JPH0574575B2

JPH0574575B2 -

Info

Publication number: JPH0574575B2
Application number: JP60166754A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Mihashi; Masashi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1985-07-30
Filing date: 1985-07-30
Publication date: 1993-10-18
Also published as: JPS61115028A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示
す新リンホカインを有効成分として含有せしめ
た抗腫瘍効果増強剤、とりわけ、化学療法剤に対
する抗腫瘍効果増強剤に関する。一般に、化学療法剤は、悪性腫瘍の化学療法剤
としてアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生
物質、植物アルカロイドなどが、単独で、又は２
種以上組合せて用いられている。しかしながら、化学療法剤は、患者に与える副
作用が強すぎること、抗腫瘍スペクトルが狭小で
あること、薬剤耐性腫瘍を誘発しやすいことなど
の欠点を有している。本発明者等は、化学療法剤におけるこれら欠点
の改善を目ざし、リンホカインに着目して化学療
法剤に対する抗腫瘍効果増強剤の研究を続けてき
た。従来、腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有する
リンホカインとしては、ヒトを含む動物由来のリ
ンホトキシンや、ヒト以外の動物由来のツモア
ネクロシスフアクター（以下、「TNF」と呼
ぶ）などが知られている。リンホトキシンは、青木隆一ほか共著「リンホ
カイン」新免疫学叢書６、87−105頁（1979年）
医学書院、ブルームビーアール（Bloom B.
R.）とグレイドピーアール（Glade P.R.）
との共編「インビトロメソツズインセル
メデイエイテツドイムニテイ（In vitro
methods in cell・mediated immunity）」アカ
デミツクプレス（Academic Press）（1971年）
および「セルラーイムノロジー（Cellular
Immunology）」第38巻、388〜402頁（1978年）
などに記載され、TNFは、カーズウエルイー
エイ（Carswell E.A.）など、「プロシーデイン
グスオブザナシヨナルアカデミーオブ
サイエンスオブザユーエスエイ
（Proceedings of the National Academy of
Science of the U.S.A.）」第72巻、第９号、3666
〜3670頁（1975年）およびイーピツク（E.
Pick）編「ツモアネクロシスフアクター
インリンホカインズ（Tumor Necrosis
Factor in Lymphokines）」第２巻、235〜272
頁、アカデミツクプレス（Academic Press）
（1981年）などに記載されている。本発明者らは、リンホカインについて多年研究
してきた。その結果、従来知られているこれらリ
ンホカインとは全く違つた理化学的性質を有する
新リンホカインの存在を認め、その製法を確立
し、各種悪性腫瘍細胞に対する細胞障害活性を認
め、さらに、化学療法剤に対する抗腫瘍効果の増
強を認め、その用途を確立して本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、理化学的性質が、分子量 20000±2000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、RF＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エ
チルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに
難溶乃至不溶呈色反応ローリー法またはミロクビユーレツト法で蛋白
質陽性反応を示し、フエノール硫酸法またはアン
トロン硫酸法で糖質陽性反応を示す作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細
胞に対する細胞増殖抑制活性およびインターフエ
ロン活性を実質的に示さず水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安
定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0乃至
11.0の範囲で安定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である
新リンホカイン（本明細書を通じて、本物質
を新リンホカインと言う。）を含有せしめた
抗腫瘍効果増強剤に関する。新リンホカインの製法は、例えば、新リンホ
カイン産生能を有するヒト由来の細胞、例えば
白血球、リンパ球、培養株化された細胞などに誘
導剤を作用させて生成せしめればよい。ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取
した血液を分離して調製すればよい。培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従つ
て、生体外（in vitro）で増殖させた細胞が使用
できる。しかしながら、本発明の場合には、培養株化さ
れた細胞の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内
に直接移植するか、または拡散チヤンバー内へ接
種して、その温血動物の体液の供給を受けながら
増殖させる方が望ましい。即ち、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
は違つて、高価な血清などを含む栄養培地が不
要、または大幅に節約できるばかりではなく、細
胞増殖中の維持管理も極めて容易であり、その
上、得られた細胞から誘導生成される新リンホカ
イン活性が高い特徴を有している。ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株
化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物
体内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給
を受けることのできる拡散チヤンバーを動物体内
に埋設して通常の飼育をすれば、温血動物体から
供給される栄養物を含有する体液を利用してその
細胞が容易に増殖しうるのである。更に、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
比較して、この細胞の増殖が安定であること、そ
の増殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多い
こと、更には、細胞当りの新リンホカインの収
量が著しく増加することも大きな特徴である。本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細
胞は、ヒト以外の温血動物体内に移植して容易に
増殖し得て、しかも新リンホカイン産生能を有
する細胞であればよく、例えば「蛋白質核酸酵
素」第20巻、第６号、616〜643頁（1975年）に記
載されているヒト由来の各種株化細胞を用いるこ
とができる。とりわけ、「ジヤーナルオブク
リニカルマイクロバイオロジー（Journal of
Clinical Microbiology）」第１巻、116〜117頁
（1975年）に記載されているNamalwa細胞、ア
イミヨシ（I.Miyoshi）著「ネイチヤ（Nature）」
第267巻、843〜844頁（1977年）に記載されてい
るBALL−１細胞、TALL−１細胞、NALL−１
細胞、「ザジヤーナルオブイムノロジー
（The Journal of Immunology）」第113巻、
1344〜1345頁（1974年）に記載されているＭ−
7002細胞、Ｂ−7101細胞、「組織培養」第６巻、
第13号、527〜546頁（1980年）に記載されている
JBL細胞、EBV−Sa細胞、EBV−wa細胞、
EBV−HO細胞、MOLT−３細胞や、その他
BALM−２細胞、CCRF−SB細胞（ATCC CCL
120）CCRF−CEM細胞、DND−41細胞などの
株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単
核細胞、顆粒性白血球細胞などを各種ウイルス、
薬剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞な
どが好適である。また、これらヒト由来の細胞の新リンホカイン
産生能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレ
ングリコールやセンダイウイルスなどを利用する
細胞融合の手段、DNAリガーゼ、制限酵素（ヌ
クレアーザ）、DNAポリメラーゼなどの酵素を利
用する遺伝子組み換えの手段などによつて処理
し、その増殖速度を高めたり、細胞当りの新リン
ホカイン産生能を高めたりして使用してもよ
く、本明細書に記載する株化細胞のみに限定され
るものではない。これらの細胞は、後に述べる新
リンホカインを誘導生成させるまでの過程で、
単独、または２種以上を混合して自由に利用され
る。必要ならば、これに、例えばヒトから採取し
調製される白血球、リンパ球などを併用すること
もできる。本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞
が増殖し得るものであればよく、例えばニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサ
ギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、モルモツト、ラツ
ト、ヌードラツト、ハムスター、普通マウス、ヌ
ードマウスなどの哺乳類が使用できる。これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけ抑えるため、使用する動物は
できるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、また
は新生期、幼少期のものの方が好ましい。また、これら動物に例えば200〜600レム程度の
エツクス線若しくはガンマ線を照射するか、また
は抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなど
の前処理をほどこして、免疫反応を弱めて移植し
てもよい。使用する動物がヌードマウスあるいはヌードラ
ツトの場合には、成長したものであつても免疫反
応が弱いので、これらの前処理を必要とすること
もなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植で
き、急速に増殖できるので特に好都合である。また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば
先づハムスターに移植し増殖させた後、この細胞
を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒ
ト以外の温血動物間で移植してヒト由来の細胞の
増殖をより安定化したり、更にそれらから誘導生
成される新リンホカイン量を増加させることも
自由である。この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱
間、同門間移植であつてもよい。ヒト由来の細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。また、動物体内にヒト由来の細胞を移植するこ
となく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾
過膜、例えば孔径約10^-7〜10^-5ｍを有するメンブ
ランフイルター、限外濾過膜またはフオローフア
イバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡
散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設し
て、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受け
つつ、そのチヤンバー内で前述の培養株化された
ヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。また必要に応じて、このチヤンバー内の栄養物
を含む溶液を動物体内の体液と接続し、灌流させ
るようにしたチヤンバーを、例えば動物体表に取
付け、チヤンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態
をその表面に設けた窓を通して透視できるように
することも、また、このチヤンバー部分のみを着
脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一
杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量
を更に高めることもできる。これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒ
ト由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、
ヒト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常
１〜10週の期間で目的を達成することができる。
このようにして得られるヒト由来の細胞数は動物
個体当り約10⁷〜10¹²個、またはそれ以上に達す
ることも見出した。換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来
の細胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約
10²〜10⁷倍、またはそれ以上にも達し、生体外の
栄養培地に接種して増殖させる場合の約10¹〜10⁶
倍、またはそれ以上にも達して、新リンホカイン
の製造のために極めて好都合である。このようにして増殖させたヒト由来の細胞から
新リンホカインを誘導生成させる方法は自由で
ある。それが、増殖した動物体内のままで新リン
ホカイン誘導剤を作用させることもできる。例
えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来
の細胞に、また皮下に生じた腫瘍細胞に、新リン
ホカイン誘導剤を直接作用させて新リンホカイ
ンを誘導生成させ、次いで、その血清、腹水ま
たは腫瘍から新リンホカインを精製採取すれば
よい。また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体
内から取り出し、生体外で新リンホカイン誘導
剤を作用させて新リンホカインを誘導生成させ
ることもできる。例えば、腹水中で増殖したヒト
由来の細胞を採取し、または皮下に生じたヒト由
来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細
胞を約20〜40℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約
10⁵〜10⁸／mlになるよう浮遊させ、これに新リン
ホカイン誘導剤を作用させることによつて新リ
ンホカインを誘導生成させ、これを精製採取す
ればよい。更に、ヒト由来の細胞を拡散チヤンバー内で増
殖させた場合は、増殖させた細胞をチヤンバー内
のままで、またはチヤンバーから取り出して、新
リンホカイン誘導剤を作用させ、新リンホカイ
ンを誘導生成させることもできる。また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用
して得られるヒト由来の細胞を、必要ならば、更
にインビトロで１〜４日間程度培養し細胞の増殖
世代を同調させるなどした後、新リンホカイン
誘導剤を作用させ新リンホカインを誘導生成さ
せることも自由である。また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先
づ動物体内のままで新リンホカインを誘導生成
させた後、次いで、同一動物個体の特定の部位ま
たは全体から採取したヒト由来の細胞に動物体外
で新リンホカインを誘導生成させる方法、ま
た、一度新リンホカインの誘導生成に使用した
細胞を、更に２度以上新リンホカインの誘導生
成に使用する方法、または動物体内に埋設、若し
くは接続するチヤンバーを交換して得られる細胞
数を増加させる方法などによつて、使用する動物
個体当りの新リンホカイン生成量を更に高める
ことも自由である。本発明の新リンホカイン誘導剤としては、α
−インターフエロン誘導剤として知られているウ
イルス、核酸、ヌクレオチドなどやγ−インター
フエロン誘導剤として知られているフイトヘマグ
ルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウイードミ
トーゲン、リポポリサツカリド、エンドトキシ
ン、多糖類、細菌などを適宜用いられる。また、
感作化された細胞にとつては、抗原も新リンホカ
インの誘導剤である。更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインを
誘導生成させるに際し、新リンホカイン誘導剤
として、α−インターフエロン誘導剤とγ−イン
ターフエロン誘導剤とを併用することにより新リ
ンホカインの生産量を高めることも自由であ
る。また、これら誘導生成によつて新リンホカイン
が産生されるだけでなく、種特異性の高いヒト
インターフエロンも同時に産生されることが判明
した。このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物
質の同時生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞
の高度利用を可能にし、新リンホカイン及びヒ
トインターフエロンを大量に安価に供給する点か
らきわめて好都合である。このようにして誘導生成された新リンホカイン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、
濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うこと
によつて容易に精製分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過およ
び等電点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグ
ラフイー、高速液体クロマトグラフイー、カラム
クロマトグラフイー、アフイニテイクロマトグラ
フイーなど公知の方法を組合せれば、比活性約
10⁹単位／mg蛋白質の最高純度の新リンホカイン
を採取することも可能である。また、このようにして得られた新リンホカイン
を、抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、
該動物から抗体産生細胞を採取して、この細胞と
骨髄腫細胞とを融合せしめ、得られる融合細胞か
ら抗新リンホカイン抗体産生能を有する融合細
胞を選択し、この選択細胞を増殖させ、生成した
モノクローナル抗体を、例えば、ブロムシアン活
性化セフアロースと反応させて得られる固定化モ
ノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リ
ンホカインを高収率で採取することも有利に用
いることができる。このようにして精製し製造された新リンホカイ
ンは、理化学的性質が、分子量 20000±2000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エ
チルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに
難溶乃至不溶呈色反応ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋白
質陽性反応を示し、フエノール硫酸法またはアン
トロン硫酸法で糖質陽性反応を示す作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細
胞に対する細胞増殖抑制活性およびインターフエ
ロン活性を実質的に示さず水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安
定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0乃至
11.0の範囲で安定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である
ことが判明した。また、新リンホカインは、マウスL₉₂₉細胞の
みならず、多くのヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅
させる能力を有しているが、ヒト正常細胞には実
質的に障害を与えないことも判明した。従つて、新リンホカインは、これを含有する
組成物などとして、新リンホカイン感受性疾
患、例えば、各種悪性腫瘍の予防剤、治療剤など
として有効に用いることができる。とりわけ、本発明は、新リンホカインを有効
成分として含有させた化学療法剤に対する抗腫瘍
効果増強剤に関するものである。本発明によれば、抗腫瘍効果が著しく増強され
ることとなり、化学療法剤の投与量を約1/2〜1/1
０００に減少させることが可能になり、その副作用
の発現を抑えるだけでなく抗腫瘍スペクトルを拡
大し、薬剤耐性腫瘍の治療をも可能にすることが
できる。本発明で使用する化学療法剤としては、例え
ば、メルフアラン、シクロホスフアミド、イホス
フアミド、リン酸エストラムスチンアトリウム、
ブスルフアン、トシル酸インプロスルフアン、Ｎ
−メチル−３，3′−ジメシルオキシジプロピラミ
ン、ビフエニル−４，4′−ジスルフオネート、カ
ルボコン、チオテパ、カルムスチン、塩酸ニムス
チン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、ピポブ
ロマンなどのアルキル化剤、メソトレキサート、
フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、
シタラビン、塩酸アンシタビン、エノシタビン、
メルカプトプリン、チオイノシンなどの代謝拮抗
剤、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アクラル
ビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイ
トマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、アクチノマ
イシンＣ、クロモマイシンA₃、ミスラマイシン、
ネオカルチノスタチンなどの抗腫瘍性抗生物質、
硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸
ビンデシン、ポドフイロトキシンなどの植物性ア
ルカロイドなどがあり、これらの１種、又は２種
以上が適宜に使用される。また、前立腺癌、乳癌
などの場合には、必要に応じて、プレドニゾロ
ン、メチルテストステロン、結合型エストロゲン
などの抗腫瘍性ホルモン剤を適宜併用すればよ
い。これらの化学療法剤と新リンホカインとの組
み合せ方法は、特定な条件に限定する必要はな
く、適宜に選択することができる。新リンホカインの活性は、標的細胞として
KB細胞、またはL₉₂₉細胞を用いて測定した。即ち、KB細胞を用いる場合には、「キヤンサ
ーケモテラピーリポーツ（Cancer
Chemotherapy Reports）パーツ（Parts）３」
第３巻、第２号、September1972の記載に準じ
て、KB細胞の増殖抑制活性を測定し、L₉₂₉細胞
を用いる場合には、イーピツク（E.Pick）編、
「ツモアネクロシスフアクターインリン
ホカインズ（Tumor Necrosis Factor in
Lymphokines）」第２巻、245〜249頁、アカデミ
ツクプレス（Academic Press）（1981年）の
記載に準じて、アクチノマイシンＤ存在下での
L₉₂₉細胞に与える細胞障害活性を測定した。この際、L₉₂₉細胞の増殖を50％抑制するときの
活性を50単位とした。本明細書では、特にことわ
らない限り、L₉₂₉細胞を用いる活性測定方法を採
用した。ヒトに種特異性の高いインターフエロンの活性
は、「蛋白質核酸酵素」第20巻、第６号、616〜
643頁（1975年）に報告されているヒト羊膜由来
のFL細胞を使用して公知のプラーク半減法で測
定した。赤血球凝集価は、ゼイイーサーク（J.E.
Salk）著、「ザジヤーナルオブイムノロジ
ー（The Journal of Immunology）」第49巻、
87頁（1944年）の方法に準じて測定した。次に、新リンホカインを実験で説明する。実験Ａ−１部分精製した新リンホカインの
調製新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫
反応を弱めた後、その皮下にBALL−１細胞を移
植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた腫瘤を摘出して細切し、生理食塩水中で
分散させほぐした。得られた細胞を血清添加の
RPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地に約
２×10⁶／mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁液
に対して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイ
ウイルスを添加し、37℃で24時間保つて新リンホ
カインを誘導生成させた。これを約４℃、約1000ｇで遠心分離し、沈澱物
を除去し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリン酸
塩緩衝液を含有する生理的食塩水で20時間透析
し、更に、精密濾過して得た濾液を、抗インター
フエロン抗体を固定化している抗体カラムに流
し、その非吸着画分を採取し、更に、これをクロ
マトフオーカツシング法により活性画分を採取
し、濃縮し、凍結乾燥して新リンホカイン活性
を含有する粉末を得た。本粉末の比活性は、約10⁶単位／mg蛋白質であ
つた。また、新リンホカインの収量は、ハムス
ター１匹当り約2000万単位であつた。実験Ａ−２抗新リンホカイン抗体の調製実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインを生
理食塩水に蛋白質濃度として約0.05w／ｖ％にな
るように溶解し、これとフロイント完全アジユバ
ンド乳化液とを等量混合して、この混合液0.2ml
をマウスの皮下に注射し、７日後再び同様に注射
してマウスを免疫した。その抗体産生能を有する
細胞に抗新リンホカイン抗体を誘導生成せし
め、このマウスからひ臓を摘出し、細切分散して
得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞P₃−X₆₃−
Ag8「フローラボラトリーズ（Flow
Laboratories）社製」とを、血清無含有Eagleの
最少基本培地で調製した50w／ｖ％ポリエチレン
グリコール−1000溶液（PH7.2、温度37℃）に、
それぞれ10⁴／mlになるように浮遊させて５分間
保つた後、前記基本培地で20倍に希釈し、次い
で、ダビソン（Davison）などが「ソマテイツク
セルゼネテイツクス（Somatic Cell
Genetics）」第２巻、175〜176頁（1976年）に報
告している方法に準してヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン培養液で増殖しうる融合細胞
を採取し、この融合細胞から抗新リンホカイン
抗体産生能を有する融合細胞を選択した。得られ
た融合細胞をマウス腹腔内に１匹当り約10⁶個移
植して２週間飼育した後、これを屠殺して腹水、
血液などの体液を集め、遠心分離し、この上清を
硫安塩析して飽和度30〜50％の沈澱画分を集め、
次いで透析し、更に、この液を、実験Ａ−１の方
法で得た新リンホカインをブロムシアン活性化
セフアロースと室温下で反応させて得られる固定
化新リンホカインゲルを用いてアフイニテイク
ロマトグラフイーを行ない、抗新リンホカイン
抗体画分を得、透析した後濃縮し、凍結乾燥して
新リンホカインのモノクローナル抗体粉末を採
取した。本品は、新リンホカインの細胞障害活性に対
して免疫学的に特異的な中和活性を示した。実験Ａ−３高純度に精製した新リンホカイン
の調製とその理化学的性質実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカイン
の部分精製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモ
ノクローナル抗体を固定化したゲルを用いてアフ
イニテイクロマトグラフイーを行ない新リンホカ
インの活性画分を採取し、透析し、濃縮して凍
結乾燥した。本品は、高純度に精製された新リンホカイン
であつて、その比活性は、約10⁹単位／mg蛋白質
であつた。本品を用いて、理化学的性質を調査した。分子量ケイウエーバーアンドエムオズボーン
（K.Weber and M.Osborn）、「ジヤーナルオブ
バイオロジカルケミストリイ（Journal of
Biological Chemistry）」第244巻、4406頁
（1969年）の記載に準じて、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により調べた。即ち、0.1％
SDS存在下、10％アクリルアミドゲルカラムに試
料約10μｇを負荷し、カラム当り8mAで４時間泳
動後、クーマシー・ブルー（Coomassie blue）
を用いて染色すると分子量20000±2000の単一の
鋭い帯が得られた。この単一の帯は新リンホカイ
ン活性を有していた。等電点スウエーデン、LKB社製、等電点電気泳動用
ゲル、商品名AMPHOLINE PAGPLATE（PH3.5
〜9.5）を用いて、25W、２時間泳動した結果、
等電点pIは6.2±0.3であつた。電気易動度ビーゼイデービス（B.J.Davis）、「アニユ
アルズオブザニユーヨークアカデミー
オブサイエンシズ（Annuals of the New
York Academy of Sciences）」第121巻、404頁
（1964年）の記載に準じて、7.5％アクリルアミド
ゲルカラムに試料約10μｇ負荷し、PH8.3、カラム
当り3mAで２時間泳動後、抽出してその活性測
定から電気易動度を求めたところ、Rf0.29±0.02
であつた。紫外線吸収スペクトル株式会社島津製作所製の分光光度計、商品名
UV−250を用いて紫外部での吸収スペクトルを
調べた結果、280nm付近に最大吸収を示した。溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エ
チルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに
難溶乃至不溶であつた。呈色反応ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋白
質陽性反応を示し、フエノール硫酸法またはアン
トロン硫酸法で糖質陽性反応を示した。作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示した。KB
細胞に対する細胞増殖抑制活性およびインターフ
エロン活性は実質的に示さなかつた。水溶液での活性安定性１熱安定性約１×10⁵単位／mlの試料を各温度によりPH7.2
で30分間保持した後、残存する活性を測定した結
果、60℃まで安定であつた。２ PH安定性約１×10⁶単位／mlの試料0.1mlを各PH緩衝液
〔PH２〜７……マツクルベイン緩衝液
（Mcllvaine buffer）、PH７〜８……リン酸塩緩衝
液（Phosphate buffer）、PH８〜11……グリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（Glycine−NaOH
buffer）〕１mlに加え、４℃で16時間保持した後、
この0.1mlをPH7.2、0.05Mリン酸塩緩衝液でPH7.2
に調整して残存する活性を測定した結果、PH4.0
乃至11.0の範囲で安定であつた。３デイスパーゼ（DISPASE）に対する安定
性約１×10⁵単位／mlの試料にデイスパーゼ（合
同酒精株式会社製造のバシラス属細菌由来のプロ
テアーゼ）100単位／mlになるように加え、PH
7.2、温度37℃で０乃至２時間反応させ、経済的
にサンプリングし、牛血清アルブミンを1w／ｖ
％になるように加えて反応を止めた。この液の新
リンホカインの残存活性を測定した結果、新リ
ンホカインはデイスパーゼ処理により不安定
で、その反応につれて新リンホカインの活性が
失なわれた。凍結貯蔵による安定性 PH7.2の水溶液を−10℃で凍結し１ケ月間貯蔵
した後、融解し、活性を測定した結果、活性の低
下は見られなかつた。以上の結果から、新リンホカインは、従来知
られているリンホトキシン、TNF、インターフ
エロンなどのリンホカインとは、明らかに違つた
文献未記載の理化学的性質を有する。実験Ｂ−１悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得た新
リンホカインを用いて、ヒト由来の各種細胞に
対する増殖抑制作用を調べた。牛胎児血清を補足した公知の栄養培地１mlにヒ
ト由来の各種細胞を10⁶個ずつとり、１日培養し
た後、これに実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方
法で調製した新リンホカインを50単位または
500単位含有する生理食塩水0.1mlを加え、37℃で
２日間培養した。培養終了後、「アプライドミ
クロバイオロジー（Applied Microbiology）」第
22巻、第４号、671〜677頁（1971年）に記載され
ている方法に準じて、染色剤ニユートラルレツド
で生細胞を染色し、続いて、この染色剤をアシド
エタノールで溶出し、溶出液の540nmにおけを吸
光度から生細胞量を測定した。なお、対照実験には、新リンホカインを含ま
ない生理食塩水0.1mlを用いた。細胞の増殖抑制率（％）は、次の式から算出し
た。細胞増殖抑制率（％）＝（１−新リンホカインを使
用した吸光度／対照の吸光度）×100 その結果を、第１表に示した。

【表】

【表】第１表の結果から明らかなように、新リンホカ
インは、正常細胞に対してほとんど影響を与え
ず、各種の悪性腫瘍細胞に対してはその増殖を著
しく抑制することが判明した。また、その結果
は、高度に精製したもののみならず、部分精製し
たものであつてもよいことが判明した。実験Ｂ−２ BALB／Ｃマウスに、マウス肉腫Meth−Ａ細
胞を移植し、その移植後10日目から、実験Ａ−３
の方法で得られた新リンホカインを生理食塩水
に溶解した状態で、毎日１回、100または1000単
位／Kgずつ15日間静脈注射を行つた。その後、マ
ウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。その結果、第２表に示した。

【表】計学的に有意差あり。
実験Ｂ−３ BALB／Ｃ由来のヌードマウスにヒト乳癌組
織片を背部皮下に移植し、その腫瘍体積が約200
mm³になつた時期から、実験Ａ−１、または実験
Ａ−３の方法で得られた新リンホカインを生理
食塩水に溶解した状態で、毎日１回、100または
1000単位／Kgずつ20日間静脈注射を行つた。その
後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定し
た。その結果を、第３表に示した。

【表】計学的に有意差あり。
実験Ｂ−４ BALB／Ｃ由来ヌードマウスにヒト乳癌組織
片を実験Ｂ−３と同様に移植し、その腫瘍体積が
約200mm³になつた時期から実験Ａ−３の方法で得
られた新リンホカイン及び／又はヒトα−イン
ターフエロンを生理食塩水に溶解した状態で毎日
１回、20日間静脈注射を行つた。その後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を
測定した。なお、対照実験には、新リンホカイン
及びヒトα−インターフエロンを含まない生理
食塩水を用いた。結果を第４表に示す。

【表】

【表】計学的に有意差あり。
第４表の結果から、新リンホカインは、イン
ターフエロンと併用することにより、その抗腫瘍
効果が著しく増強される。実験Ｂ−５生後20日のマウスを使用して、実験Ａ−３の方
法で得られた新リンホカインの急性毒性試験を
したところ、新リンホカインの毒性は極めて低
く、腹腔内に注射した時のLD₅₀は、10⁹単位以上
であることが判明した。以上の実験からも明らかなように、本発明の新
リンホカインは、生体外（in vitro）のみなら
ず、生体内においても悪性腫瘍の増殖抑制に有効
であり、その有効用量から見て安定性は極めて高
い。本発明の新リンホカインの成人１日当りの用
量は５〜500000000単位であり、好ましくは局所
注射および点眼などの局所適用用量は５〜
10000000単位、軟膏または坐剤などの経皮または
経粘皮適用の場合10〜50000000単位、静注および
筋注など全身注射の場合50〜100000000単位、経
口投与の場合500〜500000000単位であるが、用法
あるいは症状に応じて適宜増減することができ
る。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤
あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤
に調製することができる。その使用量は、新リン
ホカインの毒性、有効量および安全性を考慮す
ると医薬用製剤グラム当り５単位以上の新リンホ
カインを含有せしめるのが望ましい。新リンホカインを含有する新リンホカイン
感受性疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的
に応じてその形状を自由に選択できる。経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、散剤
などの腸溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐
剤、注射剤としては、例えば、用時に注射用蒸溜
水に溶解して使用する凍結乾燥注射剤、その他点
鼻もしくは点眼、軟膏剤として用いることもでき
る。また、新リンホカインを用いて悪性腫瘍を治
療するに際し、例えば、患者の腫瘍の一部を取
り、これを新リンホカインで処理することによ
つて、その腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患者
の体内に戻すことにより、この悪性腫瘍の治療を
より効果的に行うこともできる。また、新リンホカインと共に各種抗腫瘍剤、
例えばインターフエロン、TNF、リンホトキシ
ン、TCGFなどの他のリンホカイン、アルキル化
剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物性アル
カロイドなどの化学療法剤などと併用して抗腫瘍
効果を更に高めることも有利に実施することがで
きる。とりわけ、新リンホカインが化学療法剤の抗
腫瘍効果を増強することが判明した。次に、実験により新リンホカインの抗腫瘍効
果増強作用について説明する。実験Ｃ−１新リンホカインによる化学療法剤
の抗腫瘍効果増強作用悪性腫瘍細胞を用いて、新リンホカインによ
る各種化学療法剤の抗腫瘍効果増強作用を調べ
た。牛胎児血清を補足した公知の栄養培地１mlにヒ
ト由来の悪性腫瘍細胞を10⁶個ずつとり、１日培
養した後、これに実験Ａ−３の方法で調製した新
リンホカインの100単位及び／又は化学療法剤
を含有する生理食塩水0.1mlを加え、37℃で２日
間培養した。対照実験には、新リンホカイン及び化学療法
剤を含まない生理食塩水を用いた。培養終了後、実験Ｂ−１の方法に従つて生細胞
量を測定し、細胞増殖抑制率（％）を求めた。なお、化学療法剤の濃度は、培養液ml当り塩酸
ニムスチン（ACNU）1.0×10^-6ｇ、フルオロウ
ラシル（５−FU）1.5×10^-8ｇ、ドキソルビシン
（ADM）1.0×10^-10ｇ、マイトマイシンＣ
（MMC）2.5×10^-9ｇおよび硫酸ビンクリスチン
（VCR）1.5×10^-10ｇとした。結果を、第５表に示す。

【表】第５表の結果から明らかなように、新リンホカ
インは、各種化学療法剤の抗腫瘍効果を著しく
増強する。実験Ｃ−２ BALB／Ｃ由来のヌードマウスにヒト乳癌組
織片を背部皮下に移植し、その腫瘍体積が約200
mm³になつた時期から、実験Ａ−３の方法で得ら
れた新リンホカイン及び／又はマイトマイシン
Ｃを生理食塩水に溶解した状態で、毎日１回、20
日間静脈注射を行つた。その後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を
測定した。なお、対照実験には、新リンホカイン及び化
学療法剤を含まない生理食塩水を用いた。結果を、第６表に示す。

【表】

【表】計学的に有意差あり。
第６表の結果から明らかなように、新リンホカ
インは、生体内（in vivo）テストにおいても
悪性腫瘍に対する化学療法剤の抗腫瘍効果を著し
く増強する。以上述べた実験Ｃの結果から、抗腫瘍効果が不
充分な低濃度の化学療法剤を使用する場合であつ
ても、本発明の新リンホカインを併用すること
により、高い抗腫瘍効果を発揮することが判明し
た。新リンホカインを化学療法剤の抗腫瘍効果増
強剤として用いることにより、化学療法剤の使用
濃度を大幅に低下させ、その副作用の発現を抑え
るだけでなく、その抗腫瘍スペクトルを著しく拡
大することができる。本発明の新リンホカインを含有せしめた抗腫
瘍効果増強剤は、化学療法剤とともに使用するこ
とにより、抗腫瘍増強効果を発揮する。その使用法は、新リンホカインを含有する抗
腫瘍効果増強剤と化学療法剤とを予じめ混合し
て、同時に同一経路で投与してもよいし、どちら
か一方を投与し、続いて他方を同一経路又は他経
路で投与する方法などが適宜選択できる。以下、実施例Ａで本発明における新リンホカイ
ンの製造例を、実施例Ｂで本発明における新リ
ンホカインを含有せしめた抗腫瘍効果増強剤の
製造例を述べる。実施例Ａ−１ヒト由来のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を
牛胎児血清を20％補足したEagleの最少基本培地
（PH7.4）に接種し、37℃で常法に従い生体外（in
vitro）に浮遊培養した。得られた細胞を血清無
添加のEagleの最少基本培地（PH7.4）で洗浄し、
同培地に約１×10⁷／mlになるように懸濁した。
この懸濁液にセンダイウイルスをml当り約1000赤
血球凝集価添加し、38℃で１日保つて新リンホカ
インを誘導生成させた。これを４℃、約1000ｇ
で遠心分離し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリ
ン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で15時間透析
し、更に精密濾過して得た濾液を実験Ａ−１と同
様に抗インターフエロン抗体のカラムに流し、そ
の非吸着画分を、実験Ａ−３で述べた方法でモノ
クローナル抗体のゲルカラムを用いてアフイニテ
イクロマトグラフイーにより精製し、濃縮して比
活性約10⁹単位／mg蛋白質を有する新リンホカイ
ンの濃縮液を得た。活性収率は、誘導生成時の懸濁液１当り約
150万単位であつた。実施例Ａ−２新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射してハムスターの免疫反
応を弱めた後、その皮下に培養株化されたヒト由
来のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を移植し、
その後通常の方法で３週間飼育した。皮下に生じ
た約15ｇの腫癌を摘出し細切し、生理食塩中で分
散させほぐした。得られた細胞を血清無添加の
RPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地に約
５×10⁶／mlに懸濁した。この懸濁液に、センダ
イウイルスをml当り約1000赤血球凝集価及びE.
coli由来のエンドトキシンをml当り約10μｇを添
加し、37℃で１日間保つて新リンホカインを誘
導生成させた。これを約４℃、約1000ｇで遠心分
離し、沈澱物を除去し、得られた上清をPH7.2、
0.01Mリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で21
時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を、実施
例Ａ−１と同様に抗体カラムを用いて精製し、得
られる溶液を濃縮し、凍結乾燥して比活性約10⁹
単位／mg蛋白質を有する新リンホカインの粉末
を得た。活性収率は、約3200万単位であつた。実施例Ａ−３成長したヌードマウスの腹腔内に、培養株化さ
れたヒト由来のリンパ芽球様細胞TALL−１細胞
の移植後、通常の方法で５週間飼育した。この腹
腔内へ、約3000赤血球凝集価のニユーカツスル病
ウイルスを紫外線によつて予めほとんど失活させ
て注入し、24時間後に屠殺して腹水を採取した。
以後、実施例Ａ−２と同様に精製し濃縮乾燥して
新リンホカインの粉末を得た。活性収率は、ヌードマウス１匹当り約350万単
位であつた。実施例Ａ−４成長した普通マウスに約400レムのエツクス線
を予め照射してマウスの免疫能を弱めた後、その
マウスの皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ
芽球様細胞Mono−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育した。皮下に生じた約10ｇの
腫瘤を摘出した後、実施例Ａ−２と同様にして細
胞を分散させた。この細胞を実施例Ａ−２と同様
に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウイルス
をml当り約500赤血球凝集価及びコンカナバリン
Ａをml当り0.8μｇを添加し、37℃で１日間保つて
新リンホカインを誘導生成させた。以後、実施
例Ａ−２と同様に精製、濃縮、乾燥して新リンホ
カインの粉末を得た。活性収率は、マウス１匹当り2000万単位であつ
た。実施例Ａ−５新生児のハムスターに実施例Ａ−２と同様にし
て培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
Namalva細胞を移植し、その後通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた約20ｇの腫瘤を実施
例Ａ−２と同様にほぐして約３×10⁶／mlの細胞
懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウイルスをml
当り約1000赤血球凝集価を添加し36℃で２日間保
つて新リンホカインを誘導生成させ次いで実施
例Ａ−１と同様に精製濃縮して新リンホカイン
の濃縮液を得た。活性収率は、ハムスター１匹当り約2200万単位
であつた。実施例Ａ−６孔径0.5ミクロンのメンブランフイルターを設
けた内容量約10mlのプラスチツク製円筒型拡散チ
ヤンバー内に、培養株化されたヒト由来のリンパ
芽球様細胞NALL−１細胞を生理食塩水で浮遊
させ、これを成長したラツトの腹腔内に埋設し
た。このラツトを通常の方法で４週間飼育した
後、この拡散チヤンバーを取り出した。これによ
り得られたヒト由来の細胞の濃度は約５×10⁸／
mlであつて、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキ
ユベーター中で増殖させる場合の約10²倍以上に
も達することがわかつた。この細胞を実施例Ａ−
２と同様に懸濁し、この懸濁液に、ml当り約500
赤血球凝集価のニユーカツスル病ウイルスを紫外
線で予めほとんど失活させて加え、さらにフイト
ヘマグルチニンをml当り約50μｇを加え37℃で１
日間つて新リンホカインを誘導生成させた。以
後、実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、乾燥し
て新リンホカインの粉末を得た。活性収率は、ラツト１匹当り約800万単位であ
つた。実施例Ａ−７ 37℃で５日間保つたニワトリの受精卵に、ヒト
由来の株化細胞CCRF−CEM細胞を移植した後、
37℃で１週間保つた。この卵を割卵した後、増殖
細胞を採取した。この細胞を実施例Ａ−１と同様
に５×10⁶／mlに懸濁した。この懸濁液にml当り
約500赤血球凝集価のセンダイウイルスを添加し、
37℃で１日間保つて新リンホカインを誘導生成
させ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮
乾燥して新リンホカインの粉末を得た。活性収率は、受精卵10個当り約70万単位であつ
た。実施例Ｂ−１注射液実施例Ａ−２の方法で調製した新リンホカイン
500000単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メ
ンブランフイルターを用いて無菌的に濾過する。
濾液を滅菌したガラス容器に２mlずつ充填して凍
結乾燥し、これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤と
する。本品は、メルフアラン、メソトレキサート、ド
キソルビシンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強
剤として、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療
に好適である。実施例Ｂ−２注射剤実施例Ｂ−１の注射液の製造において、新リン
ホカイン500000単位と共に、リンパ芽球様細胞
由来のα−インターフエロン300000000単位を生
理食塩水200mlに溶解したほかは、実施例Ｂ−１
と同様に製造して凍結乾燥粉末製剤を得た。本品は、テガフール、マイトマイシンＣ、硫酸
ビンクリスチンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増
強剤として、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病な
どの各種悪性腫瘍に対して、実施例Ｂ−１の注射
液と比較して顕著に優れた治療効果を発揮する。実施例Ｂ−３軟膏剤実施例Ａ−３の方法で調製した新リンホカイン
を常法に従い少量の流動パラフインに研和した
後、ワセリンを加え20000単位／ｇの軟膏薬とし
た。本品は、シクロホスフアミド、フルオロウラシ
ル、硫酸ビンブラスチンなどの化学療法剤の抗腫
瘍効果増強剤として、皮膚癌、乳癌、リンパ腫な
どの治療に好適である。実施例Ｂ−４点眼剤蒸溜水800mlとβ−フエニルエチルアルコール
５mlと実施例Ａ−４の方法で調製した新リンホカ
イン20000000単位とに等張化するよう食塩を加
え蒸溜水で1000mlとし点眼剤とした。本品は、シタラビン、硫酸ビンブラスチンなど
の化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として、網膜芽
細胞腫などの治療に好適である。実施例Ｂ−５腸溶性錠剤実施例Ａ−７の方法で調製した新リンホカイン
を常法に従つて澱粉とマルトースとを混合使用
して打錠するに際し、新リンホカインを製品１
錠（100ml）当り200000単位になるように含有せ
しめて錠剤を製造し、これにメチルセロースフタ
レートをコーテイグして腸溶性錠剤とした。本品は、ドキソルビシン、フルオロウラシル、
マイトマイシンＣなどの化学療法剤の抗腫瘍効果
増強剤として、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療
に好適である。

Claims

【特許請求の範囲】１理化学的性質が、分子量 20000±2000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホル
ムに難溶乃至不溶呈色反応ローリー法またはミロクビユーレツト法で蛋白
質陽性反応を示し、フエノール硫酸法またはアン
トロン硫酸法で糖質陽作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細
胞に対する細胞増殖抑制活性およびインターフエ
ロン活性を実質的に示さず水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安
定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0乃至
11.0の範囲で安定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である
新リンホカインを含有せしめた抗腫瘍効果増
強剤。２新リンホカインが、新リンホカイン産生
能を有するヒト由来の白血球、リンパ球および培
養株化された細胞から選ばれる細胞を、その細胞
が増殖し得るヒト以外の温血動物体内に移植し、
またはその細胞を拡散チヤンバー内でヒト以外の
温血動物の体液の供給を受けながら増殖させて得
られる細胞から産生させ、精製、採取したもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の抗腫瘍効果増強剤。３抗腫瘍効果増強剤が、他のリンホカインの抗
腫瘍効果を増強するものであることを特徴とする
特許請求の範囲第１項又は第２項記載の抗腫瘍効
果増強剤。４他のリンホカインが、インターフエロンであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項第２項
又は第３項記載の抗腫瘍効果増強剤。５インターフエロンが、α−インターフエロン
および／またはγ−インターフエロンであること
を特徴とする特許請求の範囲第４項記載の抗腫瘍
効果増強剤。