DE1617401A1 - Verfahren zur Herstellung von Interferon-Praeparaten - Google Patents

Description

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Unsere Ir₀ 13 818

CBMEB UATIOFAIl DE LA EEOHBROHB SOIBITIi¹IQUE

und

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA EBOHEECHE MEDIOALE

Paris / Frankreich

Verfahren zur Herstellung von Interferon-Präparaten

Als Interferone bezeichnet man Proteine mit sehr variablem Molekulargewicht, die unter Einwirkung äusserer Anregungen von Zellen gebildet v/erden, und deren biologische Wirkung darin besteht, dass sie im Inneren der Zellen zu einem nooh nicht bestimmten Zeitpunkt ihrer Bildung die "Vermehrung von Viren blockieren»

Mit Interferonen vorbehandelte Zellen sind gegen Infektion durch Viren geschützt» Das Interferon ist spezifisch für die Zellart, in der es gebildet wurde» Um menschliche Zellen zu schützen, ist es daher unerlässlich ₉ ein auf menschlichem Gewebe hergestelltes Interferon zu verwenden. Die derzeitig bekanntesten Interferone stammen aus Präparaten, die aus dem Gewebe von Hühnern und Mäusen gewonnen werden» Während jedoch ihre Schutzwirkung gegenüber einer Virusinfektion unbestreitbar ist, ist ihre heilende Wirkung weniger offensichtlich» Die Ergebnisse scheinen von der Menge. J.e,s verwendeten Interferons

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sowie von dem Zeitabstand abzuhängen, der zwischen der Impfung mit dem Interferon und derjenigen mit dem infizierenden Virus liegt«.

Der therapeutische Wert des Interferons ist noch nicht in ausreichendem Masse untersucht, da man bisher grossen Schwierigkeiten bei der Massenherstellung desselben begegnete.

Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, diese Schwierigkeiten zu beheben und auf leichte Weise interferonreiche Präparate herzustellen, die für den Menschen spezifisch sind, und zwar unter Verwendung von Rohmaterialien, die in praktisch unbegrenztem Ausmass zur Verfügung stehen_e

Bei dem ^erfahren der vorliegenden Erfindung geht man von Zellen des menschlichen Körpers aus, die man am Leben erhält, und zu denen man ein induzierendes Mittel gibt. Man nimmt eine Inkubation vor, damit die Zellen die Synthese von Substanzen vom Interferon-Typ auslösen. Man trennt den am wenigsten dichten l'eil des Inkubationsproduktes ab, säuert ihn an, filtriert und stellt den pH-Wert auf'6,9 bis 7>6, insbesondere auf 7,2 bis 7,4 ein»

Die Zellen, von denen ausgegangen wird, können insbesondere Leukozyten oder Zellen sein, die aus Plazentarteilen, insbesondere von Ammion-Membranen, äusseren Embryonalhüllen und PIazentargeweben stammen. Es handelt sich daher in jedem einzelnen Fall um praktisch unerschöpfliche Quellen.

Man kann jedoch auch von anderen Zellen, insbesondere von mensch lichen Embryonalζeilen ausgehen.

Obgleich sehr verschiedenartige induzierende, virale oder nicht virale Mittel verwendet werden können, wurde gefunden, dass man die besten Ergebnisse mit dem Pare-Influenza-Typ I, Stamm Sen^ai, erzielt.

Es wurde gefunden, dass bei Verwendung von Leukozyten als Ausgangsmaterial es günstig ist, Leukozyten von verschiedenen Spendern, ohne Rücksicht auf die Blutgruppe, der diese Personen angehören, zu verwenden. Man kann die Leukozyten insbesondere

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dadurch isolieren, dass man von einem Blutgemisch ausgeht, welches nach bekannten Verfahren, beispielsweise durch Zugabe von Natriumzitr%at gegen Gerinnung geschützt ist« Man kann beispielsweise zu 400 ecm Blut 75 ecm einer sterielen, apyrogenen Lösung zugeben, die die nachfolgende Zusammensetzung hat:

Zitronensäure 1,37 g

HaOH 0,52 g

Glukose " 2,50 g

Destilliertes Wasser auf 75 ecm

Um die Leukozyten abzutrennen, kann man nach jedem bekannten Verfahren vorgehen, wobei insbesondere Mittel verwendet werden, die die Geschwindigkeit der Sedimentierung modifizieren. Eine besonders geeignete Art der Trennung wird nachfolgend als Beispiel beschrieben.

Man gibt ein Blutgemisch mit Zitronensäurezusatz zu einer Lösung von 6°/o Dextran mit einem Molekulargewicht von 180_o000 in einem physiologischen Serum, und zwar in einem Verhältnis von 4 Volumen Blut zu einem Volumen Dextran_e Dieses Gemisch wird nach wiederholtem Rühren in grosse Kolben aus mit Silikon behandeltem Glas oder Kunststoff, wie z,B_e Polytetrafluoräthylen verteilt. Während einer Stunde wird dekantiert, und die aus roten Blutkörperchen bestehende Phase, die sich absetzt, wird durch den unteren Schliesshahn des Kolbens entfernt. Die verbleibende Plasmapha-se, die alle weissen Blutkörperchen in Suspension enthält, wird durch den oberen Teil des Kolbens entnommen» Alle Plasmaf^aktionen &^er verschiedenen Kolben werden nach Auszählung der weissen Blutkörperehen vereinigt und in schrägen Kunststoffgefässen in einer Zentrifuge "International" bei 4⁰C während 15 Minuten und bei 5.000 U/Min« zentrifugiert« Die oben schwimmenden Teile werden dekantiert, aufbewahrt und später bei der Herstellung verwendet.

Der bevorzugte Stamm des induzierenden Mittels, d.h. des Virus vom Para-Influenza-Typ I, wird vorzugsweise durch eine Passage auf Eiern von ^warren- und Leghorn-Hennen kultiviert ₉ wobei die

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Impfung über die Allantois vorgenommen wird.» Auf diese Weise kann man für eine Allantois-Flüssigkeit verfügen, die pro 1/10 ecm die 10⁸- bis 1O⁹-fache DL₅₀-DoSiS enthält.

Die von dem Plasma durch Zentrifugieren getrennten Leukozyten enthalten immer noch einen Rückstand an roten Blutkörperchen in schwankender Menge_o ^s wurde gefunden, dass es möglich ist, dieselben dadurch zu entfernen, dass man mit Hilfe des Virus, der zur Infizierung der Leukozyten dient, gleichzeitig die Auflösung der roten Blutkörperchen und die Entstehung von Interferon bewirkte Man kann hierzu die Leukozyten, die sich in Suspension in der die Viren enthaltenden Allantois-Flüssigkeit befinden, auf einen pH-Wert vom 7»2 bis 7,3 einstellen (dieser Wert wird von Fall zu Fall durch HCl oder NaOH erzielt), die verschiedenen Suspensionen vereinigen, eine ausreichende Menge des Virus Sendä'i zugeben, um eine Infektion von 10 bis 100 Virusteilchen pro weisses Blutkörperchen zu erzielen und eine Inkubation bei 37°C im Wasserbad unter Rühren durchführen. Zunächst kleben alle das ^räparat verunreinigenden roten Blutkörperchen zusammen und bilden eine dicke« Anhäufung. Danach verschwinden die Anhäufungen an roten Blutkörperchen nach und nach durch eine durch das infizierende Virus hervorgerufene Auflösung. Die Inkubation wird 3 Stunden lang fortgesetzt.

Die auf diese Weise erhaltene Suspension von weissen Blutkörperchen kann dann zentrifugiert und der am wenigsten dichte Teil, der das übrigbleibende Virus und die Produkte der Auflösung der roten Blutkörperchen enthält, kann entfernt werden.

Der dichteste ^eil, der die infizierten Leukozyten enthält, kann dann bis zur Erzielung einer homogenen Suspension in eine Lösung nach Aleever eingearbeitet werden, die etwa 10$ menschliches Serum enthält, welches beispielsweise nach dem folgenden Verfahren defibriniert worden ist: Plasma, das bei der anfänglichen Abtrennung der Leukozyten erhalten worden war, wurde in einer Menge von 30 ecm pro Liter einer Lösung von 10 $> Kalziumchlorid zugegeben. Das Ganze wurde einer Inkubation bei 37⁰O unterworfen, damit das Fibrinogen zu Fibrin umgewandelt wurde, Ansohliessend wurde das klare Serum durch Dekantieren vom kon-

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zentrierten Koagulum isoliert.

Mach Zentrifugieren der Suspension der Leukozyten wird der dichte leil in ein basales Hährmedium nach Eagle gegeben, dem 5 Vol_o-$ des vorstehend "beschriebenen defibrinierten Serums zugesetzt worä den war, wobei die Menge des Mediums so gehalten wurde, dass die Leukozytenanzahl 5 Millionen pro ecm beträgt. Die auf diese ^weise erhaltenen Suspension wird in einen geschlossenen Kolben gegeben, und zwar derart, dass das Verhältnis des durch die Flüssigkeit eingenommenen Anteils zum verfügbaren Gesamtvolumen 1/4 bis 1/8, vorzugsweise 1/5 beträgt« Es wurde gefunden, dass zur besseren endgültigen Gewinnung des Interferons, und insbesondere damit dasselbe nicht an den Kolbenwänden entlang bis über die freie Oberfläche der "Flüssigkeit steigt, es von Vorteil ist, einen Glaskolben mit Silikon-behandelter Wandung oder einen Kolben aus Polytetrafluoräthylen zu verwenden.

Es folgt eine Inkubation im Wasserbad bei 37°C> und zwar unter Rühren während etwa 24 Stunden. Anschliessend wird die Suspension zentrifugiert, die oben schwimmende Flüssigkeit wird abgetrennt und a_uf einen pH-Wert von 7»3 bis 7_f4 eingestellt. Zu diesem -⁶WeCk ist es vorteilhaft, in der nachfolgenden Weise vorzugehen: man gibt zu der klaren Flüssigkeit 1n-Salzsäure, bis der pH-Wert auf 2 absinkt und hält die Flüssigkeit während etwa 24 Stunden bei etwa 4°0. Man gibt dann so lange natronlauge zu, bis der pH-Wert auf 7»3 gebracht ist, und setzt das Produkt einem längeren Ultra-Zentrifugleren aus (etwa 24 Stunden), man filtriert das ^rodukt und-zwar vorzugsweise auf einer Membran mit Poren in einer Grössenordnung von einem halben Mikron, und bringt dann den Erfordernissen entsprechend mittels Salzsäure oder-HaOH den pH-Wert suf 7,3 bis 7,4.

Das Präparat kann nun unter aseptischen Bedingungen in Ampullen von beispielsweise 5 oder 10 ecm Inhalt abgefüllt und bei niedriger temperatur, beispielsweise -80°0, aufbewahrt werden·

Geht man nicht von isolierten Zellen wie Leukozyten aus, sondern von Zellen bit organisierten Strukturen, so kann man in der Weise verfahren, wie sie im nachfolgenden als Beispiel an einer

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Amnioninembran erläutert wird«

Die Amninmembran wird von der äusseren Embryonalhülle ("cfrrion") maximal 6 Stunden nach Ausstossen der Plazenta abgetrennt. Zu diesem Zweck verfährt man in der nachfolgenden ^weice: man hängt die Plazenta _so an der kabelschnur auf, dass sie frei hängt, und mit Hilfe chirugischer Instrumente Iblst man die Amnionmembran stückweise ab₀ ^as auf diese Art entnommene Amnion-wird viermal in physiologischem Serum bis zur Entfernung von verunreinigenden Materialien, insbesondere Blutklümpchen, Schleim und Hüllenteilchen, gewaschen. Die Membran wird während 24 bis 72 Stunden in ein basales Nährmediüm nach Eagle unter täglicher Erneuerung dieses Mediums eingeweicht.

Die Membran wird in eine 1 Liter fassende Flasche nach Fourneau gegeben und in eine Allantois-E'lüssigkeit getaucht, die den durch Ultraviolettstrahlen (z„B_e 5·ΟΟΟ bis 6_e000 erg pro mm )

bestrahlte Virus Sendai in einer Menge von etwa dem 10 -fachen der DIip-Q-Dosis pro ecm enthält. Als Irägermaterial für das induzierende Virus werden etwa 150 bis 200 ecm einer Allantois-IPlüssigkeit für eine Membran mit mittlerem Gewicht, d.h. zwischen 40 und 50 g verwendet· Die Inkubation wird bei 37 C während 2 Stunden unter zeitweiligem Rühren durchgeführt.

Die so infizierte Membran wird vorzugsweise in drei aufeinanderfolgende Bäder aus physiologischem Serum getaucht, die die nicht adsorbierte Virusmenge entfernen sollen. Anschliessend wird die Membran während 24 Stunden in 200 ecm eines basalen Eagle-Mediums eingeweicht, dem menschliches, defibriniertes Serum zugesetzt worden war. Nach Ablauf dieses Zeitraums wird die flüssige Phase entfernt, und die Membran wird in 200 ecm neues Medium gebracht, um eine zweite Ausbeute an Interferon zu erhalten. Ein dritter Arbeitsgang kann unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden. Die aus den zwei oder drei Ausbeuten stammenden Flüssigkeiten werden gemischt und bei etwa 4°0 zentrifugiert.

Anschliessend kann man dieses Flüssigkeitsgemisch mit Salzsäure und danaeh mit Natronlauge behandeln. Ein Ultra-Zentri-

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fugiereri wird angeschlossen, dann -wird filtriert, und der pH-Wert wird schliesslich auf T₁ 3 "bis 7,4 eingestellt, wie vorstehend beschrieben wurde«

Geht man von menschlichen Embryonalzeilen aus, so kann man auf menschliche Embryos zurückgreifen, die "bei Auskratzungen erhalten wurden, Diese Embryos werden nach herkömmlichen Verfahren mit Trypsin behandelt. Die Zellen werden während einer bis zwei Wochen in Gefässen nach Roux kultiviert« Von diesem Augenblick an können sie in Kulturen in zylindrische, 2 Liter fassende Kolben gegeben werden, und zwar mittels eines "Roller" (mit Aushöhlungen versehene Trommel, in der die Kolben in horizontaler Lage gedreht werden können)» Im weiteren wird diese Zellkultur zur Gewinnung von Interferon genau so behandelt., wie es in den obigen Beispielen beschrieben wurde.

Vorstehend wurde im Beispiel der Amnionmembran angeführt, dass die Infizierung mittels des durch Ultraviolettstrahlen bestrahlten Virus Sendäi durchgeführt wurde. Es wurde gefunden, dass die Gewinnung von Interferon ^e nach dem Bestrahlungsgrad des der Bestrahlung ausgesetzten induezierenden Virus schwankt, und dags die Bestrahlung im ^aIIe bestimmter Zellen zu einer erhöhten Produktion, im Falle anderer ^ellen zu einer verringerten Produktion führen kann.

Um beispielsweise den Virus Sendäi zu bestrahlen, kann man in der nachfolgenden Weise verfahrene Die Virussuspension wird so in eine -"-etrischale gegeben, dass die Flüssigkeitsschieht nicht höher als einen halben Zentimeter geht. Während der Bestrahlung wird die ^xetrischale leicht mit einem Schüttler vom Khan-Typ bewegt. Die Quelle für die hierbei verwendeten Ultraviolettstrahlen ist eine keimtötende Lampe von "General Elektric", die bei 28 cm Abstand eine Leistung von 80 erg pro mm /Sek, hat. Es wurde gefunden, dass die optimale Bestrahlung im lall des Yizn Sendai und im FaIl seiner Verwendung zur Infizierung von Amnionmembranzellen bei 5.100 erg/mm lag. ^Bei diesen Zellen wird die Produktion von Interferon erhöht, Sie wird im Gegensatz dazu verringert, wenn die bestrahlten, durch das Virus infizierten Zellen Leukozyten sind.

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Um die Strahlungsdosierung zu "bestimmen, die "bei einem gegebenen Virus angeAVandt -werden muss, kann man vorweg eine Kurve anfertigen, in der die Menge an produziertem Interferon als Punktion der Strahlungsdosierung dargestellt -wird.

Die vorliegende Erfindung umschliesst auch ein Verfahren zur Reinigung des menschlichen Interferons bei seiner industriellen Gewinnung, Man bedient sich hierzu der Chromatographie auf einem kationischen Harz, insbesondere auf Carboxymethyl-Sephadex (Sephadex ist ein Dextran-Polymeres)· Die Kolonnenchromatographei ist gut bekannt, sie ist jedoch im besonderen Fall des Interferons im technischen Maßstab schwierig anzuwenden· Die beiden Hauptnachteile sind das langsame Fortschreiten des Verfahrens sowie die Verdünnung, der das Interferon während des Waschvorgangs ausgesetzt ist» Diese beiden Schwierigkeiten lassen sich dadurch beheben, dass man die Chromatographie im Bade durchführte. Die Vorteile liegen in der Schnelligkeit, der hohen Ausbeute und der leichten Anpassung an jede gewünschte Menge, Während die Anwendung der Kolonnenchromatographie durch das enge Verhältnis zwischen dem Volumen der Probe und dem Volumen des Harzes, durch das notwendige langsame Auswaschen sowie durch die Verringerung der biologischen Wirksamkeit des Produkts begrenzt ist, vermeidet die Chromatographie im Bad diese Uachteile, wobei eine teilweise Reinigung (30- bis 40-mal im Höchstfall) gewährleistet bleibt.

Nachfolgend wird ein Beispiel für die Reinigung des aus weissen Blutkörperchen stammenden Interferons gegeben» Carboxymethyl— Sephadex C₅₀ wird durch Rühren mit einem das 40- bis 50-fache seines Gewichts ausmachenden Phosphatpuffer (0,01 M - Puffer Nr. 1) ins Gleichgewicht gebracht; dann wird mit frischen Puffer erneut begonnen und das Verfahren so lange wiederholt, wie dies zur Stabilisierung des pH-Werts auf 5,9 erforderlich ist. Das rohe Präparat, welches das Interferon enthält, wird gegen das 30-fii.che seines Volumens von Puffer Hr. 1 dialysiert. Man mischt in einem Gefäss aus Polyäthylen (bevorzugt gegenüber Glas, a_uf dem das Interferon etwas zum Absetzen neigt), das Präparat und das vorher angequollene Harz in einem Volumenverhältnis von

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4δ1 gebracht worden war. Das Grenze wird dann während 18 Stunden "bei +4°C gerührt. Um die nicht am Harz fixierten Proteine zu entfernen» wird das Gel "bei 6,000 U/Min, zentrifugierte Etwa 95 "bis 97f£ des Interferons sind auf dem Harz fixiert. Das Harz wird sodann nacheinander mit den nachfolgenden Puffern gew_aschen: Puffer Ir. 2 (Phosphat = 0,01 M, NaCl = ö»G5 M_f pH-Wert = 6), Puffen Nr. 3 (Phosphat = 0,01 M, NaCl = 0,075 M, pH-Wert = 6,2)· Nachdem äie nicht oder schwa_ch fixierten Proteine durch taschen entfernt worden sind, wird das fixierte Interferon mit Hilfe der nachfolgenden, nacheinander verwendeten Puffer ausgetauscht! Puffer Hr. 4 (Phosphat = 0,01 M, HaOl * 0,1 I, pH-Wert » 7_f5)| Puffer Ir. 5 (Phosphat = 0,01 M, NaGl = 0,1 H, pH-Wert = 8).

XJia beispielsweise äen Puffer ETr. 2 herzustellen, Igst man 0,01 Molefcölgramm NaH-PO- in 900 ecm Wasser, gibt Sn-NaQH bis zu einem pH-Wert von 6 zu, löst 0,05 Molekülgramm NaGl auf und gibt sehliesslieh Wasser bis zur Erzielung eines Yolumens von 1 000 ecm zu.

Das Waschen des Harzes und das Auswaschen des Interferons werden durch Siihren und ansehiiessendes Zentrifugieren erzielt. Die Ergebnisse einer Seihe von typischen Versuchen zeigen, dass das erfindungsgemäss Verfahren eine teilweise Heini.gung ermöglicht, wobei die spezifische Wirksamkeit ψεο ¥olumeneinheit des Präparats auf etwa das 50— bis 40-fache erhöht wird. Dieses Terfahren wurde wiederholt erprobt, wobei gleichwertige Ergebnisse bei Volumen erzielt wurden, die zwischen 25 ecm und 1 üiter lagen.

Die auf diese Weise erhaltenen antiviral wirksamen Präparate erweisen, sich bei Versuchen, die die Grruppe der Interferone charakterisieren, mit beispielsweise den folgenden Eigenschaften als zufriedönsteilends

1 · Die Präparate zeigen, keime direkte Wirkung auf den Virus der veslkulären Stomatitis«

2_m Sie setzen sich nach Ültra-Zentrifugieren bei 40.000 ü/M±n_e während 4 Stunden, afe nicht ab.

3· Sie vierelen durch äas trypsin, zerstört und widerstehen der Behandlung durch Sibonuklease und Besoxyribonu&lease.

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4·* Sie widerstehen einesteils einem pH-Wert iron 2_f anderenteils einem pH—Wert von 10.

5. Sie sind spezifisch für die Zellart, in der sie erzeugt wurden c

Die Präparate eignen sich für die Verabreichung zu therapeutischen Zwecken» insbesondere in. der Präventiv —therapie» und zwar bei intravenöser Verabreichung.

Es wurde gefunden, dass die Substanz oder die Substanzen vom 3?yp der Interferone, die gemäss der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von imnionzellen als Ausgangsmaterial hergestellt wurden* ein Molekulargewicht von etwa 160.000 aufwiesen, während die Substanz oder die Substanzen des gleichen 5?yps_f die jedoch aus Leukozyten stammten» ein Molekulargewicht von etwa 25.000 hatten,,

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Claims (1)

1. A4

   PATENTANSPRÜCHE:

   1. Verfahren zur Herstellung von Interferon-Präparaten^ dadurch gekennzeichnet, dass inan als Ausgangsmaterial menschliche Körperzellen verwendet, die man am leben erhält, ein induzierendes Mittel zugibt, die Zellen zum Zweck der Infektion inkubiert, den am wenigsten dichten Teil des Inkubationsprodukts abtrennt, ihn ansäuert, ihn filtriert und seinen pH-Wert auf 6,9 bis 7,6, vorzugsweise 7,2 bis 7»4 einstellt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das induzierende Mittel vom Para-Influenza-Typ I, Stamm Sendai, ist,

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man von den Leukozyten aus dem Blut mehrerer Spender, ohne Berücksichtigung der Blutgruppen, denen diese angehören, ausgeht .

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man n;ich dem Mischen der aus dem Blut abgetrennten Leukozyten mit dem infizierenden Virus dieselben bis zur Zersetzung von die Leukozyten begleitenden roten Blutkörpereher inkubiert und die Leukozyten isoliert.

   5. Verfahren nach Anspruch 4_f dadurch gekennzeichnet, dass man die von den roten Blutkörperchen befreiten Leukozyten in einer Alsever-Lösung suspendiert, die etwa 10$ defibriniertes menschliches Serum enthält, dieselben nach dem auf diese Weise durchgeführten Waschen trennt, sie einem bagalen ifährmedium nach Eagle einverleibt, zu dem etwa '5$ defibriniertes menschliches Serum gegeben worden waren, und dä_s Gemisch bei 37°Ö inkubiert.

   6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass man das G-eiiiisoh sur Inkubation in einen geschlossenen Kolben gibt, ν -ν.»-! öic VolüLiina so gehalten werö.en, dass die 1-Ienge des in dem

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   Kolben anwesenden G-emischs 1/4 his 1/8, vorzugsweise etwa 1/5 des KoIhens einnimmt«

   7o Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man rui.ch der Iiokubation zentrifugiert, die oben schwimmende Flüssigkeit abtrennt, Salzsäure so lange zugibt, bis der pH-Wert auf 2 abgesunken ist, die so angesäuerte Flüssigkeit während etwa 24 Stunden bei etwa 4°C hält, dann den pH-Wert

   mittels Natronlauge auf 7»3 bis 7j4 bringt, ein Ultra-Zentrifugieren vornimmt und filtrierte

   8β Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial eine Amnionmembran verwendet, diese reinigt, sie durch Eintauchen in eine den induzierenden Virus enthaltende Flüssigkeit infiziert, sie anschliessend wäscht, um den nicht adsorbierten Virus zu entfernen, sie in dem basalen Medium nach Eagle einweicht, dem defibriniertes menschliches Serum zugesetzt worden war, die flüssige Phase abtrennt und dieäelbe, wie in Anspruch 7 ausgeführt, behandelt.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Einweichen die Membran in ein neues Medium nach Eagle gibt und gegebenenfalls dieses Verfahren wiederholt, um zwei oder drei, das Interferon enthaltende Flüssigkeiten zu gewinnen_β

   10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass m^{an a}l^s Ausgangsmaterial menschliche Embryos verwendet.

   11» Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Infektion der Zellen Sendai Virus verwendet, den man einer Ultraviolett-Bestrahlung von etwa

   2
   5.100 erg pro mm ausgesetzt hatte,

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Interferon-Präparate durch eine im Bad vorgenommene Chromatographie, insbesondere mit Carboxymethyl-

   209808/1771— bad

   AS

   Sephadex reinigt, wobei die Präparate nach. Fixierung der Proteine mit Pufferlösungen mit steigenden pH-Werten gewaschen werden, und zwar zunächst zur Entfernung anderer Proteine als Interferon mit leicht sauren Lösungen und dann mit leicht alkalischen Lösungen, um das Interferon zu gewinnen.

   Pur OEMTBE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIEMTII¹IQUe

   und

   INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE

   Paris / Prankreich

   Rechtsanwalt

   209808/1771