でＪ７７４．１上ダから分離した
７００００ドルトンホロトキシンに対する抗血清を作っ
た。雌のブラウン−ノルウェー・ラットに、５０％Ｖ／
マのフロイントの完全アジュバント中に乳化した２０μ
？ホロトキシン０．２６ｄ／サイトで小生に筋肉内注射
した。

どれらには続いてフロイントの不完全アジュバント中に
乳化した１０〜２０μｍのホロトキシンを用い１力月間
隔で皮下肩甲下に注射した。第３回免疫後１０日でラッ
トから抗血清を得た。

抗血清は、濃縮依存法でホロトキシンの細胞毒素活性を
免疫沈澱させた。抗血清はまた同じ方法で刺戟したＲＡ
Ｗ　２６４．７細胞の上置からおよび腫瘍壊死血清から
活性を免疫沈澱させた。高度＋ト精製されたトキシンに
対するラビット中で上昇した抗血清は、次の別の特性を
有していた：１μｔがマウスマクロファージ様細ＩＩｌ
！ｌ系から細胞毒素活性１０００単位を完全に免疫沈澱
させた、そしてバイオアッセイでそれは４０００ｍ胞毒
素単位を完全に中和した。前免疫血清は効果を有しなか
ったけれども抗血清は腫瘍壊死血清のインビボ壊死活性
を否定した。従って試ゆした細胞毒素物質は全て免疫化
学的に関連していた。

価瘍壊死血清および刺戟したＲＡＷ　２５４７御胞の上
澄からの細胞毒素物質をそれぞれＳＤＳ−ポリアクリル
アミド°ゲル電気泳動処理したとき、１５０００ＭＷ帯
で全て回復活性が検出された。

まとめると試験した全細胞毒素物質は、１５０００ドル
トンの分子＠および４．６±０．３のｐ工を耳する蛋白
質サブユニットを含有していた。

本発明の蛋白質物質は、リンホトキシン、リンパ球から
誘導されたグリコジル化蛋白質について報告された性質
に類似した幾つかの性質を有する。ジーΦニー・グラン
ガー等は、バイオロジー・オブ・ザーリンホキンス１９
７９年（アカデミツク・プレス・インコーホレイテッド
）第１４１頁〜第１６３頁に、ヒドリンホトキシンのサ
イズ不均實性を発表し、多くのサブタイプを二つの大き
な群、即ちポリアクリルアミドゲル電気泳？ｌＪ移行か
γ−グロブリンに類似したものおよび移行がアルブミン
に類似したものとに類別した。ビー・ビー・アガーワル
等は、ジャーナル侭オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー第５９巻第６８６頁〜第６９４頁１９８４年に、ヒド
リンホトキシンはより小さい単位の集合からなっている
ことを発表している。それはケルｆ”ａ　テ見ｍ　ｉｔ
ＭＷ６７０００　テｌＪ行り、、ＳＤＳゲル電気泳動し
たとき２００００の見掛けＭＷで移行する。本発明者等
は抗リンホトキシン抗血清を用い本発明の蛋白質物質を
試験した。しかしなから抗血清は蛋白質物質を中和もし
くは免疫比奴しなかった、従って後者の物質およびリン
ホトキシンは免疫化学的に関係ないことを証明している
。更に本発明の蛋白質物質のアミノ酸組成かりンホトキ
シンについて発表された組成とは著しく異なる（前掲の
アガーワルの論文客照）。従って二つの物質は畿つかの
構造（オリゴマーの大きさ）および官能（細胞毒素）特
性を共有するが、それらの組成は全（異なる。

これらの独特の活性はそれらの相異を反映させているよ
うである。例えば二つの材料は細胞糸についての異なる
毒性スペクトルを有すると主張している（ビー・ディ・
ウィリアムソン等の論文、Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｏｉ、ＴＪＳＡ、第８０巻第５３９７頁〜第５４
０１頁、１９８３年）。

更にまた暉ｌ！壊死をもたらす腫瘍担持宿主を処理する
方法を提供する。この方法は宿主に本発明の蛋白質物・
ａの＠擾嬢死投与量を投与することからなる。またこの
処置の方法に使用するための組成物も提供する、この組
成物は医薬的に許容しうるキャリヤーまたは稀釈剤と共
に本発明の蛋白質物質を含有する。

実施例 Ｊ７７４．１細胞を培地中で生育させた。３Ｘ１０“の
洗浄細胞をＥＡＬＥ　／　Ｏマウスに腹腔内圧射した。

３４間後ζこ腹水細胞をとった。マウスは１〜２　Ｘ　
１０”腫瘍細胞／マウスを生じた。細胞は先ずＲＰＭ工
１６４０で洗い、次いで冷０．８７％ＮＨｔＯ１で抗い
、再びＲＰＭ工１６４０で洗った。それらは、Ｓ、ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＬＴ　−２から得たりボボリサツ
カライド１μ２／−とガラマイシン５０μｍ／−を含有
するＲＰＭ工１６４０中に１．２　Ｘ　１０９／ｌの濃
度で懸濁した。懸濁液を３７℃で７時間培養し、その後
上澄をとった。上澄は１ｔについて１〜２×１０細胞毒
素単細胞毒素−４０■の蛋白質を含有していた。上短の
１〜２ｔのロフトを００１％のナトリウムアジドおよび
５０μＩＡのフェニルメチルスルホニルフルオライドに
した。上澄を１５００？で遠心分離し、粒状材料を１余
去し、次いでよ度をＰＭ３０メンブレン（アミコンから
入手した３００００ＭＷポアサイズメンブレン）に対し
て超濾過で１００から２００倍にａ裔した。譲縮物を平
衡化バッファー（５０ｍＭ）リス−Ｈ０Ｉ　、ｐＨ８，
０、１５１μｔＭ　Ｎａ１ｌ　）に対して透析し、モノ
Ｑアニオン交換カラム（ファルマシアΦ１四級アミン基
含有視水性重合体）に洪した。ｌ重性１戊分を直線状１
５〜５００　ｍＭ　Ｎａ１ｌ勾配で溶離した。活性画分
を果め、再びカラムに付与した。次いでｉｏｏ〜３００
ｍＭ　Ｎａ１ｌ勾配でｆ８離を行った。活性画分を集め
、ＰＭ、１０メンブレン（アミコン社からの１００　Ｑ
　ＯＭｗホアサイズメンプレン）に対して超濾過で１−
に濃縮した。濃縮物をＨ，Ｏで１０倍に稀釈し、１×５
シリンダー状７．５％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ
および積重ゲルのないレンムリのゲル系、英国、ネイチ
ャー第２２７巻第６８０頁〜第６８５頁１９７０年参照
）を使用して１１００２Ｇ装置（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−）中で分取電気泳動に供した。電気泳動は
５ｍＡの一定電流で行なった。

溶雛速度は１．１ｆＬｔ／画分７９分であった。活性画
分を集め、平衡化バッファーで稀釈し、超Ｃ過で４縮し
、モノＱ　（Ｍｏｎｏ　Ｑ）アニオン交換カラムに供し
た。活性は線状１５〜５００　ｍＭＮａｉｌ勾配で溶離
し、活性画分を集めた。ホロトキシンの見掛けの大きさ
は以下に示す如くゲルｆ過によって側層した。１０μｔ
について得られたホロトキシン９００単位（１５０μ？
）をサイズ標準調剤（Ｂｉｏｒａｄ）　５μｔと混合し
た。混合物をＨＰＬＯ装置にュージャージー州、モーリ
スタウンのウォーターズ・アソシエート）にかけた、Ｔ
ｓｘ　２５０ゲルｆ過カラム（Ｂｉｏｒ＆ｄ）をとりつ
け、１５０ｍＭ　Ｍａｉｌ、２ＱｍＭ　ＮａＰｉ　（リ
ン酸ナトリウム）　、ｐＨ７，４で行なった。流速は１
ｍ／分であった、０．２ｄ画分を集め、毒性について評
価した。結果を第１図に示す。事実ホロトキシンのＡＩ
軸は検出するのに低すぎた。第１図における四つの大き
な極大値（実線）は標準：チログロブリン（分子ｆｉ６
６９０００ドルトン）；オボアルプミン（分子量４５０
００１′ルトン）；ミオグロブリン（分子１ｔ１８００
０ドルトン）；およびフェニルアラニン（分子量１６５
）を示す。オボアルブミンとミオグロブリンは梅状対故
分子敏対溶離容槽関係を与えた、これからホロトキシン
の分子量は約７００００ドルトンであると測定された。

ホロトキシンは次の如く更に精製した。前記アニオン交
換樹脂処理から得られた集めた画分を、３１６００スラ
ブゲル装置（ヘラファー・サイアンティフィック・イン
スッルメンツ）を用い、積重ゲルなしで、ラエムリの装
置（英国、ネイチャー第２２７巻第６８０頁〜第６８５
頁）を用いてＥｉＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に付した。例えばホロトキシン（１８０ｍｇ／１００
０単位）を、０．１％のＳＤＳ、１５％のポリアクリル
アミドおよび０．２５架橋剤を含有する１４０Ｘ０．７
５ｍ＋ｍスラブゲル中のレーンに供給した。ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果を第２図に示す。

左のレーンはホロトキシンであり、右の糎は多くの分子
量蛋白質標準（メリーランド州、ベセスダのペセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズより得た）を含有している。

煽準はＩＴｉＩ部から底部まで（大きな帯）であり、ホ
スホリラーゼＢ（ＭＷ９２５００）ｉウシ血清アルフミ
ン（ＭＷ６６２００）；オボアルブミン（ＭＷ４５００
０）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１０００）；大豆トリプシ
ン阻害剤（ＭＷ２１５００）ｉリゾチーム（ＭＷ１４４
００）である。同型ホロトキシンを切片に分けた（２．
２３ｗ／切片）。切片を１５０ｍＭ　　Ｎａ１ｌ、２．
、ＱｍＭＮａＰｉ、ｐＨ７，４および０．１％ウシ血清
の２００−中に浸漬して一夜溶離し、精製したサブユニ
ット蛋白質を東めた。溶離した単位（対数スケール）お
よびゲル切片の対応する位置を示す第２図のグラフは、
見掛けＭＷ１５０００で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動でホロトキシンが移行することを示してい
る。少撤が見掛けＭＷ４５０００で移行すル。大ｔｄ（
７）１５０００Ｍルトン蛋白質は、ホロトキシンか全ゲ
ルスラブを横切って層７ＪＪされたこと以外は同様に集
められた、１５０００ドルトン蛋白質を含有する区域は
、ＳＤＳなしで、ジチオスレイトール中での千輌浸漬な
しとした以外は、エム・ダブリュー・フン、カピラー等
のＭｅｔ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、第９１巻第２２７頁〜第
２３６頁、１９８３年に発表された方法によって電気体
動的に溶層した。この方法でμ？賦のｆ４製されたトキ
シンかｆ尋られた。銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの光度測定走査でｔＰ１曲したとき電気泳動溶離剤
中でトキシンは全蛋白質の９０％より良く構成した。

ゲルｅ過は上述したホロトキシンについて行なったのと
同じ方法で精製トキシンについて行なった。そして咄沢
は細胞毒素活性について測定した。活性はＭＷ７０００
０に相当する位置で鋭く対称的な唾大値に見出された。

第二ロットはＭＷ５５０００で溶離した。

段階ｒｉ　６Ａを下表Ｉに示す。

毒　　　　　性 細胞系について分離したホロトキシンの細胞毒素性のイ
ンビトロ研究をエフ・シー・クルおよびピー・クアトレ
カサスの方法（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｆｆｌ、　
Ｂｌｏｔｅｃｈ、第８巻第９７頁〜第１０３頁１９８３
年）により行なった。試験した細胞系は次のとおりであ
った：Ｌ−Ｍ系（ＡＴＣＣＣＣＬｌ、２）、マウス腫瘍
性繊維芽細胞ｉ　ＣＰＡＥ系（ＡＴＣＣＣＣＩ、　２０
９　）、ウシ動脈内皮細胞；Ｍａｒ。

（ＡＴＣＣＨＴＢ　２２　）、ヒト乳癌腫系５；および
ＨｅｐＧ。

（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５　）、ヒト肝癌腫系。

細胞系を、大体５０００〜７５００細胞／井戸／２００
μｌ媒地でマイクロタイタートレー中のそれらの通常の
生育培地に接種し、−夜培養した。ホロトキシンのｌｏ
ｇ３稀釈物を次の日に加えた。毒性が光学顕微鏡試験で
確認されるまで、細胞系を培養したまま置いた。次にト
レーをエフ・シー・タル・ジュニアおよびピー・クアト
レカサスのＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ第８巻第９７頁〜第１０３頁１９８３年に従っ
て中性赤でしるしをつけた。細胞系は中性赤をインター
ナリゼーシコンするそれらの能力において異なる。しか
しながら第３図に示した各細胞系についての曲線は生細
胞の数の相対指標を与えるっ試験した全細胞系が敏感で
あり、Ｌ−Ｍ細胞系が最も敏感であった。

インビボでの腫瘍壊死についての投与量応答ＢＡＬＢ／
ｃマウスで、メチルコランスレン誘起した移植しうる繊
維肉腫を用い皮肉移植を作った。１週間後、肺癌直径が
約５ｆｌとなったとき、マウスに発熱源を含まぬ食塩水
で透析または稀釈された試験ホロトキシンの一回０．５
　ｍ静脈注射（ｉ、ｖ、　）をした。対照動物には０．
５　ｒｎｔｒ液（透析溶液）を注射した。各動物を２４
時間後に＠瘍壊死について記録した。この場合壊死が見
られない（０）から腫瘍の全直径を被う壊死（＋４）ま
でのスケール範囲とした。

マウス数 上表のデータから、ホロキシンが皮肉移植の壊死を誘起
する能力を含んでいることが明らかである。腫瘍壊死能
力は投与量に依存する。

追加の試験では、４０００〜５ｏｏｏ単位が試験マウス
における実質的な腫瘍壊死を再現性良く誘起したことを
確めた。壊死は注射後２時間以内で目１こ見えて現われ
た（腫瘍の赤さ）。

本発明者等は有効であるが致死量以下の壊死投与量範囲
は４０００〜１２０００単位であることを見出した。

調剤を内毒素の存在について検査した、この物質はまた
この活性も有し、ＬＰＳが粗製原材料の成分であったか
らである。

トキシン４０００単位（５００ｎｇ蛋白質）が上述した
ことから知ることができるように実質的なｐｉ＝を与え
るが、壊死を生ぜしめるのに必要なＬＰＳ単独の量より
も、カブトガニアメーバ様細胞溶解質分析で測定したと
き１０００倍も少ない内毒素を含有していた。

［Ｊしたトキシンは壊死活性を含有していた。

ホロトキシンはＳＤＳ−分取電気泳動で分画した。

大きな帯が実施例で述べた如（電気泳動溶離によって切
り出され分離された。１５０００　ＭＷ帯から得られた
材料は発熱質不含食塩水で２０借怖釈して４０００単位
（１２５ｎｇ１０．５ｍ）とした。他の帯から得られた
材料も同様に稀釈した。全部を触死活性について試験し
た。壊死は、１５０００ＭＷ帯から得られた材料を注入
したマウス群でのみ観察された。

サブユニットの集合は、Ｌ−Ｍ細胞についての細胞毒素
活性に対して必要である。精製したトキシンについて分
子１１ｉｔ７００００と仮定すると（即ち再集合材料）
、Ｌ−Ｍ細胞上に一つの細胞毒素単位を生成するトキシ
ンの濃度は２ｘ１　（）−１２Ｍであった。皮肉腫瘍の
壊死を誘起するのに必要な精製トキシンの投与量は１．
ｖ９を与える１　２５　ｎｆ　（２ｎｍｏｌｓ）であっ
た。５００　ｎｙｉ、　ｖ、の−回投与量は＠瘍担持マ
ウスに対して致死量であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は両分と毒性の関係を示す図、第２図は溶離した
単位とゲル切片の相対位置を示す図、第３図は生細胞の
数の相対指標を示す。 −２分 ↓疎柔４立 単・イ、ｔ−／ノー’ＩＬ 手続補正書 昭打）０年７月７日 特許庁兼官　宇賀這部　殿、；Ｍｔ。 １、事件の表示郊イ、　１ｏ’Ｈ禰釘血才／り？り／３
２、　　柘旨月４３冬ず 豪自噴殉填 ３、補正をする者 バｆ４−との関係　　　村饗チ［、パ賞入４、代理人 し搾１（イ）で′ダリ喀１゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定し
   たとき約１５０００ドルトンの分子量および４．６±０
   ．３の等電点を有し、非スルフヒドリル結合自己集合し
   て抗腫瘍活性を有する自己集合を形成できる蛋白質材料
   。 ２、蛋白質サブユニットがＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   ゲル電気泳動によつて測定したとき約１５０００ドルト
   ンの分子量および４．６±０．３の等電点を有する非ス
   ルフヒドリル結合自己集合できる蛋白質サブユニットの
   自己集合を含む抗腫瘍活性を有し、実質的に純粋な形の
   蛋白質物質。 ３、蛋白質サブユニットの自己集合に加えて、一つ以上
   の結合性蛋白質および／または補欠分子団も含有する特
   許請求の範囲第２項記載の蛋白質物質。 ４、ゲルろ過で測定したとき約７００００ドルトンの分
   子量を有する特許請求の範囲第３項記載の蛋白質物質。 ５、ゲルろ過で測定したとき約４５０００〜５５０００
   の分子量を有する特許請求の範囲第３項記載の蛋白質物
   質。 ６、Ｒｆ０．７を有し、７．５％非変性ポリアクリルア
   ミドゲルで移行する特許請求の範囲第４項または第５項
   記載の蛋白質物質。 ７、約３．２×１０＾７単位／ｍｇのＬ−Ｍ細胞に対す
   る比細胞毒素活性を有する特許請求の範囲第２項記載の
   蛋白質物質。 ８、マウス起源のものである特許請求の範囲第２項記載
   の蛋白質物質。 ９、部分的に精製した形で蛋白質物をＳＤＳ−ポリアク
   リルアミドゲル電気泳動に付し、約１５０００ドルトン
   の分子量に相当するゲル中の帯から材料を回収し、次い
   で回収した材料を自己集合せしめることを特徴とする特
   許請求の範囲第２項記載の蛋白質物質の製造法。 １０、蛋白質物質の粗製溶液を超ろ過し、第一アニオン
   交換樹脂と接触させ、イオン交換樹脂から吸着した物質
   を溶離し、非変性分取電気泳動に付し、続いて回収した
   物質を第二アニオン交換樹脂と接触させ、吸着物質を溶
   離することによつて部分精製した形の蛋白質物質を得る
   特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、蛋白質物質の粗製溶液が体液、血清、血漿または
   ヒトの内部臓器の抽出物からなり、これに予め細網内皮
   組織系を刺戟することのできる物質を投与し、続いて内
   毒素を注射した特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、蛋白質物質の粗製溶液が、リポポリサッカライド
   で処理して培養したマクロファージ様細胞の組織培養か
   ら集めた血清不含上澄からなる特許請求の範囲第１０項
   記載の方法。 １３、組織培養がマウスマクロファージ様細胞の培養で
   ある特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、医薬的に許容しうるキャリヤーまたは稀釈剤と共
   に腫瘍壊死投与量で特許請求の範囲第２項〜第８項の何
   れか一つに記載の蛋白質物質からなることを特徴とする
   腫瘍のインビボ処置に使用するための医薬組成物。 １５、特許請求の範囲第２項〜第８項の何れか一つに記
   載の蛋白質物質の腫瘍壊死投与量を宿主に投与すること
   を特徴とする腫瘍壊死を生ぜしめるため腫瘍を有する宿
   主の処置方法。 １６、親物質の生活性を有するその構造から演えきされ
   る如き特許請求の範囲第１項〜第７項の何れか一つに記
   載の蛋白質物質の任意部分。