DE68907933T2

DE68907933T2 - Therapeutisches Mittel für Thrombocytopenia.

Info

Publication number: DE68907933T2
Application number: DE89102324T
Authority: DE
Inventors: Kazuo Motoyoshi; Fumimaro Takaku
Original assignee: Green Cross Corp Japan; Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1988-02-10
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1993-12-16
Anticipated expiration: 2009-02-11
Also published as: JPH01207244A; CA1332149C; ES2042818T3; KR970009890B1; EP0328132A3; KR890012664A; EP0328132B1; JPH0611705B2; DE68907933D1; US5114710A; EP0328132A2

Description

Die Erfindung betrifft ein therapeutisches Mittel für Thrombocytopenie aufgrund von Blutbildungsstörungen (hämatopoetischen Störungen), die durch verschiedene Ursachen induziert sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein therapeutisches Mittel für Thrombocytopenie, das einen menschlichen Monocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor, einen der menschlichen Blutbildungsfaktoren, als aktiven Bestandteil umfaßt.
Die Thrombocytentransfusion (Übertragung von Blutplättchen) ist ein wirkungsvolles Mittel zur Behandlung von Patienten, die entweder tatsächlich an schweren Blutungen aufgrund einer merklichen Verringerung der Thrombocytenzahl oder einer durch verschiedene Arten von Blutbildungsstörungen verursachten verringerten Blutbildungsfunktion leiden, oder bei denen ein hohes Risiko für derartige Blutungen besteht. Vom Standpunkt der medizinischen Praxis ist die gegenwärtige Situation jedoch nicht so, daß Blutplättchenzubereitungen unverzüglich in ausreichenden Mengen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus ist das Risiko für Patienten, mit pathogenen Viren wie ATL (T-Zellen-Leukämie bei Erwachsenen) oder AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom) bei der Übertragung der Blutplättchen infiziert zu werden, bemerkenswert hoch.
WO-A-8 604 587 beschreibt die Reinigung von CSF-1, der auf Monocyten-Vorläuferzellen wirkt, um deren Differenzierung zu fördern, und das reife Monocyten stimuliert, um die Bildung von CSFs, TNF und INFs zu fördern.
Biological Abstracts, Bd. 85, Nr. 6 (1988), Abstract Nr. 60968 beschreibt die Behandlung von myelodysplastischem Syndrom unter Verwendung von GM-CSF. Dieser CSF fördert die Proliferation sowohl der Granulocyten als auch der Monocyten. Sein Molekulargewicht liegt im Bereich von 18 000 bis 22 000.
Chemical Abstracts, Bd. 107 (1987), Abstract Nr. 114079r betrifft ebenfalls die Verwendung vom GM-CSF zur Behandlung nach Knochenmarktransplantationen.
Als Ergebnis von Untersuchungen, die durchgeführt wurden, um für Patienten, die an schweren Blutungen als Folge von chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Behandlungen von Leukämie oder bösartigen Tumoren leiden oder bei denen ein hohes Risiko für derartige Blutungen besteht, oder die an aplastischer Anämie leiden, ein Mittel zur Förderung der Blutplättchenbildung zu finden, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung festgestellt, daß die Verabreichung einer Zubereitung, die einen spezifischen menschlichen Monocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF) als aktiven Bestandteil enthält, im Verlauf der Chemotherapie zu einer raschen Wiederherstellung eines normalen Blutplättchenspielgels führen kann, und sie haben die Erfindung auf der Grundlage dieses Befundes fertiggestellt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

In der beigefügten Zeichnung zeigen
Fig. 1 ein elektrophoretisches Muster des erfindungsgemäßen CSF, das bei einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) erhalten wurde, und
Fig. 2 und Fig. 3 das Vakuum-UV-CD-Spektrum bzw. das Infrarotabsorptionsspektrum des erfindungsgemäßen CSF.
In Fig. 1 bedeuten
A bis E nicht-reduzierte Substanz (Dimer)
F und G Molekulargewichts-Markerproteine
H bis L reduzierte Substanz (Untereinheit)

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der Kolonie-stimulierende Faktor (nachstehend als "CSF" bezeichnet), bei dem es sich um ein Glycoprotein handelt und der als wesentlicher wirksamer Bestandteil des erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels verwendet werden soll, ist bereits in EP-A-276 551 (europäische Patentanmeldung, die von einem der Anmelder der vorliegenden Anmeldung eingereicht wurde) beschrieben. Er weist eine Kolonie-stimulierende Aktivität bei Säugetier-Monocyten- Makrophagen-Zellen auf und kann auf folgende Weise hergestellt werden.
Der Urin eines gesunden Menschen wird auf einen pH-Wert von 8,0 bis 9,0 eingestellt, wobei viskose Substanzen ausgefällt und entfernt werden. Der Überstand wird unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, die die Passage von Substanzen mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 50 000 Dalton erlaubt, eingeengt und entsalzt.
Nach der mindestens 200-fachen Aufkonzentrierung (als Proteinkonzentration ausgedrückt mindestens 1 % (Gew./Vol.)) wird das Konzentrat auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 eingestellt und 10 Stunden bei 60ºC wärmebehandelt (zur Inaktivierung von Viren und dergl.). Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugation entfernt, und anschließend wird der aktive Bestandteil an einem Anionenaustauscher, z.B. DEAE-Cellulose, adsorbiert.
Der Anionenaustauscher wird mit 0,05 bis 0,1 m Puffer (pH- Wert: 6,5 bis 7,5) gewaschen, und anschließend wird der aktive Bestandteil mit 0,2 bis 0,4 m Puffer (pH-Wert: 6,5 bis 7,5) eluiert. Gegebenenfalls kann das Eluat mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran eingeengt werden. Das Eluat wird einer Gelfiltration unter Verwendung eines Gelfiltrationsmediums, wie Sephacryl S-300 (Pharmacia), das mit einem Puffer (pH-Wert: 6,5 bis 7,5), der ein Salz, wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, in einer Konzentration von 1 bis 4 m enthält, äquilibriert worden ist, unterworfen, und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 70 000 bis 150 000 Dalton wird gewonnen. Anschließend wird die Fraktion einer Behandlung zur Adsorption an einer hydrophoben Substanz mit einer Affinität für CSF, z.B. Phenyl-Sepharose (Pharmacia) unterworfen. Die Elution wird mit einem Puffer (pH-Wert: 6,5 bis 7,5), der ein Salz in einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 m enthält, durchgeführt. Das Eluat wird mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran eingeengt und einer Gelfiltration unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Gelfiltrationssäule, wie TSKG-3000 SW (Tosoh Corporation) unterworfen, und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 70 000 bis 150 000 Dalton wird gewonnen. Die Fraktion wird erneut eingeengt und einer Behandlung zur Adsorption an einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographiesäule, wie Hi-Pore RP-304 (Bio-Rad), die mit einer Lösung von 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) (pH-Wert: 1 bis 2) äquilibriert worden ist, unterworfen. Die Elution wird mit einem Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Isopropylalkohol, mit einem Gehalt an 0,1 % TFA mit Hilfe einer Elutionstechnik mit linearem Konzentrationsgradienten durchgeführt. Der auf diese Weise erhaltene CSF ist eine reine Substanz mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 1 x 10&sup8; Einheiten/mg Protein.
Der erfindungsgemäß verwendete CSF kann auch durch Isolierung aus dem Kulturmedium einer M-CSF-bildenden Zellinie oder von M-CSF-bildenden Zellen, in die DNA, die für ein M-CSF-Gen codiert, mittels einer rekombinanten DNA-Technik inseriert ist, hergestellt werden.
Der auf diese Weise hergestellte CSF kann unter Ausnutzung einer Reaktion des CSF mit einem spezifischen Antikörper gereinigt werden.
Dieses Herstellungsverfahren besteht aus drei Stufen, die im folgenden nacheinander beschrieben werden.

[1] Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen das Kolonie-stimulierende Glycoprotein (nachstehend als "anti-CSF-Antikörper" bezeichnet)

Der CSF, der nach dem vorstehend beschriebenen ersten Herstellungsverfahren oder einer Modifikation davon erhalten wurde, wird verwendet, um Säugetiere, z.B. Kaninchen, Ziegen, Schafe oder Pferde, zu immunisieren. Dazu wird der CSF in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mg/ml gelöst, die Lösung wird mit dem gleichen Volumen an komplettem Freundschen Adjuvans versetzt, und das Gemisch wird Säugetieren subkutan ein- bis zweimal pro Woche für 4 bis 8 Wochen verabreicht. Wenn die auf diese Weise immunisierten Tiere einen erhöhten Blut-Antikörpertiter zeigen, dann wird ihnen eine verstärkende Dosis durch intravenöse oder subkutane Injektion gegeben, und 3 bis 7 Tage später wird Blut gesammelt und ein Antiserum gegen CSF abgetrennt. Der Antikörpertiter des auf diese Weise erhaltenen Antiserums gegen CSF wird mit Hilfe eines nachstehend genannten Tests gemessen, der in der Neutralisierung der biologischen Potenz von CSF besteht. Es ist günstig, solche Antiseren auszuwählen, die einen solchen anti-CSF-Antikörpertiter aufweisen, daß jeder ml davon mindestens 5 x 10&sup6; Einheiten der biologischen Potenz von CSF neutralisieren kann. Das gesammelte Antiserum wird durch zweifaches Aussalzen mit Ammoniumsulfat und anschließender DEAE-Cellulose-Chromatographie oder dergl. gereinigt, wobei man den anti-CSF-Antikörper als eine Immunglobulin G- oder M- Fraktion erhält. Gegebenenfalls wird der anti-CSF-Antikörper weiter gereinigt, indem man ihn auf eine Antigen-Säule, die als Liganden CSF oder ein Verunreinigungsprotein, das mit dem anti-CSF-Antikörper als Ligand kreuzreagiert, enthält, um dadurch zu bewirken, daß entweder der anti-CSF-Antikörper allein an der Säule adsorbiert wird, oder daß die Verunreinigungsproteine an einer geeigneten Säule adsorbiert werden.

[2) Herstellung Antikörper-gebundener Träger

Beliebige bekannte unlösliche Träger, die zur Bildung einer chemischen Bindung mit der NH&sub2;- oder CQQH-Gruppe des Antikörperproteins fähig sind, können als unlösliche Träger zur Bindung des anti-CSF-Antikörpers verwendet werden. Als Beispiele können mit Bromcyan aktivierte oder epoxidierte Polysaccharidgele, formylierte Polysaccharidgele und aminoethylierte oder hydrazidierte Polymere genannt werden. Bei der Durchführung der Bindungsreaktion zwischen dem unlöslichen Träger und dem anti-CSF-Antikörper sollte die Antikörperlösung so eingestellt werden, daß sie für diese Reaktion optimal ist, da die optimalen Reaktionsbedingungen abhängig von der Bindungsgruppe des ausgewählten unlöslichen Trägers variieren können. Zum Beispiel sollte der Antikörper in einem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8 bis 10 im Fall eines Bromcyan-Trägers, in einer Lösung mit einem pH- Wert von mindestens 10 im Fall eines epoxidierten Trägers und in einer neutralen Lösung im Fall eines formylierten Trägers gelöst werden. Die für die Bindungsreaktion anzuwendenden Temperaturbedingungen können ebenfalls abhängig vom unlöslichen Träger variieren. Im allgemeinen ist es erwünscht, die erfindungsgemäße Bindungsreaktion bei einer niedrigen Temperatur, die 25ºC nicht überschreitet, durchzuführen. Insbesondere im Fall von mit Bromcyan aktivierten Trägern sollte die Reaktion bei 4ºC oder darunter durchgeführt werden. Die zu bindende Antikörpermenge beträgt im allgemeinen 10 bis 50 mg und vorzugsweise 20 bis 30 mg pro g (Naßgewicht) des unlöslichen Trägers, und die Antikörperkonzentration bei der Ausführung der Bindungsreaktion wird auf 1 bis 4 % (Gew./Vol.) eingestellt. Nach Abschluß der Bindungsreaktion werden die auf dem Träger ohne Bindung des Antikörpers verbleibenden reaktiven Gruppen durch eine geeignete Behandlung inaktiviert, wobei der gewünschte Antikörper-gebundene Träger erhalten wird.

[3] CSF-Reinigung mit dem Antikörper-gebundenen Träger

Der Antikörper-gebundene Träger wird mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 6 bis 8, der ein Salz, wie Natriumchlorid, in einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 m enthält, gewaschen. Der auf diese Weise gewaschene, Antikörper-gebundene Träger wird in eine Säule gepackt oder in einem Puffer suspendiert. Ersterer wird für die Säulenchromatographie, letzterer für die portionsweise Chromatographie verwendet. Bei der Lösung, die den CSF enthält und die gereinigt werden soll, handelt es sich z.B. um ein menschliches Urinkondensat, den Kulturüberstand von CSF-bildenden Zellen oder den Kulturüberstand von ein CSF-Gen enthaltenden, rekombinanten Zellen. Eine derartige Lösung wird auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt, und anschließend wird sie entweder mit dem gleichen Puffer, wie dem vorstehend erwähnten, zum Waschen des Antikörper-gebundenen Trägers verwendeten Puffer, äquilibriert, oder sie wird mit Natriumchlorid auf eine Konzentration von 0,5 bis 1,0 m angereichert. Die auf diese Weise behandelte Lösung wird mit dem Antikörper-gebundenen Träger in Kontakt gebracht. Dieser Kontakt wird durch Säulenchromatographie oder der absatzweisen Chromatographie durchgeführt. Im Fall der Säulenchromatographie wird die Lösung über eine Säule bei einer Temperatur, die Raumtemperatur nicht überschreitet, und vorzugsweise bei 10ºC oder darunter, mit einer Durchflußrate von 5 bis 20 ml/cm²/Stunde geleitet, wobei der CSF an der Antikörpergebundenen Trägersäule adsorbiert wird. Es ist günstig, wenn der CSF in einer Menge von 500 bis 2 x 10&sup7; Einheiten/g (Naßgewicht) des Antikörper-gebundenen Trägers adsorbiert wird. Nach der Adsorptionsbehandlung wird der vorstehend erwähnte Puffer durch die Säule zum Waschen und Entfernen verunreinigender Substanzen geleitet. Im Fall der absatzweisen Chromatographie wird die vorstehend behandelte Lösung mit dem Antikörper-gebundenen Träger bei einer Temperatur, die Raumtemperatur nicht überschreitet, und vorzugsweise bei 10ºC oder darunter, versetzt, und das Gemisch wird 1 bis 10 Stunden bei einer derartigen Temperatur gerührt. Danach wird der Antikörper-gebundene Träger durch Filtration über einen Glasfilter, ein Filterpapier oder dergl. gewonnen. Der Antikörper-gebundene Träger wird sorgfältig von verunreinigenden Substanzen durch Waschen mit dem vorstehend erwähnten Puffer befreit. Der spezifisch an den Antikörper-gebundenen Träger gebundene CSF wird von dem Antikörper-gebundenen Träger mit einer für den Antigen- Antikörper-Komplex dissoziierenden Lösung, z.B. einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 2 bis 3, einer 3 bis 4 m Thiocyanatlösung oder einer 0,1 bis 0,2 m 2,4-Dinitrophenol- Lösung, eluiert. Im Fall von Säulenchromatographie wird der CSF eluiert, indem ein derartiges Elutionsmittel durch die Säule geleitet wird. Im Fall der absatzweisen Chromatographie wird der Antikörper-gebundene Träger in dem Elutionsmittel suspendiert, und das Gemisch wird gerührt, wobei der CSF eluiert wird. Der auf diese Weise erhaltene CSF enthält keine Verunreinigungen, und es handelt sich um eine reine Form des CSF.
Der auf die vorstehende Weise hergestellte CSF weist die nachstehend angegebenen physikochemischen Eigenschaften auf. Bei der Untersuchung auf diese Eigenschaften wurde der durch das Verfahren von Referenzbeispiel 1 gereinigte CSF verwendet.

a) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht, das mittels Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Abwesenheit reduzierender Substanzen nach der Methode von Laemmli (Nature, Bd. 227, S. 680-685 (1970)) bestimmt wurde, betrug 70 000 bis 90 000 Dalton.
Die nach der gleichen Methode, aber nach Reduktion mit 0,2 m Mercaptoethanol durchgeführte Molekulargewichtsbestimmung zeigte, daß der CSF in Untereinheiten dissoziiert war, die die biologische Aktivität nicht beibehielten, wobei jede Untereinheit ein Molekulargewicht von 35 000 bis 45 000 Dalton aufwies (Fig. 1).
Fig. 1 zeigt das elektrophoretische Muster des erfindungsgemäßen CSF, das durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese erhalten wurde. In Fig. 1 bezeichnen A bis E jeweils die nicht-reduzierte Form (Dimer), F und G bezeichnen jeweils Molekulargewichts-Markerproteine, und H bis L bezeichnen jeweils die reduzierte Form (Untereinheit). Die numerischen Daten an der vertikalen Linie bezeichnen Molekulargewichte (x 10³ Dalton).

b) Aminosäuresequenz der Proteinuntereinheit

Der gereinigte CSF wurde auf seine NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz auf herkömmliche Weise mit einem Gasphasen- Aminosäure-Sequenzierautomaten untersucht. Der gereinigte CSF wurde anschließend mit 6 m Guanidin denaturiert und mit Monoiodessigsäure alkyliert. Nach Entsalzen wurde er einem Verdau mit Trypsin und anschließend einer Zersetzung mit Bromcyan unterworfen. Das Trypsinverdau-Bromcyan- Zersetzungsprodukt (peptidgemisch) wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung von Vydac C-18 fraktioniert. Die getrennten Peptidfraktionen wurden jeweils mit einem Gasphasen- Aminosäure-Sequenzierautomaten zur Bestimmung der Aminosäuresequenz jedes Peptidfragments untersucht. Auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen der entsprechenden Peptidfragmente des Trypsinverdau-Bromcyan- Zersetzungsprodukts und der Basensequenz der von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung klonierten mRNA wurde die primäre Aminosäurestruktur der Proteinuntereinheit bestimmt. Die Ergebnisse der Sequenzierung sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Sequenz von der NH&sub2;-terminalen Aminosäure (Glutaminsäure) bis zur 149. Aminosäure (Glutaminsäure) ist identisch mit der Sequenz von CSF-1, bei dem es sich um einen bekannten CSF handelt, aber die Sequenz von der 150. bis zur 214.-238. Aminosäure (65 bis 89 Aminosäuren) ist recht verschieden von der des bekannten CSF.
Als COO-terminale Aminosäuren wurden Prolin als 214. Aminosäure und Lysin als 238. Aminosäure nachgewiesen, und zwar abhängig vom Molekulargewicht der Proteinuntereinheit. Die 122. und die 140. Aminosäure (Asparagin) weisen jeweils eine typische N-Glycosid-Bindungsstruktur der Formel Asn-X-Ser/Thr (X ist eine fakultative Aminosäure) auf, und man nimmt an, daß diese Stellen die Stellen der Zuckerkettenbindung sind. Tabelle 1 Untereinheiten-Aminosäuresequenz

c) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt (pI) wurde durch isoelektrische Fokussierung an einem Polyacrylamidgel und durch eine isoelektrische Fokussierungstechnik mit einem Saccharose- Dichtegradienten zu 3,1-3,7 bestimmt.

d) Zuckerketten aufbauende Monosaccharide

Die in den an das Polypeptid gebundenen Zuckerketten enthaltenen, diese aufbauenden Monosaccharide wurden durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie nach Freisetzung durch Hydrolyse bestimmt. Aldosen und Sialinsäuren wurden an einer Anionenaustauschersäule und Hexosamine an einer Kationenaustauschersäule fraktioniert, wobei die Elution mit einem Boratpuffer-Konzentrationsgradienten durchgeführt wurde. Die Bestandteile wurden nach Verlassen der Säule einer Markierung mit Cyanoacetamid oder Arginin unterworfen und durch die Fluoreszenzmethode identifiziert. Die in dem CSF- Molekül enthaltenen Zuckerketten sind variabel, und daher waren sie schwierig zu quantifizieren, obwohl Mannose, Galactose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N- Acetylneuraminsäure als sie aufbauende Monosaccharide identifiziert wurden.

e) Zirkulardichroismus-Spektrum (CD-Spektrum)

Das CD-Spektrum im Vakuum-UV-Bereich wurde unter Verwendung eines Zirkulardichroismus-Dispersionsmeßgeräts (JASCO Modell J-600) gemessen (Fig. 2)
Fig. 2 zeigt das CD-Spektrum des erfindungsgemäßen CSF. Die Wellenlänge (nm) ist auf der horizontalen Achse und die Elliptizität (mdeg) auf der vertikalen Achse aufgetragen. Minima werden bei Wellenlängen von 208 nm und 222 nm beobachtet. Man nimmt daher an, daß die Sekundärstruktur des CSF eine α-Helix-Struktur enthält.

f) Thermische Stabilität

Der CSF wurde in einem verdünnten Puffer (pH-Wert: 7,0) bei einer Konzentration von 1 ug/ml gelöst, und die Lösung wurde 60 Minuten auf 60 ± 0,5ºC erwärmt und anschließend auf ihre Kolonie-stimulierende Aktivität (die nachstehend zu erläutern ist) untersucht. Es wurde fast keine Verringerung der Aktivität festgestellt.

g) Infrarot-Absorptionsspektrum

Das Infrarot-Absorptionsspektrum des CSF in Form eines lyophilisierten Pulvers, das nach der Transmissionsmethode (KBr-Fenster) unter Verwendung eines Fourier-Transformations- Infrarotspektrometers (Nicolet Modell 5DXC) erhalten wurde, ist in Fig. 3 gezeigt, wobei auf der horizontalen Achse die Wellenzahl (cm&supmin;¹) und auf der vertikalen Achse die Durchlässigkeit angegeben ist.
Der CSF zeigt starke Absorptionen bei 1650 cm&supmin;¹, 1201 cm&supmin;¹ und 1133 cm&supmin;¹ und mäßig starke Absorptionen bei 1537 cm&supmin;¹, 1432 cm&supmin;¹ und 1068 cm&supmin;¹.
Das Glycoprotein mit den vorstehenden physikochemischen Eigenschaften und mit einer Kolonie-stimulierenden Aktivität bei Säugetier-Monocyten-Makrophagen-Zellen wird aus menschlichem Urin nach dem vorstehend angegebenen Herstellungsverfahren oder nach den sonstigen hier gemachten Angaben hergestellt, in Glasfläschchen unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert und darin in Form eines Pulvers dicht verschlossen. Es ist auch möglich, eine wäßrige Lösung, die menschliches Serumalbumin (als CSF-Stabilisator) und eine Aminosäure oder einen Zucker (als Lösungshilfe) enthält, vor dem Lyophilisieren zu dem CSF zu geben, und das Gemisch einer Sterilisation durch Filtration und anschließend der Lyophilisation unter aseptischen Bedingungen zu unterwerfen.
Die Kolonie-stimulierende Aktivität des CSF wurde nach einer Methode bestimmt, die die Koloniebildung von Knochenmarkzellen aus Mäusen auf einer einzelnen Schicht aus Weichagargel beinhaltete. So wurde eine CSF-Probe mit 1 ml McCoy-5A-Medium (GIBCO) mit einem Gehalt an 0,3 % Agar, 20 % foetalem Kälberserum (FCS) und 1 x 10&sup5; Knochenmarkzellen aus Mäusen versetzt. Die Inkubation wurde 7 Tage bei 37ºC unter einem 7,5 % CO&sub2; enthaltenden Luftstrom durchgeführt. Danach wurden Zellaggregate, die aus 50 oder mehr Zellen bestanden, als Kolonien bewertet und gezählt. Die Kolonie-stimulierende Aktivität wurde in Einheiten ausgedrückt. Eine Einheit wurde als die Menge an CSF definiert, die zur Bildung einer Kolonie erforderlich ist. Die spezifische Aktivität wurde als Zahl der pro mg CSF-Protein gebildeten Kolonien (Einheiten) ausgedrückt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der erfindungsgemäße CSF eine spezifische Aktivität von 1,4 x 10&sup8; Einheiten/mg Protein aufwies. Die gebildeten Kolonien wurden zur morphologischen Klassifikation mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Auf diese Weise wurde festgestellt, daß es sich bei mindestens 95 % der gebildeten Kolonien um Monocyten- Makrophagen-Kolonien handelte.
Die erfindungsgemäße Zubereitung wird in Form einer Lösung in physiologischer Kochsalzlösung, destilliertem Wasser für Injektionszwecke oder dergl., die eine CSF-Konzentration von 10 bis 100 mg/ml aufweist, durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion oder durch intravenöse Dauerinfusion verabreicht. Additive, wie Albumin, eine Aminosäure (z.B. Glycin) , ein Zucker (z.B. Glucose, Saccharose), ein Zuckeralkohol (z.B. Mannit) und ein anorganisches Salz (z.B. Natriumchlorid), können zu der CSF-Zusammensetzung gegeben werden.
Die Dosis beträgt im allgemeinen 1000 bis 150 000 Einheiten/kg Körpergewicht pro Verabreichung einmal oder mehrmals täglich, aber sie kann in geeigneter Weise abhängig vom Symptom erhöht oder verringert werden.
Es wird empfohlen, die Verabreichung des CSF zu beginnen, wenn erwartet wird, daß die Blutbildungsstörung nach einer Chemotherapie oder Radiotherapie auftritt. Die Verabreichung kann mehrmals täglich über mehrere Tage (2 bis 14 Tage) abhängig von der Variation der Blutplättchenzahl erfolgen, bis die Zahl wieder ein bestimmtes konstantes Niveau erreicht.
Das Ziel der Verabreichung umfaßt alle Patienten mit Knochenmarkschwund, der durch Blutbildungsstörungen induziert ist, ohne eine spezielle Beschränkung.
Wenn die erfindungsgemäße Zubereitung derartigen Zielpatienten verabreicht wurde, wie es in den klinischen Testbeispielen 1 und 2 beschrieben wird, dann wurden merkliche Verbesserungen des Blutplättchenspiegels im zirkulierenden Blut beobachtet. Es wurden keine unerwünschten Nebenwirkungen als Folge der Verabreichung beobachtet. Die erfindungsgemäße Zubereitung bietet sich daher als ein wertvolles therapeutisches Mittel bei Thrombocytopenie an.
Das folgende Testbeispiel, die Beispiele und die Referenzbeispiele verdeutlichen oder zeigen die Toxizität und die pharmakologischen Wirkungen des erfindungsgemäßen Mittels und typische Verfahren zu seiner Herstellung.

Testbeispiel 1 (Toxizität)

Das in Referenzbeispiel 1 hergestellte Glycoprotein wurde in männlichen C&sub5;&sub7;BL-Mäusen nach der Methode von Richard et al. (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Bd. 90, S. 99 (1949)) auf akute Toxizität bewertet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Intraperitoneale Verabreichung Intravenöse Verabreichung Subkutane Verabreichung Einheiten/kg

Beispiel 1

Ein Patient mit einem bösartigen Tumor wurde einer Chemotherapie (erste Chemotherapie) unterworfen und anschließend für eine Zeitspanne (Kontrollphase) lediglich beobachtet. Nach einer zweiten Chemotherapie wurden ihm 8 x 10&sup6; Einheiten einer Glycoprotein-Zubereitung, die den in Referenzbeispiel 1 hergestellten CSF als aktiven Bestandteil umfaßte, durch intravenöse Dauerinfusion an 7 aufeinanderfolgenden Tagen (Herstellungs-Verabreichungs- Phase) verabreicht. Granulocyten und Blutplättchen wurden in festgelegten Intervallen gezählt. Veränderungen dieser Parameter sind in Tabelle 3 gezeigt. Die minimale Zahl der Blutplättchen und die Zahl der Tage, die erforderlich war, um wieder einen Spiegel von mindestens 10&sup5;/mm³ Blutplättchen in der Kontrollphase und in der Präparat-Verabreichungs-Phase zu erreichen, sind vergleichend in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 3 Tag/Monat Granulozyten (/mm³) Blutplättchen (/mm³) Therapie: 19. Jan. 23. Feb. CPA (Cyclophosphamid) ACR (Aclarubicin) CDDP (Cisplatin)Ab dem 24. Februar wurde die CSF-Zubereitung (8 x 10&sup6; Einheiten/Tag) einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Bemerkung: Das Symbol "-" bedeutet: "nicht gezählt" Tabelle 4 Minimale Blutplättchenzahl Zahl der Tage, bis Niveau der Blutplättchen wieder 10&sup5; erreicht Kontrollphase Präparat-Verabreichungs-Phase

Beispiel 2

10 Patienten mit bösartigen Tumoren wurden einer ersten Chemotherapie unterworfen und anschließend ohne Behandlung für eine Zeitspanne (Kontrollphase) beobachtet. Nach einer zweiten Chemotherapie wurden ihnen 8 x 10&sup6; Einheiten einer Glycoprotein-Zubereitung, die den in Referenzbeispiel 1 hergestellten CSF als aktiven- Bestandteil enthielt, durch intravenöse Dauerinfusion an 7 aufeinanderfolgenden Tagen (Präparat-Verabreichungs-Phase) verabreicht. Die Blutplättchen wurden in festgelegten Intervallen gezählt. Die minimale Zahl der Blutplättchen und die Zahl der Tage, die erforderlich war, bis die Zahl der Blutplättchen wieder einen Wert von mindestens 10&sup5;/mm³ in der Kontrollphase und in der Präparat-Verabreichungs-Phase erreichte, sind vergleichend in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Minimale Blutplättchenzahl Zahl der Tage, bis Spiegel der Blutplättchen wieder 10&sup5; erreicht Kontrollphase Präparat-Verabreichungs-Phase

Referenzbeispiel 1

Von gesunden Menschen gesammelter Urin (200 Liter) wurde auf einen pH-Wert von 8,5 mit 10 %-iger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon; H10x50; Molekulargewicht-Rückhaltevermögen: 50 000 Dalton) eingeengt und entsalzt. Das Konzentrat wurde dann auf einen pH-Wert von 7,0 mit 10 %-iger Salzsäure eingestellt und zur Sterilisation in einem hermetisch abgeschlossenen Gefäß 10 Stunden auf 60ºC erwärmt. Anschließend wurde der resultierende Niederschlag durch Zentrifugation (5000 x g, 30 Minuten) entfernt, und der Überstand wurde mit DEAE- Cellulose, die mit 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,2) äquilibriert worden war, zur Adsorption versetzt. Die Elution wurde durch Behandlung der DEAE-Cellulose mit 0,02 m Phosphatpuffer und 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2), der mit 0,05 m Natriumchlorid angereichert worden war, durchgeführt. Das Eluat wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon; H1P10) eingeengt und anschließend einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephacryl 5-300 (Pharmacia, ∅ 4 x 80 cm) mit 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,2), der mit 1 m Ammoniumsulfat angereichert worden war, unterworfen. Die bei der vorstehend erwähnten Gelfiltration erhaltenen Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 70 000 bis 150 000 Dalton entsprachen, wurden vereinigt und auf eine Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Pharmacia, ∅ 2 x 20 cm), die mit dem vorstehend erwähnten, mit 1 in Ammoniumsulfat angereicherten Puffer äquilibriert worden war, zur Adsorption aufgebracht. Die Elution wurde mit einem 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,2), der mit 0,5 m Ammoniumsulfat angereichert worden war, durchgeführt. Das Eluat wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran (Asahi Chemical Industry, NM-3) eingeengt, und das Konzentrat wurde einer Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung einer TSKG-3000SW-Säule (Tosoh Corporation, ∅ 4 x 600 mm x 2) unterworfen, wobei man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 70 000 bis 150 000 Dalton erhielt. Diese Fraktion wurde erneut eingeengt und einer Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie unterworfen, die an einer Umkehrphasen-Säule der Bezeichnung Hi-Pore RP-304 (Bio- Rad, ∅ 4 x 150 mm) mit einem linearen Acetonitril-Konzentrationsgradienten (0 bis 100 %, pH-Wert: 2,0) durchgeführt wurde. Das Elutionsmittel enthielt 0,1 m Trifluoressigsäure. Auf diese Weise wurde gereinigter CSF eluiert, der eine spezifische Aktivität von 1,4 x 10&sup8; Einheiten/mg Protein aufwies. Der Reinigungsgrad in den einzelnen Stufen des vorstehenden Herstellungsverfahrens ist in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Reinigung von CSF Reinigungsstufe (*) Ausbeute Protein (mg) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Reinigungsgrad (1) DEAE-Cellulose (2) Sephacryl S-300 (3) Phenyl-Sepharose (4) TSKG-3000SW (5) Hipor-RP-304 (*) Da nicht behandelter menschlicher Urin eine CSF-hemmende Substanz enthält, ist eine genaue Bestimmung der Aktivität unmöglich. Daher sind die Aktivitätsdaten nur für die Stufe der DEAE-Cellulose-Behandlung und die nachfolgenden Stufen gezeigt.

Referenzbeispiel 2

Von 10 mit dem in Referenzbeispiel 1 erhaltenen CSF immunisierten Kaninchen, die einen ausreichend angestiegenen Antikörpertiter zeigten, wurde anti-CSF-Antiserum gesammelt, das nach der vorstehend erwähnten Methode [1] behandelt wurde, wobei man etwa 4 g gereinigten anti-CSF-Antikörper erhielt. Der anti-CSF-Antikörper wurde gegen 0,1 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0) dialysiert, und die Konzentration wurde auf 20 mg/ml eingestellt. Die Antikörperlösung (200 ml) wurde zu 100 g Formyl-Cellofine, das zuvor mit destilliertem Wasser und mit 0,1 m Phosphatpuffer gewaschen worden war, gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) 2 Stunden gerührt. 700 mg Natriumcyanoborhydrid wurden zugegeben, und das Gemisch wurde weitere 16 Stunden gerührt. Auf diese Weise wurde ein Antikörper-gebundener Träger hergestellt, der durch Binden von anti-CSF-Antikörper an Formyl-Cellofine resultierte. Das Bindungsprodukt wurde mit 0,2 m Tris-Salzsäure-Puffer (pH- Wert: 7,0) gewaschen. Anschließend wurden 200 ml Trispuffer mit einem Gehalt an 500 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden zur Inaktivierung nicht umgesetzter Gruppen gerührt. Der Antikörper-gebundene Träger wurde anschließend gründlich mit 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0) mit einem Gehalt an 0,5 in Natriumchlorid gewaschen. Jedes Gramm des Antikörpergebundenen Trägers enthielt 29,5 mg an daran gebundenem anti- CSF-Antikörper. Getrennt davon wurden 1000 Liter von gesunden Menschen gesammelter Urin mittels eines Ultrafiltrations- Konzentrationsapparats eingeengt und entsalzt und mit DEAE- Cellulose zur Adsorption aktiver Substanzen und zur Entfernung nicht adsorbierbarer Verunreinigungen behandelt. Die Elution wurde mit 0,3 in Natriumchloridlösung durchgeführt, und Natriumchlorid wurde zu dem Eluat in einer Konzentration von 0,5 m gegeben, wobei man eine CSF enthaltende Lösung erhielt. Das CSF wies eine spezifische Aktivität von 2 x 10&sup5; Einheiten/mg auf. Diese CSF enthaltende Lösung (Gesamtvolumen 500 ml) wurde zu 100 g des vorstehend erwähnten Antikörper-gebundenen Trägers gegeben, und das Gemisch wurde über Nacht (für etwa 12 Stunden) bei 10ºC oder darunter zur portionsweisen chromatographischen Behandlung gerührt. Danach wurde der Antikörper-gebundene Träger durch Filtration über einen Glasfilter gewonnen und gründlich mit 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0), der 0,5 m Natriumchlorid enthielt, gewaschen. Nach dein Waschen wurden 500 ml 0,2 m Acetatpuffer (pH-Wert: 2,5) zugegeben, und der CSF wurde durch Rühren des Gemisches für 1 Stunde bei 10ºC eluiert. Das Eluat wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und anschließend mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran eingeengt und entsalzt, wobei man etwa 10 mg des CSF in reiner Form enthielt. Der gereinigte CSF wies eine spezifische Aktivität von 5,2 x 10&sup7; Einheiten/mg und eine Reinheit von mindestens 90 % auf, die durch die SDS-PAGE-Methode bestimmt wurde.

Claims

1. Verwendung eines menschlichen Monocyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktors, der aus zwei identischen Untereinheiten, die 214 bis 238 Aminosäurereste enthalten, zusaminengesetzt ist, wobei jede Untereinheit die folgende Aminosäuresequenz der ersten 214 Aminosäurereste aufweist:

wobei der menschliche Monocyten-Makrophagen-Koloniestimulierende Faktor die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht:

es handelt sich um ein Homodimer, das aus zwei identischen Untereinheiten zusammengesetzt ist, und, wenn das Molekulargewicht mittels Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt wird, dann ist das Molekulargewicht der Untereinheit, die aus der Dissoziation mit einem reduzierenden Mittel erhalten wird und die biologische Aktivität nicht beibehält, gemäß SDS-PAGE 35 000 bis 45 000 Dalton,

b) Isoelektrischer Punkt:

der isoelektrische Punkt (pI), wie er durch isoelektrische Fokussierung Polyacrylamidgel und durch eine isoelektrische Fokussierungstechnik mit einem Saccharose-Dichtegradienten bestimmt wird, ist 3,1-3,7,

c) Zuckerketten aufbauende Monosaccharide:

die folgenden Zuckerketten aufbauenden Monosaccharide sind durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie nach der Hydrolyse identifiziert worden: Mannose, Galactose, N- Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N- Acetylneuraminsäure,

d) Zirkulardichroismus-Spektrum:

das CD-Spektrum im Vakuum-UV-Bereich, das unter Verwendung eines Zirkulardichroismus-Dispersionsineßgeräts gemessen wurde, weist Minima bei Wellenlängen von 208 nm und 222 nm auf, was anzeigt, daß eine α-Helix-Struktur enthalten ist,

e) thermische Stabilität:

die biologische Aktivität geht selbst bei 60-minütigem Erwärmen auf 60 ± 0,5ºC nicht verloren, und

f) Infrarotabsorptionsspektrum:

sein Infrarotabsorptionsspektrum, das für die Form eines lyophilisierten Pulvers nach der Transmissionsmethode (KBr- Fenster) unter Verwendung eines Fourier-Transformations-Infrarotspektrometers (Nicolet Modell SDXC) aufgenommen wurde, ist wie in Fig. 3 gezeigt,

zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Thrombocytopenie, die durch Blutbildungsstörungen induziert ist.