JPS6061600A - インタフエロンｅ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たとえばひと及びその他の細胞培養物におい
て抗ウィルス剤及び（又は）抗増殖剤として有用な物質
（以下、インタフ工四ンイプシロン又はＩＦＮ−１１と
呼ぶ）の新規組成物、この物質の製造方法及びウィルス
感染を防止するためのひと上皮細胞の処理方法に関する
ものである。

インタ７エロンは、抗ウイルス特性を有する物質である
。これらは、ウィルス、成る種の核酸又は抗原／ミトゲ
ン後合体に露呈して刺激された成る種の細胞により生産
される。インタ７エロンは、臨床的な抗ウィルス剤及び
抗ＩＩ！！瘍剤として将来性の大きい極めて有望な薬剤
である。

現在の、３種の公知種類のひとインタ７エｐンが存在し
、すなわちひと白血球又はリンパ芽細胞から生産される
インタフニシンｆｆ（ＩＦＮ−α）、繊維芽細胞から生
産されるインタ７エｐンβ（ＩＦＮ−β）及びひとＴ−
リンパ球から生産されるインタフニシンγ（ＩＦＮ−γ
）である。これら３種は全て、細胞をウィルス、成る種
の核酸又は抗原／ミトゲン複合体により刺激した後に各
細胞により分泌される。最近のｍＬ明が示すように、こ
れらのインタ７エｐンは単一の蛋白質ではなく構危上関
連した蛋白質の混合物からなっている。

ひとインタ７エｐンは、ひと及び生細胞培養物における
異なる活性レベルにより互いに相違している。活性の測
定方法はザ・インタフエロン・システム、ウィリアム・
イー・スチュワード、スプリンガー出版社、ニューヨー
ク（１９７Ｂ）に開示されたように行なうことができ、
この方法はザ・プ田シーディング・オプ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オプ・サイエンス、第４５巻、第３８
５〜３８９頁（１９５９年）にＱｉｉ　＜’ａされたホ
ー及びエンデルスの方法の変法である。ＩＦＮ−αは、
ひと繊維芽細胞培養物に対する活性よりも１〜５倍の牛
腎臓細胞培養物に対する抗ウィルス活性しベルを有する
。ＩＦＮ−βは、ひとａｔｉ維芽細胞培養物に対する活
性の１／１００〜２／１００に相当する生育臓細胞倍養
物に対する抗ウイルス活性レベルを有する。ＩＦＮ−７
は、ひと繊維芽細胞培養物に対する活性の１／１ｏｏ未
満の生細胞培養物に列する活性を有する。

ＩＦＮ−αをひと白血球から生産させる最も有効な方法
においては、約１単位のインタ７エロンが５０個の細ｎ
当りに生産される。ＩＦＮ−γは、細Ｕ１ｏｏｏ個当り
約１単位の収率でひと１９２８球から生産される。ひと
繊維芽細胞から生産されるＩＦＮ−βは、細胞１５個当
り約１単位の最適収率を有する。

インタ７エロンの抗ウイルス単位は、小水飽性口内炎ウ
ィルスに罹患したひと繊維芽細胞培養物中において標準
ｔ１度（１ｐｆｕ　／細胞）にてこれら細胞の半分を保
護する濃度である。

抗ウィルス活性は、他のひと細胞及び動物細胞から培地
中に検出されている。イン７：ｒ−ンザウイルルの繁殖
における抑制が、アイザック及びリンデンマン（１９５
７）により磯の絨毛尿素の培養物において始めて検出さ
れた。他の例はヘラ細胞系であり、これは上皮（頚部）
源の転移癌細胞であって、ジー・ゲイ等によりカンサー
・リサーチ、第１２巻、第２６４〜２６５頁（１９５２
）に報告されている。インクフェリン活性は、ひと上皮
組織から元来化ずる各種の形質転換された又は新生組織
の細胞系で検出されている〔「ひと腫瘍細胞系によるイ
ンク７エシンの生産」、ジエイムソン等、アーチブス・
オプ・パイロロジー、第６２巻、第２０９〜２１９頁（
１９７９））。従来のひとインタ７エロン製剤は、ひと
細胞培養物において抗ウィルス活性を有することが観察
されている。

インタ７エロンイプシロンと命名スル新ｍすｆｄ類の抗
ウイルス物質が今回見出されかつ生産された。他のイン
タ７エ四ンと同様に少なくとも２種の作用上関連する蛋
白質から措成されると思われるこの新規な物質は、たと
えば正常なＯ・と上皮細胞をインタ７工ロン酷発技術に
かけ、次（・でこれら細胞を新規なインタ７エロンの生
産を促進させる条件下で培養することにより製造するこ
とができる。ＩＦＮ−ａはα、β及びγの従来物質と対
比して、ひと培養物における活性のμ〜約捧の生育ｌ１
ｆＩ培養物における抗ウイルス活性レベルを有する。Ｉ
ＦＮ−ａはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γに対
し調製された抗血清との顕著な交叉反応を中和分析にお
いて示さない。これはｐＨ２において安定である。上皮
細胞におけるその生産は、ＲＮＡ合成抑制剤又は蛋白質
合成抑制剤を培養物中に導入することにより妨げられる
。ＩＦＮ−６を含有するＡ８物の抗ウィルス活性はプロ
テアーゼにより失活される。

ＩＦＮ−ａは、全ゆる種類の一次ひと二倍染色体上皮ｆ
ｉ’ＪＵ　Ｂｅ４から生産させることができる。ひと表
皮、布膜、鞘膜及び食道細胞の培養物を使用して成功を
収めている。使用しうる他の上皮組繊細胞の例は、限定
はしないが鼻、咽頭、気管支、ＰＪ改及ヒｌｌう管細胞
を包含する。有利には、白血球、リンパ芽細胞及び繊維
芽細胞から他のｄ類のインク７エｐンを生産するための
従来技？ｆｊで使用されたと同じ技術を用いて、−吹上
皮細胞をＭＡさせてインタフニシン−εを生産しうろこ
とが見出された。ニューキャッスル病ウィルス（パンコ
ラスキ株）又はセンダイウィルスを使用する好適肪発技
術においては、１単位のＩＦＮ−６を生産するには１０
０〜５００個の上皮細１畿が必要とされる。

上記したように、ＩＦＮ−１１はひとの一次二倍染色体
上皮細胞により生産される。本明細書中に使用する「−
次二倍染色体ひと上皮」細胞培養物という用語は、グリ
ーン痔に係る米国特許第４ｔ）１６０５６号公報にυｌ
］示された方法により生成成された健全ひと組織から採
取される細■ａ又はこの種の細胞の培養物を意味し、参
考のためこの開示をここに引用する。これら種類の細胞
培養物は、非ひと細胞、上皮源以外のひと細胞及び形質
転換された若しくは新生組織の上表細胞とは区別すべき
である。

さらに、この新規なインク７エｐンはＩＦＮ−８の生産
の原因となるひと上皮核酸の１部を含イｆ。

する天然若しくは人為的に形質転換させた成熟核細胞、
或いは組換ＤＮＡ技術により改変された細胞で生産させ
ることもできる。

さらに、所定種類のひと細胞、たとえば上皮細胞から生
産されるインタ７エｐンは他の種類のヒト細胞よりもこ
の特定種類のｆｌＩＩ　Ｅｌにおいて、より大きな抗ウ
ィルス活性を示すことも見出された。

すなわち、インタフェリン−は、他の種類のひと細胞に
関するその効果に比較して、腫瘍若しくはウィルス感染
を受けた上皮組織の処理において抗ウイルス能力及び抗
腫瘍能力が増大されている。

したがって、本発明の目的は、たとえばひと細胞をウィ
ルス攻ツ２から保護するのに有用な新規な種類の抗ウイ
ルス性物質を提供することである。

本発明の他の目的は、正常かつ健全なひと上皮組織に対
して固有な種類のインタ７エｐンの製造方法を提供する
ことである。さらに本発明の他の目的は、同じ種類の組
織から得られたインタフェリンに露呈することにより特
定種類の組織におけるウィルス感染又は腫瘍成長を処置
する方法を提供することである。他の目的は他の種類の
ひとｒｌｌｌ　Ｕ、たとえばひと繊維芽１１１胞に対す
るよりもひと上皮細胞に対し、より大きい活性を有する
ａ類のインタ７エｐンを提供することである。本発明の
これら及びその他の目的並びに特徴は、以下の記載から
明らかとなるであろう。

広飴において、ＩＦＮ−８を製造するには、正常ひと上
皮細胞は１９８１年３月１４日付出願の米国特許出願第
２４５，５８６号明細書にジャルビス等により開示され
た方法、或いはその他の方法によりマイクルカプセル内
でＦｉｔ　１６７として試験管内（たとえば、グリーン
等の方法による）で培養することができる。次いで、こ
れら細胞を成る種のウィルス又は核酸に露呈することに
よりＩＦＮｉｉ４発技術にかける。たとえば、増殖培地
は公知のウィルス若しくは核酸型のＩ　Ｆ　Ｎ　ｒｆ、
）発剤を含有する培地で代用することができる。短時間
の培養の後、典型的には１時間程度で誘発剤を除去し、
細胞を正常かつ新鮮な増殖若しくは維持培地に入れ、そ
してたとえば２４時間培養する。＋１６　’１１３剤に
対する細胞の露呈は、インタ７エｐンーの生産を暗号化
する細胞のＤＮＡ暗号の発現を引き起こす。その後の培
養の間、細胞はＩＦＮ−ａを合成しかつ分泌する。この
時点で培地を収穫し、そしてたとえば、ホー及びエンデ
ルスの方法（プロシーディング・オプ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オプ・サイエンス、第４５巻、第３８５
〜３８９頁、１９５９）により分析すればＩ　ＦＮ−８
抗ウイルス活性を有することが判るであろう。

この過程で生ずる生産物はＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又は
ＩＦＮ−γに対する抗体との顕著な交叉反応を中和実験
において示さない。これはｐＨ２において安定であり、
かつ蛋白質状の性質を有する。免疫吸着実験が示すとこ
ろでは、抗ＩＦＮ−β抗血清は誘発された上皮細胞のイ
ンタ７エシン生産物の１部と反応する。この新規なイン
タ７エロンは、さらに公知種類のインタ７エロンとは異
なる活性プロフィルを哺乳類細胞において示す。

これらの化学特性は、ＩＦＮ−ａを独特な物質とする。

現在、ＩＦＮ−８は「正常誘発」〔フィールド等、プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
プ・サイエンス、ｉｔ’ｓ　５８　＠　、第１００４〜
１００９頁（１９６７））及び「超誘ＵＪ　［ハベル及
びピルヤク、アンチミクνビアル・エイジェント・イン
・ケモテラピ、ｉ１工２６、第４７６〜４８４頁（１９
７２））を用いて核酸、すなわちポリ１．　Ｃ，（マイ
ルス・ラボラドリース社）により、ニューキャッスル病
ウィルス（バルン及びアイザック、プリティッシュ・メ
ジカル・ジャナール、第５６巻、第１８〜２０頁、１９
６２）により、或いはセンダイウィルス（パライン７レ
ンザー１、グレツサー、プロシーディング・オプ・ザ・
ソサイエテイー・オプ・エキスベリメンタリ・アンド・
バイオレジカル・メデイスン、第１０８巻、第３０３〜
６０７頁、１９６１）によりひと表皮、産膜、情膜及び
食道から得られる正常な上皮細胞から生産させることに
成功している。

分析結果が示すところでは、試鹸したｌｉｄ技術のそれ
ぞれ及び種々な種類の細胞培養物のそれぞれはＩＦＮ−
１を生産する。生産レベルは、使用した誘発剤の種類及
び誘発技術の種々の方法に応じて変化する。ニューキャ
ッスル病ウィルスが最も良好である。使用しうる他のウ
ィルスを下表に示す。

第１表 インフルエンザ−Ａ　Ｇｒｅｓｓａｒ及びＤｕｌｌ（１
９５４）；Ａｎｄｒｅｖｒｓ　（１９６１） パラインフルエンザ−５、Ｃｈａｎｙ　（１９６０）麻
疹　Ｐｅｔｒａｌｌｉ　、　Ｍｅｒｉｇａｎ及びＷｉ　
１ｂｕｒ（１９６５ｍ　）　；　Ｄｅｍａｅｙｅｒ及び
Ｅｎｄｅｒｓ（１９６１） 耳下腺炎　Ｃａｎｔｅｌｌ　（１９６１）；Ｗａｄｄｅ
ｌｌ　。

Ｗｉｌｂｕｒ及びＭｅｒｉｇａｎ（１９６８）風疹　Ｎ
ｅｖａ及びＷｅｌｌｅｒ（１９６４）ｒＰ吸合Ｂ！体ｉ
ｌｌ　Ｒａｙ、　Ｇｙａｖｅｌｌｅ及びＣｈｉｎ（１９
６７）　；Ｍｏｅｈｒｌｎｇ及びＦｏｒａｙｔｈ（１９
７１） 狂犬病ウィルＸ　Ｗｌｋｔｏｒ等（１９７５）第１表（
続き） 小水飽性口内炎　Ｍａｒｃｕｓ及び５ｎｋｅｌｌｉｃｋ
（１９７７）；Ｖｉｌｃｅｋ、　Ｙａｍａｚａｋｉ及び
Ｈａｖｅｌｌ（１９７７） チクングンヤ　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ等（１９７２）シ
ンドビス　Ｇｒｅａ！１ｅｒ及びＥｎｄｅｒｓ（１９６
２）西部馬脳炎　Ｌｕｂｙ、　５ａｎｄｅｒｓ及び５ｕ
ｌｋｉｎ（１９７１） 黄熱　Ｗｈａｅｌｏｅｋ及び５ｉｂｌｅｙ　（１９６５
）；Ｗｂ　ｅ　ｅ　１　ｏ　ｃ　ｋ及びＥｄｅｌｍａｎ
　（１９６９）１型灰白炎ワイルス　Ｇｒｅｓｓｏｒ、
　Ｃｈａｎｙ及びＥｎｄｓ　ｒ　ｔｓ（１９６５） ２型灰白炎ウイルス　Ｓｍｏｒｏｄｉｎｔｓｅｖ等（１
９７０）；Ｈｏ及びＥｎｄｅｒｓ　（１９５９ａ、　ｂ
　）脳心筋炎　Ｓｔｅｗａｒｔ　ｎ、Ｇｏｓｓｅｒ及び
Ｌｏｃｋａｒｔ　（１９７１ａ　） リノウイルス−２Ｓｍｏｒｏｄｉｎｔｓｅｖ等（１９７
１ｍ）；Ｆｉｍｌｍ（１９７２） 第１俵（Ｍき） リノウイルス−１２Ｇａｔｍａｉｔａｎ、　５ｔａｎｌ
ｅｙ及びＪｎｃｋ＠ｏｎ　（１９７３） レオウィルス−２０Ｌｅ、　Ｌｏｈ及びＲａｔｎａｙａ
ｋｅ（１９７３） 青舌病　Ｊ　ａｍｅ　ｓ　ｏ　ｎ及びＧｒｏｓａｂｅｒ
ｇ（１９７７） アデノライ＃Ｘ　Ｌｙｌｌｏｖ　’Ｇ　（１９７１）水
痘ｆ５　Ｖａｅｚｉ　、　Ｈｏｒｖａｔｈ及びＨａｄｈ
ａｚｙ（１９６５） ひとメガロウイル　Ｖａｃｚｔ　、　ｌ１ｏｒｖａｔｈ
及びＨａ＋１ｈａｚｙス　（１９６５）；Ｇｌａｓｇｏ
ｗ　（１９７４）単純痘、疹　Ｒａ＠ｍｕａｓｓｎ等（
１９７４）＋７クシ＝７症　Ｗｈｅｅｌｏｅｋ　（１９
６４）　；Ｅｐｓｔｅｉｎ。

５ｌｅｖｅｎｓ及びＭａｒｉｇａｎ（１９７２）さらに
、選択された種類のひと細胞、たとえ１ｆ上皮細胞、繊
維芽細胞、血管、肝臓及び腎ｍ　ｍ１１１ナトシ振瓜止
畠丸勃、スインタフニリンＧｌａ択すｔ’した１７ｍ　
ｌ１ａＫ　１ｍ類よりなるひと組織の泊ｆｌχに関し抗
ウィルス刻苦しくは抗腫瘍剤として特に有効であること
が見出された。たとえば、ＩＦＮ−ａは、上皮細胞を処
置するのに使用すると特に有効であり、他の種類のひと
細ＪＪ８を処置するのに使用するとそれより低い活性レ
ベルを有することが判るであろう。同様に、ＩＦＮ−β
（ひと繊維芽細Ｈご源）はひと繊維芽細胞若しくは組織
を処置するのに特に有効であり、同様に他の種類のひと
組織の細胞に関しより低い抗腫瘍及び抗ウイルス特性を
有する。

したがって、次の方法を使用して所定の細胞種類若しく
は組織をウィルス感染から保設し、所定種類の細胞若し
くは組織に感染したウィルスの増殖を阻止し、或いは所
定組織における腫瘍の成長を阻止することができる。

先ず第１に、問題とする４′飛類の細１１ｋｌ培養物を
たとえば上記のグリーンの技術のような慣用技術（上皮
細胞の場合）により増殖させる。次いで、この培養物細
胞を処理してインクフエロン６の生産をもたらすＤＮＡ
暗号の１部の発現を誘発さゼ。

る。たとえば、これは後記するＩＦＮ誘発技術により行
なうことができる。次いで、生産物を典型的には培養後
の培地から収穫する。この生産物を、問題とする細胞若
しくは組織の処置に対する有効な抗ウィルス若しくは抗
腫瘍物質として使用することができる。試験管内におい
て、培養物は１　ｍｇ当り２〜５単位のＩＦＮ−＠の添
加によりウィルス攻撃に対し保護される。この濃度は、
Ｏ，５Ｘ１０５−２．５Ｘ１０５細胞／ｃｆｎ２の密度
を有する上皮細胞を保護するのに有効である。

さらに、この新規な抗ウイルス性物質の著量は、現在知
られているさらに２つの細胞技術により生産させること
ができる。第１のものは、ＩＦＮ−αをひとリンパ芽細
胞系から生産するのに従来使用されているものと同様な
化学的、ウィルス的又は自発的に形質転換された成熟核
細胞を使用することである。第２のものは、ＩＦＮ−α
及びＩＦＮ−βの生産に現在使用されているものと同様
な現在公知の組換ＤＮＡ技術を使用する。

第１の方法において、ＩＦＮ−ｊを生産しりる形質転換
された細りは、２つの技術のうち１つを用いて得ること
ができる（生体内又は試験管内）。

第１の技術（生体内）は形ＪＢ、転換された細胞の新鮮
組織から直接に単離することであり、第２の技術（試験
管内）は選択的方法であって、正常ひと二倍染色体細胞
の種類を長期間培養して少数であるが検出しうる個数の
集落が自発的形質転換を受けるようにするか、或いは初
期種類をたとえばＥＭＳ、ＭＭＳ又はＭＮＮＧのような
公知のムタゲン又はウィルスにより短時間処理して形￥
１転換の傾度を増大させることである。上記試験管内法
における２つのいずれかで形質転換された成る柚の細胞
は、ＩＦＮ−ａの生産をもたらす上皮細胞のＤＮＡ暗号
の１部を含有するであろう。

このようにして得られた形質転換培養物を、正常ひと二
倍染色体上皮細胞につき上記したような標準的誘発技術
を使用してＩＦＮ−６を生産させるべく誘発させること
ができる。

第２の技術において、Ｉ　Ｆ　Ｎ　ｉ９発に応じて上皮
細胞で合成されたｍＲＮＡを細胞から抽出し、必要に応
じ超遠心分離などにより情調して１寺異性の増大したｍ
ＲＮＡ７ラクシヨンを得、そしてこのｆｉｌｌ　ＩＩ物
を補完的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の合成に苅するｎ型とし
て使用する。このｃＤＮＡはＢ類の筋原ｉａ　Ｈａ逆転
写酵素を用いて生成させることカーできる。この方法の
最終的に得られる生産物、すな１〕ちＩＦＮ−εの合成
を暗号化する配列を有する二重鎖の検車的補完ＤＮＡ　
（ｄｉｅ　ＤＮＡ）及び細菌性若しく！ま成熟核ベクタ
ーを次いで制限酵素により処理してＤＮＡを開裂させる
と共に、ｄｓｃＤＮＡとベクターとを結合させうる結合
部位を生ぜしめる。次（１で、ベクターとＤＮＡとを混
合し、融合させ、力）つりガーゼ酵素を用いて共有結合
させる。この時点で、組換ベクタ７ｉｉ１１を製動を使
用して細菌細胞又！ま成熟核細胞を彫質転ｔ）させる。

かくして形質転換された細北は、上皮細胞に元来含有さ
れて−・るＲＮＡの全部又は１部に対し補完的なりＮＡ
をそのＩＦＮ−εの化ＩＣ工程の際に含有する。

次いで、これらの組換ベクターを適当な種類の細胞と共
に培養してベクターを作用させる。この結果ＩＦＮ−１
！を合成かつ分泌しうる個々の細胞を含有した細胞集落
が得られる。次いで、この細胞集落を選別してＩＦＮ−
εを生産するサブ非落の細胞を得、そしてこのサブ集？
′１−を培砿して比較的多針のＩＦＮ−ＩＩを生産しう
る細胞系を確立させる。

この組換ＤＮＡ技術の群縄は、さらにたとえば下記の文
献に見られ、その開示をここに参考として引用する。

ｔ　「生物学的に機能する分子キメラのＩ、ｉ７Ｍ　１
１方４法」と題するコーエン等に係る米国特許第４、２
５７．２２４号０ ２、７−ル・シェラ−等（１９７７）、「合成Ｅｃ。

ＲＩ部位により仰成されたシー・ウルシンＤＮＡからの
個々の反復配列のクローン」、サイエンス誌、第１９６
巻、第１９７〜２００頁。

３、　エフ・ブラットナ−（１９７７）、ｒシャロン・
７アージ：　ＤＮＡクローン化のためのバクテリオファ
ージλの安全誘導体」、サイエンス誌、第１９６巻、第
１６１〜１６９頁。

４、　ジエー・アール・ブローチ及びジェー・ビー・ヒ
ックス（１９８ｏ）、「酵母プラスミド、２ミクロンサ
ークルに関連する枚製及び組換機能」、セルεξ、第２
１巻、第ｓｏｉ〜５０Ｂ頁、及び５、　ディー・ハマー
（１９８１）、ｌ’−８Ｖ４０−猿細胞系における成熟
核蛋白質の合成法及び分泌」、組換ＤＮＡアブストラク
ト、第１巻、第４頁。

以下の例により本発明を説明するが、これらのみに限定
されない。

例１ マサチューセッツエ利大学におけるハヮード・グリーン
の実動室から得られたひと表皮細胞の上皮細胞培養物を
、１０％の熱失活させた胎児牛血清（５６℃にて３０分
間培養、ＨＩＦＣ３）を含有する最少必須培地（ＭＥＭ
、ギプコ社）において１ｎｎ２当り１〜２Ｘ１０５個の
細胞密度まで増殖さ・せた。ＭＥＭ及び２％ＨＩＦＣ８
において培養した４種の均等な培養物をそれぞれ０％１
．１０及び１００　ＩＩ　ｆ　／ｍｅ（Ｄポリ（Ｉ−Ｃ
）　−（ｑ　ｓ　）、すなわちＰＬラボラドリース社（
ウィスコンシン州・ミルウオーキー在）から市販されて
いる高分子Ｆ（核酸に対し３７℃で１時間露呈させた〔
フィールド等Ｘ誘発技術、上記〕。次いで、細Ｈａ　＃
ｊ養物をＭ　Ｅ　Ｍで２回洗浄し、２％）Ｉ　Ｉ　Ｆ　
ＣＳを補充した同じ培地で２４時間培養した。次いで、
培地を集めてスチュワード■の方法〔ザ・インクフェロ
ン・システム、第１７〜１８頁〕により分析した。０及
び１μｔ　／ｍｌのポリ（工・Ｃ）と共に培養した培養
物においては、検出しうる抗ウィルス活性が観察されな
かった。１０及び１００　ｐｔ／ｍｌポリ（工・Ｃ）に
より誘発させた培養物から得られた試料においては、約
１０単位／　ｍｅのＩＦＮ−８が検出された。

例２ 改変「超誘発」技術〔ハベル及びビルセフ、上記〕を使
用してＩＦＮ−ａ生産の増加を試みた以外は、例１の手
順を反復した。ポリ（Ｉ−Ｃ）と共に５０μｆ／−のシ
クロヘキサミド（蛋白質合成抑制剤）を含ませた。１時
間の培養の後、細胞を洗浄しそして２％ＨＩＦＣ８と５
０１ｉ　？　／ｍｌのシクロ７ヘキサミドとを含有する
Ｍ　Ｅ　Ｍにおいてさらに６時間培ｊｉシた。次いで、
細胞を再び洗浄し、そして５０μｆ／ｍｐのシクロへキ
サミドと５．０μｔ／−のアクチノマイシンＤ（ＲＮＡ
合成抑制剤）とを含有するΔ’ＩＢＭと共にさらに２時
間培養した。この培養の終了後に細胞を２回洗浄し、次
いで正常培地において３７゛Ｃで２４時間培養した。例
１に示したと同じ培地の収穫及び分析は、０及び１μ２
／　ｍｅのポリ（Ｉ−Ｃ）で誘発させた培養物において
検知しうるＩ　ＦＮ−４の生産を与えなかった。

１０μｔ／ｌｎｌのポリ（工・Ｃ）により誘発させた培
養物は、１００単位／　ｍｅのＩＦＮ−１を生成した。

１００μｔ　／ｍｅのポリ（Ｉ−Ｃ）で誘発させた培養
物は、３３０単位／　ｒｒｄ１以上のＩＦＮ−ＩＩの生
産をもたらした。

例３ １〜２　×１０５の細胞を含有する表皮細胞の上皮細胞
培養物（例１）を使用して、ニューキャッスル病ウィル
ス（ＮＤＶ）ｉ発法（バロン及びアイザツクス、上記）
を用いることによりＩＦＮ−εを生成させた。使用した
ウィルスはカルホルニャ州、テビス在、パウルトリー・
ヘルス・ラボラドリース社から入手しうるＮ　Ｉ）　Ｖ
のパンコラスギ株とした。試駆試料中にそれぞれ、０．
１００〜２００．２５〜５０、及び１〜１６ウイルスｐ
ｆｕ／細胞のｆυ終濃度を与えるのに充分なＮＤＶと２
％ＨＩＦＣ８とを含有するＭ　Ｅ八つの１　ｍｅ試１１
４個を潤製した。各１　ｍｇのウィルス調製′１カ（ウ
ィルス、８〈５発剤）の０．２づを次いで１１！１胞培
養物に加え、これを５分間隔で３７°Ｃにて３０分間振
とうした。次イテ、残部０．、８　ｍ＋！（１）　Ｎ　
Ｄ　Ｖ　ｒｉ”、、’ｌＩ製物製動え、そして培養物を
さらに３０分間培養した。次いで、ａ：ＩＩ　Ｉｌａ培
養物を正常培地で２回洗浄し、１づの扇鮮培地を各培養
物に加え、そして培養物を２４時間培養した。

次いで、培地を収穫し、０．１　Ｎ　ｌｌＣｌによりｐ
Ｈ２にまで酸性化し、そして４”Ｃにて５〜６０間貯蔵
してＮＤＶを失活ざぜた。その後、収秒した培地を０．
１　Ｎ　ＮａＯＨにて中和し、そしてＩ　Ｆ　Ｎ　−ε
につき分析した。ＮＤＶを含イｆしない試料（比。

較）においては、抗ウィルス活性が存在しなかった。１
００〜２００ウイルス粒子／細胞のＮＤＶで防発さぜた
試料は、約５００〜１０００単位のＩＦＮ−ａ／ｍｌを
含有した。２５〜５０ウィルス粒子／細胞を含有するＮ
ＤＶで誘発さぜた培養物は、１７０〜３３０３３０単　
Ｆ　Ｎ　−ａ　／　ｍｅを含有した。１〜１６ウイルス
粒子／細胞を含有するＮＤ　Ｖ　１４製物で誘発させた
培養物は、５０〜１７０単位のＩ　Ｆ　Ｎ　−ｇ　／　
ｍｌを含有した。

この実験から判かるように、１〜２　Ｘ　１０Ｓ細胞／
　ｍｅを含有する細胞培養物は約５００〜１０００単位
のＩＦＮ−ε／−を生産することができる。

したがって、収率は１００〜５００個の細胞当り１単位
程度のＩＦＮ−ａが培養物中に生産される。

例４ パラインフレンザ−１（センダイ）ウィルスをｌｉｔ々
の濃度でＮＤＶの代りに誘発剤として使用した（グレツ
サー、上記参照）以外は、例６の手順を反復した。購入
時（フロー・ラボラドリース社）におりるセンダイウィ
ルスは、１ｆｎｌ当り１０，０００〜４０．０００血球
凝集単位を有した。

市販ウィルス調製物を１対６に希釈した培シ；物におい
ては、１０００単位／　ｍｅのＩＦＮ−８が生成された
。１対１０希釈は２００単位／　ｍｅ、をもたらし、か
つ１対３３希釈は１００単位／　ｍｅをもたらした。ウ
ィルスを省略した比・咬培養物においては、抗ウィルス
活性を検出することができなかった。

下記の表は、種々の誘発技術を使用してひと粘膜細胞培
養物及びひと表皮、Ｉ：ｌ！ｌｊ１茂培養物による実験
結果（例１〜４）を要約している。

第■表 ポ１月・Ｃ−）　５３０　５．３Ｘ１０−４なしく比較
）００ ひと表皮　ボリエ・Ｃ米　００ センダイ＋＋　５３０　３．３Ｘ１０−’ＮＤＶ＊来　
１，０００　１．０Ｘ１０−３なしく比較）００ ＊　１００μｆ／ｍｌｌポリＩ−Ｃを使用する例１の誘
発方法。

＋　１００μｔ／ｍｌポリＩ−Ｃを使用する例２の誘発
方法。

来＊１：３希釈のＮＤｖ（１００〜２００ウイルス粒子
／細胞）を使用する例３の誘発方法。

＋＋　１　：　３希釈の原液を使用する例４の誘発方法
。

例５ インクフエロンは従来定餞として蛋白質であると示され
ているので、ＩＦＮ−εの試料をこれら試別に存在する
抗ウィルス活性が蛋白質成分によるものかどうか決定す
るため試躾した。これらの試ｊＡｉ！　ハ、Ｉ　Ｆ　Ｎ
　−ｔｘ　（Ｎ　Ｉ　ＩＩ　４．ｊ　１９ｆｉ　）、ｘ
ＦＮ−ｆ３（ＮＩＨ標準）及びＩ　ＦＮ−ａ　（ＮＤｖ
ｇ：Ｈｈされた上皮ケラチン細Ｈａから得たもの）の試
料を公知の蛋白質分解酵素の存在下で培養し、次いで残
存する抗ウィルス活性につき処理Ｉ４１”＋を分析する
ことにより行なった。ＭＥＭにおけるＩＦＮ−α（１６
単位／コ）、ＩＦＮ−β（１６単位／、ｅ）及びＩＦＮ
−１（３２単位／耐）の試料を６，６〜１００μｆ　／
ｍｌの濃度のトリプシン（シグマ・ケミカル社、ミズリ
州、セントルイス在）又をまプνナーゼ（シグマ社）の
存在下で３７℃にて１時間培養した。反応の完結後、試
料中の残存蛋白質分解活性を、３３％（、／、）の最終
ｆ）度までＨＩ　Ｆ　ＣＳを添加して中和させた。次い
で、これら試料をＧＭ−２７６７細ｆｌａに対するミク
ロ滴定により残存ＩＦＮ−誘発抗ウイルス活性につき分
析した。

そのデータを下記に示す： ＩＦＮ−８の蛋白質分解感度 トリプシン　１００　０　０　０ ３３　０　０　０ １０　１　２　４ ′５．３　８　８　１６ ０　１５　１６　３２ プ四ナーゼ　１０　０　０　０ ３．３０　０　０ ０　１６　１５　３２ これらのデータは、試料中のＩＦＮ−６につき観察され
た抗ウィルス活性が蛋白質分解酵素での処理による活性
の完全失活に基づく蛋白質成分の存在に起因することを
示している。さらに、ＩＦＮ−８の蛋白質特性は、ＲＮ
Ａ及び蛋白質合成抑制ハ１１がＩ　Ｆ　Ｎ−εの生産を
阻止するという事実からも明らかである。

例に の例は酸性ｐ　）Ｉに対するＩ　Ｆ　Ｎ　−ａの安定性
を示している。ＩＦＮ−６は、例３にしたがってＮＤＶ
によりひと表皮細胞の誘発により生成させた。培地を収
穫した後、これを３つの部分に分けた。第１の部分にお
いては、例５に記載したように、ＨＣｌでｐＨ２まで酸
性化することによりウィルスを失活させた。第２の部分
はミリポア０１３１０フイルタ（マサチュセツツ州、ベ
ッドホード在、ミリボア・コーポレーション社の１００
，０００分子量範囲）を通して５日間濾過することによ
りウィルスを除去した。第３の部分は、予めＢＳＡの１
％溶液に４詩間浸漬させたミリポアＰＴＭＫ０１３１０
フィルタ、すなわちｉｏｏ、ｏｏｏ分子量範囲のフィル
タに通した。

各場合につき、得られた培地をＩＦＮと残存ウィルスの
存在との両者につき分析し１こ。これらの結果を下記に
示す： 酸性ｐ　ｒ−ｒに対するＩＦＮ−εの安定性ｐＨ２，５
日１川　ｉ、１ｘｉｏｓ　ａ　１２８ＰＴ■（００１０
１，Ｉ　Ｘｌ　０’　０　１２８による５濾過 いずれの試料も何らウィルス活性を示さなかったが、６
試ｒ１は同旦のＩＦＮ−ε活性を有した。

これは、ＩＦＮ−ａ活性が酸性ｐＨで安定であることを
示している。

例７ ＩＦＮ＝６（例３にしたがいひと表皮Ａｌ１胞のＮＤｖ
誘発により生成）、Ｉ　ＦＮ−ａ、ＩＦＮ−β（ＮＩＩ
（）及びＩＦＮ−γ（テキサス州、ガルベストン在、テ
キサス医科大学、ニス・バロン氏カら得た）の免疫学的
性質を比較した。各インタ７エロンの中和滴定を、抗−
ＩＦＮ−α（ＮＩＨ）、Ｋ　−Ｉ　Ｆ　Ｎ−β（Ｎ　Ｉ
　Ｈ及びワイ・エッチ・タン、す１＋々°−了ルノく−
々科］−カルガリー！ｒ−カルガリ−大学）、抗−Ｉ　
ＦＮ−γ（ニス・バロン）及ヒこれら抗血清の混合物を
用いてずｊ′なった。Ｊｌｌ当な抗血清の一連の２倍希
釈物を、９６穴のミクロ４Ｉ；１定板を用いてＭ　Ｅ　
Ｍで作成した。各ＩＦＮ調製物のＳ　２　ＩＵ／ｍｌｉ
〜２　Ｉ　ｔＪ　／　ｍｌの範１４ｉｉの希釈物をこれ
らの穴に加え、そしてプレートを先ず６７℃で１時間、
次いで４℃にて１時間培養して抗体−ＩＦＮ’ｄ合体を
生成させた。次いで、ひとｔｌ（維芽細胞（ＧＭ−２７
６７：ヒユーマン・ミュータント・セル・レボジトリ−
）を１個の穴につき２　Ｘ　１０４個の細胞で接種し、
そして２０〜２４時間３７℃で培養した後、標帛量の小
水胞性口内炎ウィルス（１ｐｆｕ　／細胞）を接種した
。３７℃で２４〜４８時間後、各穴をウィルスＹ３発さ
れた最１１胞ｈｉ１理学的効果（ＣＰＥ）のインタ７エ
ロンによる抑制につき顕＠鏡下で観察した。これらの結
果を下記に要約する： ＩＦＮを中和するのに必要とされる抗血清の量４　６２
　＞３，０００　１２５ ＩＦＮ−β　Ｂ　＞４０００　３７５　７５０（Ｎ　Ｉ
　Ｈ標ｊ町　４　＞３．０００　１８８　７５０２　＞
３．０００　１８８　４７ ＩＦＮ−ａ　８　＞３，０００　＞５，０００　１８８
ＡＩＬ−ＩＶｂ４　＞３．［１００３７５１８８２＞３
，０００　３７５　４７ ＩＦＮ−ε　１６　＞４０００　＞５，０００　５７５
ＡＯＢｃ　８　＞３，０００　＞５．０００　３’７５
２　＞５＋０００　１，５００　９４ 繊維芽細胞ＩＦＨに対する比較羊血清は中和活性を示さ
なかった。

Ｎ、　Ｄ、　＝測定せず ａ；各ＩＦＮに対し羊で調製した抗血清ｂ；表表皮ケラ
チン細胞ら得た。必らずしも繊維芽細胞を含有せず（Ｎ
ＤＶ誘発） Ｃ：繊維芽細胞を含まない表皮ケラチン細胞から上記の
表から次のことが判る： （ａ）ＩＦＮ−αは、抗−α及び抗α／抗−β抗血清の
混合物の両者により中１１１される。予想通り、同量の
ＩＦＮ−αを中和するには抗−αの２倍の抗−α／βを
必要とする（同量の抗血清は同Ｌ１のＩＦＮ−αを中和
する）。

（ｂ）ＩＦＮ−βは抗−β及び抗−α／抗−β抗血清の
両者により中和される。ここでも、同量のＩＦＮ−βを
中和するには、抗−βの２倍の抗−α／βを必要とする
。

（ｅ）　同量のＩＦＮ−６を中和するには抗−ρの半分
以下の抗−α／抗−β混合物しか必要しない。

ＩＦＮ−εは、ＩＦＮ−γに［ゾＪする抗血清と反Ｊｉ
ｉｉしない。

この例は、ＩＦＮ−１が免疫学的にＩＦＮ−α及びＩＦ
Ｎ−β及びＩＦＮ−γとは異なり、したがってこれら公
知のひとインタフエロンとは化学的に異なることを示し
ている。

例８ 例７に示した血清学的証明の他、部分的に免疫化ｒさせ
たＩＦＮ−６を中和実験に使用した。このインタフエロ
ンの試料に抗−βＩ　Ｆ　Ｎ　（Ｎ　Ｉ　Ｉ（から入手
したポリクローン又はワイ・エッチ・タンから手入した
モノクローン）を添加した。混合物を３７℃にて１時間
ＩＦｉｌしだ後４℃にて１時間培養し、抗体−ＩＦＮ複
合体を生成させ、次（Ｓでこの複合体を過剰の抗体と共
に３０μを対反応混合物１，５μＬの比における蛋白質
Ａ七７アローズ（シグマ社）の存在下に複合若しくしよ
非捏合ＦＩＴ、血清を培養して除去した。残存する非複
合ＩＦＮを第２回の免疫沈澱にかけ、そして試料をＣＰ
Ｅ抑制分析により上記したようにＩＦＮ活性につき分析
した。これらの結果を下記に示す： 予備法ＶさせたＡＯＢＩＦＮ−εを例７におけると圧線
に同じく行なった中和試験に使用すると、次の結果が得
られた： ＩＦＮを中和するのに必要とされる抗血清の量４　１．
５００　９４ １　１２　２４ 桟維芽ＩＦＮに幻する比較羊血清は中和活性を示さなか
った。

上記表のデータは、Ｉ　ＦＮ−ａｎ剤の１部が２つの異
なる抗−β抗体を使用した場合にも抗−β抗血清により
中和されへないこ□とを示している。

しかしながら、抗−ρ抗血清により充分沈設させた後に
も、ＩＦＮ−８の追加部分を混合粒−α／β抗血清によ
り沈澱させることができる。これらのデータは、Ｉ　Ｆ
　Ｎ−εが免疫学的及び化学的に他の公知のひとインク
フエロンとは異なることをさらに証明している。

例９ 例３にしたがいＮＤＶによりひと上皮細胞を誘発させて
生産したＩＦＮ−εは、多くの不動化リガンドでの親和
性クロマトグラフィーにより精製かつ濃縮することがで
きる。限定はしないが、これらは反応性の赤色アガロー
ス、フェニルセファロース（ミズウリ州、セントルイス
在、シグマ・ケミカル・カンパニー社）、プロジオン赤
色アガロース、フェニルアガローズ（メリーランド州、
ガイテルスブルク在、ｌｌＲＬ社）、グリコゲルＢ１Ｎ
−（Ｘ−カルボキシプロピオニル）アミノデカ＞　（Ｃ
ＰＡＤ　）７ガロース及びＮ−ピロメリチルアミノデカ
ン（ＰＭＡＤ）アガロース（イリノイ州、ロック７オー
ド在、ピアス・ケミカル・カンパニ、−社）を包含する
。

９００単位のＩＦＮ−８を６有するＭ　Ｅ　Ｍ中のＩ　
Ｆ　Ｎ　−６８ｍｅをｏ、　ｓ　ｍｅの反応性赤色アガ
ロースカラムに加えた。このカラムを１０−の２０ｍＭ
燐酸塩燐酸塩緩衝液　Ｈ７，４）で洗浄した。次いで、
ＩＦＮを１Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ燐酔塩
緩ｇｉ液における５０％エチレングリコールの５２−で
溶出させた。これら７ラクシヨンのそれぞれを２０ｍＭ
の燐酸塩緩衝液の同容艮に集めてエチレングリコールを
希釈した。カラムを最終的に追加５−の２０ｍＭ燐酸塩
燐酸塩緩衝液した。

この蛋白質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ−２
８０）により測定した。これらの結果を次の表に示す： 第１回の２つのエチレングリコールフラクションを合し
、イけられた７ラクシヨンはカラムに加えられたＩＦＮ
−εの全部を含有し、初期材料に比べて６倍の精製を示
した。

他の同様な実験において６８ゴまでのＩＦＮ−一をカラ
ムに加え、そしてＩＦＮを最終容量８　ａｔで回収した
。これは材料の８．５倍の濃度を示す。

ＩＦＮ−ａをこれら不動化リガンドの２種若しくはそれ
以上に！’ＣＩ吹に加えると、より大きい精製度を得る
ことができる。たどえば、ＩＦＮ−ε試料をＣＰＡＤカ
ラムに加え、そして上記のように同じ手順で溶出させた
。混合したＩＦＮ自有フラクションは約９倍の精製度を
示し、これを２０ｍＭ燐酸塩緩行液に対し透析してエチ
レングリコールを°除去した。次いで、この試料をＰＭ
ＡＤアガロ〜ス力ラムに加え、同様に展開させた。ＩＦ
Ｎ−聰を７０−１００％収率で回収し、これは全蛋白質
に関しさらに５倍の精？！度を示した。

この例は、ＩＦＮ−８を不動化リガンドのいずれか１つ
又は組合せにより精製しうろことを示している。

例１０ 未分別ＩＦＮ−６を先ず５００×２にて２０分間遠心分
離した。上澄液を１４，１１負′ｊされた気孔ガラス（
Ｃ−Ｐ−Ｇ・）を有するフィッシャー・ロータラック（
エレクトロヌクレオエックス・インコーポレイション社
）において４℃にて伝動混合した。

０、２８９の調節気孔ガラスを３０　ｍｌの培養上澄液
につき使用した。６時間後、この上澄液を取出し、かつ
８１節された気孔ガラス玉をカラム（２，５Ｘ３、１　
ｃ！ｎ）に充填した。カラムを先ずカラムの４信組のＰ
ＢＳで洗浄し、次いでカラムの４倍量のｔ　ＯＭ　Ｎａ
Ｃ１−２０ｍＭ燐ＡＱ　！ＩＫ　ｒｌ　６ＩＩ　ｒｖ：
　（ｐ　ＨＩ３）で洗浄した。Ｉ　Ｆ　Ｎ−εをカラム
の４　’ＩＪ　ｊｌ’＋の５０ｖ／ｖ％エチレングリコ
ールーｔ　ＯＭ　ＮａＣ１−２０ｍＭ燐酸塩緩術液（ｐ
　）Ｉ　１４　）で溶出させ、回容量のｔ　ＯＭ　Ｎａ
Ｃ１−２０ｍＲ（憐酸塩紛凸液中に集めてエチレングリ
コールの最１％　ｎ度２５％にした。

ＩＦＮ−ａを含有する７ラクシヨンを限外濾過により１
．０〜１６　ｔｎｅまで濃縮し、ぞしてこれを２５％ｘ
チレングリコール（ｖ／ｖ）−１，０Ｍ　ＮａＣ１−２
０ｍ　Ｍ燐酸塩綬衝液（ｐ　Ｈ７，４）で平衡化させた
ポリアクリルアミド−アガロース（ウルトラゲルＡｃＡ
３４）カラム（ｔ６×８５備）に加えた。吹いで、Ｉ　
ＦＮ−ａを、毎時６．０　ｍｇの流速で平衡化級往Ｉ液
により溶出させた。２．０−の７ラクシヨンを集め、そ
のＩ　Ｆ　Ｎど蛋白賃金りとにつき分析した（ラウリー
分析）。これらの結呆を下記に示す：例１１ 例１０により部分的に精製された粗製の（ｐ−ＩＦＮ−
６）及び抗−ねずみインタフエロンー吸収されたｐ−Ｉ
ＦＮ−１を含めＩＦＮ−ｇ、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β
の調製物を、ラメリの方法にしたがうＳＤＳゲル電気詠
動を用いて分子量分析にかけた。これら試料を室温にて
１．０％ＳＤＳと０．０５　Ｍのトリス−ＩＣ１（ｐＨ
＆８　）緩衝液と１０％（、／＊）グリセリンと０．０
０１％ブロムフェノールブルーとの存在下に１時間培養
し、これを１２．５％のポリアクリルアミドゲルに充填
し、そして約１６時間流した。電気詠動の後、分子量標
ｎ＋（を含有するレーンを染色した。ＩＦＮ含有のレー
ンを３艷のスライスに切断し、そして０．５でＳＤＳを
含有するＰ　Ｂ　Ｓ　０．５　ｍｇと共に室温で２０時
間振どうすることにより抽出した。これらフラクション
の分析をＧ　Ｍ　−２７６７ｉｉ’ｔ！ｌ胞で行ない、
各活性ピークの分子量をゲルにおけるその位置と分子ｊ
Ｖｋ　（３帛との比較から計算した。これらの結果を下
表に示す： ＾＾＾＾ハ＾ ×　− 荀　與　は ■Ｈ１！Ｉ ＴＦＮ−ε試Ｊ−Ｆにつき得られた３つの７ラクシヨン
は全て、ＧＭ−２７６７１１Ｉ＋胞に対し抗ウィルス活
性を示す。Ｉ　Ｆ　Ｎ　−６から由られた２２０×１０
３ｍｗフラクションは、生育１’＜、ｉｆ細胞（ＭＤＢ
Ｋ）に対し活性を示さない。他の２つのＩＦＮ−εフラ
クション（１７，５Ｋ　、　２０．　ＯＫ　）は、Ｍ　
Ｄ　Ｂ　Ｋ細胞に対しＧ　Ｍ　−２７６７Ａｊ：１１１
４におけるそれの約２５％の活性であった。

例１２ ＩＦＮ−ε（例６にしたがいひと表皮Ａｔｔ＋胞からＮ
ＤＶｔう発させて生産したもの）とＩ　Ｆ　Ｎ−α（ナ
ショナル・インスチチュート・Ａブ・ヘルスからイけた
ちの、Ｎ　Ｉ　Ｈ）どＩＦＮ−β（Ｎ　Ｉ　Ｈ）との抗
ウイルス能力を、正常ひと表皮ｈ」１１胞対正常ひと二
倍染色体繊維芽細胞の培養物において比較した。３　ｆ
、ｌｔのＩＦＮ調製物の一連の希釈物を、正常なひと表
皮細胞及び正常なひど籾：維芽細胞の標準培養物と共に
ミクロ測定板の穴に加えた。３７℃で１８〜２４時間培
養した後、穴のそれぞれにおける細胞に標べへＫＬ、の
小水飽性ｌ」内炎ウィルス（１ｐｆｕ／細ｊｔｉ　）を
接種した。３６−９６１１．ｆｌｉｉｊ　１ケ（比較が
１０［１％の細ｊ泡夕Ｔｉ　ｂＪ＜を示した時）、各ン
（をウィルスに対する耐性の分４１［につきｉｌ′ｉ目
最現下でｆｆ１４察した。これらの結果を下記に“ソ約
する。

第１ｉ１表 ＩＦＮ　−６３２−６４５１２−２０４８ＩＦＮ　−α
　１２８−５１２　６４ ＩＦＮ−β　３２−２５６　８−３２ ８、ジエー・ビルセフから得られた正″）；ヤひと二（
Ｈ’ｉ染色体繊イ１仁芽にＩＩＩ　Ｉｉ説（Ｎ、Ｙ、Ｕ
、　、ニューヨーク州、ニューヨーク） 上記の表から明らかなように、上皮＾４１１１ｉ）１の
■月ＮＡＩＪｉ’ｔ　号ニヨリ生１ｆｉ　サレ７．　Ｉ
　Ｆ　Ｎ　−６４；１、ｋ　ｉｉＡ　内’　１ｌｉｌ　
ｌＩ：（に対するよりも上皮細胞にス・ｊし抗つイルス
ハ１１としてずつと大きな能力を有する（約１６イ１°
７まで）。

ひと白血球及びリンパ芽細ＩＪＩχからイ（ＩられたＩ
）　Ｎ　Ａ暗号から生産されるＩＦＮ−αは上皮にグ、
Ｊするよりも繊雁芽細胞に対しより大きい１」ヒカをイ
ｊシ（８倍Ａ：で）、又ｔ；ちＭＩＲ；！Ｊ：細ｌ己か
らイυられたＤＮＡ暗号から生産されるＩ　Ｆ　Ｎ−β
は上皮；１ｉｌｌ　ｌ１ｔｔに対するよりもへ＃ｊ’Ｈ
芽Ａ”ＪＪ　＋１”、＋に対しより大きい１１ヒカを有
する（３２倍まで）。

伊１１３ 例１１の手１１０を使用して牛’ｌ’ｉ１１％訓ｊ、ｌ
　（ＭＤ　Ｂ　Ｋ　１ｉｒＪ１１抱Ａ１’ＣＣＣＣＬ２
２）対ひと三陪染色体伝オ、１１：芽ろ！ｉｌｌ胞（染
色体２１の３つのコピー：　ＧＭ−２７６７ひと突然変
異、ｆｉｌ＋胞レボジトリ−４７、ＸＸ、Ｔ２１）に１
−′ＪするＩＦＮ−α、β、γ及び６の比抗ウィルス活
性を分析した。これらの分４ノ１結果を下記に示す・ α　＞５１２　５１２ β　０１２８ γ　０１２８ ８−１６　３２ ＩＦＮα、β及びγに対する結シｌ：　ｉ’ｊ’、　ｊ
ｉｅ来）°１に告されたデータに一致する。ＩＦ″Ｎ−
εに久］する結果は１、この新規なインタフエロンがＧ
　Ｍ　−２７６７に夕、・１し、生育Ｆｉ　＃ｌｌＩ胞
に対するよりも約２〜４　（ｉ”ｉの活１゛１−を有す
ることを示す。

例１４ さらに新規なインクフエロンは、ひとリンノ′：当−細
胞（ダウジ細胞）の増殖！ｉｌｉ止により判定して、抗
繁殖活性を示す。約１０．０００個のひとリン、＜芽細
胞を２００μｔの培地と共にミクロ＋１ｔｉｌ定板σ）
各穴に接種した。次いで、ＩＦＮ−α、β及びεの種々
の希釈′吻を各穴に加え、そして１１４．２１１及び４
日後に生存、細胞の個数を、；１絨した。これらの結果
を次表に示す： ダウジｆ：ｔｉｌ胞分４Ｊｉ 生存細胞数／穴（Ｘｉ（］　） Ｉ　Ｆ　Ｎ　４：Ｒｊ、ｒｉ及Ｕ”ｔｆ３１Ｍ　Ｉ　Ｄ
［ｌ　２ｔＪＩｊ　４ＬＩ［４α−１００ｕ　６．０　
４８　６．０ １０ｕ　４．８　５．２　６．０ β−１００ｕ　７．２　９．６　６．４１０ｕ　５．２
　９．６　１８．４ ε−１００ｕ　６．０　５．２　４．８１０ｕ　５．６
　５．２　６．０ 比較（ＩＦＮなし）　８，０　２１．５　６７これらの
結果は、１０単位のＩＦＮ−εがダウジ細胞増殖を９０
％以上抑制しうることを示している。

例１５ １　Ｆ’　Ｎ−α、β及び６の試料を炉ｉ　ｉ’ｉ象塩
級＆塩水（ＰＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）及びＳＤＳとメルカプトエタノール（ＢＭＥ）と尿素
との混合物によりそれぞれ１００℃にて平衡化さぜた。

洗剤ＳＤＳは、蛋白質ノ１（へ成を変化させることによ
り蛋白質を変性させることが知られており、ＢＭ！はジ
スルフィド結合を減少さゼる。

ＩＦＮ−α、β及び６はこれらの試桑に対しその感度が
著しく相違することが見出された。特に、ＩＦＮ−αは
Ｓ　Ｄ　Ｓ　ｆｉｌ独において安定であったが、ＳＤＳ
と尿素とＢＭＥとの混合物の存在下で実質的に失活され
た。ＩＦＮ−βはＳＤＳ単独において殆んど失活された
が、５Ｉ）Ｓ／尿素／ＢＭＥ混合物において安定であっ
た。ＩＦＮ−６はＳＤＳ単独においても或いはＳＤＳ／
１３ＭＥ／尿素混合物においても比較的安定である。１
００’ＣのＰＢβ中において、これら３種のインタフエ
ロンの全てにつき５％未満の活性が残存する。

同様な実験において、予めｓＤｓ−ｎＪＶｉｇ混合物に
より失活させたＩＦＮ−αは、５ＤＳ−ＰＢＳ混合物に
より１００℃で平衡化させると再賦活されること、ＳＤ
Ｓ単独で予め失活させたＩＦＮ−βはＳＤＳ、ＢＭＥ、
尿素及びＰＢＳの混合物中で再賦活されうること、及び
ＰＢＳ中で予め失活させたＩ　Ｆ　Ｎ　−ａ、はＰＩＩ
Ｓ／ＳＤＳの存在下でＢＭＥ／尿素が存在しても或いは
存在しなくても１００℃で平衡化させると再賦活されう
ろことが確認された。これらの観察は、さらに本発明の
ＩＦＮ−ε潤製動の特ダへ性を１１Ｆ明している。

例１に の実験により、青色セファロースカラム（ファルマシア
社）に対するｒｐＮ−ａ及びｒＦＮ−βの結合及び溶出
４＝Ｍ性を比軸した。これらのカラムは製造業者の指示
にしたがって調製し、ＰＢＳ中のＩＦＮ−β又はＩ　Ｆ
　Ｎ　−ｇの試料のいずれかを室温で充填した。溶出は
、ＰＢＳ中のｉ、０ＭＮａＣ１及び２０　ｍ　Ｍ（Ｊｌ
“１ジナトリウム綬傭簡における５０％（Ｖ／Ｖ）エチ
レングリコールを用いて行なった。各インク７エロン調
剋物を異なる青色セファローズロットを含有する２つの
カラウにて操作し、次のデータが得られた： ｔＯＭＮａｃｌによる溶出　２．７−４．３　１９．３
−３０５０％エチレングリコール／ ２０　ｍ　Ｍ燐Ｍ塩４’Ｖ　ｇｔ液液中　５１．９−５
２．３　６［ＬＯ−７８，２１，０Ｍ　ＮａＣ１による
溶出 この例は、Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ａ及びＩＦＮ−βが青色セフ
ァロースに対し異る親和性を有しかつ異なる溶出挙動を
有することを示している。１７色セファ四−スは約９０
〜９７％のＩＦＮ−６活性を結合するのに対し、僅か約
６０％のＩＦＮ−βが同じ条件下で結合される。さらに
、ＩＦＮ−６の２０〜３０％が１．　ＯＭ　ＮａＣ１を
用いて回収されるのに対し、ＩＦＮ−β活性の僅か３〜
４％のみが同じ条件下で回収される。最後に、約８０％
までのＩＦＮ−６活性がｓ　ｏ％エチレングリコール／
　１．　ＯＭＮａＣｌの組合せにより溶出されるのに対
し、（’ｒ″ゼか約５０％のＩＦＮ−β活性が同４．）
）な条件下で回収される。

争、 又−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ひと上皮細胞のＤＮＡ暗号の少なくとも１部を
   含有する生細胞を培養して抗ウィルス活性を有するイン
   タ７エロンを合成し、この培養物からインタ７エｐンの
   豊富なフラクションを収穫する工程により製造される抗
   ウィルス活性を有するインク７エロン製剤において、 （ｉ）ｐＩ（２にて安定であり、 （１１）抗ウィルス活性が蛋白質分解酵素により失活さ
   れ、 （山）インタフェレンα又はインタフェレンγに対する
   抗体との交叉反応性を示さず、かつＧＶ）ＭＤＢＫ牛腎
   臓細胞に対する抗ウィルス活性がひと三染色体繊維芽細
   胞（ＧＭ−２７６７）に対する活性のμ〜棒である ことを特徴とするインタ７エｐン製剤。 （２）　培養物がひと上皮細胞培養物である特許請求ｆ
   ）１［ｆｌｆ４１項記載のインタフエｔ−＞　製剤。 （３）培養物が形質転換された成熟絞細ｆｌａからなる
   特許請求の範囲第１項記載のインク７エロン製剤。 （４）培養物が、ＤＮＡ暗号の１部を組換ＤＮＡ技術に
   より細胞中へ挿入した細胞からなる特許請求の範囲第１
   項記載のインク７エロン製剤。 （５）抗−α抗血清と抗−β抗血清との混合物に対する
   交叉反応の独特なプロフィルをイｆし、同単位の中和剤
   に基づき抗−β抗血清のみで中和されるより２倍の量の
   インタ７エ買ンが前記混合物により中和されることを特
   徴とする特ｇ′Ｆ請求の範囲第１項記載のインク７エロ
   ン製剤。 （６）　Ａ　、ひと上皮細胞のＤＮＡ暗号の１部を含有
   する生細胞の培養つを調製し、 Ｂ、前記細胞をインタ７エロンの合成を促４にする条件
   下で培地中にて培養し、 Ｃ１前記細胞から前記インタ７エロンの豊富な７ラクシ
   ヨンを収穫する 工程からなるインタ７エｐン製剤の製造方法において、
   前記インタフエロンが、 （りｐＨ２にて安定であり、 （１１）抗ウィルス活性が蛋白質分解酵素により失活さ
   れ、 （ｉｉｉ）　インタ７エロンα又はインタ７エロンγに
   対する抗体との交叉反応を示さず、 （ＩＶ）ＭＤＢＫ牛腎臓細胞における抗ウィルス活性が
   ひと二倍染色体繊維芽細胞（ＧＭ−２７６７）に対する
   活性のＡ−にである ことを特徴とするインタ７エｐン製剤の製造方法。 （７）生細胞の培養物がひと上皮細胞培養物であり、か
   つ工程Ｂの前にウィルスを使用して前記インタフエロン
   を生産させるよう前記細胞を誘発させる特許請求の範囲
   第６項記載の方法。 （８）工程Ａの培養物が形質転換された成熟核細胞から
   なる特許請求の範囲第６項記載の方法。 （９）工程Ａの培養物が、ＤＮＡ暗号の１部を組換ＤＮ
   Ａ技術により細胞中に挿入した細胞からなる特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 （１０）　ウィルスを二ニー牟ヤッスル病ウィルス及び
   センダイウィルスよりなる邸から選択する特ｉ′Ｆ請求
   の範囲第７項記載の方法。 （１１）ウィルスがニューキャッスル病ウィルスのパン
   コラスキ株である特許請求の範囲第１５項記載の方法。 （１２）細胞培養物を表皮、結膜、鞘藤及び食道よりな
   る卵から選択されるひと上皮細鉱から採取された細胞か
   ら増殖させる特許請求の範囲第７項記載の方法。 （１３）処理すべき細胞全有効鼠の特ｇ’ｒ請求の範囲
   第１項乃至第５項のいずれかに記載のインタフニシン製
   剤と接触させてウィルス感染ご抑制すルコとを特徴とす
   る、ウィルス感染を抑制するための生細胞の処理方法。 （１４）生細胞がひと上皮細胞である特許請求の範Ｕ」
   第１３項記載の方法。 （１５）処理すべき細胞を有効量の特ａ１・請求の範囲
   第１項乃至第５項のいずれかに記載のインタ７エロン製
   剤と接触させて増殖を抑制害ることを特徴とする、新生
   組織生細胞の増殖を抑制する新生組織。 生細胞の処理方法。 （１６）新生組線生細胞がひと上皮細胞からなる特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。