MX2012005927A - Anticuerpos para il-6 uso de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos para il-6 uso de los mismos.

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MX
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antibody
cancer
abl
antibodies
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MX2012005927A
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John Latham
Brian Kovacevich
Katie Olson
Anne Elisabeth Carvalho Jensen
Ben Dutzar
Jeffrey T L Smith
Mark Litton
Randall Schatzman
Leon Garcia-Martinez
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Alder Biopharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente invención se dirige a métodos terapéuticos que usan antagonistas de IL-6 tal como un anticuerpo Ab1 o fragmento de anticuerpo que tiene especificidad de enlace para IL-6 para prevenir o tratar una enfermedad o para mejorar la supervivencia o calidad de vida de un paciente en necesidad de los mismos. En modalidades preferidas estos pacientes comprenderán aquellos que exhiben (o están en riesgo de desarrollar) un nivel de proteína C-reactiva en el suero elevado, nivel de albúmina en el suero reducido, D-dímero elevado u otra(s) proteína(s) relacionada(s) con la cascada de coagulación, caquexia, fiebre, debilidad y/o fatiga antes del tratamiento. Las presentes terapias también pueden incluir la administración de otros activos tales como quimioterapéuticos, anticoagulantes, estatinas y otros. Las modalidades preferidas adicionales de la presente invención se relacionan a composiciones terapéuticas y métodos para tratar o prevenir la artritis reumatoide, especialmente formulaciones subcutáneas e intravenosas y regimenes de dosificación que usan los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención, así como métodos para prevenir o tratar GVHD o recaída de leucemia en sujetos que reciben células, tejido u órganos transplantados, uso de los mismos en el tratamiento o prevención de mucositis, y uso de los mismos para aumentar en potencia los efectos citotóxicos, apoptóticos y antimetastáticos o anti-invasivos de los quimioterapéuticos y radiación sobre cánceres, especialmente cánceres que han desarrollado una resistencia a la radiación o quimioterapia, tal como un inhibidor de EGFR.

Description

ANTICUERPOS PARA IL-6 Y USO DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional Serie No. 61/410,169, presentada el 04 de noviembre de 2010; solicitud provisional Serie No. 61/358,615, presentada el 25 de junio de 2010; solicitud provisional Serie No. 61/355,819, presentada el 17 de junio de 2010 y solicitud provisional Serie No. 61/325,547, presentada el 19 de abril de 2010. La presente solicitud reivindica además prioridad a la EUA Serie No. 12/624,965, 12/624,830, 12/624,816 y 12/624,778, presentadas el 24 de noviembre de 2009, la descripción de cada una de las solicitudes provisionales y no provisionales mencionadas anteriormente, incluida toda la información de secuencias, se incorpora en su totalidad mediante esta referencia a la presente.
El listado de secuencias en el archivo denominado "67858o706005.txt" con un tamaño de 332,081 bites creado el 23 de noviembre de 2009 se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención es una extensión de una invención anterior de los solicitantes descrita en las solicitudes de patente referidas anteriormente que se relacionan a anticuerpos anti-IL-6 novedosos, terapias novedosas y protocolos terapéuticos usando anticuerpos anti-IL-6 y formulaciones farmacéuticas que contienen anticuerpos anti-IL-6. En modalidades preferidas, un anticuerpo anti-IL-6 es Abl, que incluye formas de ratón o humanizadas del mismo, asi como cadenas pesadas, cadenas ligeras, fragmentos, variantes y CDRs del mismo o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un fragmento de polipéptido de IL-6 humana intacta de los mismos como Abl. La aplicación objeto de la presente se refiere, en particular, a formulaciones y usos terapéuticos preferidos de un anticuerpo humanizado de ejemplo denominado en la presente Abl y variantes del mismo. En modalidades preferidas, el anticuerpo anti-IL-6 tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 25 días, un efecto de aumento de albúmina in vivo, un efecto de disminución de la proteína C reactiva in vivo, un efecto de restitución de un perfil de coagulación normal in vivo, posee una afinidad de unión (Kd) para la IL-6 menor a alrededor de 50 picomolar y/o tiene una tasa de disociación (Koff) de IL-6 menor o igual a 10"4 S"1.
La invención también se refiere a métodos para analizar enfermedades y trastornos asociados con la IL-6 y a métodos para prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados con la IL-6 mediante la administración de dicho anticuerpo o un fragmento o una variante del mismo.
En un aspecto, la presente invención se relaciona a métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o calidad de vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6, tal como Abl o fragmento o variante del mismo, por lo cual disminuye el nivel de proteína C reactiva ("CRP") del paciente y/o aumenta el nivel de albúmina del paciente y, opcionalmente, controlar el paciente para determinar el nivel de albúmina y/o CRP en el paciente.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona a métodos para disminuir el nivel de proteína C reactiva en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como Abl, por lo cual disminuye el nivel de CRP del paciente y monitorear al paciente para evaluar el nivel de CRP. En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos para aumentar el nivel de albúmina en un paciente que lo necesita que comprende administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como Abl, por lo cual el nivel de albúmina en suero del paciente aumenta, y controlar el paciente para evaluar el nivel de albúmina.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos para prevenir o tratar caquexia, debilitamiento, fatiga y/o fiebre en un paciente que lo necesite, por ej . , un paciente que presenta niveles elevados de CRP, que comprenden la administración a un paciente de un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, mediante lo cual se mejora la caquexia, el debilitamiento, la fatiga y/o la fiebre del paciente o se vuelve a un estado normal y, opcionalmente, controlar al paciente para evaluar la caquexia, el debilitamiento, la fatiga y/o la fiebre. En otra modalidad, la presente invención se refiere adicionalmente al uso de los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos objeto de la presente para el tratamiento o la prevención de mucositis, por ej . , mucositis oral o gastrointestinal. La mucositis oral y gastrointestinal es una toxicidad de varias formas de radioterapia y quimioterapia. Tiene un impacto importante en la salud, la calidad de vida y los resultados económicos que están asociados con el tratamiento. También afecta de manera indirecta el logro de la terapia antineoplásica limitando la capacidad de los pacientes de tolerar la terapia tumoricida óptima. La patogénesis compleja de mucositis ha sido apreciada recientemente y refleja las interacciones dinámicas de todas las células y los tipos de tejidos que comprenden el epitelio y la submucosa . La identificación de eventos moleculares que conducen a la lesión mucosal inducida mediante tratamiento ha proporcionado dianas para intervenciones mecánicamente basadas para prevenir y tratar la mucositis.
Históricamente, la mucositis fue pensada para surgir únicamente como consecuencia de la lesión epitelial. Se asumió como hipótesis que la radiación o quimioterapia se dirigía de manera no específica a las células rápidamente proliferantes del epitelio basal, ocasionando pérdida de la capacidad del tejido de renovarse a sí mismo. Se consideró que la atrofia, reducción y ulceración del epitelio mucosal que están asociadas con la mucositis son una consecuencia de estos eventos. Asimismo, se consideró que el proceso se veía facilitado por trauma y microorganismos orales.
La mucositis inducida por radiación era típicamente reconocida como un proceso 'desde afuera hacia adentro', en el cual las rupturas de cadena del ADN ocurrieron en células epiteliales básales orales. La mucositis inducida por quimioterapia se ha atribuido principalmente al daño de las células básales que resulta de fármacos que invaden estas células desde el suministro de sangre de la submucosa. También se ha propuesto, pero no se ha comprobado, un papel para los agentes quimioterapéuticos transmitidos por la saliva en la inducción de mucositis. La mucositis inducida por quimioterapia puede verse agravada además por mielosupresión concomitante.
La mucositis inducida por quimioterapia o radiación se inicia mediante lesión directa de células epiteliales básales y células en el tejido subyacente. Las rupturas de cadena de ADN pueden ocasionar muerte celular o lesión. La ausencia de lesión del ADN se inicia mediante una variedad de mecanismos, algunos de los cuales están mediados por la generación de especies de oxígeno reactivo. La radiación y quimioterapia son activadores eficaces de varias vías que producen lesiones en los endotelios, fibroblastos y epitelios. En estas células, la activación de los factores de transcripción, tal como el factor nuclear ?? (NF-??) y NRF2, conduce a la regulación por aumento de genes que modulan la respuesta al daño. Las células inmunes (macrófagos) producen citocinas proinflamatorias, tales como factor de necrosis tumoral OÍ (TNF-a) e interleucina 6, que ocasionan más lesión en el tejido. Estas moléculas de señalización también participan en un bucle de retroalimentación positiva que amplía los efectos originales de la radiación y quimioterapia. Por ejemplo, TNF-a activa la actividad de esfingomielinasa y NF-?? en la mucosa, lo que conlleva más muerte celular. Además, el daño directo e indirecto a las células madre epiteliales da como resultado una pérdida de la capacidad renovable. Como resultado, el epitelio comienza a afinarse y los pacientes comienzan a experimentar los síntomas tempranos de mucositis.
La mucositis se observa durante el tratamiento con radiación o quimioterapéuticos de varios cánceres diversos incluyendo cáncer de cabeza y cuello, mieloma múltiple, cánceres colorrectales . Dados los problemas ocasionados por la mucositis que pueden descartar más radiación o quimioterapia y asimismo impiden la nutrición debido a la incomodidad ocasionada por la mucositis durante la deglución y la digestión .
Los síntomas más comunes de la mucositis incluyen enrojecimiento, sequedad o hinchazón de la boca, ardor o incomodidad al comer o beber, llagas abiertas en la boca y garganta, calambres abdominales, y sensibilidad o úlceras o enrojecimiento rectal. Fundamentalmente la mucositis implica la inflamación del recubrimiento de la boca y el tracto digestivo, y ocurre f ecuentemente en pacientes con cáncer luego de terapia con quimioterapia y radiación. La mejilla, las encías, el paladar suave, la orofaringe, la parte superior y los costados de la lengua y el piso de la boca se pueden ver afectados, asi como también el área del esófago y recto. Junto con el enrojecimiento y la hinchazón, los pacientes experimentan típicamente un dolor fuerte y urente.
Aunque hay factores que aumentan la probabilidad y gravedad de la mucositis, no hay forma confiable de predecir quién se verá afectado. No solo la mucositis es más común en pacientes mayores, sino que el grado de colapso es a menudo más debilitante. La gravedad de la mucositis tiende a aumentar si un paciente se efectúa poca higiene oral o tiene un estado nutritivo comprometido. Una infección o irritación preexistente en la membrana mucosa también puede ocasionar un caso más grave de mucositis .
Los tipos de fármacos usados para tratar el cáncer y el cronograma mediante el cual son administrados pueden influenciar el riesgo de desarrollar mucositis. La doxorubicina y el metotrexato, por ejemplo, con frecuencia ocasionan mucositis. El agente quimioterapéutico fluorouracilo no afecta normalmente con gravedad las membranas mucosas cuando se administra en pequeñas dosis en infusión intravenosa (IV) continua. Cuando el cronograma se ajusta de modo que se administre una dosis mayor durante un período de tiempo más corto (típicamente durante cinco días) , el fluorouracilo puede ocasionar casos de mucositis muy grave, dolorosa y limitante de la dosis. Los pacientes que se someten al tratamiento con quimioterapia en altas dosis y rescate de médula ósea a menudo desarrollan mucositis.
Además, la mucositis también tiende a desarrollarse en radioterapia administrada a la cavidad oral, o en dosificaciones que exceden los 180 cGy por día en un período de cinco días. La terapia de combinación, ya sea agentes de quimioterapia o quimioterapia y radioterapia a la cavidad oral, puede aumentar la incidencia de mucositis.
Actualmente no hay una cura real para la mucositis, el tratamiento está dirigido a la prevención y al manejo de los síntomas. La mucositis se soluciona típicamente unas pocas semanas después del tratamiento mientras se regeneran las células, y solo ocasionalmente se requiere la finalización del tratamiento. En algunos casos, se alterará la terapia con fármacos de modo que se administre un agente menos tóxico.
Los pacientes en riesgo de mucositis deberían ser meticulosos con su higiene oral, lavándose frecuentemente con un cepillo blando y pasándose el hilo dental cuidadosamente con hilo dental no encerado. Si se desarrolla sangrado de encías, los pacientes deberían remplazar sus cepillos con gasas o Toothettes blandos. Las dentaduras también se deberían limpiar con regularidad. Los pacientes deberían estar bien hidratados, tomar líquido frecuentemente y enjuagarse la boca varias veces al día. Los enjuagues bucales que contienen alcohol o peróxido de hidrógeno deberían evitarse dado que pueden secar la boca y aumentar el dolor. Los labios también deberían mantenerse húmedos. Debería evitarse la irritación física en la boca. Si el tiempo lo permite, los problemas dentales, tales como cavidades o dentaduras mal ajustadas, se deberían resolver con un dentista antes de comenzar con el tratamiento contra el cáncer. Los pacientes se sienten más cómodos en general ingiriendo alimento suave y de temperatura media. Alimento picante, ácido, muy caliente o muy frío puede irritar la mucosa. También se deberían evitar el tabaco y el alcohol.
El personal del hospital y los pacientes en sí mismos deberían inspeccionar la boca con frecuencia para buscar signos y síntomas de mucositis. La prueba de mucositis (inflamación, membranas mucosas brillantes amarillas o blancas que se tornan membranas rojas, en carne viva y dolorosas) puede estar presente tan temprano como cuatro días después de la administración de quimioterapia. Los enjuagues bucales con bicarbonato de sodio se usan a veces para disminuir la cantidad de flora oral y promueven la comodidad, aunque no hay prueba científica de que esto sea beneficioso. Típicamente, los pacientes se enjuagarán cada pocas horas con una solución que contiene 1/2 cucharadita (tsp) de sal y 1/2 tsp de bicarbonato de sodio en una taza de agua.
A veces se requiere alivio del dolor en pacientes con mucositis. En algunos casos, el enjuague con una mezcla de maalox, lidocaína y clorhidrato de difenhidramina alivia el dolor. Sin embargo, debido a los efectos anestésicos de la lidocaína, la sensación de sabor puede verse alterada. Aun puede reducir el reflejo nauseoso natural del cuerpo, lo que probablemente ocasiona problemas al tragar. Los agentes de recubrimiento, tales como kaopectato y gel de hidróxido de aluminio también pueden ayudar a aliviar los síntomas. El enjuague con bencidamina también ha mostrado ser prometedor, no solo en el manejo del dolor, sino también en la prevención del desarrollo de mucositis. El dolor más grave puede requerir tylenol líquido con codeína, o aun fármacos opioides intravenosos. Los pacientes con dolor grave a veces no pueden ingerir alimentos, y también pueden requerir complementos nutritivos a través de una I.V. (línea intravenosa).
Un tratamiento denominado crioterapia ha demostrado ser prometedor en pacientes que se tratan con fluorouracilo administrado en el cronograma de altas dosis y cinco días, mencionado anteriormente. Los pacientes se meten continuamente trozos de hielo en la boca durante la infusión del fármaco de treinta minutos, haciendo que los vasos sanguíneos se contraigan, reduciendo así la capacidad del fármaco de afectar la mucosa oral .
En el pasado se trató que los enjuagues con manzanilla y alopurinol controlen la mucositis, pero estudios han descubierto que no son eficaces. Los modificadores de respuesta biológica están siendo evaluados para determinar su posible implicancia en el control de la mucositis. Estudios recientes que usan grageas antimicrobianas tópicas también han demostrado ser prometedores, pero se necesita más investigación.
Por lo tanto, hay una gran necesidad en la técnica de métodos mejorados para tratar y prevenir la mucositis, mucositis oral y gastrointestinal, dado que esta afección compromete la eficacia de los tratamientos contra el cáncer con radiación o quimioterapia asi como afecta de manera adversa la calidad de vida de pacientes con cáncer debido al dolor e incomodidad extremos ocasionados por esta afección.
Se ha informado en la bibliografía (Rossi et ál., Bone Marrow Transplantation 36:771-779 (2005)) que los pacientes con mieloma múltiple que reciben quimioterapia (dexametasona y melfalán) y transplante autólogo de células madre (ASCT) , a quienes, además, se les administró un anticuerpo anti-IL-6 (BE8) tenían niveles reducidos de CRP y una reducción significativa en la fiebre así como una gravedad y comienzo reducidos de mucositis. En particular, la mucositis en los pacientes tratados tuvo un grado más bajo de toxicidad que no requería infusión de morfina en comparación con los pacientes que no recibían el anticuerpo anti-IL-6. Asimismo, los síntomas de mucositis gastrointestinal, tal como la diarrea, fueron reducidos y se mejoró la calidad de vida tal como se prueba mediante una mejor ingesta oral de actividad diaria y de nutrición.
Tal como se discutió en esta solicitud, los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos de la invención reducen eficazmente los niveles de CRP, caquexia y fiebre en pacientes tratados así como también proporcionan niveles potenciados de seroalbúmina y perfiles mejorados de coagulación y tendencia reducida de trombosis. Estos anticuerpos provocan estas actividades debido a sus efectos inhibidores sobre la IL-6, una citocina inflamatoria que provoca varios efectos biológicos. Además, con base en estas observaciones, se pueden usar los anticuerpos anti-IL-6 de la invención para prevenir la anemia o mieiosupresion que puede ocurrir durante el tratamiento contra el cáncer y pueden ser beneficiosos en tratamientos incluyendo transplante de célula madre o médula ósea.
Asimismo, debido a los efectos antiinflamatorios de los anticuerpos objeto de la presente y sus efectos beneficiosos sobre la mieiosupresion y la anemia, que, de otro modo, pueden ocurrir durante la radioterapia y quimioterapia, se anticipa adicionalmente que se pueden usar los anticuerpos objeto de la presente para tratar o prevenir la mucositis oral y gastrointestinal, en especial la mucositis que ocurre como consecuencia de regímenes de quimioterapia o radioterapia.
En esta modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo se administrará profilácticamente a pacientes con un riesgo importante de desarrollar mucositis oral o gastrointestinal, por ej . , debido a un régimen quimioterapéutico o de radioterapia al que se van a someter, y/o se puede administrar a pacientes que ya presentan síntomas de mucositis tal como se discutió anteriormente. Los presentes anticuerpos, debido a sus efectos paliativos en las células sanguíneas y en la inflamación, promoverán [sic] normal o restituir el daño del tejido en la mucosa oral y gastrointestinal que ocurre durante la mucositis.
Dado que la mucositis es particularmente una preocupación durante la radioterapia o quimioterapia de algunos cánceres donde el tratamiento puede afectar la mucosa, tal como cáncer de cabeza y cuello, cáncer del esófago, cáncer de garganta, cáncer de pulmón, cánceres gastrointestinales tales como cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, asi como cánceres hematológicos, tal como mieloma múltiple, la presente invención incluye en particular la prevención o el tratamiento de mucositis que puede ocurrir en estas condiciones mediante la administración de anticuerpos anti-IL-6 de acuerdo con la invención. Además, la presente invención abarca también la prevención o el tratamiento de mucositis en pacientes que reciben quimioterapia o radioterapia y transplante autólogo de células madres o médula ósea, tal como mieloma múltiple y leucemias o linfornas. Se sabe que la mucositis es una preocupación significativa en dichos pacientes.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a métodos para prevenir o tratar trombosis en un paciente que se encuentra en un estado de hipercoagulación, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6, tal como Abl o un fragmento o variante del mismo, mediante lo cual se mejora el perfil de coagulación del paciente o se restablece a un estado normal y, opcionalmente, controlar al paciente para evaluar el perfil de coagulación.
En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos anti-IL-6 de acuerdo con la invención, tal como Abl o formas humanizadas del mismo para tratar o prevenir artritis reumatoide en sujetos que lo necesitan. En la presente solicitud proporcionamos resultados de datos clínicos que muestran seguridad, farmacocinética y farmacodinámica para la administración subcutánea e intravenosa de un anticuerpo humanizado preferido derivado de Abl, también conocido como ALD-518, cuyo anticuerpo humanizado contiene las secuencias variables ligera y pesada contenidas en las SEQ ID NO: 19 y 20 (también se muestran a continuación) . Estos datos clínicos demuestran además que este anticuerpo mejora la actividad de la enfermedad en pacientes con artritis reumatoide a los que se les ha administrado ALD-518 subcutánea o intravenosamente.
SEQ ID NO: 19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPG GLEWVGIIYGSDETAYATSAIG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNL SEQ_ID_NO_20 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELS YQQKPGKAP LLIYRASTLASGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNA Esta solicitud proporciona datos que establecen que el anticuerpo anti-IL-6 ALD518 se toleró bien al administrarse en una única dosis SC; las reacciones en el sitio de inyección fueron en general leves. La biodisponibilidad de ALD518 SC fue -60% de ALD518 IV, y la semivida fue ~30 días. Se observaron reducciones rápidas e importantes en la CRP (proteina C reactiva) , que se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación.
La semivida de ADL518, cuando se administró subcutáneamente (aproximadamente 30 días), fue similar a la semivida observada anteriormente con la administración IV. Adicionalmente, ALD518 subcutánea condujo a reducciones grandes y rápidas en la CRP en suero y las reducciones en la CRP observadas durante las primeras 12 semanas del estudio se sostuvieron durante 24 semanas de evaluación. Los resultados también son similares los observados con la administración IV. En conjunto, estos resultados respaldan el uso de ALD518 para el tratamiento de RA, asi como también la prevención o el tratamiento de otras afecciones asociadas con la IL-6 tal como se describe en la presente. Estos regímenes terapéuticos se pueden combinar con otros terapéuticos de RA, incluyendo metotrexato u otros fármacos de RA identificados en la presente y conocidos generalmente en la técnica.
En otro aspecto, la presente invención proporciona regímenes de dosificación y formulaciones de dosificación específicos para tratar la artritis reumatoide mediante la administración subcutánea o intravenosa de anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención, tal como anticuerpos Abl humanizados.
En otro aspecto, la invención proporciona nuevas composiciones farmacéuticas y su uso en terapias de combinación novedosas y que comprenden la administración de un anticuerpo anti-IL-6, tal como Abl o un fragmento o variante del mismo y al menos otro compuesto terapéutico como una estatina, un agente anticoagulante, un antiemético, un agente antináuseas, un agente anticaquexia, un agente quimoterapéutico, un agente anticitocina, etc.
La pérdida de peso, la fatiga y la debilidad muscular son síntomas muy comunes en pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer progresa. La fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular pueden tener efectos negativos considerables en la recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo alterando estilos de vida y relaciones y afectando la voluntad o capacidad de los pacientes de continuar con los tratamientos contra el cáncer. Los métodos conocidos que se ocupan de la fatiga, pérdida de peso y debilidad muscular incluyen rutinas regulares de entrenamiento y ejercicios, métodos para conservar la energía del paciente y tratamientos que abordan la fatiga inducida por anemia y la debilidad muscular. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para mejorar la fatiga, la pérdida de peso y debilidad muscular en pacientes con cáncer.
La trombosis es una causa significativa de mortalidad en pacientes con cáncer. Bick, N Engl J Med 349:109-111 (2003). Por ejemplo, los eventos trombóticos graves y que amenazan la vida ocurren en aproximadamente un 6% de pacientes con cáncer de pulmón. Alguire et ál., J Clin Oncol 2004 Vol 22 (Suplemento del 15 de julio) No. 14S: 8082. Los pacientes con cáncer a menudo presentan hipercoagulacion, donde el sistema de coagulación tiene una mayor tendencia a la coagulación. Rickles and Edwards, Blood 62:14-31 (1983). Los marcadores de hipercoagulacion se correlacionan con malos resultados de los pacientes en al menos algunos cánceres. Bick, Semin Thromb Hemostat 18:353-372 (1992); Buccheri et ál., Cáncer 97:3044-3052 (2003); Woj tukiewicz , Blood Coagul Fibrinolysis 3:429-437 (1992). Las causas de la hipercoagulacion incluyen el cáncer en si mismo y los tratamientos contra el cáncer (por ej . , quimioterapia). La hipercoagulacion da como resultado un mayor riesgo de eventos trombóticos, lo cual se puede exacerbar aun más cuando los pacientes quedan postrados. En los casos en que no estaba contraindicada, la terapia anticoagulante otorgó beneficios de supervivencia en algunos cánceres. Lebeau et ál., Cáncer 74:38-45 (1994); Chahinian et ál., J Clin Oncol 7:993-1002 (1989). No obstante, las opciones terapéuticas a menudo están limitadas debido a que muchos pacientes con cáncer tienen un riesgo elevado de hemorragia importante, lo que impide la administración de anticoagulantes que, de otra forma, se suministrarían a modo de profilaxis para reducir el riesgo de trombosis. En resumen, los métodos disponibles para la prevención de la trombosis en pacientes con cáncer no son satisfactorios y, por consiguiente, existe la necesidad de nuevas terapias. Tales terapias mejorarían la supervivencia de pacientes con cáncer y darían una mejora calidad de vida.
La trombosis también puede ser una causa significativa de eventos adversos y mortalidad en otros grupos de paciente, incluyendo aquellos con enfermedad crónica o inflamación crónica, pacientes quirúrgicos, personas postradas y pacientes ortopédicos . En los casos en que no están contraindicados de otra forma, los métodos preventivos incluyen la compresión de la pantorrilla y anticoagulantes (por ej . , heparina de bajo peso molecular) . Estos métodos preventivos pueden reducir, pero no eliminar, el riesgo de trombosis. Debido a que estos métodos preventivos no siempre son eficaces y están contraindicados en algunos pacientes y debido también a que los anticoagulantes pueden provocar efectos secundarios potencialmente letales, como sangrado importante, se necesitan métodos alternativos para prevenir la trombosis en estos pacientes. Dichos métodos deberían mejorar los resultados de los pacientes.
La interleucina-6 (en lo sucesivo "IL-6") (también conocida como interferón^2; factor de diferenciación de linfocitos B; factor estimulador-2 de linfocitos B; factor estimulador de hepatocitos; factor de crecimiento del hibridoma; y factor de crecimiento de plasmocitoma) es una citocina multifuncional involucrada en numerosos procesos biológicos tales ,como la regulación de la respuesta inflamatoria aguda, la modulación de respuestas inmunológicas especificas incluyendo la diferenciación de linfocitos B y T, metabolismo óseo, trombopoyesis, proliferación epidérmica, menstruo, diferenciación de células neuronales, neuroprotección, envejecimiento, cáncer y la reacción inflamatoria que ocurre en la enfermedad de Alzheimer. Véase A.
Papassotiropoulos et ál, Neurobiology of Aging, 22:863-871 (2001) .
La IL-6 es un miembro de una familia dé citocinas que promueven las respuestas celulares a través de un complejo de receptores que consiste en al menos una subunidad de la glicoproteina transductora de señales gpl30 y el receptor de IL-6 ("IL-6R") (también conocido como gp80) . La IL-6R puede también estar presente en forma soluble ("sIL-6R") . La IL-6 se une a la IL-6R, que luego dimeriza el receptor transductor de señales gpl30. Véase Jones, SA, J. Immunology, 175:3463-3468 (2005).
En los seres humanos, el gen que codifica la IL-6 se organiza en cinco exones y cuatro intrones y mapea al brazo corto del cromosoma 7 en 7p21. La traducción del ARN de IL-6 y el procesamiento postraduccional da como resultado la formación de una proteina de 21 a 28 kDa con 184 aminoácidos en su forma madura. Véase A. Papassotiropoulos, et ál, Neurobiology of Aging, 22:863-871 (2001).
Tal como se establece en mayor detalle en la presente, se cree que la IL-6 juega un papel importante en el desarrollo de una multitud de enfermedades y trastornos que incluyen, de modo no taxativo, fatiga, caquexia, enfermedades autoinmunes, enfermedades del sistema óseo, cáncer, enfermedades coronarias, obesidad, diabetes, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. Debido a la participación percibida de la IL-6 en una gran variedad de enfermedades y trastornos, persiste la necesidad en la técnica de composiciones y métodos útiles para prevenir o tratar enfermedades asociadas con la IL-6, asi como también métodos de monitoreo para identificar pacientes con enfermedades o trastornos asociados con la IL-6. Las composiciones anti-IL-6 particularmente preferidas son aquellas que poseen efectos secundarios mínimos o reducidos al mínimo al administrarse al paciente. Las composiciones o métodos que reducen o inhiben las enfermedades o trastornos asociados con la IL-6 son beneficiosos para el paciente que los necesitan.
La función de la IL-6 no está restringida a la respuesta inmunológica ya que actúa en hematopoyesis, trombopoyesis, formación de osteoclastos , provocación de la respuesta hepática de fase aguda que da como resultado el aumento de la proteína C-reactiva (CRP) y la proteína amiloide A sérica (SAA) . Es sabido que es un factor de crecimiento para queratinocitos epidérmicos, células mesangiales renales, células de mieloma y plasmocitoma (Grossman et ál . , 1989 Prot Nati Acad Sci . , 86, (16) 6367-6371; Horii et ál., 1989, J Immunol, 143, 12, 3949-3955; Kawano et ál., 1988, Nature 332, 6159, 83-85) . La IL-6 es producida por una gran variedad de tipos de células incluyendo monocitos/macrófagos , fibroblastos, queratinocitos epidérmicos, células endoteliales vasculares, células mesangiales renales, células gliales, condrocitos, linfocitos T y B y algunas linfocitos Tumorales (Akira et ál, 1990, FASEB J., 4, 11, 2860-2867) . Excepto por las linfocitos Tumorales que producen constitutivamente la IL-6, las células normales no expresan la IL-6 a menos que sé estimulen de manera adecuada.
Se han observado niveles elevados de IL-6 en varios tipos de cáncer, que incluyen cáncer de mama, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, linfoma, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, cáncer colorrectal y mieloma múltiple (por ej . , Chopra et ál., 2004, MJAFI 60:45-49; Songur et ál., 2004, Tumori 90:196-200; Blay et ál., 1992, Cáncer Research 52:3317-3322; Nikiteas et ál., 2005, World J. Gasterenterol . 11:1639-1643; analizado en Heikkila et ál., 2008, Eur J Cáncer, 44:937-945). Tal como se describe anteriormente, es sabido o se sospecha que la IL-6 juega un papel importante en promover la proliferación o supervivencia de al menos algunos tipos de cáncer. Asimismo, algunos de estos estudios han demostrado correlación entre los niveles de IL-6 y el desenlace clínico del paciente. En su conjunto, estos resultados sugieren la posibilidad de que la inhibición de la IL-6 puede ser beneficiosa desde el punto de vista terapéutico. De hecho, estudios clínicos (analizados en Trikha et ál., 2003, Clinical Cáncer Research 9:4653-4665) han demostrado alguna mejora en el desenlace clínico del paciente debido a la administración de varios anticuerpos anti-IL-6, particularmente en aquellos cánceres en los que IL-6 juega un papel directo al promover la proliferación o supervivencia de células cancerígenas.
Tal como se describe anteriormente, la IL-6 estimula la respuesta hepática de fase aguda, dando como resultado la producción aumentada de CRP y niveles elevados de CRP en suero. Por esta razón, se ha informado que la proteína C reactiva (CRP) comprende un marcador sustituto de la actividad de la IL-6. Por consiguiente, es posible detectar la actividad elevada de IL-6 mediante la medición de la CRP en suero. Por el contrario, es posible detectar la supresión eficaz de la actividad de la IL-6, por ej . , mediante la administración de un anticuerpo anti-IL-6 neutralizante, mediante la disminución resultante en los niveles de la CRP en suero.
Un reciente estudio clínico demostró que la administración de rosuvastatina a individuos aparentemente sanos que poseen la CRP elevada (mayor a 2.0 mg/1) redujo sus niveles de CRP en un 37% y disminuyó en gran medida la incidencia de infarto de miocardio, apoplejía, revascularización arterial, hospitalización por angina inestable o muerte por causas cardiovasculares. Ridker et ál . , N Engl J Med. 2008 Nov 9 [Publicación electrónica antes de su impresión] .
Además de su papel directo en la patogénesis de algunos cánceres y otras enfermedades, los niveles elevados de manera crónica de IL-6 parecen afectar desfavorablemente al bienestar y calidad de vida de los pacientes. Por ejemplo, se ha informado que los niveles elevados de IL-6 están asociados con caquexia y fiebre y disminución de la albúmina en suero. Gauldie et ál., 1987, PNAS 84:7251-7253; Heinric et ál., 1990, 265:621-636; Zamir et ál., 1993, Metabolism 42:204-208; Zamir et ál., 1992, Arch Surg, 127:170-174. Se ha informado que la inhibición de la IL-6 mediante un anticuerpo neutralizante mejora la fiebre y caquexia en pacientes con cáncer, aunque no se ha informado la mejora del nivel de albúmina en suero en estos pacientes (Emille et ál., 1994, Blood, 84:2472-2479; Blay et ál . , 1992, Cáncer Research 52:3317-3322; Bataille et ál., 1995, Blood, 86: 685-691) .
Numerosos estudios han sugerido que la CRP es un valioso factor de pronóstico en pacientes con cáncer, con niveles elevados de CRP que predicen un pobre desenlace clínico. Véase, por e j . , Hefler et ál, Clin Cáncer Res, 1 de febrero de 2008;14 (3) :710-4; Nagaoka et ál, Liver Int, octubre de 2007; 27 (8) :1091-7; Heikkilá et ál, J Epidemiol Community Health, setiembre de 2007; 61 (9) : 824-33, Review; Hará et ál, Anticáncer Res, julio-agosto de 2007 ; 27 ( 4C) : 3001-4 ; Polterauer et ál, Gynecol Oncol, octubre de 2007; 107 (1) : 114-7, Epub 6 de julio de 2007; Tingstedt et ál, Scand J Gastroenterol, junio de 2007 ; 42 ( 6) : 754-9; suh et ál, Support Care Cáncer, junio de 2007; 15 ( 6) : 613-20, Epub 18 de enero de 2007; Gerhardt et ál, World J Gastroenterol, 14 de setiembre de 2006; 12 (34) : 5495-500; McArdle et ál, Urol Int, 2006; 77 (2 ) : 127-9; Guillem et ál, Dis Esophagus, 2005; 18 (3) : 146-50; Brown et ál, Cáncer, 15 de enero de 2005; 103 (2) : 377-82. La disminución de albúmina en suero (hipoalbuminemia) también está asociada con el aumento de la morbilidad y mortalidad en varias enfermedades graves, incluyendo cánceres (por ej . , Vigano et ál., Arch Intern Med, 27 de marzo de 2000;160 (6) :861-8; Hauser et ál., Support Care Cáncer, octubre de 2006/ 14(10) .999-1011; Seve et ál., Cáncer, 1 de diciembre de 2006/107 (11) ¡2698-705) . El vinculo aparente entre la hipoalbuminemia y el pobre desenlace clínico del paciente puede sugerir que restablecer los niveles de albúmina mediante la infusión directa de albúmina podría promover la supervivencia de los pacientes, no obstante, la infusión de albúmina sola no ha mejorado la supervivencia de pacientes con cáncer avanzado (Demirkazik et ál . , Proc Am Soc Clin Oncol 21: 2002 (abstr 2892)) u otros grupos de pacientes gravemente enfermos (analizado en Wilkes et ál . , Ann Intern Med, 7 de agosto de 2001; 135 (3) : 149-64) .
El Glasgow Prognostic Score [Escala de Pronóstico de Glasgow] (GPS) es una escala de pronóstico basada en la inflamación que combina niveles de albúmina (< 35 mg/L = 1 punto) y CRP (> 10 mg/L = 1 punto) (Forrest et ál . , Br J Cáncer, 2004 May 4; 90(9) :1704-6) . Desde su introducción en 2004, ya se ha demostrado que la escala de pronóstico de Glasgow posee un valor pronóstico como predictor de la mortalidad en numerosos cánceres, incluyendo cáncer gastro-esofágico, cáncer de pulmón no microcitico, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer broncogénico y cáncer renal metastático (Forrest et ál., Br J Cáncer, 4 de mayo de 2004 ; 90 ( 9) : 1704-6 ; Sharma et ál., Clin Colorectal Cáncer, setiembre de 2008 ; 7 (5) : 331-7 ; Sharma et ál., Eur J Cáncer, enero de 2008 ; 44 (2 ): 251-6; McMillan et ál.f Nutr Cáncer, 2001; 1 (1-2) : 64-9; McMillan, Proc Nutr Soc, agosto de 2008; 67 (3) :257-62; Ramsey et ál., Cáncer, 15 de enero de 2007; 109 (2) :205-12) .
La publicación de la solicitud de patente de EUA No. 20080081041 (relacionada al tratamiento del cáncer usando un anticuerpo anti-IL-6) describe que debido a que la IL-6 está asociada a la actividad de la enfermedad y ya que la CRP es un marcador sustituto de la actividad de la IL-6, la supresión sostenida de la CRP mediante la neutralización, de la IL-6 a través de su anticuerpo anti-IL-6 (CNTO 328, Zaki et ál., Int J Cáncer, 10 de setiembre de 2004 ; 111 (4) : 592-5) puede suponerse necesaria para alcanzar la actividad biológica. La misma solicitud de patente indica que la relación entre la IL-6 y la CRP en pacientes con enfermedad de próstata benigna y maligna fue previamente examinada por McArdle (McArdle et ál . 2004 Br J Cáncer 91 ( 10 ): 1755-175 ) . Según se dice, McArdle no encontró diferencias considerables entre las concentraciones de IL-6 y CRP en los pacientes con enfermedad benigna en comparación con los pacientes con cáncer de próstata, en los pacientes con cáncer hubo un aumento considerable tanto en la concentración de IL-6 como en la de CRP con grado creciente de tumor. El valor medio de CRP en suero para los 86 sujetos con cáncer de próstata fue de 1.8 mg/L. Basándose en esto, los inventores de la anterior solicitud de patente postulan una dosis y cronograma propuestos donde se administran 6 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-6 (CNTO 328) cada 2 semanas y afirman que probablemente se alcance la supresión sostenida de la CRP en sujetos con HRPC metastático.
La señalización de la IL-6 está mediada por la familia Jak-Tyk de tirosina cinasas citoplasmáticas, incluyendo JAK1, JA 2 y JAK3 (analizado en Murray J Immunol. 1 de marzo de 2007; 178 (5) :2623-9) . Sivash et ál. informa la abrogación de la señalización JAK mediada por IL-6 por la prostaglandina ciclopentenona 15d-PGJ2 en las células de carcinoma escamosa oral. British Journal of Cáncer (2004) 91, 1074-1080. Estos resultados sugieren que los inhibidores de JA 1, JAK2, o JAK3 podrían emplearse como antagonistas de IL-6.
Ulanova et ál. informan que la inhibición de la proteina tirosina cinasa no receptora Syk (usando ARNsi) disminuyó la producción de IL-6 por las células epiteliales. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Marzo de 2005; 288 ( 3) : L497-507. Estos resultados sugieren que se podría emplear un inhibidor de Syk como un antagonista de IL-6.
Kedar et ál. informan que el tratamiento con talidomida reduce considerablemente los niveles en suero de CRP e IL-6 hasta niveles normales o casi normales en una fracción importante de pacientes con carcinoma de células renales. Int J Cáncer. 10 de junio de 2004; 110 (2) :260-5. Estos resultados sugieren que la talidomida y posiblemente derivados de la misma tales como lenalidomida, podrían ser útiles antagonistas de IL-6.
Asimismo, otra solicitud de patente publicada, EUA 20070292420 enseña un estudio de aumento de dosis de Fase I usando un anticuerpo anti-IL-6 (cCLB-8) para tratar pacientes que no responden al tratamiento con mieloma múltiple en etapa avanzada (N=12) e indica que este estudio demuestra que algunos pacientes presentaron una estabilización de su enfermedad. La solicitud también informa que luego de la interrupción del tratamiento se produjo aceleración en el aumento de los niveles de proteína M, lo que sugiere un rebote de la enfermedad luego del cese del tratamiento. El anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 inhibió la IL-6 que circula libremente.
La solicitud también indica que en este ensayo de anticuerpos no se observaron reacciones tóxicas (excepto trombocitopenia transitoria en dos pacientes previamente tratados de forma intensiva) o alérgicas y disminuyó la proteina C reactiva (CRP) por debajo del nivel de detección en todos los pacientes. Su anticuerpo (anticuerpo cCLB-8) supuestamente poseía una semivida circulante de 17.8 días y no se observó ninguna respuesta inmunológica al anticuerpo humano anti-quimérico (HACA) (van Zaanen et ál. 1998). Ellos afirman que la administración de CNTO 328 no provocó cambios en la presión sanguínea, pulsaciones, temperatura, hemoglobina, funciones hepáticas y funciones renales. Excepto por trombocitopenia transitoria en dos pacientes previamente tratados de forma intensiva, no se observaron supuestamente reacciones tóxicas o alérgicas y no se observó ninguna respuesta inmunológica al anticuerpo humano antiquimérico (HACA) . Tres pacientes en su estudio supuestamente desarrollaron complicaciones relacionadas con la infección durante el tratamiento, no obstante, los inventores concluyeron que no era probable una posible relación con el anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 debido a que las complicaciones infecciosas son supuestamente comunes en el mieloma múltiple en etapa final y son una causa principal de muerte. Basándose en sus resultados concluyeron que este anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 era seguro en los pacientes con mieloma múltiple.
Determinados anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente también se describieron en las siguientes solicitudes de patente publicadas y no publicadas, las cuales son de propiedad conjunta de la cesionaria de la presente solicitud: U.S. 2009/0028784, WO 2008/144763, U.S. Serie No. 12/391,717 presentada el 24 de febrero de 2009 (Carpeta del agente No. 67858.702201) y U.S. Serie No. 12/366,567 presentada el 05 de febrero de 2009 (Carpeta del representante 67858.702101).
Otros anticuerpos anti-IL-6 se describieron en las siguientes patentes y solicitudes de patente publicadas de EUA: 7,482,436; 7,291,721; 6,121,423; 2008/0075726; 2007/0178098; 2007/0154481; 2006/0257407 y 2006/0188502.
Como se expresó anteriormente, la IL-6 elevada ha estado implicada en la patogénesis de caquexia, debilidad, fatiga y fiebre. Las enfermedades y los trastornos asociados con la fatiga incluyen, de modo no taxativo, fatiga general, fatiga inducida por estrés, fatiga inducida por ejercicio, fatiga relacionada con cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria y síndrome de fatiga crónica. Véase, por ejemplo, Esper DH, et a'l, The cáncer cachexia syndrome: a review of metabolic and clinical manifestations, Nutr Clin Pract., agosto de 2005;20 (4) :369-76; Vgontzas AN, et ál, IL-6 and its circadian secretion in humans, Neuroimmunomodulation, 2005 ; 12 ( 3 ) : 131- 0 ; Robson-Ansle , PJ, et ál, Acute interleukin-6 administration impairs athletic performance in healthy, trained male runners, Can J Appl Physiol., agosto de 200 ; 2 ( ) : 411-8 ; Shephard RJ., Cytokine responses to physical activity, with particular reference to IL-6: sources, actions, and clinical implications , Crit Rev Immunol., 2002 ; 22 ( 3) : 165-82 ; Arnold, MC, et ál, Using an interleukin-6 challenge to evalúate neuropsychological performance in chronic fatigue syndrome, Psychol Med., agosto de 2002; 32 (6) : 1075-89; Kurzrock R . , The role of cytokines in cancer-related fatigue, Cáncer, 15 de setiembre de 2001;92(6 Suppl) : 1684-8; Nishimoto N, et ál, Improvement in Castleman's disease by humanized anti-interleukin-6 receptor antibody therapy, Blood, 01 de enero de 2000; 95 (1) :56-61; Vgontzas AN, et ál) Circadian interleukin-6 secretion and quantity and depth of sleep, J Clin Endocrinol Metab., agosto de 1999; 84 ( 8 ): 2603-7 ; y Spath-Schwalbe E, et ál, Acute effects of recombinant human interleukin 6 on endocrine and central nervous sleep functions in healthy men, J Clin Endocrinol Metab., mayo de 1998 ; 83 ( 5 ): 1573-9 ; cuyos contenidos se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
Las enfermedades y los trastornos asociados con la caquexia incluyen, de modo no taxativo, caquexia cancerosa, caquexia cardiaca, caquexia respiratoria, caquexia renal y caquexia relacionada con la edad. Véase, por ejemplo, Barton, BE., Interleukin-6 and ne strategies for the treatment of cáncer, hyperproliferative diseases and paraneoplastic syndromes, Expert Opin Ther Targets, agosto de 2005; 9 (4) : 737-52; Zaki H, et ál, CNTO 328, a monoclonal antibody to IL-6, inhibits human tumor-induced cachexia in nude mice, Int J Cáncer, 10 de setiembre de 2004;111 (4) :592-5; Trikha M, et ál, Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cáncer: a review of the rationale and clinical evidence, Clin Cáncer Res., 15 de octubre de 2003; 9 (13) : 653-65; Lelli G, et ál, Treatment of the cáncer anorexia-cachexia syndrome: a critical reappraisal, J Chemother., junio de 2003; 15 (3) : 220-5; Argües JM, efc ál, Cytokines in the pathogenesis of cáncer cachexia, Curr Opin Clin Nutr Metab Care, julio de 2003; 6 (4) : 01-6; Barton BE., IL-6-like cytokines and cáncer cachexia: consequences of chronic inflammation, Immunol Res., 2001; 23 (1) : 1-58; Yamashita JI, et ál, Medroxyprogesterone acétate and cáncer cachexia: interleukin-6 involvement, Breast Cáncer, 2000;7 (2) : 130-5; Yeh SS, et ál, Geriatric cachexia: the role of cytokines, Am J Clin Nutr., agosto de 1999; 70 (2 ) : 183-97 ; Strassmann G, et ál, Inhibition of experimental cáncer cachexia by anti-cytokine and anti-cytokine-receptor therapy, Cytokines Mol Ther., junio de 1995; 1 (2) : 107-13; Fujita J, et ál, Anti-interleukin-6 receptor antibody prevents muscle atrophy in colon-26 adenocarcinoma-bearing mice with modulation of lysosomal and ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathways, Int J Cáncer, 27 de noviembre de 1996; 68 (5) : 637-43; Tsujinaka T, et ál, Interleukin 6 receptor antibody inhibits muscle atrophy and modulates proteolytic systems in interleukin 6 transgenic mice, J Clin Invest., 01 de enero de 1996; 97 (1) : 244-9; Emilie D, et ál, Administration of an anti-interleukin-6 monoclonal antibody to patients with acquired immunodeficiency syndrome and lymphoma: effect on lymphoma growth and on B clinical Symptoms, Blood, 15 de octubre de 1994;84 (8):2472-9; y Strassmann G, et ál, Evidence for the involvement of interleukin 6 in experimental cáncer cachexia, J Clin Invest., mayo de 1992;8 (5) : 1681-4; cuyos contenidos se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
Otra enfermedad relacionada con la caquexia es el síndrome del declive, también conocido como retraso del crecimiento, donde un niño presenta una tasa de aumento de peso menor a la esperada. El síndrome del declive se define típicamente como un peso inferior al tercer percentil o una disminución en el rango de percentil de 2 parámetros de crecimiento principales en un período acotado. El síndrome del declive se produce como resultado de causas psicosociales y médicas heterogéneas y, algunas veces, la causa elude el diagnóstico. Un estudio reciente (con un total de 34 pacientes) indicó un crecimiento considerable desde el punto de vista estadístico en los niveles de IL-6 en pacientes diagnosticados con síndrome del declive. Shaoul et ál. J Pediatr Gastroenterol Nutr., octubre de 2003;37 (4) : 487-91.
BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención es una extensión de una invención anterior de los solicitantes dirigida a anticuerpos específicos, anticuerpos humanizados o quiméricos o de cadena simple y fragmentos y variantes de los mismos que poseen especificidad de unión por IL-6, en particular anticuerpos que poseen especificidad epitópica específica y/o propiedades funcionales y terapias novedosas que usan estos y otros anticuerpos anti-IL-6. Una modalidad de la invención comprende anticuerpos humanizados específicos y fragmentos y variantes de los mismos capaces de unirse a IL-6 y/o el complejo IL-6/IL-6R. Estos anticuerpos pueden unir IL-6 solubles o IL-6 expresadas en la superficie celular. Asimismo, estos anticuerpos pueden inhibir la formación o los efectos biológicos de una o más IL-6, complejos IL-6/IL-6R, complejos IL-6/IL-6R/gpl30 y/o multimeros de IL-6/IL-6R/gpl30. La presente invención se relaciona a terapias novedosas y protocolos terapéuticos que usan anticuerpos anti-IL-6, preferentemente aquellos descritos en la presente. En particular, la presente invención se relaciona a métodos para prevenir o tratar la trombosis en un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente que presente niveles de dimero-D y/o CRP antes del tratamiento, que comprenden administrar a un paciente un antagonista de IL-6, como los identificados anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 (como Abl) o un fragmento o variante de anticuerpo del mismo, mediante lo cual se mejora o se restablece el perfil de coagulación del paciente hasta un estado normal. En algunas modalidades, estos métodos también pueden incluir la administración de otros activos tales como estatinas que pueden ayudar adicionalmente (sinergizar) con el antagonista de IL-6, como Abl y, de ese modo, tratar o prevenir de manera más eficaz la trombosis.
La presente invención también se refiere a métodos para mejorar la supervivencia o calidad de vida de un paciente que lo necesita, por ej . , un paciente que presenta niveles de CRP elevados y/o niveles de albúmina reducidos, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como los que se identifican a continuación, por ej., un anticuerpo anti-IL-6 (por e . , Abl) o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, por lo cual se reduce el nivel de proteina C reactiva ("CRP") en el paciente y/o se aumenta el nivel de albúmina en el paciente. En algunas modalidades, estos métodos pueden incluir adicionalmente la administración de otros activos, tales como estatinas, que pueden además ayudar (sinergizar) con el antagonista de IL-6, tal como Abl, y por lo tanto tratar al paciente de manera más eficaz.
Otra modalidad de la invención se refiere a Abl, incluyendo conejo y formas humanizadas del mismo, asi como cadenas pesadas, cadenas ligeras, fragmentos, variantes y CDR de las mismas. En los datos de la prueba clínica humana presentada se administró una forma humanizada de Abl.
En una modalidad preferida, esto se efectúa mediante la administración de los anticuerpos descritos en la presente, que comprenden las secuencias de los polipéptidos de VH, VL y CDR descritas en la presente, o versiones humanizadas o quiméricas o de cadena simple de las mismas que contienen uno o más de las CDR de las secuencias de anticuerpo anti-IL-6 ejemplificadas y los polinucleótidos que las codifican. Preferentemente estos anticuerpos serán aglicosilados . En modalidades más específicas de la invención estos anticuerpos bloquearán la activación de gpl30 y/o poseerán afinidades de unión (Kds) menores a 50 picomolar y/o valores Koff menores o iguales a 1CT4 S"1.
En otra modalidad de la invención, estos anticuerpos y versiones humanizadas serán derivados de células inmunes de conejo (linfocitos B) y pueden seleccionarse basándose en su homología (identidad de secuencia) con las secuencias de línea germinal humana. Estos anticuerpos pueden requerir modificaciones mínimas de secuencias, o pueden no requerir modificaciones, por lo cual facilitan la retención de propiedades funcionales luego de la humanización. En ejemplos de modalidades estos anticuerpos humanizados comprenderán regiones flanqueantes humanas que son altamente homologas (poseen altos niveles de identidad de secuencia) a aquellas de un anticuerpo progenitor (por e . , conejo) tal como se describe más adelante.
En otra modalidad de la invención los anticuerpos en cuestión pueden seleccionarse según su actividad en ensayos funcionales tales como ensayos de proliferación de T1165 conducidos por IL-6, ensayos de producción de haptoglobina de células HepG2 simulada por IL-6 y similares. Una modalidad adicional de la invención está dirigida a fragmentos de anticuerpos anti-IL-6 que comprenden polipéptidos de VH, VL y CDR o variantes o fragmentos de los mismos, por ej . , derivados de células inmunes de conejo y los polinucleótidos que codifican los mismos, así como también el uso de estos fragmentos de anticuerpo y los polinucleótidos que los codifican en la creación de anticuerpos y composiciones de polipéptidos novedosos capaces de reconocer complejos IL-6 y/o IL-6/IL-6R o complejos IL-6/IL-6R/gpl30 y/o multímeros de los mismos.
La invención también contempla la administración de conjugados de anticuerpos anti-IL-6 y versiones humanizadas, quiméricas o de cadena simple de los mismos y otros fragmentos de unión y variantes de los mismos conjugados a uno o más restos funcionales o detectables . La invención también contempla métodos para realizar dichos anticuerpos anti-IL-6 humanizados o anticuerpos de complejo anti-IL-6/IL-6R y fragmentos de unión y variantes de los mismos. En una modalidad, los fragmentos de unión incluyen de modo no taxativo, fragmentos Fab, Fab', F(ab' )2, Fv y scFv.
Las modalidades de la invención se relacionan al uso de anticuerpos anti-IL-ß para el diagnóstico, evaluación y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con IL-6 o la expresión aberrante de la misma. La invención también contempla el uso de fragmentos o variantes de anticuerpos anti-IL-6 para el diagnóstico, evaluación y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con IL-6 o la expresión aberrante de la misma. Los usos preferidos de los anticuerpos en cuestión, especialmente anticuerpos humanizados, quiméricos y de cadena simple son el tratamiento y prevención de cáncer asociado a la fatiga y/o caquexia y artritis reumatoide.
Otras modalidades de la invención se relacionan a la producción de anticuerpos anti-IL-6 en células hospedadoras recombinantes , preferentemente levadura diploide tal como Pichia diploide y otras cepas de levadura.
En otra modalidad, la presente invención también se refiere al uso de anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención para prevenir o mitigar el comienzo de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) o recaída de leucemia en sujetos que reciben células, tejidos u órganos transplantados, tales como sujetos que reciben transplantes de células madre hematopoyéticas (HCT) , transplantes de médula ósea (??G) y otras células, tejidos u órganos transplantados, en particular células, tejidos u órganos transplantados, en particular donde el transplante puede contener células dendríticas, en particular células dendríticas plasmocitoides BDCAA4+.
Se ha informado en la bibliografía ( Perez-Martinez et ál . , "Blood dendritic cells suppress NK cell function and increase the risk of leukemia relapse after hematopoietic cell transplantation", Biology of Blood and Marrow Transplantation, disponible en línea 25 de octubre de 2010) que los sujetos con leucemia que reciben HCT transplantadas que contienen mayores cantidades de células dendríticas plasmocitoides BDCAA4+ (así como células dendríticas mieloides BDCA1+) son más propensos a presentar recaída de leucemia y presentan menos supervivencia. Estos sujetos con transplante presentan típicamente un ambiente inflamatorio caracterizado por abundantes patrones moleculares asociados a patógenos abundantes (PAMP) derivados de patógenos endógenos y tejidos hospedadores como consecuencia de tejidos dañados por radiación y quimioterapia de alta dosis (como resultado del tratamiento de la enfermedad, tal como cáncer antes de la necesidad del transplante) .
En particular, los autores explican que mientras que las células N inducen normalmente la maduración de DC y las DC aumentan a su vez la expresión de activación de marcadores en las células NK que, paradójicamente, ambas células dendriticas plasmocitoides BDCAA4+ y células dendriticas mieloides BDCA1+ suprimieron la función de células NK en ambos ensayos in vitro y modelos de ratón in vivo cuando se usaron los ligandos de TLR para imitar el ambiente inflamatorio asociado a microbios en HCT alogénico. Su teoría es que estos fenómenos pueden explicar por qué los pacientes que recibieron HCT, que contenían más cantidad de estas células, tuvieron un gran riesgo de recaída de leucemia. Adicionalmente describen que los descubrimientos mecánicos detallados sugieren que estas células dendriticas provocan este efecto inhibidor sobre la citotoxicidad de las células NK a través de IL-10 e IL-6 (dado que la incubación de las células NK con estas citocinas tiene un efecto supresor dependiente de la dosis sobre la citotoxicidad de las células NK) .
Con base en estos descubrimientos y en la potente capacidad de anticuerpos de acuerdo con la invención de suprimir la producción de IL-6 in vitro e in vivo, la presente invención proporciona métodos y composiciones para prevenir una recaída de leucemia o la enfermedad de injerto contra huésped, mediante el uso de un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención como un agregado a las terapias donde se usan células, tejidos u órganos transplantados. Más particularmente, la invención proporciona métodos para reducir o prevenir GVHD o recaída de leucemia en pacientes que reciben transplantes de médula ósea, transplantes de células hematopoyéticas, transplantes de hígado o páncreas y otros transplantes de células, tejidos y órganos donde el transplante puede comprender células dendríticas, en particular células dendríticas plasmocitoides BDCAA4+ y/o células dendríticas mieloides BDCA1+.
La presente invención es adecuada en particular para tratar pacientes con transplantes que ya tienden a tener un medio inflamatorio, tales como sujetos que ya se han sometido o aún se están sometiendo a quimioterapia y/o radiación. Fundamentalmente, los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos objeto de la presente actuarán para suprimir niveles de IL-6 ya altos en estos sujetos que reciben transplantes y ayudar así a mitigar el efecto no deseado de dichas células dendríticas sobre células NK. Esto es clínicamente ventajoso dado que las células NK tienen mucha incidencia en el transplante de células madre hematopoyéticas y en interferencia con las células dendríticas para inducir respuestas primarias contra la infección. Asimismo, se ha demostrado que las células NK donantes pueden promover injertos, prevenir la GVHD, controlar infecciones y reducir el riesgo de recaída de leucemia.
Por consiguiente, con base en lo anterior, la presente invención proporciona métodos para promover el injerto de transplante, controlar o reducir el riesgo de infección, y/o reducir o prevenir la GVHD, y/o recaída de leucemia en un sujeto que recibe células, tejidos u órganos transplantados mediante la administración anterior, concurrente o posterior del transplante de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención. En modalidades preferidas, estos sujetos comprenderán individuos que tienen cáncer, y/o sujetos que ya han recibido un régimen terapéutico o tienen una afección subyacente que ocasiona un medio inflamatorio endógeno, tales como sujetos que han recibido quimioterapia o radiación antes del transplante .
La terapia del sujeto administrará típicamente el anticuerpo antes o junto con el transplante, por ej . , en el orden de alrededor un mes, varias semanas o una semana antes del transplante de modo de reducir niveles circulantes del anticuerpo IL-6 cuando se lleva a cabo el transplante. Sin embargo, alternativamente los anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpos objeto de la presente se pueden administrar junto con la célula, tejido u órgano transplantado o poco tiempo después, por ej . , preferentemente dentro de varias horas o días del transplante. Si estos restos se administran junto con el anticuerpo IL-6 o fragmento de anticuerpo se pueden combinar con las células, tejidos u órganos transplantados o se pueden administrar en composiciones de medicamentos separadas.
En algunos casos, por ej . , en el caso de transplantes de médula ósea o células madre hematopoyéticas , puede ser deseable poner en contacto las células, tejidos u órganos antes del transplante con un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención de modo de suprimir la producción de IL-6 mediante cualquier célula dendrítica contenida allí antes del transplante.
Asimismo, puede ser deseable además administrar al sujeto o pretratar las células, tejidos u órganos de manera adicional antes del transplante con un antagonista de IL-10, por ej . , un anticuerpo anti-IL-10 o fragmento de anticuerpo.
Por lo tanto, la presente invención proporciona de manera adicional composiciones que contienen al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención junto con células, tejidos o un órgano que se va a transplantar y opcionalmente de manera adicional incluye también al menos un antagonista de IL-10.
La invención proporciona también métodos para reducir el riesgo de infección en sujetos que reciben células, tejidos u órganos transplantados, en particular aquellos que probablemente contienen células dendriticas mediante la administración anterior, concomitante o posterior al transplante de una cantidad de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención suficiente como para prevenir o reducir el riesgo de infección.
La invención proporciona también métodos para reducir el riesgo de GVHD en sujetos que reciben células, tejidos u órganos transplantados, en particular aquellos que probablemente contienen células dendríticas mediante la administración anterior, concomitante o posterior al transplante, por ej . , BMT o HCT, a un paciente de una cantidad de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención suficiente como para prevenir o reducir el riesgo de GVHD. En algunas modalidades, estos sujetos habrán recibido quimioterapia y/o radiación o dicha quimioterapia y/o radiación puede ser continua .
La invención también proporciona métodos para reducir el riesgo de recaída de leucemia en sujetos que reciben células, tejidos u órganos transplantados, en particular aquellos que probablemente contienen células dendríticas mediante la administración anterior, concomitante o posterior al transplante de una cantidad de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención suficiente como para prevenir o reducir el riesgo de recaída de leucemia. Los ejemplos de dichas leucemias incluyen leucemias crónicas, leucemias agudas tal como leucemia mielógena que es una enfermedad que se desarrolla a partir de células mieloides y puede ser crónica o aguda, denominada leucemia mielógena crónica (CML) o leucemia mielógena aguda (AML) , leucemia linfocítica que se desarrolla a partir de células denominadas linfoblastos o linfocitos en la médula ósea y cuya enfermedad de manera similar puede ser aguda o crónica, denominada leucemia linfocítica crónica (CLL) o leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de linfocitos T (T-PLL) que es una leucemia muy rara y agresiva que afecta a los adultos, leucemia linfocítica granular grande cuya enfermedad puede implicar tanto linfocitos T como células NK que, como la leucemia de células pilosas, implica únicamente linfocitos B, y es una leucemia rara e indolente (no agresiva) .
La presente invención también proporciona métodos para reducir el riesgo de GVHD en sujetos que reciben células, tejidos u órganos transplantados de hígado o páncreas mediante la administración anterior, concomitante o posterior al transplante de una cantidad de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención suficiente como para prevenir o reducir el riesgo de GVHD.
La presente invención se refiere además al uso de los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos objeto de la presente para el tratamiento de cánceres específicos en combinación con quimioterapéuticos , preferentemente inhibidores de EGFR, y/o radiación donde esta combinación se administra usando un régimen de dosificación mediante el cual el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo anti-IL-6 hace a las células cancerosas más sensibles a la acción de quimioterapia y radiación. Estos métodos incluyen en particular el tratamiento de cualquier cáncer, especialmente cánceres donde un inhibidor de EGFR es útil para el tratamiento contra el cáncer. Ejemplos no taxativos de los mismos incluyen cánceres avanzados y no avanzados incluyendo cánceres metastizados , tales como cáncer de pulmón metastásico y no metastásico, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, (HNSCC) , cáncer de páncreas, cáncer de faringe, cáncer colorrectal, cáncer anal, glioblastoma multiforme, cánceres epiteliales, carcinomas de células renales, leucemia mielogena crónica y aguda y otras leucemias.
Con respecto a esta modalidad de la invención se ha informado en la bibliografía que la regulación por aumento de la IL-6 contribuye a la resistencia de algunos cánceres a quimioterapéuticos, tales como inhibidores de EGFR, y que esta resistencia implica IL-6 elevada en el sitio del cáncer. Por ejemplo, Yao et ál., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, PNAS 31 de agosto de 2010 vol . 107 No. 35 15535-15540 enseñan que la IL-6 se expresa en altos niveles en células de cáncer resistentes a erlotinib y se requiere para su supervivencia.
Asimismo, Otero et ál., J Immunol. 177:6593-7 (2006) informan que la IL-6 puede tener incidencia en la resistencia adquirida a la apoptosis inducida por radiación de linfocitos B. Además, Sriuranpong et ál., Cáncer Research 63:2948-2956 (2003) describieron que la activación constitutiva independiente de EGFR de STAT3 en carcinoma de cáncer de cabeza y cuello implica la señalización de IL-6/gpl30 y que esta activación puede conferir potencial tanto proliferativo como de supervivencia de estas células cancerosas. Aun de manera adicional, Chen et ál., Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys . 76 (4) : 1214-1224 (2010) informaron la importancia de la señalización de IL-6 en la resistencia del cáncer de faringe a la irradiación y a inhibidores de EGFR.
Además, un estudio más temprano de Gao et ál. (2007) "Mutations in the EGFR kinase domain medíate STAT3 activation via IL-6 production in human lung adenocarcinomas", J Clin Invest 117:3846-38569); y los autores mostraron que las células NSCLC que expresan EGFR mutante dependen del eje de IL-6 para su proliferación y supervivencia de larga duración.
Más particularmente, Yao et ál. (Id) mostraron que la reducción del nivel de IL-6 mediante ARNip asi como la inhibición del eje de IL-6 mediante un anticuerpo neutralizante de IL-6 o un inhibidor de JAK1/2 no solo disminuyeron de manera significativa la señalización mediada por IL-6 sino que también afectaron la viabilidad celular y revelaron que la IL-6 fue suficiente para modificar la sensibilidad de células cancerosas al inhibidor de EGFR erlotinib. Demostraron esto midiendo el efecto de la IL-6 sobre la viabilidad de varias lineas celulares de NSCLC (HCC827, PC9 y HCC4006) que expresan EGFR mutante. Descubrieron que probablemente como consecuencia de la acumulación de diversas anormalidades genéticas y epigenéticas , estas lineas celulares, a pesar de alojar mutaciones de EGFR que activan somáticos, presentaron sensibilidades a erlotinib diferentes con IC50 que varían de 5 µ? en el caso de H1650 a 0.001 µ? en el caso de HCC827. A pesar de estas diferencias, en todos los casos la presencia de IL-6 en el medio fue suficiente para disminuir la sensibilidad de varias líneas celulares a erlotinib. Además observaron que el tratamiento con IL-6 no afectó de manera sustancial las velocidades de proliferación celular, disminuyó su respuesta apoptótica y que el efecto de IL-6 fue originado por la activación del eje gpl30-STAT3 y no disminuyó la biodisponibilidad de erlotinib. Con base en estos resultados, presentaron como hipótesis un modelo de tumor en el cual la estimulación parácrina o autócrina del eje TGF-ß (y producción de IL-6 aumentada) es suficiente para la adquisición de morfología tipo mesenquimal, motilidad y capacidad de invasión aumentadas, y resistencia a erlotinib aumentada.
Otros han informado también los efectos de niveles aumentados de IL-6 sobre la resistencia de tumores a inhibidores de EGFR. Por ejemplo, Nishioka et ál . , en Leukemia (2009) 23:2304-2308 enseñan que las lineas celulares de AML adquieren resistencia de fármacos a tirosina cinasas receptoras tales como sunitibib e imatinib, aparentemente debido a la secreción de citocinas inflamatorias tal como IL-6 y muestran además que el tratamiento de estas células con IL-6 debilitó la eficacia de estos compuestos contra estas líneas celulares de cáncer. Además describen que un anticuerpo humanizado contra el receptor IL-6, tocilizumab o AG490 bloqueó la señalización de JAK2/STAT5 y recuperó la sensibilidad de las células a sunitinib.
Por lo tanto, con base en las propiedades inhibidoras de IL-6 potentes de anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención, la presente invención en otra modalidad se refiere a los regímenes del tratamiento usando quimioterapéuticos y/o radiación mediante los cuales la resistencia contra el quimioterapéutico o la radiación puede implicar una producción aumentada de IL-6 en el sitio del tumor, y mediante los cuales esta resistencia se bloquea o inhibe mediante la administración del quimioterapéutico y/o de la radiación junto con un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención. En particular, dichos quimioterapéuticos incluyen inhibidores de EGFR ya que se ha informado que los cánceres pueden volverse resistentes a estos fármacos con base en niveles aumentados de IL-6 en el sitio del tumor, probablemente como consecuencia de una respuesta inflamatoria provocada como resultado de quimioterapia y/o radiación prolongadas .
Ejemplos de inhibidores de EGFR que se pueden administrar en regímenes terapéuticos con anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen, a modo de ejemplo, Cetuximab (Erbitux) disponible en ImClone, Erlotinib (Tarceva) disponible en OSI Pharmaceuticals , Gefitinib (Iressa) disponible en AstraZeneca, Lapatinib (Tykerb) disponible en Glaxo, Panitimumab (Vectibox) disponible en Amgen, Sunitinib o Sutent (N- (2-dietilaminoetil) -5- [ (Z) - (5-fluoro-2-oxo-lH-indol-3-ilideno) metil] -2 , -dimetil-lH-pirrol-3-carboxamida) comercializado por Pfizer, Gefitinib o N- (3-cloro-4-fluoro-fenil) -7-metoxi-6- ( 3-morfolin-4-ilpropoxi) quinazolin-4-amina comercializado por AstraZeneca, Zalutumumab en desarrollo clínico mediante GenMab y otros.
De acuerdo con esta modalidad de la invención, un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención se administrará antes, junto con o después de la administración del quimioterapéutico, por ej . , un inhibidor de EGFR o radiación. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo se administrará a individuos mediante los cuales su cáncer, por ej . , una leucemia tal como AML, cáncer de faringe o un cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón no microcitico (NSCLC) ha desarrollado una resistencia al fármaco, por ej . , como consecuencia del ambiente inflamatorio alrededor del cáncer que da como resultado niveles de IL-6 aumentados. Además, los anticuerpos IL-6 objeto de la presente se pueden usar para potenciar la eficacia de la radiación contra tumores resistentes a la radiación en casos donde la resistencia al tumor implica de manera similar un ambiente de tumor inflamatorio asociado a citocinas proinflamatorias elevadas y en particular IL-6 elevada.
En una modalidad preferida, la invención administrará un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención para potenciar la eficacia de un inhibidor de EGFR, en particular en pacientes que han desarrollado una resistencia o sensibilidad debilitada del cáncer tratado al fármaco debido a una respuesta inflamatoria que implica niveles de IL-6 aumentados. Los inhibidores de EGFR específicos que se pueden usar en combinación con anticuerpos de acuerdo con la invención se identifican anteriormente. Además, en la tabla a continuación se proporcionan ejemplos específicos de inhibidores de EGFR aprobados por la FDA e indicaciones y regímenes de dosificaciones .
Se anticipa que cuando estos fármacos se usan junto con los anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpos objeto de la presente, se pueden usar los mismos regímenes de dosificación quimioterapéutica pero con mayor citotoxicidad que las células cancerosas, con base en el efecto sensibilizante del anticuerpo IL-6 sobre las células cancerosas tratadas (debido al efecto inhibidor del anticuerpo sobre los niveles de IL-6 en el sitio del cáncer o tumor que, cuando son elevados, "protegen" al cáncer de los efectos del fármaco) .
TABLA 1. Inhibidores de EGFR aprobados por la FDA T / = inhibidor de tirosina cinasa; mAb = anticuerpo monoclonal; NSCLC= cáncer de pulmón no microcítico; HNSCC = carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello En una modalidad preferida, el cáncer tratado será un cáncer de pulmón tal como un cáncer de pulmón no microcítico, por e . , carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes o adenocarcinoma o un cáncer de pulmón microcítico tal como carcinoma de células pequeñas (cáncer de células de avena) o carcinoma de células pequeñas combinadas. En una modalidad particularmente preferida, el cáncer de pulmón tratado comprenderá carcinoma de células escamosas y el paciente tratado será uno que recibe erlotinib o sunitinib. Estos pacientes incluirán individuos cuyos tumores han desarrollado una resistencia a estos fármacos después de una o más sesiones de quimioterapia .
Sin embargo, tal como se observó anteriormente, se contempla cualquier cáncer donde estos fármacos inhibidores de EGFR son probablemente útiles, tales como formas no avanzadas, no metastásicas y metastásicas de cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de cerebro y otros.
En esta modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpos objeto de la presente se administrarán en dosificaciones eficaces para hacer al tumor más sensible a los efectos del fármaco y/o radiación, por e . , dosificaciones que varían de alrededor de 25-500 mg, más típicamente dosificaciones de alrededor de 120, 160, 240 o 320 mg. El anticuerpo se administrará antes, junto con o luego de la administración del quimioterapéutico, por ej . , desde alrededor de un mes, varias semanas o una semana antes o después de quimioterapia. De preferencia, el anticuerpo se administrará antes de quimioterapia o radiación con el fin de hacer al cáncer más sensible a los efectos del fármaco o la radiación.
Como se ha observado, las células cancerosas resistentes al fármaco tienen una capacidad más invasiva o mestastásica y una apoptosis reducida con respecto a las células cancerosas no resistentes, la presente invención debería reducir de manera adicional el riesgo de invasión o metástasis de las células cancerosas a otros sitios y/o potencialmente invertir o prevenir la metástasis. Asimismo, la presente invención debería dar como resultado apoptosis aumentada de las células cancerosas resistentes a fármacos.
En algunos casos puede ser posible coadministrar el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo, por ej . , en casos donde el inhibidor de EGFR también es un biológico tal como un anticuerpo. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el anticuerpo y el inhibidor de EGFR que puede ser una molécula pequeña o biológica se administrarán en composiciones separadas, aun en casos donde la administración de estos restos se lleva a cabo de manera concomitante. Otra modalidad de la invención se relaciona a métodos para mejorar la capacidad de supervivencia y la calidad de vida de un paciente al que se le diagnosticó cáncer, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, por lo cual el nivel de proteína C reactiva ("CRP") en suero del paciente se estabiliza y preferentemente disminuye y monitorear al paciente para evaluar la reducción en el nivel de CRP en suero del paciente, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es ) y/o competir para unirse al/a los mismo (s) epitopo(s) lineal (es) o conformacional (es) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento de anticuerpo o variante del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6, que preferentemente están aglicosilados.
Otra modalidad de la invención se relaciona a métodos para mejorar la fuerza muscular de un paciente al que se le diagnosticó cáncer, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, por lo cual mejora la fuerza muscular del paciente y monitorear al paciente para evaluar la fuerza muscular, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es ) y/o competir para unirse al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional ( es ) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6, que preferentemente están aglicosilados. En tales métodos preferentemente la fuerza muscular de los pacientes mejora al menos alrededor de 15% dentro de aproximadamente las 4 semanas a partir de la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, tal como lo mide la prueba Hand Grip Strength [de fuerza de prensión] y más preferentemente la fuerza muscular de los pacientes mejora al menos alrededor de 20% dentro de aproximadamente las 4 semanas a partir de la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del anticuerpo o variante del mismo, tal como lo mide la prueba de fuerza prensión.
Otra modalidad de la invención se relaciona a métodos para aumentar la albúmina en suero en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, por lo cual aumenta la albúmina en suero del paciente y monitorear al paciente para evaluar el nivel de albúmina en suero, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal(es) o conformacional (es ) y/o competir para unirse al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento de anticuerpo o variante del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6, que preferentemente están aglicosilados . Preferentemente, estos métodos se llevan a cabo en condiciones por lo cual mejora la capacidad de supervivencia del paciente, y/o en condiciones donde aumenta el nivel de albúmina en suero alrededor de 5-10 g/L, preferentemente 7-8 g/L, dentro de aproximadamente 6 semanas a partir de la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo. Estos pacientes incluirán, sin limitación a ellos, aquellos a los que se les diagnosticó artritis reumatoide, cáncer, cáncer avanzado, enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celiaca, traumatismo, quemaduras, otras enfermedades asociadas con la disminución de albúmina en suero o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, al paciente puede habérsele diagnosticado artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artropatia psoriática, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pénfigo, dermatomiositis , polimiositis , polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Káwasaki, vasculitis aislada del sistema nervioso central, arteritis de Churg-Strauss , poliarteritis microscópica, poliangeitis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis crioglobulinémica esencial, vasculitis reumatoide, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedad de Behcet, arteritis de Takayasu, enfermedad cardiaca isquémica, apoplejía, esclerosis múltiple, sepsis, vasculitis causada por infecciones virales (por ej . , hepatitis B, hepatitis C, VIH, citomegalovirus, virus Epstein-Barr, virus Parvo B19, etc.), enfermedad de Buerger, cáncer, cáncer avanzado, osteoartritis , esclerosis sistémica, síndrome de CREST, enfermedad de Reiter, enfermedad ósea de Paget, síndrome de Sjogran, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fiebre mediterránea familiar, trombocitopenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis alcohólica, hepatitis viral incluyendo hepatitis B y C, otras enfermedades autoinmunes específicas de órganos, quemaduras, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma alérgico, otras afecciones alérgicas o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener un nivel elevado de proteína C reactiva (CRP) en suero antes del tratamiento .
Otra modalidad de la invención se relaciona a métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o calidad de vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como Abl, por lo cual disminuye el nivel de proteína C reactiva ("CRP") en suero del paciente y monitorear al paciente para evaluar la reducción del nivel de CRP en suero del paciente.
Otra modalidad de la invención se relaciona a métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o calidad de vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como Abl, por lo cual aumenta el nivel de albúmina en suero del paciente y monitorear al paciente para evaluar el aumento del nivel de albúmina en suero del paciente .
Otra modalidad de la invención se relaciona a métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o calidad de vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como Abl, por lo cual disminuye el nivel de CRP en suero del paciente y aumenta el nivel de albúmina en suero del paciente y monitorear al paciente para evaluar la disminución del nivel de CRP en suero del paciente y el aumento del nivel de albúmina en suero del paciente.
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para prevenir o tratar la trombosis en un paciente en estado de hipercoagulación, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Abl) y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDRs de los anticuerpos mencionados previamente) que se unen de forma especifica a la IL-6, que preferentemente están aglicosilados , mediante lo cual se mejora o restablece el perfil de coagulación del paciente hasta un estado normal y controlar al paciente para evaluar el perfil de coagulación. Como se expone a continuación, en un ejemplo de modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá un anticuerpo humanizado que contiene las CDR de Abl y, más preferentemente, comprenderá la cadena ligera y pesada variables de la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709, respectivamente y las regiones constantes de las SEQ ID NO: 588 y 586, respectivamente o variantes de las mismas, donde uno o más aminoácidos están modificados por sustitución o eliminación sin alterar la afinidad de unión a la IL-6 de forma sustancial.
En tales métodos, si el antagonista de IL-6 es un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o variante de anticuerpo del mismo, preferentemente, este anticuerpo se puede unir específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y fragmentos y variantes del mismo. En los métodos de la invención para prevenir o tratar la trombosis, se evalúa el perfil de coagulación del paciente mediante la medición del nivel de uno o más de dímero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo trombina-antitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protombina y factor de von Willebrand en suero del paciente y, preferentemente, mediante un método que incluye medir el nivel de dímero-D en suero del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, si el nivel de dímero-D en suero del paciente es elevado. Adicionalmente, los niveles de proteína C reactiva del paciente se pueden evaluar antes del tratamiento y, en , caso de ser elevados, esto se puede utilizar como un indicador adicional de un aumento en el riesgo de trombosis para el paciente.
Una modalidad de la invención se refiere a métodos para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o afección asociada con la hipercoagulación, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se mejora o se restituye el perfil de coagulación del paciente hasta la normalidad y controlar al paciente para evaluar el perfil de coagulación .
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener niveles de dimero-D en suero elevados antes del tratamiento.
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener un nivel reducido de albúmina en suero antes del tratamiento.
En una modalidad de la invención, la escala de pronóstico de Glasgow (GPS) del paciente puede mejorar después del tratamiento .
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener un nivel de CRP en suero elevado antes del tratamiento.
En una modalidad de la invención, el método puede comprender, adicionalmente, la administración de , al menos una estatina .
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede dirigirse a la IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3, SY o cualquier combinación de los mismos .
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido, un glucoalcaloide, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un retinoide, un avemir, una molécula pequeña o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo anti-IL-6R, anti-gpl30, anti-p38 MAP cinasa, anti-JAKl, anti-JAK2, anti-JAK3 o anti-SYK o fragmento de anticuerpo.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender una molécula pequeña que comprende talidomida, lenalidomida o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 (por e . , Abl) o fragmento del anticuerpo o variante del mismo.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es ) y/o competir para unirse al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos antes mencionados) que se unen específicamente a la IL-6, que preferentemente están aglicosilados .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 puede unirse al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es ) y/o competir por unirse al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo como Abl.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos antes mencionados) que se unen específicamente a la IL-6, que preferentemente están aglicosilados.
En una modalidad de la invención, un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente al/a los mismo (s) epítopo(s) lineal (es) o conformacional (es) en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo tal como Abl.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede unirse específicamente los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta o fragmento del mismo que está(n) específicamente unidos por Abl y donde dichos epítopo(s), cuando se establecen por mapeo epitópico usando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan todo el largo del polipéptido de IL-6 humana nativa, incluyen uno o más residuos comprendidos en fragmentos de IL-6 que se seleccionan de aquellos que respectivamente comprenden residuos de aminoácidos 37-51, residuos de aminoácidos 70-84, residuos de aminoácidos 169-183, residuos de aminoácidos 31-45 y/o residuos de aminoácidos 58-72.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede comprender al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada región ligera variable y pesada variable que son idénticas a aquellas contenidas en un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos antes mencionados) que se unen específicamente a la IL-6, que preferentemente están aglicosilados . En determinadas modalidades, los anticuerpos que contienen esta CDR se pueden formar usando marcos humanos apropiados en función de los métodos de humanización descritos en la presente.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede comprender al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en ca región ligera variable y pesada variable que son idénticas aquellas contenidas en Abl .
En una modalidad de la invención, todas las CDR en el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo pueden ser idénticas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos antes mencionados) que se unen específicamente a la IL-6, que preferentemente están aglicosilados .
En una modalidad de la invención, todas las CDR en el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo pueden ser idénticas a una o más CDR contenidas en Abl.
En un ejemplo de modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá todas las CDR en Abl. En una modalidad más preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá las secuencias de cadena pesada y ligera variables en las SEQ ID: 657 y SEQ ID NO: 709 (Abl humanizado) o variantes de las mismas.
En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 humanizado comprenderá las secuencias de cadena pesada variable y de cadena ligera variable respectivamente contenidas en la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709 y preferentemente comprendiendo adicionalmente las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera respectivamente contenidas en las SEQ ID NO: 588 y SEQ ID NO: 586 y variantes de las mismas que comprenden una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente la unión a IL-6 y/o la función efectora deseada. La presente modalidad también contempla polinucleótidos que comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno o más ácidos nucleicos que codifican las secuencias de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 700) y variables de cadena ligera (SEQ ID NO: 723) y las secuencias de región constante de cadena pesada (SEQ ID NO: 589) y de región constante de cadena ligera (SEQ ID NO: 587). Esta modalidad además contempla ácidos nucleicos que codifican variantes que comprenden una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácidos a las secuencias de cadena pesada y ligera variables respectivamente contenidas en la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709 y las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera respectivamente contenidas en la SEQ ID NO:588 y SEQ ID NO: 586, que no afectan sustancialmente la unión a IL-6 y/o función efectora deseada.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede estar aglicosilado.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede contener una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, semivida, proteólisis y/o glicosilación .
Preferentemente la región Fe se modifica para eliminar la glicosilación .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede ser un anticuerpo humano, humanizado, de cadena simple o quimérico.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede ser un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti-IL-6 de conejo (progenitor) .
En una modalidad de la invención, las regiones flanqueantes (FR) en la región ligera variable y regiones pesadas variables de dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo respectivamente pueden ser una FR humana sin modificar o que ha sido modificada mediante la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos de FR humanas en la región de cadena ligera variable o pesada con los correspondientes residuos de FR del anticuerpo progenitor de conejo y las FR humanas pueden haber sido derivadas de secuencias de anticuerpo de cadena pesada y ligera variables que han sido seleccionadas de una biblioteca de secuencias de anticuerpo germinales humanas basándose en su alto nivel de homología con las correspondientes regiones de cadena pesada o ligera variables de conejo relativas a otras secuencias de anticuerpo germinales humanas contenidas en la biblioteca. Tal como se describe en detalle más adelante, en una modalidad preferida el anticuerpo comprenderá FR humana que se selecciona basándose en su alto nivel de homología (grado de identidad de secuencia) a aquellos del anticuerpo principal que está humanizado .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede administrarse al paciente con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente ocho semanas, aproximadamente doce semanas, aproximadamente dieciséis semanas, aproximadamente veinte semanas o aproximadamente veinticuatro semanas .
En una modalidad de la invención, se puede mantener la mejora en el perfil de coagulación del paciente durante un período completo entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer disminuido y/o el nivel de albúmina en suero puede permanecer elevado durante todo un período entre dos administraciones consecutivas de anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, se puede mantener la mejora en la caquexia, la debilidad, la fatiga y/o la fiebre del paciente durante un período completo entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, al paciente se le pudo haber diagnosticado cáncer que se selecciona de acantoma, carcinoma de células acinicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofilica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocitica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendriticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocitica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma quistico adenoide, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical, leucemia de linfocitos T del adulto, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, angiomiolipoma , angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atipico, carcinoma de células básales, carcinoma de tipo basal, leucemia de linfocitos B, linfoma de linfocitos B, carcinoma de los conductos de Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor de hueso, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar, tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocitica crónica, leucemia monocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia neutrofilica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniofaringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberans, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de linfocitos B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario, tumor de seno endodérmico, cáncer endometrial, cáncer uterino endometrial, tumor endometrioide, linfoma de linfocitos T asociado a enteropatia, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de la familia dé E ing, sarcoma de la familia de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ducto biliar extrahepático, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de tubo falopiano, Fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma , ganglioneuroma , cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células granulosas, leucemia de células pilosas, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, malignidad hematológica, carcinoma hepatocelular, linfoma hepatoesplénico de linfocitos T, síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, linfoma Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico, cáncer de mama inflamatorio, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia juvenil mielomonocítica, sarcoma aposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma léntigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer del labio y la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno óseo, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de vaina nerviosa periférica, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT, linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor mediastinal de células germinales, tumor mediastinal, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer escamoso . metastásico del cuello con tumor primario oculto, carcinoma urotelial metastásico, tumor Mülleriano mixto, leucemia monocítica, cáncer de boca, tumor mucinoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, micosis fungoides, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplasicos, leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales del ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, enfermedad de Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer pancreático, cáncer pancreático, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis, paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, tumor perivascular de células epitelioides , cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor parénquima pineal de diferenciación intermedia, pineoblastoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma precursor linfoblástico de linfocitos T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodermal primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer rectal, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio relacionado con el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcígeo, cáncer de la glándula salival, sarcoma, Schwannomatosis, carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasma secundario, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordones sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas, redondas y azules, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, somatoestatinoma, verruga del deshollinador, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma superficial diseminante, tumor neuroectodermal primitivo supratentorial, tumor epitelial superficial de ovario, sarcoma sinovial, leucemia aguda de linfocitos T, leucemia linfocítica granular grande de linfocitos T, leucemia de linfocitos T, linfoma de linfocitos T, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células de transición, cáncer uracal, cáncer uretral, neoplasma urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Warthin, tumor de Wilms o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, al paciente pudo habérsele diagnosticado cáncer que se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma, mesotelioma, enfermedad de Castleman, carcinoma de células renales o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede comprender una secuencia de polipéptido de cadena pesada que comprende: SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708; y puede comprender además una secuencia de polipéptido de VL que comprende: SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709 o una variante de las mismas donde uno o más de los residuos flanqueantes (residuos de FR) en dicho polipéptido de VH o VL fue sustituido por otro residuo de aminoácido que da como resultado un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo que se une específicamente a IL-6 humana o puede comprender un polipéptido donde la CDR está incorporada en un marco humano homólogo con dicha secuencia. Preferentemente las secuencias pesada y ligera variables comprenden aquellas en las SEQ ID NO: 657 y 709 (Abl humanizado).
En una modalidad de la invención, uno o más de dichos residuos de FR pueden sustituirse por un aminoácido presente en el sitio correspondiente en un anticuerpo anti-IL-6 de conejo progenitor desde donde se han derivado las regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en dichos polipéptidos de VH o VL y por una sustitución consecutiva de aminoácidos.
En una modalidad de la invención, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede estar humanizado .
En una modalidad de la invención, dicho anticuerpo anti-IL- 6 o fragmento del anticuerpo o variante del mismo puede ser quimérico .
En una modalidad de la invención, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede además comprender una Fe humana, por ej . , una región Fe que comprende las regiones constantes de cadena pesada y ligera variables contenidas en la SEQ ID NO: 704 y 702.
En una modalidad de la invención, dicha Fe humana puede derivar de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede comprender un polipéptido que tiene al menos 90% de homología de secuencia con una o más de las secuencies de polipéptidos de la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704, 708, 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 y 709.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede tener una semivida de eliminación de al menos alrededor de 22 días, al menos alrededor de 25 días, o al menos alrededor de 30 días.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6, tal como Abl, puede administrarse conjuntamente con un agente quimioterapéutico . En una modalidad de la invención, el agente quimioterapéutico, de modo no taxativo: antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ej . , vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ej . IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux1™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin®, o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el otro compuesto terapéutico puede ser una estatina.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo puede estar directa o indirectamente unido a una etiqueta detectable o agente terapéutico .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo puede ser Abl o una cadena simple, humanizada, quimérica o fragmento de la misma que comprende todas o la mayoría de las CDR de Abl.
En una modalidad de la invención, la enfermedad o afección se puede seleccionar de trombosis venosa aguda, embolia pulmonar, trombosis durante el embarazo, necrosis cutánea hemorrágica, coagulación intravascular diseminada aguda o crónica (DIC) , formación de coágulos por cirugía, reposo prolongado, inmovilización prolongada, trombosis venosa, meningococcemia fulminante, apoplejía trombótica aguda, oclusión coronaria aguda, oclusión arterial periférica aguda, embolia pulmonar masiva, trombosis venosa axilar, trombosis venosa iliofemoral masiva, oclusión de cánulas arteriales, oclusión de cánulas venosas, cardiomiopatía, enfermedad venooclusiva hepática, hipotensión, disminución del rendimiento cardíaco, disminución de la resistencia vascular, hipertensión pulmonar, disminución de la distensibilidad pulmonar, leucopenia, trombocitopenia, trombocitopenia inducida por heparina (HIT) , trombocitopenia y trombosis inducida por heparina (HITT) , fibrilación auricular, implante de una válvula cardíaca prostética, propensión genética a padecer trombosis, factor V Leiden, mutación del gen de la protrombina, polimorfismo de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) , polimorfismo del receptor plaquetario, traumatismo, fracturas, quemaduras o cualquier combinación de las mismas .
En una modalidad de la invención, la enfermedad o afección se puede seleccionar de cáncer, artritis reumatoide, SIDA, enfermedad cardiaca, deshidratación, desnutrición, exposición al plomo, malaria, enfermedad respiratoria, vejez, hipotiroidismo, tuberculosis, hipopituitarismo, neurastenia, hipernatremia, hiponatremia, enfermedad renal, esplénica, espondilitis anquilosante, síndrome del declive (retraso del crecimiento) o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la administración de un antagonista de un factor asociado con la caquexia, un factor asociado con la debilidad, un factor asociado con la fatiga y/o un factor asociado con la fiebre. El factor asociado con la caquexia, el factor asociado con la debilidad, factor asociado con la fatiga y/o factor asociado con la fiebre se puede seleccionar de factor de necrosis tumoral alfa, interferón gamma, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor que induce la proteólisis, factor que inhibe la leucemia o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la administración de un agente anti-caquexia seleccionado de cannabis, dronabinol (Marinol1™) , nabilona (Cesamet) , cannabidiol, cannabicromeno, tetrahidrocannabinol, Sativex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la administración de un agente antináusea o antiemético seleccionado de antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos, antihistaminas , aprepitant, benzodiazepinas, cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides, cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jengibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet), antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la administración de un agente antináusea o antiemético seleccionado de antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos, antihistaminas, aprepitant, benzodiazepinas, cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides, cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jengibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet), antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, la fiebre del paciente se puede evaluar mediante la medición de la temperatura corporal del paciente .
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la temperatura corporal del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo si la temperatura corporal del paciente es mayor a alrededor de 38° C.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la temperatura corporal del paciente dentro de las 24 horas antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del. mismo si la temperatura corporal del paciente indica presencia de fiebre.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir, adicionalmente, la medición del peso corporal del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo si el peso del paciente disminuyó en más de aproximadamente 5% dentro de aproximadamente 30 días o si el índice de masa corporal magra del paciente es menor a alrededor de 17 kg / m2 (paciente masculino) o menos a alrededor de 14 kg / m2 (paciente femenina) .
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la fuerza muscular del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo si la fuerza muscular del paciente disminuyó más de aproximadamente 20% dentro de aproximadamente 30 días.
En una modalidad de la invención, el método puede dar como resultado una mejora prolongada de la caquexia, la debilidad, la fatiga y/o la fiebre del paciente.
En una modalidad de la invención, la masa corporal del paciente se puede aumentar en aproximadamente 1 kilogramo dentro de aproximadamente 4 semanas desde la administración del anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo.
En una modalidad de la invención, la caquexia del paciente se puede mejorar considerablemente dentro de alrededor de 4 semanas de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la caquexia del paciente se puede evaluar mediante medición de la masa corporal total del paciente, la masa corporal magra, el índice de masa corporal magra y/o la masa corporal magra apendicular.
En una modalidad de la invención, la medición de la masa corporal del paciente puede descontar (restar) el peso estimado del o de los tumores del paciente y/o la o las recolecciones de fluido extravascular .
En una modalidad de la invención, la caquexia del paciente se puede mantener considerablemente mejorada aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la debilidad del paciente se puede mejorar considerablemente dentro de alrededor de 4 semanas de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la debilidad del paciente se puede medir mediante la prueba de fuerza de prensión.
En una modalidad de la invención, la fuerza de prensión del paciente se puede mejorar en al menos alrededor de 15% o al menos alrededor de 20%.
En una modalidad de la invención, la debilidad del paciente se puede mantener considerablemente mejorada aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fatiga del paciente se puede mejorar considerablemente dentro de alrededor de 1 semana de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fatiga del paciente se puede medir mediante la prueba FACIT-F FS .
En una modalidad de la invención, la puntuación de FACIT-F FS del paciente se puede mejorar en al menos alrededor de 10 puntos .
En una modalidad de la invención, la fatiga del paciente se puede mantener considerablemente mejorada aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fiebre del paciente se puede mejorar considerablemente dentro de alrededor de 1 semana de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fiebre del paciente se puede mantener considerablemente mejorada aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, se puede mejorar la calidad de vida del paciente.
En una modalidad de la invención, se puede incluir la administración de uno o más anticoagulantes o estatinas.
En una modalidad de la invención, el o los anticoagulantes se pueden seleccionar de abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxara/PradaxTO) , desirudina (Revasc™/Iprivask™) , dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta™/Exarta'IM) o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, la o las estatinas se pueden seleccionar de atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas .
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede evaluar mediante la medición del nivel de uno o más de dimer-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y factor de von Willebrand en suero del paciente .
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede evaluar mediante una medición funcional de la capacidad de coagulación.
En una modalidad de la invención, la medición funcional de la capacidad de coagulación se puede seleccionar del tiempo de protrombina (PT) , la tasa de protrombina (PR) ,· la tasa normalizada internacional (INR) o cualquier combinación de los mismos .
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la tasa normalizada internacional del paciente (INR) antes de la administración del antagonista de IL-6 y la administración al paciente de un antagonista del IL-6 tal como Abl si la INR del paciente es menor a alrededor de 0.9.
En una modalidad de la invención, la invención puede incluir la medición de la tasa normalizada internacional del paciente (INR) antes de la administración del antagonista de IL-6 y la administración al paciente de un antagonista de la IL-6 tal como Abl si la INR del paciente es menor a alrededor de 0.5.
En una modalidad de la invención, la INR del paciente se puede aumentar hasta más de aproximadamente 0.9 dentro de las 4 semanas de la administración de un antagonista de IL-6 al paciente .
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición del nivel de dimero-D en suero del paciente antes de la administración del antagonista de IL-6 y la administración del antagonista de IL-6 tal como Abl si el nivel de dimero-D en suero del paciente está por encima del intervalo de referencia normal.
En una modalidad de la invención, el nivel de dimero-D en suero del paciente se puede disminuir hasta menos que el limite superior del intervalo de referencia normal dentro de las 4 semanas de administración del antagonista de IL-6 al paciente.
En una modalidad de la invención, el método puede dar como resultado una mejora prolongada del perfil de coagulación del paciente .
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede mejorar considerablemente dentro de alrededor de 2 semanas de la administración del antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede mantener considerablemente mejorado aproximadamente 12 semanas luego de la administración del antagonista de IL-6 al paciente.
En una modalidad de la invención, se puede mejorar la supervivencia del paciente.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede ser un ácido nucleico antisentido.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede ser un ácido nucleico antisentido, por ejemplo que comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos de una secuencia que codifica IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAK1, JA 2, JAK3 o SY .
En una modalidad de la invención, el ácido nucleico antisentido puede comprender ADN, ARN, ácido nucleico peptidico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino) , ácido nucleico glicólico, ácido nucleico treósico, o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender Actemra™ (Tocilizumab) , Remicade®, Zenapax™ (daclizumab) o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia que comprende un fragmento de IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAKl, JA 2, JAK3, SYK, o cualquier combinación de los mismos, tal como un fragmento o polipéptido de longitud completa que es de al menos 40 aminoácidos de longitud.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender una IL-6 soluble, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAKl, JAK2, JAK3, SYK, o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede estar acoplado a un resto aumento de la semivida.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición del nivel de CRP en suero del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo si el nivel de CRP en suero del paciente es al menos aproximadamente 5 mg/L.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede reducirse a menos de aproximadamente 5 mg/L dentro de 1 semana a partir de la administración de un antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede reducirse a menos de 1 mg/L dentro de 1 semana a partir de la administración de un antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, el tratamiento puede resultar en una reducción prolongada del nivel de CRP en suero del paciente.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede reducirse a menos de 10 mg/L dentro de aproximadamente 1 semana a partir de la administración de un antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, 14 días luego de la administración del antagonista de IL-6, e nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo d 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 21 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 28 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 35 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 42 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 49 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 56 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, la capacidad de supervivencia del paciente mejora.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición del nivel de albúmina en suero del paciente antes de la administración del antagonista de IL-6 y administrar el antagonista de IL-6, tal como Abl, si el nivel de albúmina en suero del paciente es menos de aproximadamente 35 g/L.
En una modalidad de la invención, el nivel de albúmina en suero del paciente puede aumentarse a más de aproximadamente 35 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas a partir de la administración del antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, el tratamiento puede resultar en un aumento prolongado del nivel de albúmina en suero del paciente.
En una modalidad de la invención, 42 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de albúmina en suero del paciente puede permanecer por encima de 35 g/L.
En una modalidad de la invención, 49 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de albúmina en suero del paciente puede permanecer por encima de 35 g/L.
En una modalidad de la invención, 56 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de albúmina en suero del paciente puede permanecer por encima de 35 g/L.
En una modalidad de la invención, el nivel de albúmina en suero del paciente puede aumentarse alrededor de 5 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas a partir de la administración del antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, al paciente puede habérsele diagnosticado artritis reumatoide, cáncer, cáncer avanzado, enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celiaca, traumatismo, quemaduras, otras enfermedades asociadas con la disminución de albúmina en suero o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, el método puede además comprender la administración de una o más estatinas al paciente que incluyen, de modo no taxativo, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, itievastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de los mismos Otra modalidad de la invención se refiere a una composición que comprende un antagonista de IL-6 tal como Abl y un anticoagulante. En una modalidad de la invención, el o los anticoagulantes se pueden seleccionar de abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán ( Pradaxa^/Pradax™) , desirudina (RevasC™7lprivask™) , dipiridamol, eptifibatida (Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exantam/Exarta™) o cualquier combinación de los mismos .
Otra modalidad de la invención se refiere a una composición que comprende un antagonista de IL-6 tal como Abl y un agente quimioterapéutico. En una modalidad de la invención, el agente quimioterapéutico se puede seleccionar de antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ej . , IL-12 o IL-2) , antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 muestra que se reconoció una variedad de epítopos únicos por la recolección de anticuerpos anti-IL-6 preparados por el protocolo de selección de anticuerpos. La variabilidad de los epítopos se confirmó por medio de estudios de competencia de unión de anticuerpos anti-IL-6 (ForteBio Octet) .
La Fig. 2 muestra las alineaciones de secuencias de cadena ligera y pesada variables entre secuencias de cadena ligera variable y pesada variable de anticuerpo de conejo y secuencias humanas homologas y las secuencias humanizadas. Las regiones flanqueantes se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. Los residuos de amino ácido se enumeran tal como se muestra. Las secuencias iniciales de conejo se denominan RbtVL y RbtVH para las secuencias de cadena ligera y pesada variable respectivamente. Tres de las secuencias de anticuerpo germinales humanas más similares, que abarcan desde la Región Flanqueante 1 hasta el final de la Región Flanqueante 3, se alinean por debajo de las secuencias de conejo. La secuencia humana considerada la más similar a la secuencia de conejo se muestra en primer lugar. En el presente ejemplo, aquellas secuencias más, similares son L12A para la cadena ligera y 3-64-04 para la cadena pesada. No se muestran las secuencias CDR3 humanas. La secuencia de Región Flanqueante humana 4 más cercana se alinea por debajo de la secuencia de Región Flanqueante de conejo 4. Los guiones verticales indican un residuo donde el residuo de conejo es idéntico a uno o más de los residuos humanos en la misma posición. Los residuos en negrita indican que el residuo de humano en esa posición es idéntico al residuo de conejo en la misma posición. Las secuencias finales humanizadas se denominan VLh y VHh para las secuencias de cadena ligera y pesada variable respectivamente. Los residuos subrayados indican que el residuo es igual al residuo de conejo en esa posición pero distinto que los residuos humanos en esa posición en las tres secuencias humanas alineadas.
La Fig. 3 muestra la alta correlación entre la IgG producida y la especificidad del antigeno para un ejemplo de protocolo IL-6. 9 de 11 pocilios mostraron correlación especifica de IgG con el reconocimiento de antigenos.
La Fig. 4 proporciona la curva de respuesta a la dosis de alfa-2-macroglobulina (A2M) para el anticuerpo Abl administrado por vía intravenosa en diferentes dosis una hora luego de una dosis de IL-6 humano de 100 g/kg s.c.
La Fig. 5 proporciona datos de supervivencia para los grupos de evolución del anticuerpo Abl contra los grupos de control.
La Fig. 6 proporciona datos adicionales de supervivencia para los grupos de regresión del anticuerpo Abl contra los grupos de control.
La Fig. 7 proporciona datos de supervivencia para IgG humana policlonal a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) contra el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) .
La Fig. 8 proporciona datos de supervivencia para IgG humana policlonal a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) contra el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) .
La Fig. 9 proporciona un perfil farmacocinético del anticuerpo Abl en monos macacos. Los niveles del anticuerpo Abl en plasma se cuantificaron mediante ELISA de captura de antigenos. Esta proteina muestra una semivida de entre 12 y 17 días que concuerda con otros anticuerpos humanizados de longitud completa .
La Fig. 10 (A-D) proporciona datos de unión para los anticuerpos Ab4, Ab3, Ab8 y Ab2, respectivamente. La Fig. 10 E proporciona datos de unión para los anticuerpos Abl, Ab6 y Ab7.
La Fig. 11 resume los datos de unión de la Fig. 10 (A-E) de forma tabular.
La Fig. 12 presenta las secuencias de los 15 péptidos de aminoácidos usados en el experimento de mapeo de péptidos del Ejemplo 14.
La Fig. 13 presenta los resultados de las bandas preparadas en el Ejemplo 1 .
La Fig. 14 presenta los resultados de las bandas preparadas en el Ejemplo 14.
La Fig. 15A muestra la afinidad y cinética de unión de Abl para IL-6 de varias especies.
La Fig. 15B muestra la inhibición de la IL-6 por Abl en el ensayo de proliferación celular de T1165.
La Fig. 16 muestra la concentración promedio de Abl en plasma que resulta de la administración única de Abl a sujetos masculinos saludables en varios grupos de dosis.
La Fig. 17 muestra el área promedio bajo la curva de tiempo de concentración (AUC) de Abl en plasma para los grupos de dosis de la Fig. 16.
La Fig. 18 muestra el pico promedio de concentración de Abl en plasma (Cmáx) para los grupos de dosis de la Fig. 16.
La Fig. 19 resume las mediciones farmacocinéticas de Abl de los grupos de dosis de la Fig. 16.
La Fig. 20 muestra la concentración promedio de Abl en plasma que resulta de la administración única de Abl a pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 21 ilustra la semivida de eliminación sin precedentes de Abl en comparación con otros anticuerpos anti-IL-6.
La Fig. 22 muestra el aumento de la concentración de hemoglobina luego de la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 23 muestra las concentraciones promedio de lipidos en plasma luego de la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado. 24 muestra los conteos promedio de neutrófilos luego de administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado .
La Fig. 25 muestra la supresión de los niveles de CRP en suero en individuos saludables.
La Fig. 26 (A-B) muestra la supresión de los niveles de CRP en suero en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 27 muestra la prevención de la pérdida de peso por Abl en un modelo de caquexia cancerosa de ratón.
La Fig. 28 muestra la apariencia física de ratones de control y tratados con Abl representativos en el modelo de caquexia cancerosa.
La Fig. 29 muestra que el Abl promueve el aumento de peso en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 30 muestra que el Abl disminuye la fatiga en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 31 muestra que el Abl promueve la fuerza de prensión en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 32 muestra que el Abl suprime una proteína de fase aguda (amiloide A sérica) en ratones.
La Fig. 33 muestra que el Abl aumenta la concentración de albúmina en plasma en pacientes con cáncer avanzado.
Las Figuras 34 y 35 muestran alineaciones entre secuencias pesadas y ligeras variables de anticuerpo de conejo y secuencias humanas homologas y las secuencias humanizadas finales. Las regiones flanqueantes se identifican como FR1-FR . Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3.
Las Figuras 36 A-B y 37 A-B muestran alineaciones entre las secuencias pesadas y ligeras variables, respectivamente, de diferentes formas de Abl. Las regiones flanqueantes se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. Las diferencias de las secuencias dentro de las regiones CDR se encuentran destacadas .
La Fig. 38 muestra los valores medios de CRP para cada concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl .
La Fig. 39 muestra el cambio en los valores medios de CRP de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Fig. 38.
La Fig. 40 muestra una reducción en los niveles de CRP en suero en pacientes con varios cánceres luego de dosificaciones de 80, 160 o 320 mg durante 12 semanas.
La Fig. 41 muestra una reducción en los niveles de CRP en suero en la población de pacientes con artritis reumatoide luego de dosificaciones de 80, 160 y 320 mg durante 12 semanas.
La Fig. 42 muestra que el Abl aumenta la hemoglobina promedio a 80, 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación.
La Figura 43 muestra el cambio promedio desde la hemoglobina de referencia para los datos presentados en la Figura 42.
La Figura 44 muestra que el Abl aumenta la hemoglobina promedio a 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación en pacientes que tienen la hemoglobina de referencia por debajo de 11 g/1.
La Figura 45 muestra que el Abl aumenta la hemoglobina promedio a 80, 160 y 320 mg luego de 16 semanas de dosificación.
La Figura 46 muestra que el Abl aumenta la concentración de albúmina promedio a 80, 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación.
La Figura 47 muestra el cambio desde el punto de referencia para la concentración promedio de albúmina de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Figura 46.
La Figura 48 muestra que el Abl proporciona aumentos sostenidos en la concentración promedio de albúmina a 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación en pacientes que tienen la albúmina de referencia por debajo de 35 g/1.
La Figura 49 muestra los datos de cambio en el peso promedio de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl durante 12 semanas .
La Fig. 50 muestra el cambio porcentual promedio en el peso corporal de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Fig. 49.
La Figura 51 muestra los datos de masa corporal magra promedio para los grupos de concentración de dosis correspondientes a la Figura 49.
La Figura 52 muestra aumentos en la puntuación de subescala Facit-F FS promedio para algunos de los grupos de concentración de dosis en la población de pacientes luego de una dosificación de 80, 160 y 320 mg luego de 8 semanas.
La Fig. 53 muestra el cambio de la puntuación de subescala Facit-F FS desde el punto de referencia correspondiente a la Fig. 52.
La FIG. 54 muestra que el Abl disminuye los niveles del dimero-D con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg luego de 16 semanas de dosificación.
La FIG. 55 muestra el cambio porcentual a partir del punto de referencia para la concentración de dímero-D de cada grupo de concentración de dosificación correspondiente a la Figura 54.
La FIG. 56 muestra que el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide produjo una mejora considerable con respecto al placebo, con base en las mediciones de ACR.
La FIG. 57 muestra pacientes que alcanzan un ACR 20 con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg, luego de 16 semanas de dosificación.
La FIG. 58 muestra pacientes que alcanzan un ACR 50 con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg, luego de 16 semanas de dosificación .
La FIG. 59 muestra pacientes que alcanzan un ACR 70 con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg, luego de 16 semanas de dosificación .
La FIG. 60 muestra el cambio a partir del punto de referencia en los componentes de la medición de ACR para grupos de concentración de dosificación de 80, 160 y 320 mg de placebo.
La FIG. 61 muestra el cambio en los valores de HAQ-DI en los grupos de concentración de dosificación de 80, 160 y 320 mg de placebo.
La FIG. 62 muestra el cambio en los valores de DAS28 en los grupos de concentración de dosificación de 80, 160 y 320 mg de placebo .
La FIG. 63 muestra el cambio en el porcentaje de pacientes que alcanzan respuestas de EULAR moderadas o buenas en los grupos de concentración de dosificación de 80, 160 y 320 mg de placebo.
La FIG. 64 muestra esquemáticamente un estudio clínico con respecto al uso de Abl humanizado para el tratamiento de artritis reumatoide .
La FIG. 65 muestra concentraciones en plasma de Abl humanizado en pacientes con artritis reumatoide luego de la dosificación subcutánea (SC) o intravenosa (iv) de Abl humanizado .
La FIG. 66 muestra concentraciones del nivel de CRP en plasma luego de la dosificación subcutánea o intravenosa de Abl humanizado .
La FIG. 67 contiene una tabla que enumera eventos adversos en pacientes a quienes se les administró Abl humanizado durante la semana 24.
La FIG. 68 contiene una tabla que enumera las reacciones en el sitio de inyección al Abl humanizado durante la semana 12 luego de la administración del anticuerpo.
La FIG. 69 presenta en forma de tabla evaluaciones clínicas de laboratorio (ALT, AST, bilirrubina, conteos de neutrófilos y conteos de plaquetas) para pacientes a quienes se les administró Abl humanizado de manera subcutánea o intravenosa y controles durante la semana 12 luego de la administración de Abl humanizado .
La FIG. 70 presenta en forma de tabla parámetros farmacocinéticos en plasma en pacientes durante la semana 24 luego de la administración subcutánea o intravenosa de Abl humanizado .
La FIG. 71 muestra el efecto de la administración ubcutánea e intravenosa de ALD518 durante 1 semana 12 luego de a dosificación del anticuerpo a 50 o 100 mg.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones Se debe entender que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales y reactivos particulares descritos, ya que los mismos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas .
El término "variantes" (según se aplica a anticuerpos, incluyendo Abl) incluye anticuerpos de cadena simple, dímeros, multímeros, variantes de secuencias, variantes de sustitución de dominios, etc. Anticuerpos de cadena simple tales como SMIP, anticuerpos de tiburón, nanocuerpos (por ej . , anticuerpos de camélidos) . Las variantes de secuencia se pueden especificar según la identidad porcentual (o similitud), por ej . , 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, etc. o según la cantidad de sustituciones conservadoras o no conservadoras permitidas. Las variantes de sustitución de dominios incluyen el remplazo de un dominio de una proteína con un dominio similar al de una proteína relacionada. Se puede identificar un dominio similar mediante similitud de secuencia, estructura (real o prevista) o función. Por ejemplo, las variantes de sustitución de dominios incluyen la sustitución de una o más CDR y/o regiones flanqueantes.
Tal como se usa en la presente las formas en singular "un/a", "y" [sic] y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto claramente exprese lo contrario. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado tal como lo entiende el experto en la técnica a la que pertenece la presente invención a menos que se indique lo contrario.
Interleucina-6 (IL-6) : Tal como se usa en la presente, la interleucina-6 (IL-6) comprende no solo la siguiente secuencia de aminoácidos 212 disponible como acceso a la proteína GenBank No. NP_000591: MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGIS ALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQ NRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQ KA NLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLIL RSFKEFLQSSLRALRQM (SEQ ID NO: 1), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos de IL-6, así como también mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Antagonista de IL-6: Tal como se usa en la presente, el término "antagonista de IL-6" y variantes gramaticales del mismo incluyen cualquier composición que previene, inhibe o aminora los efectos de la señalización de IL-6. Generalmente, tales antagonistas pueden reducir los niveles o actividad de la IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, o una molécula involucrada en la transducción de señalización de IL-6, o puede reducir los niveles o complejos de actividad entre los anteriores (por ej . , reducir la actividad de una IL-6/ complejo de receptores de IL-6) . Los antagonistas incluyen ácidos nucleicos antisentido, que incluyen ADN, ARN o un análogo de ácido nucleico tal como un ácido nucleico peptidico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino), ácido nucleico glicólico o ácido nucleico treósico. Véase Heasman, Dev Biol. 15 de marzo de 2002; 243 (2) : 209-14 ; Hannon and Rossi, Nature 16 de septiembre de 2004; 431 ( 7006 ): 371-8 ; Paul et ál., Nat Biotechnol. mayo de 2002; 20(5): 505-8; Zhang et ál., J Am Chem Soc. 30 de marzo de 2005; 127 (12) : 4174-5; Wahlestedt et ál., Proc Nati Acad Sci E.U.A. 9 de mayo de 2000; 97 ( 10) : 5633-8; Hanvey et ál . , 27 de noviembre de 1992; 258 ( 5087 ): 1481-5 ; Braasch et ál . , Biochemistry 9 de abril de 2002; 41 ( 14 ) : 4503-10 ; Schoning et ál . , Science 17 de noviembre de 2000;290 (5495) : 1347-51. Además los antagonistas de IL-6 específicamente incluyen péptidos que bloquean la señalización de IL-6 tales como los descritos en cualquiera de las patentes de EUA No. 6,599,875; 6,172, 042; 6,838,433; 6,841,533; 5,210,075 et ál. También, los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención pueden incluir inhibidores de p38 MAP cinasa tales como los registrados en US2007001052:9 et ál. dado este rol de cinasa en la producción de citosina y más particularmente la producción de IL-6. Adicionalmente, los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención incluyen los compuestos glucoalcaloides registrados en el documento US20050090453 así cómo también otros compuestos antagonistas de IL-6 aislables usando los ensayos de exploración de antagonistas de IL-6 registrados en el mismo. Otros antagonistas de IL-6 incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-IL-6 del receptor alfa, anticuerpos anti-gpl30 y anticuerpos anti-p38 MAP cinasa que incluyen (de modo no taxativo) los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente, Actemra™ (Tocilizumab) , Remicade®, Zenapax™ (daclizumab) , o cualquier combinación de los mismos. Otros antagonistas de IL-6 incluyen porciones o fragmentos de moléculas involucradas en la señalización de IL-6, tales como IL-6, receptor de IL-6 alfa y gpl30, que pueden ser secuencias nativas, mutantes o variantes y pueden opcionalmente estar acoplados a otros restos (tales como restos de semivida en aumento, por e . un dominio Fe) . Por ejemplo, un antagonista de IL-6 puede ser un receptor de IL-6 soluble o fragmento, un receptor de IL-6 soluble :proteína de fusión Fe, un inhibidor de molécula pequeña de IL-6, un anticuerpo del receptor anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, ácido nucleico antisentido, etc. Otros antagonistas de IL-6 incluyen avemirs, tales como C326 (Silverman et ál., Nat Biotechnol. diciembre de 2005; 23 ( 12) : 1556-61) y moléculas pequeñas, tales como retinoide AM80 sintético (tamibaroteno) (Takeda et ál., Arterioscler Thromb Vasc Biol. mayo de 2006;26 (5) : 1177-83) . Tales antagonistas de IL-6 pueden administrarse de cualquier manera conocida en la técnica, que incluye poner en contacto un sujeto con ácidos nucleicos que codifican o hacen que se exprese cualquiera de los polipéptidos o secuencias antisentido.
Trombosis: Tal como se usa en la presente, trombosis se refiere a un trombo (coágulo sanguíneo) dentro de un vaso sanguíneo. El término abarca, de modo no taxativo, trombosis venosa y arterial, incluyendo trombosis venosa profunda, trombosis venosa portal, trombosis venosa yugular, trombosis venosa renal, apoplejía, infarto de miocardio, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad de Paget-Schroetter y trombosis de senos venosos cerebrales. Las enfermedades y afecciones asociadas con la trombosis y el riesgo de desarrollar trombosis o hipercoagulación incluyen, de modo no taxativo, trombosis venosa aguda, embolia pulmonar, trombosis durante el embarazo, necrosis cutánea hemorrágica, coagulación intravascular diseminada aguda o crónica (DIC), formación de coágulos por cirugía, reposo prolongado, inmovilización prolongada, afecciones que impiden o restringen el movimiento tal como parálisis parcial o completa, obesidad mórbida, trastornos que impiden la captación y absorción de oxígeno tales como trastornos del pulmón incluyendo cáncer de pulmón, COPD, enfisema, fibrosis relacionada con fármacos, fibrosis cística, trombosis venosa, meningococcemia fulminante, apoplejía trombótica aguda, oclusión coronaria aguda, oclusión arterial periférica aguda, embolia pulmonar masiva, trombosis venosa axilar, trombosis venosa iliofemoral masiva, oclusión de cánulas arteriales, oclusión de cánulas venosas, cardiomiopatía, enfermedad venooclusiva hepática, hipotensión, disminución del rendimiento cardíaco, disminución de la resistencia vascular, hipertensión pulmonar, disminución de la distensibilidad pulmonar, leucopenia y trombocitopenia.
Dímero-D: Tal como se usa en la presente, dimero-D se refiere a un producto de la degradación de fibrina que se produce durante la descomposición de coágulos sanguíneos por parte de la plasmina enzimática. Los anticuerpos monoclonales específicamente reactivos contra el dímero-D se encuentran fácilmente disponibles, por ej . , DD-3B6/22 (Elms et ál., 1986, Am J Clin Pathol. 85:360-4) . Rutinariamente se realizan mediciones clínicas de los niveles de dímero-D, por ej . , utilizando un análisis de aglutinación de glóbulos rojos, un ELISA, etc. (analizado en Dempfle, Semin Vasc Med, noviembre de 2005; 5 ( 4 ) : 315-20 ) . Las mediciones del dímero-D pueden variar dependiendo del método de medición y el laboratorio de análisis. No obstante, se puede establecer fácilmente un "intervalo de referencia" normal para cualquier método y laboratorio de análisis particulares, por ej . , realizando mediciones de individuos saludables. Por consiguiente, un experto en la técnica entiende que un nivel elevado de dímero-D se refiere a un nivel de dímero-D que supera el intervalo de referencia para el método y laboratorio de análisis particulares.
Perfil de coagulación: Tal como se usa en la presente, el perfil de coagulación se refiere en general al funcionamiento del sistema de coagulación. Tanto la vía del factor tisular (extrínseca) como la de la activación por contacto (intrínseca) de coagulación son componentes del perfil de coagulación. Un perfil de coagulación normal se refiere a una coagulación que funciona como en un individuo normal y saludable, es decir, que mantiene el equilibrio entre la capacidad de controlar el sangrado y la tendencia hacia una coagulación excesiva (tendencia trombótica) . Un perfil de coagulación anormal puede ser una disminución o un aumento en la tendencia de coagulación. Un perfil de coagulación particularmente anormal es la ipercoagulación, que se refiere a un riesgo aumentado en gran medida de la formación excesiva de coágulos, lo que da como resultado un alto riesgo de trombosis. El perfil de coagulación se puede evaluar mediante varias pruebas y ensayos conocidos en la técnica, tales como: la prueba de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) , la prueba de tiempo de protrombina (PT) (intervalo de referencia típica de 12 a 15 segundos), las mediciones derivadas de la prueba de PT, como la tasa de protrombina (PR) y la tasa normalizada internacional (INR) (intervalo de referencia típico de 0.8 a 1.2), la prueba del fibrinógeno (por ej . , el método de Clauss (Clauss A, "Rapid Physiological Coagulation Method for the Determination of Fibrinogen [Alemán] , "Acta Haematol, 1957, 17:237-46) o el método de Ellis (Ellis BC y Stransky A, "A Quick and Accurate Method for the Determination of Fibrinogen in Plasma, "J Lab Clin Med, 1961, 58:477-88), ensayos de resistencia a la proteína C activada, proteína C, proteína S y antitrombina, ensayos de anticuerpos antifosfolípidos (anticuerpos anticardiolipina y anticoagulante iúpico) , homocisteína elevada, ensayos de plasminógeno, disfibrinogenemia, cofactor II de la heparina o hiperagregabilidad plaquetaria. Otros ensayos útiles para evaluar el perfil de coagulación incluyen la medición de los factores de coagulación y/o indicadores de coagulación, tales como los niveles de dímero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina III, trombocitosis , fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y factor de von Willebrand en suero. Empeoramiento del perfil de coagulación se refiere a un cambio cuantificable de un indicador de coagulación, por ej . , cualquiera de los ensayos mencionados anteriormente, que refleja un deterioro de la tendencia de coagulación normal, de forma tal que el valor medido se torne anormal o se desvie aún más que antes del intervalo normal. Mejora del perfil de coagulación se refiere a un cambio cuantificable de un indicador de coagulación, por ej . , cualquiera de los ensayos mencionados anteriormente, que refleja una restitución parcial o total de la tendencia de coagulación normal, es decir, luego de una intervención terapéutica, tal como la administración de un anticuerpo anti-IL-6, el valor medido se encuentra en el intervalo normal o más cerca del intervalo normal que antes de la intervención terapéutica .
Enfermedad o afección: Tal como se usa en la presente, "enfermedad o afección" refiere a una enfermedad o afección que se le ha diagnosticado a un paciente o se sospecha que la tenga, particularmente una enfermedad o afección asociada con IL-6 elevada. Una enfermedad o afección comprende, sin limitación, los efectos secundarios de medicaciones o tratamientos (tales como terapia de radiación) , asi como también afecciones idiopáticas caracterizadas por síntomas que incluyen IL-6 elevada.
Caquexia: Tal como se usa en la presente, caquexia, también conocida como enfermedad consuntiva, refiere a cualquier enfermedad marcada especialmente por demacración progresiva, debilidad, insalubridad general, desnutrición, pérdida de masa corporal, pérdida de masa muscular, o una pérdida acelerada de músculo esquelético en el contexto de una respuesta inflamatoria crónica (analizado en Kotler, Ann Intern Med. 17 de octubre de 2000; 133 (8) : 622-34) . Las enfermedades y afecciones en las que se observa frecuentemente la caquexia incluyen cáncer, artritis reumatoide, SIDA, enfermedad cardiaca, deshidratación, desnutrición, exposición al plomo, malaria, enfermedad respiratoria, vejez, hipotiroidismo, tuberculosis, hipopituitarismo, neurastenia, hipernatremia, hiponatremia, enfermedad renal, esplénica, espondilitis anquilosante, síndrome del declive (retraso del crecimiento) y otras enfermedades, particularmente enfermedades crónicas. La caquexia también puede ser idiopática (que surge de una causa incierta) . Se entiende que la evaluación del peso en un paciente excluye los tumores o acumulación de fluidos, por ej . peso del tumor, acumulación de fluido extravascular, etc. La caquexia puede evaluarse mediante la medición de la masa corporal total del paciente (excepto los tumores o acumulación de fluidos), masa magra total (sin grasa) masa corporal, masa magra de brazos y piernas! (masa magra apendicular, por ej . medida usando absorciometria de rayos x de energía dual o espectroscopia de impedancia bioeléctrica ) , y/o índice de masa corporal magra (masa corporal magra dividida entre la altura del paciente al cuadrado) . Véase Kotler, Ann Intern Med. 17 de octubre de 2000 ; 133 ( 8 ) : 622-3 Marcora et ál., Rheumatology (Oxford) . Noviembre de 2006; 5 (11) : 1385-8.
Debilidad: Tal como se usa en la presente, la debilidad refiere a la fatiga física, que típicamente se manifiesta como una pérdida de fuerza y/o resistencia muscular. La debilidad puede ser central (que afecta la mayoría o todos los músculos del cuerpo) o periférica (que afecta un subgrupo de músculos) . La debilidad incluye "debilidad real" en la que los músculos del paciente disminuyen en alguna medida la producción de fuerza pico y/o sostenida y "debilidad percibida", en la que el paciente percibe que se requiere un mayor esfuerzo para realizar una tarea aunque la fuerza medida de manera objetiva permanece casi igual y el paciente puede medirla de manera objetiva o reportarla él mismo. Por ejemplo, la debilidad puede medirse de manera objetiva usando la prueba de fuerza de prensión (una prueba médicamente reconocida para evaluar la fuerza muscular) , típicamente utilizando un dinamómetro de prensión manual.
Fatiga: Tal como se usa en la presente, la fatiga refiere a fatiga mental (para fatiga física véase "debilidad") . La fatiga incluye sopor (somnolencia) y/o disminución de la atención. La fatiga puede medirse usando una variedad de pruebas conocidas en la técnica, tales como la prueba FACIT-F (Evaluación funcional del tratamiento de enfermedades crónicas y de la fatiga) . Véase, por ej . , Celia, D., Lai, J.S., Chang, C.H., Peterman, A., & Slavin, . (2002) . Fatigue in cáncer patients compared with fatigue in the general population. Cáncer, 94(2), 528-538; Celia, D . , Eton, D.T., Lai,F J-S., Peterman, A.H & Merkel, D.E. (2002) . Combining anchor and distribution based methods to derive minimal clinically important differences on the Functional Assessment of Cáncer Therapy anemia and fatigue scales. Journal of Pain & Symptom Management, 24 (6) 547-561.).
Fie£>re: Tal como se usa en la presente, "fiebre" refiere al punto de referencia de la temperatura corporal que aumenta al menos 1 a 2 grados Celsius. La fiebre se asocia comúnmente con un sentimiento subjetivo de hipotermia que se manifiesta como una sensación fría, temblores, aumento de la frecuencia cardiaca y frecuencia respiratoria por lo que el cuerpo del individuo alcanza el punto de referencia aumentado. Tal como se entiende en medicina, la temperatura corporal normal típicamente varía con el nivel de actividad y momento del día, con temperaturas máximas observadas en las horas de la tarde y antes de la noche y temperaturas mínimas observadas durante la segunda mitad del ciclo de sueño y las mediciones de temperatura pueden estar influenciadas por factores externos tales como respiración por la boca, consumo de comida o bebida, fumar o temperatura ambiente (dependiendo del tipo de medición) . Asimismo, el punto de referencia de la temperatura normal para los individuos puede variar hasta alrededor de 0.5 grados Celsius, por consiguiente un profesional médico puede interpretar la temperatura de un individuo según estos factores para diagnosticar si tiene fiebre. Por lo general, la fiebre se diagnostica típicamente por una temperatura interna corporal por encima de 38.0 grados Celsius, una temperatura oral por encima 37.5 grados Celsius, o una temperatura axilar por encima de 37.2 grados Celsius.
Mejorado; Tal como se usa en la presente, "mejorado/a", "mejora" y otras variantes gramaticales incluyen cualquier cambio beneficioso que resulte de un tratamiento. Un cambio beneficioso es cualquier forma en la que el estado del paciente es mejor de lo que seria en ausencia del tratamiento. "Mejorado/a" incluye la prevención de una afección indeseada, el enlentecimiento del ritmo de empeoramiento de la afección, el retardo del desarrollo de una afección indeseada y restablecimiento a un estado esencialmente normal. Por ejemplo, la mejora de la caquexia comprende cualquier aumento de la masa del paciente, tal como la masa corporal total (excepto el peso normalmente excluido durante la evaluación de la caquexia, por ej . , peso del tumor, acumulación de fluido extravascular, etc.), masa corporal magra, y/o masa magra apendicular, asi como también cualquier retraso o enlentecimiento del ritmo de pérdida de masa, o prevención o enlentecimiento de la pérdida de masa asociado a una enfermedad o afección que ae diagnosticó al paciente. Para otro ejemplo, la mejora en la debilidad comprende cualquier aumento en la fuerza del paciente, asi como también cualquier demora o enlentecimiento del ritmo de pérdida de fuerza, o prevención o enlentecimiento de la pérdida de fuerza asociado con una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente. Para aun otro ejemplo, la mejora en la fatiga comprende cualquier disminución en la fatiga del paciente, asi como también cualquier demora o enlentecimiento del ritmo del aumento de la fatiga, o prevención o enlentecimiento del aumento de la fatiga asociado con una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente. Para aun otro ejemplo, la mejora en la fiebre comprende cualquier disminución en la fiebre del paciente, asi como también cualquier demora o enlentecimiento del ritmo del aumento de la fiebre, o prevención o enlentecimiento del aumento de la fiebre asociado con una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente.
Proteína C reactiva (CRP) : Tal como se usa en la presente, la proteína C reactiva (CRP) comprende no solo la siguiente secuencia de 224 aminoácidos disponible como acceso a la proteína GenBank No. NP_000558: MEKLLCFLVLTSLSHAFGQTDMSRKAFVFPKESDTSYVSLKAPLTKPLKAFTVCLHFYTELSSTR GYSIFSYATKRQDNEILIFWSKDIGYSFTVGGSEILFEVPEVTVAPVHICTS ESASGIVEFWVD GKPRVRKSLKKGYTVGAEASI ILGQEQDSFGGNFEGSQSLVGDIGNVNMWDIFVLSPDEINTIYLG GPFSPNVLNWRALKYEVQGEVFTKPQLWP (SEQ ID NO: 726), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos de CRP, así como también mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia. Los niveles de CRP, por ej . en suero, hígado, tumor o en cualquier otra parte del cuerpo, puede medirse fácilmente usando métodos de rutina y reactivos comercialmente disponibles, por ej . ELISA, tira de prueba del anticuerpo, inmunoturbidimetría, inmunodifusión rápida, aglutinación visual, transferencia Western, transferencia Northern, etc. Tal como se mencionó anteriormente, los niveles de CRP pueden medirse además en pacientes que tienen o que están en riesgo de desarrollar trombosis de acuerdo con la invención.
Receptor de interleucina-6 (IL-6R) ; también denominado receptor de IL-6 alfa (IL-6RA) : Tal como se usa en la presente, "receptor de interleucina-6" ("IL-6R"; también "receptor de IL-6 alfa" o "IL-6RA") comprende no solo la siguiente secuencia de aminoácidos 468 disponible como acceso a la proteina Swiss-Prot No. P08887: LAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVH VLRKP AAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSCFRKSPLSNV VCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVA SSVGS FSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAE RSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAEN EVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKK TW LRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRS PYDISNTDYFFPR (SEQ ID NO: 727), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos, asi como también mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia. gpl30: Tal como se usa en la presente, gpl30 (también denominado receptor de interleucina-6 subunidad beta) comprende no solo la siguiente secuencia precursora de aminoácidos 918 disponible como acceso a la proteina Swiss-Prot No. P40189: MLTLQTWVVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVL EKCMDYFHVNANYI VWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKP NLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIE V VEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSIL LTWTNPSIKSVIIL YNIQ YRT DASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGY SDWSEEASGITYEDR PSKAPSFWY IDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTR KSHLQNYTVNAT LTVN LTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYIL E CVLSDKAPCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESI AYLKQAPPS KGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYTLSSLTSD TLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPVCLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIK H IWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNFTDVSVVEIEANDK PFPEDLKSLDLFK KE INTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRS ESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDF VRLKQQISDHISQSCGSGQMK FQEVSAADAFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEG PKSYLPQTV RQGGYMPQ (SEQ ID NO: 728), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos, tal como las formas maduras codificadas por aminoácidos 23 hasta 918 de la secuencia mostrada, asi como también mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Escala de pronóstico de Glasgow (GPS) : Tal como se usa en la presente, la escala de pronóstico de Glasgow (GPS) se refiere a un puntaje basado en una inflamación que otorga un punto por un nivel de albúmina en suero menor que < 35 mg/L y un punto por un nivel de CRP por encima de 10 mg/L. Por consiguiente, un GPS de 0 indica albúmina y CRP normales, un GPS de 1 indica menos albúmina o más CRP de lo normal y un GPS de 2 indica menos albúmina y más CRP de lo normal.
Cantidad eficaz: Tal como se usa en la presente, "cantidad eficaz", "cantidad eficaz para", "cantidad de X eficaz para" y similares, refieren a una cantidad de un ingrediente activo efectivo para aliviar o reducir en algún punto uno o más de los síntomas de la enfermedad que necesita tratamiento, o para retardar el inicio de síntomas o marcadores clínicos de una enfermedad que necesita prevención, cuando se administra el compuesto. Por consiguiente, una cantidad eficaz refiere a una cantidad del ingrediente activo que exhibe efectos tales como (i) revertir el ritmo de evolución de una enfermedad; (ii) inhibir en algún punto un mayor progreso de la enfermedad; y/o (iii) aliviar en algún punto (o, preferentemente, eliminar) uno o más síntomas asociados con la enfermedad. La cantidad eficaz puede determinarse empíricamente mediante la experimentación con compuestos implicados en sistemas modelo in vivo e in vitro conocidos para una enfermedad que necesita tratamiento. El contexto en el que se usa la frase "cantidad eficaz" puede indicar un efecto deseado particular. Por ejemplo, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para prevenir o tratar un estado hipercoagulable" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administre a un sujeto, ocasionará una mejora considerable en el perfil de coagulación del sujeto, o previene, ralentiza, retrasa o detiene un empeoramiento del perfil de coagulación que representa un riesgo para el sujeto. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para reducir los niveles de CRP en suero" y frases similares refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, causará una disminución medible de los niveles de CRP en suero, o prevendrá, enlentecerá, retardará o detendrá un aumento de los niveles de CRP en suero que ponen en riesgo al paciente. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para aumentar los niveles de albúmina en suero" y frases similares refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, causará un aumento medible de los niveles de albúmina en suero, o prevendrá, enlentecerá, retardará o detendrá una disminución de los niveles de albúmina en suero que ponen en riesgo al paciente. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para reducir la debilidad" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administre a un sujeto, ocasionará una disminución considerable de la debilidad según lo determina la prueba de fuerza de prensión. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para aumentar el peso" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administre a un sujeto, ocasionará un aumento considerable en el peso del paciente. Una cantidad eficaz variará de acuerdo con el peso, sexo, edad e historial médico del individuo, asi como también la gravedad de la(s) afección (es) del paciente, el tipo de enfermedad (es) , modo de administración y similares. Una cantidad eficaz puede determinarse fácilmente usando experimentos de rutina, por ej , titulación (administración de dosis crecientes hasta que se encuentra una dosis eficaz) y/o por referencia a cantidades que fueron eficaces para pacientes anteriores. En general, los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención se administrarán en dosis que varían entre alrededor de 0.1 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg del peso corporal de los pacientes .
Mejora prolongada del perfil de coagulación: Como se utiliza en la presente, "mejora prolongada del perfil de coagulación" y frases similares se refieren a una mejora considerable del perfil de coagulación del sujeto con respecto al perfil de codificación inicial (es decir, el perfil de coagulación antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar alrededor de una semana a partir del inicio del tratamiento (por ej . , administración de un antagonista de IL-6 tal como Abl) y permanece mejorado por un periodo prolongado, por ej . , al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 dias, al menos alrededor de 35 dias, al menos alrededor de 40 dias, al menos alrededor de 50 dias, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas o al menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento.
Reducción prolongada de la CRP en suero: Tal como se usa en la presente, "reducción prolongada de la CRP en suero" y frases similares refieren a una disminución medióle del nivel de CRP en suero con respecto al nivel inicial de CRP en suero (es decir, el nivel de CRP en suero al momento anterior al comienzo del tratamiento) que es detectable aproximadamente dentro de aproximadamente de una semana a partir de que comienza el tratamiento (por ej . administración de un anticuerpo anti-IL-6) y permanece por debajo del nivel inicial de CRP en suero para una duración prolongada, por ej . al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas, o al menos alrededor de 12 semanas a partir del comienzo del tratamiento.
Aumento prolongado de la albúmina en suero: Tal como se usa en la presente, "aumento prolongado de la albúmina en suero" y frases similares refieren a una disminución medible del nivel de albúmina en suero con respecto al nivel inicial de albúmina en suero (es decir, el nivel de albúmina en suero al momento anterior al comienzo del tratamiento) que es detectable durante aproximadamente una semana a partir de que comienza el tratamiento (por ej . administración de un anticuerpo anti-IL-6) y permanece por encima del nivel inicial de albúmina en suero para una duración prolongada, por ej . al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas, o al menos alrededor de 12 semanas a partir del comienzo del tratamiento .
Mejora prolongada de la caquexia: Tal como se usa en la presente, "mejora prolongada de la caquexia" refiere a una mejora medible de la masa corporal, masa corporal magra, masa corporal magra apendicular y/o índice de masa corporal magra del paciente, respecto del nivel inicial (es decir, el nivel al momento anterior al comienzo del tratamiento) que es detectable durante aproximadamente 4 semanas y permanece mejorado por un período prolongado, por ej . al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas, o al menos alrededor de 12 semanas a partir del comienzo del tratamiento Mejora prolongada en la debilidad: Tal como se usa en la presente, "mejora prolongada de la debilidad" refiere a una mejora medible de la fuerza muscular, respecto del nivel inicial (es decir, el nivel al momento anterior al comienzo del tratamiento) que es detectable durante aproximadamente 2 semanas y permanece mejorado por un período prolongado, por ej . al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas, o al menos alrededor de 12 semanas a partir del comienzo del tratamiento .
Mejora prolongada de la fatiga: Tal como se usa en la presente, "mejora prolongada de la fatiga" refiere a una mejora medible de la fatiga, respecto del nivel inicial (es decir, el nivel al momento anterior al comienzo del tratamiento) que es detectable durante aproximadamente 1 semana y permanece mejorado por un período prolongado, por ej . al menos aproximadamente 14 días , al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días , al menos alrededor de 35 días , al menos alrededor de 40 días , al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas, o al menos alrededor de 12 semanas a partir del comienzo del tratamiento.
Mejora prolongada de la fiebre: Tal como se usa en la presente, "mejora prolongada de la fiebre" refiere a una disminución medible de la fiebre (por ej . la temperatura pico o cantidad de tiempo que la temperatura permanece alta) , respecto del nivel inicial (es decir, el nivel al momento anterior al comienzo del tratamiento) que es detectable durante aproximadamente 1 semana y permanece mejorado por un periodo prolongado por ej . al menos alrededor de 14 dias , al menos alrededor de 21 días , al menos alrededor de 28 dias, al menos alrededor de 35 días , al menos alrededor de 40 dias , al menos alrededor de 50 días , al menos alrededor de 60 dias, al menos alrededor de 70 dias , al menos alrededor de 11 semanas, o al menos alrededor de 12 semanas a partir del comienzo del tratamiento .
Especies de levadura capaces de apareamiento: La presente invención pretende comprender ampliamente cualquier levadura diploide o tetraploide que puede crecer en cultivo. Tales especies de levadura pueden existir en forma haploide, diploide o tetraploide. Las células de una determinada ploidia pueden, en condiciones apropiadas, proliferar para un número indeterminado de generaciones en dicha forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede resultar en cepas tetraploides mediante apareamiento o fusión adicional de cepas diploides . En la presente invención las células de levadura diploides o poliploides son producidas preferentemente por apareamiento o fusión de esferoplastos .
En una modalidad de la invención, la levadura que puede aparearse es miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma; Ascobotryozyma Citeromyces ; Debaryomyces ; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces ; Kodamaea Lodderomyces ; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces ; Saturnispora ; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygosaccharomyces . Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyen Yarrowia, Rhodosporidium, Candida, Hansenula, Filobasium, Filobasidellla, Sporidiobolus , Bullera, Leucosporidium y Filobasidella .
En una modalidad preferida de la invención, la levadura que puede aparearse es miembro del género Pichia. En una modalidad adicional preferida de la invención, la levadura que puede aparearse del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha (Pichia angusta) . En una modalidad particularmente preferida de la invención, la levadura que puede aparearse del género Pichia es la especie Pichia pastoris .
Célula de levadura haploide Célula que tiene una copia única de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal .
Célula de levadura poliploide: Célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura diploide: Célula que tiene dos copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formado por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.
Célula de levadura tetraploide: Célula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formado por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Las tetraploides pueden tener dos, tres, cuatro o más casetes de expresión diferentes. Tales tetraploides podrían obtenerse en S. cerevisiae mediante apareamiento selectivo de diploides homocigóticos heterotálicos a/a y alfa/alfa y en Pichia mediante apareamiento1 secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos . Por ejemplo, una haploide [met his] puede aparearse con una haploide [ade his] para obtener una diploide [his] ; y una haploide [met arg] puede aparearse con una haploide [ade arg] para obtener una diploide [arg]; y la diploide [his] x diploide [arg] para obtener un prototrofo tetraploide. Los expertos en la técnica entenderán que la referencia a los beneficios y usos de células diploides también puede aplicar a linfocitos Tetraploides.
Apareamiento de levadura: Proceso por el cual dos células de levadura haploides se fusionan naturalmente para formar una célula de levadura diploide.
Meiosis: Proceso por el cual una célula de levadura diploide se somete a división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede luego germinar y formar una línea celular haploide vegetativamente en crecimiento .
Marcador seleccionable: Un marcador seleccionable es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica física de crecimiento) en una célula que recibe dicho gen, por ejemplo, mediante un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las que las células que no reciben dicho gen de marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes de marcador seleccionable generalmente están comprendidos en varios tipos, que incluyen genes de marcador seleccionable positivos tales como un gen que confiere a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, temperatura cuando dos mutantes ts se cruzan o cuando un mutante ts se transforma; los genes de marcador seleccionable negativo tales como un gen biosintético que confiere a una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico necesitado por todas las células que no tienen dicho gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere a una célula la incapacidad de crecer por células que no tienen el gen de tipo salvaje; y similares. Los marcadores adecuados incluyen de modo no taxativo: ZEO; G418; LYS3; METI; MET3a; ADE1; ADE3; URA3 y similares.
Vector de expresión: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína extraña dentro de la célula hospedadora objetivo. Convenientemente, la manipulación de secuencias y producción de ADN para la transformación se lleva a cabo en primer lugar en un hospedador bacteriano, por ej . E. coli y en general los vectores incluirán secuencias para facilitar dichas manipulaciones, que incluyen un origen bacteriano de replicación y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) brindan resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Los ejemplos de vectores y métodos de transformación de levadura se describen, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual . Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Los vectores de expresión para usar en métodos de la invención incluirán adicionalmente secuencias específicas de levadura, que incluyen un auxotrófico seleccionable o marcador de fármaco para identificar las cepas de levadura transformadas. Un marcador de fármaco puede usarse adicionalmente para ampliar el número de copias del vector en una célula hospedadora de levadura .
La secuencia de interés que codifica el polipéptido está operativamente enlazada a secuencias reguladoras transcripcionales y traslacionales que proporcionan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes de vectores pueden incluir, de modo no taxativo, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También pueden estar incluidas secuencias para la secreción del polipéptido, por ej . una secuencia de señal y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión están comúnmente integrados al genoma de la levadura.
En una modalidad de la invención, el polipéptido de interés está operativamente enlazado, o fusionado, a secuencias que proporcionan secreción optimizada del polipéptido de células diploides de levadura .
Los ácidos nucleicos están "operativamente enlazados" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una secuencia de señal está operativamente enlazado a un ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción de un polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por la ligadura en sitios de restricción convenientes o de manera alternativa mediante un método PCR/de recombinación conocido para aquellos expertos en la técnica (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California) . Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlaces de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional .
Los promotores son secuencias sin traducir situadas corriente arriba (5') al codón inicial de un gen estructural (generalmente entre alrededor de 100 y 1000 bp) que controlan la transcripción y traducción de secuencias de ácidos nucleicos particulares a las que están operativamente enlazadas. Dichos promotores están comprendidos en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y represibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor) . Los promotores inducibles pueden iniciar los niveles aumentados de transcripción desde el ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ej . , la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.
El fragmento promotor de levadura puede también servir como sitio para la recombinación e integración homologa del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de levadura; de manera alternativa un marcador seleccionable se usa como sitio para la recombinación homologa. La transformación de Pichia se describe en Cregg et ál. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376-3385 .
Ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el promotor AOX1 (Cregg et ál. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); promotor ICLl (Menendez et ál. (2003) Yeast 20 (13) : 1097-108) ; promotor gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et ál. (1997) Gene 186 (1) : 37- 44 ) ; y promotor FLDl (Shen et ál. (1998) Gene 216 ( 1 ): 93-102 ) . El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLDl son inducibles.
Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL , PH03, PH05, Pyk y promotores quiméricos derivados de los mismos. Adicionalmente, los promotores que no son de levadura pueden usarse en la invención tales como promotores mamíferos, de insectos, vegetales, reptiles, anfibios, virales y de aves. Más típicamente el promotor comprenderá un promotor mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o viral que proporcione transcripción eficaz en los sistemas de levadura.
Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ej . una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N del polipéptido o proteína madura. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte de la secuencia de codificación del polipéptido introducida en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada a través de una de las vías estándares disponibles dentro de la célula hospedadora. La señal pre-pro del factor alfa S. cerevisiae posee eficacia probada en la secreción de una ? variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias de señal de levadura incluyen la secuencia de señal del factor de apareamiento alfa, la secuencia de señal de invertasa y las secuencias de otros polipéptidos de señal de levadura secretados. Adicionalmente, estas secuencias de péptidos de señal pueden diseñarse para proporcionar una secreción mejorada de los sistemas de expresión de levadura diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias de señal de mamíferos, que pueden ser heterólogas a la proteína que se secreta, o puede ser una secuencia nativa para la proteína que se secreta. Las secuencias de señal incluyen secuencias prepeptídicas y en algunos casos pueden incluir secuencias propeptídicas . Varias de dichas secuencias de señal son conocidas en la técnica, incluyendo secuencias de señal encontradas en cadenas de inmunoglobulina, por ej . , secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias de señal de albúmina en suero humanas, cadena pesada Ig humana, cadena ligera Ig humana y similares. Por ejemplo, véase Hashimoto et. ál. Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi et. ál. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998) .
La transcripción puede aumentar insertando una secuencia activadora de la transcripción en el vector. Estos activadores son elementos de ADN que actúan en cis, en general alrededor de 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de transcripción tienen posición y orientación relativamente independiente, habiéndose encontrado en posición 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón, asi como también dentro de la secuencia de codificación en sí misma. El potenciador puede empalmarse en el vector de expresión en la posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de codificación, pero está situado preferentemente en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas pueden también contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles desde 3' al codón de terminación de traducción, en regiones sin traducir de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm.
La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas estándar de ligadura o métodos PCR/de recombinación. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN están escindidos, hechos a medida y religados en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o mediante métodos de recombinación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas de plásmidos construidos, se usan mezclas de ligadura para transformar células hospedadoras y los transformadores satisfactorios seleccionados por resistencia a un antibiótico (por ej . ampicilina o Zeocin™ (fleomicina) ) fueron los adecuados. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan por digestión con endonucleasas de restricción y/o secuencian.
Como una alternativa a la restricción y ligadura de fragmentos, pueden usarse métodos de recombinación en sitios att y enzimas de recombinación para insertar secuencias de ADN en un vector. Dichos métodos son descritos, por ejemplo, por Landy (1989) Ann . Rev . Biochem. 58:913-949; y son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos utilizan recombinación de ADN intermolecular que es mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas lambda y E.coli. La recombinación ocurre entre sitios de unión (att) específicos en las moléculas de ADN de interacción. Para una descripción de sitios att véase Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp.211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se cambian, de modo que luego de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas comprendidas de secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede ocurrir entre ADN de cualquier topología.
Los sitios att pueden introducirse en una secuencia de interés mediante la ligadura de la secuencia de interés a un vector apropiado; la generación de un producto de PCR que contiene sitios att B mediante el uso de cebadores específicos; generación de una biblioteca de ADNc clonada en un vector opiado que contiene sitios att y similares.
El plegamiento, tal como se usa en la presente, refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, donde las interacciones entre los residuos de aminoácido actúan para estabilizar la estructura. Mientras que las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, en general las proteínas de interés tendrán enlaces covalentes de disulfuro intra- y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para las proteínas y polipéptidos de origen natural o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento apropiado es típicamente el arreglo que da como resultado una actividad biológica óptima y puede de manera conveniente monitorearse mediante ensayos para actividad, por ej . unión de ligando, actividad enzimática, etc.
En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en actividad biológica serán menos significativos . El plegamiento adecuado de dichas moléculas puede determinarse basándose en propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelado y similares.
El hospedador de expresión puede modificarse adicionalmente mediante la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que potencian el plegamiento y la formación de unión de disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas, etc. Dichas secuencias pueden expresarse constitutiva o induciblemente en la célula hospedadora de levadura, usando vectores, marcadores, etc., tal como se conoce en la técnica. Preferentemente las secuencias, que incluyen elementos reguladores transcripcionales suficientes para el patrón de expresión deseado, están integradas de manera estable en el genoma de la levadura mediante una metodología con fines específicos.
Por ejemplo, la PDI eucariota es no solo un eficaz catalizador de la oxidación de proteína cisteína e isomerización de unión de disulfuro, sino que también exhibe actividad chaperona. La expresión conjunta de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que poseen múltiples uniones de disulfuro. También de interés es la expresión de BIP (proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina) ; ciclofilina ; y similares. En una modalidad de la invención, cada una de las cepas parentales haploides expresan una enzima de plegamiento distintiva, por ej . una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de las mismas.
Los términos "proteína deseada" o "proteína objetivo" se usan de manera intercambiable y refieren generalmente a un anticuerpo humanizado o porción de unión del mismo descrito en la presente. El término "anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contiene una cadena de polipéptidos con forma específica que se adecúan a y reconocen un epítopo, cuando una o más interacciones de unión no covalente estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina y todos los tipos de inmunoglobulinas , IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ej . de humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollos, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida de acuerdo con la invención son los conejos. Se han descrito numerosas secuencias de codificación de anticuerpos; y otras pueden surgir mediante métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de las mismas incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple tales como scFvs, anticuerpos de camélidos, nanoanticuerpos, IgNAR (anticuerpos de cadena simple derivados de tiburones), productos farmacéuticos inmunológicos de molécula pequeña (SMIP) y fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fab', F(ab')2 y similares. Véase Streltsov VA, et ál., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci . noviembre de 2005; 14 ( 11 ) : 2901-9. Epub 30 de setiembre de 2005; Greenberg AS, et ál., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 9 de marzo de 1995;37 (6518) :168-73; Nuttall SD, et ál . , Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop librarles, Mol Immunol . Agosto de 2001; 38 (4) : 313-26; Hamers-Casterman C, et ál., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. Junio de 1993;363 (6428) : 446-8 ; Gilí DS, et ál . , Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol . Diciembre de 2006; 17 ( 6) : 653-8. Epub 19 de octubre de 2006.
Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno o variantes de los mismos pueden producirse mediante ingeniería genética. En esta técnica, al igual gue con otros métodos, las células que producen anticuerpos se sensibilizan al antígeno o inmunógeno deseados. El ARN mensajero aislado de las células que producen anticuerpos se usa como una plantilla para producir ADNc usando amplificación por PCR. Una biblioteca de vectores, cada uno conteniendo un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que retienen la especificidad inicial del antígeno, se produce por inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Una biblioteca combinatoria se construye mediante la combinación de la biblioteca de genes de cadena pesada y la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que expresan conjuntamente una cadena ligera y pesada (asemejándose al fragmento Fab o fragmento de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo) . Los vectores que llevan estos genes se cotransfectan en una célula hospedadora. Cuando la síntesis de gen de anticuerpos se induce en el hospedador transíectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se ensamblan a sí mismas para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante análisis con el antígeno o inmunógeno.
Las secuencias de codificación de anticuerpos de interés incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como también ácidos nucleicos que, debido a la degeneración del código genético, no son idénticos en secuencia a los ácidos nucleicos descritos y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos (aa) . Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, como para alterar un sitio de glicosilación, o para minimizar la falta de plegamiento por sustitución o supresión de uno o más residuos de cisteina que no son necesarios para funcionar. Las variantes pueden diseñarse como para retener o tener actividad biológica potenciada de una región particular de la proteina (por ej . , un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos, etc) . Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en la presente, en particular fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la invención en cuestión polipéptidos que han sido modificados usando técnicas biológicas moleculares comunes para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agentes terapéuticos.
Los anticuerpos quiméricos pueden realizarse por medios recombinantes combinando las regiones de cadena ligera y pesada variables (VL y VH) , obtenidas de células que producen anticuerpos de una especie con las regiones constantes de cadena ligera y pesada de otras. Típicamente los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedores o conejos y regiones constantes humanas para producir un anticuerpo predominantemente con dominios humanos. La producción de dichos anticuerpos quiméricos es conocida en la técnica y puede lograrse por medios estándar (tal como se describe, por ej . , en la patente de EUA No. 5,624,659, incorporada en la presente en su totalidad mediante esta referencia) . Adicionalmente, se contempla que las regiones constantes humanas de anticuerpos quiméricos de la invención pueden seleccionarse de regiones constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
Los anticuerpos humanizados están diseñados para contener aun más dominios de inmunoglobulina de tipo humano, e incorporar solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de animales. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y adecuándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpo humanas. Aunque el proceso es aparentemente complejo, es sencillo en la práctica. Véase, por ej . , patente de EUA No. 6, 187,287, incorporada en la presente en su totalidad mediante esta referencia. En una modalidad preferida, la humanización puede afectarse tal como se describe en detalle más adelante. Este esquema injerta CDR en FR humanas altamente homologas al anticuerpo principal que está siendo humanizado.
Además de inmunoglobulinas completas (o sus equivalentes recombinantes ) pueden sintetizarse los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epitopo (por ej . Fab' , F(ab' )2 u otros fragmentos). Se pueden diseñar "fragmentos", o inmunoglobulinas mínimas utilizando técnicas recombinantes de inmunoglobulina . Por ejemplo inmunoglobulinas "Fv" para uso en la presente invención pueden producirse sintetizando una región de cadena ligera variable fusionada y una región de cadena pesada variable. Las combinaciones de anticuerpos también son de interés, por ej . diacuerpos que comprenden dos especificidades de Fv distintas. En otra modalidad de la invención, los SMIP (productos farmacéuticos inmunológicos de molécula pequeña) , anticuerpos de camélidos, nanoanticuerpos e IgNAR están comprendidos en los fragmentos de inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas pueden modificarse postraduccionalmente, por ej . , para agregar restos efectores tales como enlaces químicos, restos detectables, tales como tintes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o pueden utilizarse los restos de unión específicos, tales como estreptavidina, avidina, o biotina y similares en los métodos y composiciones de la presente invención. Más adelante se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales .
El término "levadura poliploide que expresa de manera estable o expresa un polipéptido heterologo secretado deseado por tiempo prolongado" refiere a un cultivo de levadura que secreta dicho polipéptido por al menos varios días a una semana, más preferentemente al menos un mes, aun más preferentemente al menos 1-6 meses y aun más preferentemente más de un año a niveles umbral de expresión, típicamente al menos 10-25 mg/litro y preferentemente sustancialmente mayor.
El término "cultivo de levadura poliploide que secreta cantidades deseadas de polipéptido recombinante" refiere a cultivos que secretan de manera estable o durante períodos prolongados al menos 10-25 mg/litros de polipéptido heterólogo, más preferentemente al menos 50-500 mg/litros y más preferentemente 500-1000 mg/litros o más.
Una secuencia de polinucleótidos "corresponde" a una secuencia de polipéptidos si la traducción de la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el código genético produce la secuencia de polipéptidos (es decir, la secuencia de polinucleótidos "codifica" la secuencia de polipéptidos) , una secuencia de polinucleótidos "corresponde" a otra secuencia de polinucleótidos si las dos secuencias codifican la misma secuencia de polipéptidos.
Una región o dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra asociado a la molécula más grande en la naturaleza. Por consiguiente, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen en general se flanqueará por el ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo original. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción en la que la secuencia de codificación misma no se encuentra en la naturaleza (por ej . , un ADNc donde la secuencia de codificación genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que poseen codones diferentes al gen nativo) . Las variaciones alélicas o eventos mutacionales de origen natural no provocan una región heteróloga de ADN tal como se define en la presente.
Una "secuencia de codificación" es una secuencia dentro del marco de codones que (en vista del código genético) corresponde a o codifica una secuencia de péptido o proteina. Dos secuencias de codificación se corresponden con cada una si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia de codificación asociada a secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción en general estará situada en dirección 3' con respecto a la secuencia de codificación. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3' ) . Las secuencias promotoras típicamente contienen sitios adicionales para unir moléculas reguladoras (por ej . , factores de transcripción) que afectan la transcripción de la secuencia de codificación. Una secuencia de codificación está "bajo el control" de la secuencia promotora o "unida operativamente" al promotor cuando la ARN polimerasa enlaza la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia de codificación en ARNm, que luego se traduce a su vez en la proteína codificada por la secuencia codificante.
Los vectores se usan para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o proteína, en un organismo o célula hospedadora. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposoraas u otros agregados lipidíeos (para polipéptidos y/o polinucleótidos) . Un "vector de ADN" es un replicón, tal como plásmido, fago o cósmido, al que se le puede unir otro segmento de polinucleótido para provocar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos mediante una célula hospedadora apropiada. Esto en general significa un promotor para unir 1 ARN polimerasa e inicia la transcripción de ARNm, así como también los sitios de unión a ribosomas y señales de iniciación para dirigir la traducción del ARNm en polipéptido ( s) . La incorporación de una secuencia de polinucleótido en un vector de expresión en el sitio apropiado y en el marco de lectura correcto, seguido por la transformación de una célula hospedadora apropiada por el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia de polinucleótidos. Los ejemplos de vectores de expresión y técnicas para su uso se describen en las siguientes publicaciones: Oíd et ál., Principies of Gene Manipulation : An Introduction to Genetic Engineering, Blackwell Scientific Publications, 4a edición, 1989; Sambrook et ál., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et ál . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells," in DNA Cloning, Volumen II, Glover, D. M . , Ed. , IRL Press, Washington, D.C., pp . 143 190 (1985) .
Por ejemplo, un liposoma u otro agregado lipido puede comprender un lipido tal como fosfatidilcolinas (lecitinas) (PC), fosfatidiletanolaminas (PE) , lisolecitinas, lisofosfatidiletanolaminas , fosfatidilserinas (PS) , fosfatidilgliceroles (PG), fosfatidilinositol (PI) , esfingomielinas , cardiolipina, ácidos fosfatidicos (PA) , ácidos grasos, gangliósidos , glucolipidos , glicolipidos , mono-, di o triglicéridos , ceramidas, cerebrósidos y combinaciones de los mismos; un lipido catiónico (u otro anfifilo catiónico) tal como 1, 2-dioleiloxi-3- ( trimetilamino) propano (DOTAP) ; N-colesteriloxicarbaril-3, 7, 12-triazapentadecan-l, 15-diamina (CTAP) ; bromuro de N-[l-(2,3, -ditetradeciloxi) propil] -N, redimeti1-N-hidroxietilamonio (DMRIE); bromuro de N-[l-(2,3,-dioleiloxi ) ropil ] -N, N-dimetil-N-hidroxi etilamonio (DORIE) ; cloruro de N- [ 1- (2 , 3-dioleiloxi) propil] -N, , -trimetilamonio (DOTMA) ; 3 beta [N- ( 1 , N ' -dimetilaminoetano) carbamoilo] colesterol (DC-Choi) ; y dimetildioctadecilamonio (DDAB) ; dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) , DOPC que contiene colesterol; y combinaciones de los mismos; y/o un polímero hidrofílico tal como polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetac ilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietileneglicol , poliaspartamida y combinaciones de los mismos. Otros lipidos catiónicos adecuados se describen en Miller, Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768 1785 (1998) y Cooper et ál., Chem. Eur. J. 4(1) : 137 151 (1998) . Los liposomas pueden estar reticulados, parcialmente reticulados o no reticulados. Los liposomas reticulados pueden incluir componentes reticulados asi como también no reticulados. Las citofectinas o liposomas catiónicos adecuados se encuentran comercialmente disponibles y también pueden prepararse tal como se describe en Sipkins et ál., Nature Medicine, 1998, 4 (5) : (1998), 623 626 o se describe en Miller, anteriormente. Los ejemplos de liposomas incluyen un lipido neutral o zwiteriónico polimerizable, un lipido que se dirige a la integrina polimerizable y un lipido catiónico polimerizable adecuado para unir un ácido nucleico. Los liposomas pueden opcionalmente incluir péptidos que proporcionan eficacia aumentada, por ejemplo tal como se describe en la patente de EUA No. 7,297,759. Adicionalmente, los ejemplos de liposomas y otros agregados de lipidos se describen en la patente de EUA No. 7,166,298.
La "amplificación" de secuencias de polinucleótidos es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico particular. La secuencia amplificada es en general en forma de ADN. Una variedad de técnicas para llevar a cabo dicha amplificación se describe en una reseña de Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8 ( ) : 291-29 ) . La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácido nucleico y el uso de PCR en la misma debería considerarse ejemplo de otras técnicas de amplificación adecuadas.
Actualmente se conoce bien la estructura general de anticuerpos en vertebrados (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Los anticuerpos consisten en dos cadenas ligeras de polipéptidos idénticas de peso molecular de aproximadamente 23,000 daltons (la "cadena ligera") y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53,000-70,000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas se juntan por uniones de disulfuro en una configuración "Y" donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuración "Y" . La porción "rama" de la configuración "Y" se designa como región Fab la porción tallo de la configuración "Y" se designa como región Fe. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N-terminal al comienzo de la configuración "Y" hasta el extremo C-terminal al final de cada cadena. El extremo N-terminal posee la región variable que tiene especificidad para el antigeno que lo provocó y es aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, habiendo pequeñas variaciones entre cadena ligera y pesada y de anticuerpo a anticuerpo.
La región variable se une en cada cadena a una región constante que extiende la longitud restante de la cadena y que dentro de una clase particular de anticuerpo no varia con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antigeno que lo provoca) . Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE que corresponden a regiones constantes de cadena pesada ?, µ, a, d y e (gamma, mu, alfa, delta o epsilon) ) . La región o clase constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, que incluye la activación de complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)) y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et ál., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et ál., Immunology, 48: 187 (1983)); mientras que la región variable determina el antigeno con el cual reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como ? (kappa) o ? (lambda) . Cada clase de cadena pesada puede arreglarse en pares con la cadena ligera de ya sea kappa o lambda. Las cadenas ligera y pesada están covalentemente enlazadas entre si y las porciones "cola" de las dos cadenas pesadas están enlazadas entre si por medio de enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas o por linfocitos B.
La expresión "región variable" o "VR" refiere a los dominios dentro de cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo están directamente involucrados en la unión del anticuerpo con el antigeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
Las expresiones "región determinante de complementariedad", "región hipervariable" o "CDR" refieren a una o más de las regiones determinantes de complementariedad o hipervariables (CDR) que se encuentran en las regiones de las cadenas ligera o pesada variables de un anticuerpo (Véase abat, E. A. et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)) . Estas expresiones incluyen regiones hipervariables tal como se define en Kabat et ál. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et ál., US Dept . of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia and Lest, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Las CDR de cada cadena se mantienen a gran proximidad por regiones flanqueantes y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antigeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos selectos que han sido descritos como las regiones determinantes de selectividad (SDR) que representan los residuos de contacto críticos usados por las CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashmiri, S., ethods, 36:25-34 (2005)) . En la presente se proporcionan las CDR para ejemplos de anticuerpos anti-IL-6.
Las expresiones "región flanqueante" o "FR" refieren a una o más de las regiones flanqueantes dentro de las regiones de las cadenas ligera o pesada variables de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)) . Estas expresiones incluyen aquellas regiones de secuencia de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones de las cadenas ligera y pesada variables de un anticuerpo. Tal como se menciona en las modalidades preferidas, las FR comprenderán FR humanas altamente homologas al anticuerpo progenitor (por ej . anticuerpo de conejo) .
Anticuerpos anti-IL-6 Abl y fragmentos de unión de los mismos La invención incluye anticuerpos que poseen una especificidad de unión a IL-6 y una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia establecida á continuación: MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTI CQASQSINNELSWYQQ PGQR P LLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTE V VKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN (SEQ ID NO: 2) o AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGT VEIKR (SEQ ID NO: 709) y versiones humanizadas y variantes de la misma que incluyen las que se exponen las FIGS. 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
La invención también incluye anticuerpos que poseen una especificidad de unión a IL-6 y una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia establecida a continuación: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEW IGIIYGSDETAYATWAIGRFTISKTSTTVDLK TSLTAADTATYFCARDDSSDWDA FNLWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK (SEQ ID NO: 3) o EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWVGIIYGSDETAYATSAIG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 657) y versiones humanizadas y variantes de la misma que incluyen las que se exponen las FIGS. 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
La invención incluye, adicionalmente , anticuerpos que poseen especificidad de unión a IL-6 y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que es una versión modificada de la SEQ ID NO: 3 donde el residuo de triptófano en la CDR2 se cambia a una serina tal como se expresa a continuación: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEW IGIIYGSDETAYATSAIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDAKFNLWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK (SEQ ID NO: 658) y versiones humanizadas y variantes de la misma que incluyen las que se exponen las FIGS. 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
La invención contempla adicionalmente anticuerpos que comprenden una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que corresponde a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o 120; y SEQ ID NO: 9 que corresponde a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de; cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o 19, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen combinaciones de las CDR y las secuencias de cadena ligera y pesada variable establecidas anteriormente .
En otra modalidad, la invención contempla otros anticuerpos, tales como por ejemplo anticuerpos quiméricos que comprenden una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6 que corresponde a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o 120; y SEQ ID NO: 9 que corresponde a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o 19, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen combinaciones de las CDR y versiones humanizadas de las secuencias de cadena ligera y pesada variable establecidas anteriormente.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, versiones humanizadas de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, versiones humanizadas de una secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708.
En una modalidad adicional de la invención,1 los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 709.
En una modalidad adicional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden, o de manera alternativa consisten en una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 120; y SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 y 657 o 19.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de los anticuerpos que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más fragmentos de anticuerpo, incluidos todos los siguientes: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6) la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 120; y SEQ ID NO: 9) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 y 657 o 19.
La invención también contempla variantes donde ya sea cualquiera de las secuencias de polipéptidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se sustituyen por la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 657; la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20 se sustituyen por la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 709; la secuencia CDR de cadena pesada de la SEQ ID NO: 120 se sustituye por la secuencia CDR de cadena pesada de la SEQ ID NO: 8.
En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 es Abl, que comprende la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, o más particularmente un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709 (que están respectivamente codificadas por las secuencias de ácido nucleico en la SEQ ID NO:700 y SEQ ID NO:723) o uno comprendido de las secuencias SEQ ID NO alternativas establecidas en el párrafo anterior y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá una secuencia humanizada tal como se muestra en las Figuras 34-37.
Las secuencias de anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención se muestran en la Tabla 2. Se muestran ejemplos de variantes de secuencias y otras formas alternativas de las cadenas pesadas y ligeras de Abl a Ab . Los anticuerpos de la presente invención comprenden variantes de secuencia adicionales que incluyen sustituciones conservadoras, sustituciones de una o más secuencias de CDR y/o secuencias FR, etc.
Ejemplos de modalidades de Abl incluyen un anticuerpo que comprende una variante de la cadena ligera y/o la : cadena pesada. Ejemplos de variantes de la cadena ligera de Abl incluyen la secuencia de cualquiera de las cadenas ligeras de Abl mostradas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706, o 709) donde se reemplaza la totalidad de la secuencia CDR1 o donde uno o más residuos en la secuencia CDR1 se sustituye por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias CDR1 de cadena ligera establecidas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 39, 55, 71, 87, 103, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, o 572); y/o donde la totalidad de la secuencia CDR2 se reemplaza o donde uno o más residuos en la secuencia CDR2 se sustituye por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias CDR2 de cadena ligera establecidas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 40, 56, 72, 88, 104, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, o 573); y/o donde la totalidad de la secuencia CDR3 se reemplaza o donde uno o más residuos en la secuencia CDR3 se sustituye por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias CDR3 de cadena ligera establecidas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 25, 41, 57, 73, 89, 105, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, o 574) .
Ejemplos de variantes de la cadena pesada de Abl incluyen la secuencia de cualquiera de las cadenas pesadas de Abl mostradas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704, o 708) donde la totalidad de la secuencia CD 1 se reemplaza o donde uno o más 1 residuos en la secuencia CDR1 se sustituye por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias CDRl de cadena pesada establecidas (esto es, cualquiera de (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 26, 42, 58, 74, 90, 106, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, o 575); y/o donde la totalidad de la secuencia CDR2 se reemplaza o donde uno o más residuos en la secuencia CDR2 se sustituye por el residuo en la posición correspondiente de una CDR2 de cadena pesada de Abl, tal como se establece en la Tabla 1 (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 8, o 120) o cualquier otra de las secuencias de CDR2 de cadena pesada establecidas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 27, 43, 59, 75, 91, 107, 121, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, o 576); y/o donde la totalidad de la secuencia CDR3 se reemplaza o donde uno o más residuos en la secuencia CDR3 se sustituye por el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias CDR3 de cadena pesada establecidas (esto es, cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 44, 60, 76, 92, 108, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, o 577).
En otra modalidad, la invención contempla otros anticuerpos, tales como por ejemplo anticuerpos quiméricos o humanizados que comprenden una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7 (CDRl); SEQ ID NO: 8 (CDR2); SEQ ID NO: 120 (CDR2) ; y SEQ ID NO: 9 (CDR3) que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 19, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen combinaciones de las CDR y las secuencias de cadena ligera y pesada variable establecidas anteriormente incluidas aquellos establecidas en las Figuras: 2 y 34-37 y aquellas identificadas en la Tabla 1.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 de la invención es uno que comprende al menos una de las siguientes: una cadena ligera de CDRl codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 694; una cadena ligera de CDR2 codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 13; una cadena ligera de CDR3 codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 695; una cadena pesada de CDR1 codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 15, una cadena pesada de CDR2 codificada por la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 696 y una cadena pesada de CDR3 codificada por la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 697. Además, la invención abarca dichas secuencias de ácido nucleico y variantes de las mismas .
En otra modalidad, la invención se dirige a secuencias de aminoácidos correspondientes a las CDR de dicho anticuerpo anti-IL-6 que se seleccionan de la SEQ ID NO: 4 (CDR1) , SEQ ID NO: 5 (CDR2), SEQ ID NO: 6 (CDR3), SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 9.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701, 705, 720, 721, 722, o 723; y/o una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEQ ID NO: 11, 663, 700, 703, 707, 724, o 725. Además, la invención se dirige a los polipéptidos correspondientes codificados por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas y combinaciones de las mismas.
En una modalidad especifica de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 o una porción de los mismos se codificarán por una secuencia de ácido nucleico seleccionado de aquellas comprendidas en SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 662, 694, 695, 698, 701, 705, 720, 721, 722, 723, 11, 15, 16, 17, 663, 696, 697, 700, 703, 707, 724 y 725. Por ejemplo, la CDRl en la cadena ligera puede codificarse por la SEQ ID NO: 12 o 694, la CDR2 en la cadena ligera puede codificarse por la SEQ ID NO: 13, la CDR3 en la cadena ligera puede codificarse por la SEQ ID NO: 14 o 695, la CDRl en la cadena pesada puede codificarse por la SEQ ID NO: 15, la CDR2 en la cadena pesada puede codificarse por la SEQ ID NO: 16 o 696, la CDR3 en la cadena pesada puede codificarse por la SEQ ID NO: 17 o 697. Tal como se discute más adelante los anticuerpos que contienen estas CDR pueden crearse usando regiones flanqueantes humanas apropiadas basadas en procesos de humanización descritos en la presente.
En otra modalidad especifica de la invención la cadena ligera variable se codificará por la SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701, 705, 720, 721, 722, o 723 y la cadena pesada variable de los anticuerpos anti-IL-6 se codificarán por la SEQ ID NO: 11, 663, 700, 703, 707, 724, o 725.
En una modalidad más especifica, las cadenas variables ligera y pesada del anticuerpo anti-IL-6 se codificarán por la SEQ ID NO: 10 y 11, o SEQ ID NO: 698 y SEQ ID NO: 700, o SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703 o SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707.
En otra modalidad especifica, la invención abarca construcciones de ácido nucleico que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico precedentes y combinaciones de las mismas asi como células recombinantes que contienen estas secuencias y construcciones de ácido nucleico y donde estas secuencias o construcciones de ácido nucleico pueden ser extracromosomales o estar integradas en el genoma de la célula hospedadora .
En otra modalidad especifica, la invención abarca polipéptidos que contienen cualquiera de las CDR o combinaciones de las mismas descritas en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 9 o polipéptidos que comprenden cualquiera de los polipéptidos de cadena ligera variable comprendidos en la SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706, o 709 y/o los polipéptidos de cadena pesada variable comprendidos en la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704, o 708. Estos polipéptidos pueden estar opcionalmente unidos, directa o indirectamente, a otros polipéptidos de inmunoglobulina o restos efectores tales como entidades terapéuticas o detectables.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 es uno que comprende al menos una de las siguientes: una cadena ligera variable codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 698 o SEQ ID NO: 701 o SEQ ID NO: 705 y una cadena variable codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 700 o SEQ ID NO: 703 o SEQ ID NO: 707.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 es una variante de las secuencias precedentes que incluyen una o más sustituciones en las secuencias flanqueantes y/o de CDR y que tiene una o más de las propiedades de Abl in vitro y/o luego de la administración in vivo.
Estas propiedades in vitro e in vivo se describen en más detalle en los ejemplos a continuación e incluyen: competir con Abl para la unión a IL-6 y/o péptidos de esta; con una afinidad de unión (Kd) para IL-6 o menor a aproximadamente 50 picomolar, y/o una tasa de disociación (Koff) a partir de IL-6 o menor o igual a 10"4 S"1; con semivida in vivo de al menos alrededor de 22 días en un ser humano sano; capacidad para prevenir o tratar hipoalbuminemia; capacidad para prevenir o tratar CRP elevado; capacidad para prevenir o tratar la coagulación anormal; y/o capacidad para disminuir el riesgo de trombosis en un individuo con una enfermedad o afección asociada con el riesgo aumentado de trombosis. Ejemplos adicionales no limitantes de la actividad anti-IL-6 se establecen en la presente, por ejemplo, bajo el titulo "Actividad anti-IL-6".
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 incluye una o m s secuencias de CDR de cadena ligera y/o pesada de Abl (véase Tabla 1) o variantes de las mismas que poseen una o más de las propiedades de Abl in vitro y/o luego de la administración in vivo (ejemplos de dichas propiedades se discuten en el párrafo anterior) . Un experto en la técnica entenderá cómo combinar estas secuencias de CDR para formar una superficie de unión al antigeno, por ej . por medio de un enlace a uno o más andamiajes que pueden comprender otras secuencias flanqueantes humanas o mamiferas o sus ortólogos funcionales derivados a partir de un SMIP, anticuerpos de camélido, nanoanticuerpos, IgNAR u otra inmunoglobulina u otro anticuerpo diseñado. Por ejemplo, las modalidades pueden unirse específicamente a IL-ß humano e incluyen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las siguientes secuencias de CDR o variantes de las mismas: un polipéptido que posee al menos una identidad de 72.7% (esto es, 8 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 81.8% (esto es, 9 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 90.9% (esto es, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (esto es, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 85.7% (esto es, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (esto es, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos una identidad de 50% (esto es, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 58.3% (esto es, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 66.6% (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 75% (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 83.3% (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 91.6% (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad de 80% (esto es, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (esto es, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos una identidad de 50% (esto es, 8 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 56.2% (esto es, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 62.5% (esto es, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 68.7% (esto es, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 75% (esto es, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 81.2% (esto es, 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 87.5% (esto es, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 93.7% (esto es, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de ' 100% (esto es, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad de 33.3% (esto es, 4 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; . un polipéptido que posee al menos una identidad de 41.6% (esto es, 5 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 50% (esto es, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 58.3% (esto es, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 66.6% (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 75% (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 83.3% (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 91.6% (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 90.9% de semejanza (esto es, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee un 100% de semejanza (esto es, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos un 85.7% de semejanza (esto es, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos un 100% de semejanza (esto es, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos un 66.6% de semejanza (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos un 75% de semejanza (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO : 6 ; un polipéptido que posee al menos un 83.3% de semejanza (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos un 91.6% de semejanza (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee 100% de semejanza (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos un 80% de siemejanza (esto es, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos 100% de semejanza (esto es, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos 56.2% de semejanza (esto 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee al menos 62.5% de semejanza (esto 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee al menos 68.7% de semejanza (esto 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee al menos 75% de semejanza (esto 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee al menos 81.2% de semejanza (esto 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee al menos 87.5% de semejanza (esto 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee al menos 93.7% de semejanza (esto 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID 120; un polipéptido que posee 100% de semejanza (esto es, 16 de aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos un 50% de semejanza (esto 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID 9; un polipéptido que posee al menos un 58.3% de semejanza (esto es, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 66.6% de semejanza (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 75% de semejanza (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 83.3% de semejanza (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 91.6% de semejanza (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee 100% de semejanza (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9.
Otros ejemplos de modalidades incluyen uno o más polinucleótidos que codifican cualquiera de las anteriores, por ej . un polinucleótido que codifica un polipéptido que se une de manera especifica a IL-6 humana e incluye uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las siguientes CDR o variantes de las mismas : un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 72.7% de identidad (esto es, 8 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 81,8% de identidad (esto es, 9 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 90,9% de identidad (esto es, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (esto es, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 85,7% de identidad (esto es, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (esto es, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 50% de identidad (esto es, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 58, 3% de identidad (esto es, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 66,6% de identidad (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 83,3% de identidad (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 91,6% de identidad (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 80% de identidad (esto es, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (esto es, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 50% de identidad (esto es, 8 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 56,2% de identidad (esto es, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 62,5% de identidad (esto es, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 68,7% de identidad (esto es, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad (esto es, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 81,2% de identidad (esto es, 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 87,5% de identidad (esto es, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 93,7% de identidad (esto es, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (esto es, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 33,3% de identidad (esto es, 4 de 12 aminoácidos) con la cadena ¦pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 41, 6% de identidad (esto es, 5 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 50% de identidad (esto es, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 58,3% de identidad (esto es, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 66,6% de identidad (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 83,3% de identidad (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 91,6% de identidad (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 90,9% de semejanza (esto es, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de semejanza (esto es, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 85,7% de semejanza (esto es, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de semejanza (esto es, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 66,6% de semejanza (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75% de semejanza (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 83,3% de semejanza (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 91,6% de semejanza (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de semejanza (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 80% de semejanza (esto es, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de semejanza (esto es, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 7 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 56,2% de semejanza (esto es, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 62,5% de semejanza (esto es, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 68,7% de semejanza (esto es, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75% de semejanza (esto es, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 81,2% de semejanza (esto es, 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 87,5% de semejanza (esto es, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 93,7% de semejanza (esto es, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de semejanza (esto es, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 50% de semejanza (esto es, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 58,3% de semejanza (esto es, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 66,6% de semejanza (esto es, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75% de semejanza (esto es, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 83, 3% de semejanza (esto es, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 91,6% de semejanza (esto es, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de semejanza (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9.
Tabla 2. Secuencias de ejemplos de anticuerpos anti-IL-6.
* Ejemplos de formas de variantes de secuencia de cadenas pesada y ligera se muestran en lineas separadas.
PRT.: Secuencia de polipéptidos Nuc. : Ejemplos de secuencia de codificación.
Como referencia, los identificadores de secuencia distintos de los incluidos en la Tabla 2, se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3. Resumen de los identificadores de secuencia en esta solicitud.
Dichos fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos pueden estar presentes en una o más de las siguientes formas no restrictivas: Fab, Fab', F(ab' ) 2/ Fv y formas de anticuerpo de cadena simple Fv. En una modalidad preferida, los anticuerpos anti IL-6 descritos en la presente comprenden adicionalmente la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia establecida a continuación: VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 586) .
En otra modalidad preferida, los anticuerpos anti IL-6 descritos en la presente comprenden adicionalmente la secuencia de polipéptido de cadena pesada constante gamma-1 que comprende una de las secuencias establecidas a continuación: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT PREEQYASTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIE TIS AKGQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVKGFYPSDI AVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SLS LSPGK (SEQ ID NO: 588) y ASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT PREEQYASTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 719) .
Modalidades de los anticuerpos descritos en la presente pueden incluir una secuencia líder, tal como, líder Ig de conejo, prepéptido de albúmina, una secuencia líder pre o pro secreción de factor de apareamiento de la levadura (tal como P. pastoris o Saccharomyces cerevisiae o factor alfa), o líder HAS humano.
Ejemplos de secuencias líder se muestran desalineados con respecto a FR1 en la N-terminal de los polipeptidos mostrados en las Figuras 36A y 37A como sigue: Secuencias líder de Ig de ratón de la SEQ ID NOs : 2 y 660 (MD. . .) y SEQ ID NOs : 3 y 661 (ME. . . ) ; y un prepéptido de albúmina en la SEQ ID NOs: 706 y 708, lo que facilita su secreción. También se pueden usar otras secuencias líder conocidas en la técnica para conferir propiedades deseadas, tales como secreción, estabilidad mejorada o semivida, etc., solas o en combinaciones entre sí, en las cadenas pesadas y/o ligeras, que puede escindirse opcionalmente previo a la administración a un sujeto. Por ejemplo, se puede expresar un polipéptido en un sistema celular o libre de células que también expresa o incluye (o se modifica para expresar o incluir) una proteasa, por ej . una peptidasa señal ligada a la membrana que escinde una secuencia líder.
En otra modalidad, la invención contempla un anticuerpo anti-IL-6 aislado que comprende una secuencia de polipéptido de VH que comprende: SEQ ID NO: 3, 18, 19, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 117, 118, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 668, 672, 676, 680, 684, 688, 691, 692, 704, o 708; y comprende también una secuencia de polipéptido de VL que comprende: SEQ ID NO: 2, 20, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 119, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 647, 651, 660, 666, 667, 671, 675, 679, 683, 687, 693, 699, 702, 706, o 709 o una variante de la misma donde uno o más de los residuos flanqueantes (residuos FR) o residuos de CDR en dicho polipéptido de VH o L fue sustituido por otro residuo de aminoácido que da como resultado un anticuerpo anti-IL-6 que se une específicamente a IL-6. La invención contempla formas humanizadas y quiméricas de estos anticuerpos, donde preferentemente FR comprenderá FR humano altamente homólogo al anticuerpo progenitor. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fe derivado de las regiones constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 y IgG19 y en particular una región constante de cadena pesada y ligera variable tal como la contenida en la SEQ ID NO: 588 y SEQ ID NO:586.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos o los polipéptidos de VH o VL se originan o se seleccionan de una o más poblaciones de linfocitos B de conejos previo al inicio del proceso de humanización nombrado en la presente.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos y variantes de los mismos poseen especificidad de unión por homólogos de primate de la proteína IL-6 humana. Ejemplos no limitantes de homólogos primates de la proteína IL-6 humana son IL-6 obtenidas a partir de Macaca fascicularis (también conocidas como mono macaco) y el macaco Rhesus. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos y variantes de los mismos inhiben la asociación de IL-6 con IL-6R, y/o la producción de complejos IL-6/IL-6R/gpl30 y/o la producción de multímeros IL-6/IL-6R/gpl30 y/o antagonizan los efectos biológicos de uno o más de los antemencionados.
Tal como se estableció anteriormente, los anticuerpos y fragmentos y variantes de los mismos pueden modificarse postraduccionalmente para agregar restos efectores tales como enlaces químicos, restos detectables tales como, por ejemplo, tintes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y restos quimioluminiscentes o restos funcionales tales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos.
En cuanto a restos detectables, ejemplos adicionales de enzimas incluyen, de modo no taxativo, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta galactosidasa y luciferasa. Ejemplos adicionales de materiales fluorescentes incluyen, de modo no taxativo, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbelliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Ejemplos adicionales de restos quimioluminiscentes incluyen, de modo no taxativo, luminol. Ejemplos adicionales de materiales bioluminiscentes incluyen, de modo no taxativo, luciferina y aequorina. Ejemplos adicionales de materiales radiactivos incluyen, de modo no taxativo, Yodo 125 (125I), Carbono 14 (14C) , Azufre 35 (35S) , Tritio (3H) y Fósforo 32 (32P) .
En cuanto a restos funcionales, ejemplos de agentes citotoxicos incluyen, de modo no taxativo, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina; agentes alquilantes tales como ntecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) , mitomicina C, lomustina (CCNU) , 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino) ; antraciclinas incluyen daunorubicina (antiguamente daunomicina) , doxorubicina (adriamicina) , detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D) , bleomicina, caliqueamicina, mitramicina y antramicina (AMC) ; y agentes antimitóticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotoxicos incluyen paclitaxel (taxol) , ricina, pseudomonas exotoxina, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etoposida, tenoposida, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1-dihidrotestosterona, glucocorticoides , procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides , mitotano (0, P ' - ( DDD) ) , interferones y mezclas de estos agentes citotoxicos .
Agentes citotoxicos adicionales incluyen, de modo no taxativo, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ej . , vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ej . IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin®, o combinaciones de los mismos. Enzimas tóxicas de plantas y bacterias tales como ricina, toxina difteria y toxina Pseudomonas pueden conjugarse a los anticuerpos humanizados o fragmentos de unión de los mismos para generar reactivos para la destrucción específica de un tipo de células (Youle, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980) ) .
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas tal como describe Goldenberg en la Patente estadounidense No. 6,653,104. Modalidades de la invención también se refieren a radioinmunoconjugados donde un radionúclido que emite partículas alfa o beta se encuentra acoplado de manera estable al anticuerpo o fragmentos de unión del mismo, con o sin el uso de agentes formadores de complejos. Tales radionúclidos incluyen emisores beta tales como Fósforo-32 (32P) , Escandio-47 (47Sc), Cobre-67 (67Cu), Galio-67 (67Ga) , ltrio-88 (88Y) , Itrio-90 (90Y), Yodo-125 (125I), Yodo-131 (131I) , Samario-153 (153Sm) , Lutecio-177 (177Lu) , Renio-186 (186Re) o Renio-188 (188Re) y emisores alfa tales como Astatina-211 (211At) , Plomo-212 (212Pb) , Bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o Actinio-225 (225Ac) .
Se conocen métodos en la técnica para la conjugación de un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo a un resto detectable y similar, tal como, por ejemplo, aquellos métodos descritos por Hunter et ál, Nature 144:945 (1962); David et ál, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et ál, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982) .
Modalidades descritos en la presente incluyen adicionalmente variantes y equivalentes sustancialmente homólogos a los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIP, anticuerpos de camélido, nanoanticuerpos, IgNAR, polipéptidos , regiones variables y CDR establecidas en la presente. Estos pueden contener, por ej . mutaciones de sustitución conservadoras (esto es, la sustitución de uno o más aminoácidos por medio de aminoácidos similares) . Por ejemplo, sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ej . un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico, o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Se conoce bien en la técnica lo que se pretende por la sustitución conservadora de un aminoácido.
En otra modalidad, la invención contempla secuencias de polipéptidos que poseen al menos 90% o más de homología de secuencia con una o más de las secuencias de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR establecidas en la presente. Más preferentemente, la invención contempla secuencias de polipéptidos que poseen al menos 95% o más de homología de secuencia, más preferentemente al menos 98% o más de homología de secuencia y aún más preferentemente al menos 99% o más de homología de secuencia con una o más de las secuencias de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR establecidas en la presente. Métodos para determinar la homología entre las secuencias de ácido nucleico y de aminoácido son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.
En otra modalidad, la invención contempla adicionalmente los homólogos de polipéptidos antemencionados de los fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDR establecidas en la presente que poseen actividad IL-6 adicional. Ejemplos no limitantes de la actividad anti-IL-6 tal como se establece en la presente, por ejemplo, bajo el título "Actividad anti-IL-6" más adelante .
En otra modalidad, la invención contempla adicionalmente la creación y el uso de anticuerpos anti-idiotípicos que se unen a cualquiera de las secuencias precedentes. En una modalidad ejemplar, este anticuerpo anti-idiotipico puede administrarse al sujeto que recibió un anticuerpo anti-IL-6 para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-IL-6. Dichos anticuerpos anti-idiotipicos también pueden ser- útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes caracterizadas por la presencia de anticuerpos anti-IL-6. Un ejemplo de uso adicional de tales anticuerpos anti-idotipicos es la detección de anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención, por ejemplo, monitorear los niveles de anticuerpos anti-IL-6 presentes en la sangre de un sujeto u otros fluidos corporales.
La presente invención también contempla anticuerpos anti-IL-6 que comprenden cualquiera de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos descritas en la presente sustituidas por cualquier otra secuencia de polinucleótidos descrita en la misma.
Por ejemplo y sin limitación a ellos, la presente invención contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualesquiera secuencias de cadena ligera variable y pesada variable descritas en la presente y contempla adicionalmente anticuerpos que resultan de la sustitución de cualquier secuencia de CDR descrita en la presente por cualesquiera secuencias de CDR descrita en la misma. Como se indicó, los anticuerpos anti-IL-6 preferidos o fragmentos o variantes de los mismos pueden contener una secuencia ligera y/o pesada variable tal como se muestra en las FIGS. 34 o 35, tal como las SEQ ID NO: 651, 657, 709 o variantes de las mismas, donde uno o más residuos CDR o FR están modificados sin afectar de manera adversa la unión del antigeno a IL-6 u otra actividad funcional deseada.
Polin cleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo anti-IL-6 La invención se dirige adicionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de los anticuerpos que poseen una especificidad de unión a IL-6. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifican una secuencia de polipéptido de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2: ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATG TGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA AGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGT CCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAG TGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACT ACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT (SEQ ID NO: 10) o la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 662, 698, 701 o 705.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptido de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3: ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGCT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTG GATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGG ATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGCCGATTCACCAT CTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCT ATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTGTGGGGCCAAGGCACC CTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG (SEQ ID NO: 11) o la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 663, 700, 703 o 707.
En una modalidad adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que posee una especificidad de unión a IL-6 comprenden, o de manera alternativa consisten en una o más secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID NO 12 o 694; SEQ ID NO: 13; y SEQ ID NO: 14 o 695 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2.
En una modalidad adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que posee una especificidad de unión a IL-6 comprenden, o de manera alternativa consisten en una o más secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID NO 15; SEQ ID NO: 16 o 696; y SEQ ID NO: 17 o 697 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 661 o SEQ ID NO: 657 u otras descritas en las Figs . 34 o 35.
La invención también contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que poseen una especificidad de unión a IL-6 comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido de la SEQ ID NO: 10) que codifica la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 11 que codifica la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 720 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 721 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 647; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 662 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 660; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 722 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 666; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 698 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 699; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 701 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 702; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 705 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 706; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 724 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 725 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 652; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 663 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 661; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 703 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 704; el polinucleótido de la SEQ ID NO: 707 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 708, los polinucleótidos de la SEQ ID NO: 12, 13, 14, 694 y 695 que codifican las regiones determinantes de complementariedad de los polipéptidos de cadena ligera mencionados anteriormente y los polinucleótidos de las SEQ ID NO: 15, 16, 17, 696 y 697 que codifican las regiones determinantes de complimentariedad de los polipéptidos de cadena pesada mencionados anteriormente, y polinucleótidos que codifican las secuencias de cadena ligera y pesada variable en SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709 respectivamente, por ej . , las secuencias de ácido nucleico en SEQ ID NO: 700 y SEQ ID NO: 723 y fragmentos o variantes de los mismos, por ej . , basados en la degeneración de codones. Estas secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de cadena pesada y ligera variables pueden expresarse solas o en combinación y estas secuencias preferentemente se fusionan a secuencias constantes variables adecuadas, por ej . , aquellas en SEQ ID NO: 589 y SEQ ID NO: 587.
En la Tabla 1 anterior se identifican ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención. Las secuencias de polinucleótidos que se muestran se deben entender como ilustrativas en lugar de limitantes. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las secuencias de polinucleótidos que codificarían un polipéptido dado y pueden crear fácilmente secuencias de codificación adecuadas para la expresión en un sistema de expresión dado, tal como mediante la adaptación de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas y/o mediante la creación de las mismas de nuevo, y pueden producir fácilmente secuencias de expresión optimizadas por codones, por ejemplo, tal como se describe en la solicitud de patente de EUA publicada No. 2008/0120732 o utilizando otros métodos conocidos en la técnica.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden adicionalmente, o de manera alternativa consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de cadena ligera constante kappa de la SEQ ID NO: 586: GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC TGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACG CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 587) .
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden adicionalmente, o de manera alternativa consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptido de cadena pesada constante gamma-1 de la SEQ ID NO: 588: GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCA CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC CTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 589) .
En una modalidad, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo VH anti-IL-ß seleccionado de la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 y 708 o codifica una variante de la misma donde al menos un residuo flanqueante (residuo FR) fue sustituido por un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VH de anticuerpo anti-IL-6 de conejo o una sustitución conservadora de aminoácidos .Además , la invención abarca específicamente anticuerpos anti-IL-6 humanizados o fragmentos de unión al anticuerpo humanizado o variantes de los mismos y secuencias de ácido nucleico que codifican lo anterior que comprenden los polipéptidos de cadena ligera y/o cadena pesada variables humanizados descritos en las secuencias contenidas en la FIG. 2 o 34-37 o aquellos identificados en la Tabla 1, o variantes de los mismos donde se pueden modificar una o más regiones flanqueantes o residuos de CDR. De preferencia, si se introducen modificaciones, no afectarán de forma adversa la afinidad de unión del anticuerpo anti-IL-6 resultante o fragmento o variante del mismo.
En otra modalidad, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo VL anti-IL-6 seleccionado de las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 y 709 o codifica una variante de la misma donde al menos un residuo flanqueante (residuo FR) fue sustituido por un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VL de anticuerpo anti-IL-6 de conejo o una sustitución conservadora de aminoácidos.
En aun otra modalidad, la invención se dirige a uno o más polinucleótidos heterólogos que comprenden una secuencia que codifica los polipéptidos contenidos en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID N0:3; SEQ ID N0:2 y SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:20 y SEQ ID N0:19.
En otra modalidad, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-IL-6 donde dicho polipéptido expresado se une solo específicamente a IL-6 o se une específicamente a IL-6 cuando se expresa asociado con otra secuencia de polinucleótidos que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-IL-6 donde al menos una de las CDR se selecciona de aquellas contenidas en los polipéptidos VL o VH contenidos en la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 704, 708, 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709.
También se contemplan células hospedadoras y vectores que comprenden dichos polinucleótidos.
En otra modalidad específica, la invención abarca construcciones de ácido nucleico que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico precedentes y combinaciones de las mismas así como células recombinantes que contienen donde estas secuencias o construcciones de ácido nucleico pueden ser extracromosomales o estar integradas en el genoma de la célula hospedadora.
La invención contempla adicionalmente vectores que comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican secuencias de polipéptido de cadena ligera y pesada variable, así como las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables ) individuales establecidas en la presente, así como células hospedadoras que comprenden dichas secuencias. En una modalidad de la invención, la célula hospedadora es una célula de levadura. En otra modalidad de la invención, la célula hospedadora de levadura pertenece al género Pichia.' En algunos casos se proporciona más de un ejemplo de polinucleótido que codifica una secuencia de polipéptidos determinada, tal como se resume en la Tabla 4.
Tabla 4. Múltiples ejemplos de polinucleótidos que codifican polipéptidos particulares.
En algunos casos, identificadores de secuencia múltiple se refieren a la misma secuencia de polipéptido o polinucleotido, tal como se resumen en la Tabla . Se entiende que las referencias a estos identificadores de secuencias son intercambiables, salvo cuando el contexto indique lo contrario.
Tabla 5. Secuencias repetidas. Cada celda enumera un secuencias repetidas incluidas en el listado de secuencias Algunos ejemplos de modalidades incluyen polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de restricción moderada o alta a un polinucleótido que posee uno de los ejemplos de secuencias codificadoras citadas en la Tabla 1 y también incluyen polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de restricción moderada o alta a un polinucleótido que codifica el mismo polipéptido como un polinucleótido que posee uno de los ejemplos de secuencias codificadoras citadas en la Tabla 1, o un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos anteriores.
La expresión "condiciones de hibridación de restricción alta" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se híbrida a su subsecuencia blanco, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico pero no a otras secuencias. Las condiciones de restricción alta dependen de las secuencias y serán diferentes en circunstancias distintas. Secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas superiores. Una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) . En general, se establece que las condiciones de restricción alta son alrededor de 5-10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (según concentración nucleica, pH y fuerza iónica definidos) en la que el 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridan la secuencia objetivo en equilibrio (como las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Las condiciones de restricción alta serán aquellas en donde la concentración salina es menor a aproximadamente ión de sodio 1.0 M, típicamente alrededor de 0.01 a 1.0 M concentración de ión de sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos alrededor de 30 °C para sondas cortas (por ej., 10 a 50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 °C para sondas largas (por ej . , mayor a 50 nucleótidos) . Las condiciones de restricción alta también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces hibridación de fondo, opcionalmente 10 veces de fondo. Los ejemplos de condiciones de hibridación de restricción alta pueden ser como sigue: 50% de formamida, 5*SSC y 1% SDS, incubando a 42 °C, o 5*SSC, 1% SDS, incubando a 65 °C, con lavado en 0.2xSSC y 0.1% SDS a 65 °C. Tales etapas de hibridación y lavado pueden realizarse durante, por ej., 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60; o más minutos.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre ellos en condiciones de restricción alta aún están sustancialmente relacionados si los polipéptidos que codifican están sustancialmente relacionados. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de ácido nucleico usando la máxima degeneración del codón permitida por el código genético. En estos casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente en condiciones de restricción moderada. Ejemplos de "condiciones de hibridación de restricción moderada" incluyen una hibridación en un tampón de 40% de formamida, NaCl 1 M, 1% SDS a 37 °C y un lavado en 1*SSC a 45 °C. Tales etapas de hibridación y lavado pueden realizarse durante, por ej . , 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, o más minutos. Una hibridación positiva es al menos dos veces de fondo. Los expertos en la técnica rápidamente reconocerán que las condiciones alternativas de hibridación y lavado pueden utilizarse para proporcionar condiciones de restricción similar.
Ejemplos adicionales de modalidades de la invención En otra modalidad, la invención contempla uno o más anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos del anticuerpo o variantes del mismo que se pueden unir específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o pueden competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o fragmento del mismo, tal como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos identificados anteriormente) que se unen específicamente a la IL-6, que están preferentemente aglicosilados . En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento o variante del mismo se puede unir específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o puede competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, tal como Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a la IL-6, que están preferentemente aglicosilados.
En otra modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 que se puede unir específicamente a los mismos epítopos conformacionales o lineales en un polipéptido de IL-6 intacto o fragmento del mismo que está (están) específicamente unido mediante Abl se puede unir a uno o más epítopos, cuando se establecen por mapeo epitópico usando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan todo el largo del polipéptido de IL-6 humana nativa. En una modalidad de la invención, el epítopo de IL-6 comprende o de manera alternativa consiste en uno o más residuos comprendidos en fragmentos de IL-6 que se seleccionan de aquellos que respectivamente comprenden residuos de aminoácidos 37-51, residuos de aminoácidos 70-84, residuos de aminoácidos 169-183, residuos de aminoácidos 31-45 y/o residuos de aminoácidos 58-72.
La invención también se refiere a un anticuerpo anti-IL-6 que se une al mismo epítopo de IL-6 y/o compite con un anticuerpo anti-IL-6 para la unión a IL-6 como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en la presente incluyendo, de modo no taxativo, un anticuerpo anti-IL-6 seleccionado de Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 que preferentemente están aglicosilados .
En otra modalidad, la invención también se refiere a un anticuerpo anti-IL-6 aislado o fragmento del anticuerpo o variante del mismo que comprende una o más de las CDR contenidas en las secuencias de polipéptidos VH que comprenden: SEQ ID NO: 3, 18, 19, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 117, 118, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 668, 672, 676, 680,; 684, 688, 691, 692, 704 o 708; y una o más de las CDR contenidas en la secuencia de polipéptidos VL que consiste en: SEQ ID NO: 2, 20, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 119, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 647, 651, 660, 666, 667, 671, 675, 679, 683, 687, 693, 699, 702, 706 o 709 y las secuencias de VH o VL descritas en las alineaciones de anticuerpo comprendidas en las Figuras 34-37 de la presente solicitud.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 descrito en los dos párrafos anteriores comprende al menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligera variable y pesada variable, que son idénticas a las contenidas en un anticuerpo anti-IL-6 que comprenden Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 que preferentemente están aglicosilados .
En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 descrito anteriormente comprende al menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligera variable y pesada variable, que son idénticas a las contenidas en Abl. En otra modalidad, todas las CDR del anticuerpo anti-IL-6 descrito anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDR del anticuerpo mencionado anteriormente) que se unen específicamente a IL-6 que preferentemente están aglicosilados . En una modalidad preferida de la invención, todas las CDR del anticuerpo anti-IL-6 descrito anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en Abl, por ej . , un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL comprendidas en las SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709, respectivamente .
La invención contempla adicionalmente que uno o más anticuerpos anti-IL-6 descritos anteriormente están aglicosilados; contienen una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, semivida, proteólisis y/o glicosilación; son humanos, humanizados, de cadena simple o quiméricos; y son anticuerpos humanizados derivados de un anticuerpo anti-IL-6 de conejo (principal). Los ejemplos de regiones constantes que permiten la producción de anticuerpos aglicosilados en Pichia se encuentran comprendidos en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586 que están codificadas, respectivamente, por las secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 589 y la SEQ ID NO: 587.
La invención contempla además uno o más anticuerpos anti-IL-6 donde las regiones flanqueantes (FR) en la región ligera variable y en las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo son respectivamente FR humanas que no están modificadas o que fueron modificadas por la sustitución de como mucho 2 o 3 residuos de FR humana en la región ligera o pesada variable con los residuos de FR correspondientes del anticuerpo de conejo principal y donde las FR humanas se derivan de secuencias de anticuerpo de cadena pesada y ligera variables que han sido seleccionadas de una biblioteca de secuencias de anticuerpo germinales humanas basándose en su alto nivel de homología con las correspondientes regiones de cadena pesada o ligera variables de conejo relativas a otras secuencias de anticuerpo germinales humanas contenidas en la biblioteca.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento o variante del mismo se puede unir específicamente a células humanas que expresan IL-6 y/o a moléculas de IL-6 solubles circulantes in vivo, que incluyen IL-6 expresada en o mediante células humanas en un paciente con una enfermedad asociada con células que expresan IL-6.
En otra modalidad, la enfermedad se selecciona de fatiga general, fatiga inducida por ejercicio, fatiga relacionada con cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, fibromialgia, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal, caquexia relacionada con la edad, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriática, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedades de injerto versus huésped (GVHD)", síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil sistémica, osteoartritis , osteoporosis , enfermedad ósea de Paget, osteoartritis, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de células renales, enfermedad de Castleman multicéntrica, cáncer de ovario, resistencia a los fármacos en quimioterapia contra el cáncer, toxicidad de quimioterapia contra el cáncer, enfermedad cardíaca isquémica, ateroesclerosis, obesidad, diabetes, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia por inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con una enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis , insuficiencia cardíaca aguda, síndrome metabólico, aborto espontáneo, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, rechazo de transplante, enfermedad injerto contra huésped (GVHD) , influenza aviar, viruela, influenza pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS) , síndrome respiratorio agudo severo (SARS), sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) . En una modalidad preferida, la enfermedad se selecciona de cáncer, trastorno inflamatorio, trastorno viral o trastorno autoinmune. En una modalidad particularmente preferida, la enfermedad es artritis, caquexia y síndrome consuntivo.
La invención contempla además anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos o variantes del mismo unidos directa o indirectamente a un agente terapéutico o etiqueta detectable.
La invención también contempla una o más. secuencias de ácido nucleico que dan como resultado la expresión de un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo o variante del mismo, tal como se describe anteriormente incluyendo aquellas que comprenden o, alternativamente, consisten en levadura o codones humanos preferidos. La invención también contempla vectores (incluidos plásmidos o vectores virales recombinantes) que comprenden dicha/s secuencia/s de ácido nucleico. La invención también contempla células hospedadoras o células hospedadoras recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos mencionados anteriormente, incluyendo células de mamífero, de levadura, bacterianas y de insectos. En una modalidad preferida, la célula hospedadora es una célula de levadura. En una modalidad preferida, la célula de levadura es una célula de levadura diploide. En una modalidad más preferida, la célula de levadura es una levadura Pichia.
La invención también contempla un método de tratamiento que comprende administrar a un paciente que padece una enfermedad o afección asociada con células que expresan IL-6, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-IL 6 o fragmento o variante del mismo. Las enfermedades que se pueden tratar se presentan en la lista no taxativa a continuación. En una modalidad preferida, la enfermedad se selecciona de cáncer, enfermedad autoinmunitaria o afección inflamatoria. En una modalidad particularmente preferida, la enfermedad es cáncer o infección viral. En otra modalidad, el tratamiento incluye además la administración de otro agente o régimen terapéutico seleccionado de quimioterapia, radioterapia, administración de citocinas o terapia génica.
La invención contempla además un método de imagenologia in vivo que detecta la presencia de células que expresan IL-6, que comprende administrar una cantidad eficaz para el diagnóstico de al menos un anticuerpo anti-IL-6. En una modalidad, dicha administración incluye además la administración de un radionúclido o fluoróforo que facilita la detección del anticuerpo en los sitios de la enfermedad que expresan IL-6. En otra modalidad de la invención, el método de imagenologia in vivo se usa para detectar tumores o metástasis que expresan IL-6 o para detectar la presencia de sitios de trastornos autoinmunitarios asociados con las células que expresan IL-6. En una modalidad adicional, los resultados de dicho método de imagenologia in vivo se usan para facilitar el diseño de un régimen terapéutico apropiado que incluye regímenes terapéuticos incluyendo radioterapia, quimioterapia o una combinación de los mismos .
Actividad anti-IL-6 Tal como se estableció previamente, la IL-6 es un miembro de la familia de las citocinas que promueven las respuestas celulares a través de un complejo de receptores que consiste en al menos una subunidad de la glicoproteína transductora de señales gpl30 y el receptor IL-6 (IL-6R) . La IL-6R puede también estar presente en forma soluble (sIL-6R) . La IL-6 se une a la IL-6R, que luego dimeriza el receptor transductor de señales gpl30.
Se cree que los anticuerpos anti-IL-6 de la invención, o fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, son útiles al presentar actividad anti-IL-6. En una modalidad no limitante de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la invención o los fragmentos o variantes de unión a la IL-6 de los mismos, presentan actividad anti-IL-6 mediante la unión con IL-6 que puede ser IL-6 soluble o IL-6 expresadas en la superficie celular y/o pueden prevenir o inhibir la unión a IL-6 con IL-6R y/o la activación (dimerización) de la glicoproteina transductora de señales gpl30 y la formación de multimeros IL-6/IL-6R/gpl30 y los efectos biológicos de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos anti-IL-6 en cuestión pueden poseer distintas actividades antagonistas según dónde (esto es, epitopo) el anticuerpo particular se une a IL-6 y/o cómo afecta la formación de los complejos y/o multimeros anteriores y los efectos biológicos de los mismos. Como consecuencia, diferentes anticuerpos . anti-IL-6 de acuerdo con la invención, por ej . , pueden ser más adecuados para prevenir o tratar afecciones que involucren la formación y acumulación de IL-6 soluble sustancial tal como artritis reumatoide mientras que otros anticuerpos pueden ser favorables en tratamientos donde la prevención de IL-6/IL-6R/gpl30 o multimeros IL-6/IL-6R/gpl30 es el resultado terapéutico que se desea. Esto puede determinarse en ensayos de unión y otros.
La actividad anti-IL-6 del anticuerpo anti-IL-6 de la presente invención y fragmentos y variantes del mismo que poseen especificidad de unión a IL-6 también se puede describir por su fuerza de unión o su afinidad por IL-6. Esto también puede afectar sus propiedades terapéuticas. En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención y fragmentos de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6, se unen a IL-6 con una constante de disociación (KD) menor o igual a 5xl0~\ 10~\ 5xl0~8, 1CT8, 5xl0"9, 10~9, 5xl0"10, 10"10, 5x10" u, 10"u, 5xl0~12, 1CT12, 5xl0'13, 10"13, 5xl0"14, 10'", 5xl0"15 o 10"15. Preferentemente, los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos y variantes de los mismos se unen a IL-6 con una constante de disociación menor o igual a 5x10 •10 En otra modalidad de la invención, la actividad anti-IL-6 de los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención y fragmentos y variantes de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6, se unen a IL-6 con una tasa de disociación menor o igual a 10"4 S"1, 5xl0"5 S"1, 10"5 S"1, 5xl0~6 S"1, 10"6 S"1, 5xl0"7 S"1, o 10~7 S"1. En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención y fragmentos y variantes de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6, se unen a un epitopo lineal o conformacional de IL-6.
En una modalidad adicional de la invención, la actividad anti-IL-6 de los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención y fragmentos y variantes de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6, presentan la actividad anti-IL-6 mediante la mejora o reducción de los síntomas de, o que de manera alternativa tratan o previenen enfermedades y trastornos asociados con IL-6. Se establecen más adelante ejemplos no limitantes de las enfermedades y trastornos asociados con IL-6. Tal como se observa, la fatiga relacionada con cáncer, caquexia y artritis reumatoide son indicaciones preferidas para los anticuerpos anti-IL-6 en cuestión.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL 6 descritos en la presente o fragmentos y variantes de unión IL-6 de los mismos no poseen especificidad de unión por IL-6R la glicoproteína transductora de señales gp-130.
Análisis y aislamiento da linfocitos B En una modalidad, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno que pueden usarse para aislar al menos una célula específica para antígeno. Tal como se describe y ejemplifica más adelante, estos métodos contienen una serie de etapas de cultivo y selección que pueden ser usadas por separado, en combinación, de manera secuencial, repetitiva o periódica. Preferentemente, estos métodos se usan para aislar al menos una célula específica para antígeno que puede usarse para producir un anticuerpo monoclonal que es especifico para un anticuerpo deseado o una secuencia de ácido nucleico que se corresponde con tal anticuerpo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método que comprende las etapas de: a. preparar una población celular que comprende al menos un linfocito B especifico para antigeno; b. enriquecer la población celular, por ej . , por cromatografía, para formar una población celular enriquecida que comprende al menos un linfocito B específico para antígeno; c. aislar el linfocito B simple a partir de la población de linfocitos B enriquecidos; y d. determinar si el linfocito B simple produce un anticuerpo específico para el antígeno.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una mejora para un método para aislar un linfocito B simple, productor de anticuerpos, esta mejora comprende enriquecer una población de linfocitos B obtenida a partir de un hospedador que fue inmunizado o naturalmente expuesto a un antígeno, donde la etapa de enriquecer precede la etapa de selección, comprende al menos una etapa de cultivo y trae como resultado una población clonal de linfocitos B que producen un anticuerpo monoclonal simple específico para dicho antígeno.
A lo largo de esta solicitud, una "población clonal de linfocitos B" se refiere a una población de linfocitos B que solo secreta un único anticuerpo específico para un antígeno deseado. Esto es que estas células producen solamente un tipo de anticuerpo monoclonal específico para el antígeno deseado.
En la presente solicitud, "enriquecer" una población celular significa aumentar la frecuencia de células deseadas, típicamente células específicas para antígeno, contenidas en una población celular mixta, por ej . , un aislamiento que contiene linfocitos B derivados a partir de un hospedador que se inmuniza contra un antígeno deseado. Por tanto, una población celular enriquecida comprende una población celular que posee una mayor frecuencia de células específicas para antígeno como resultado de una etapa de enriquecimiento, pero esta población celular puede contener y producir diferentes anticuerpos.
El término general "población celular" comprende poblaciones celulares previas y posteriores al enriquecimiento, teniendo presente que cuando se llevan a cabo las etapas de múltiple enriquecimiento, una población celular puede ser previa o posterior al enriquecimiento. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona un método: a. que cultiva una población celular a partir de un hospedador inmunizado para obtener una población celular cultivada; b. que crea al menos una suspensión unicelular a partir de la población celular cultivada; c. que enriquece al menos una suspensión unicelular para formar una primera población celular enriquecida; d. que enriquece la primera población celular enriquecida para formar una segunda población celular enriquecida; e. que enriquece la segunda población celular enriquecida para formar una tercera población celular enriquecida y; f. que selecciona un anticuerpo producido por una célula específica para antígeno' de la tercera población celular enriquecida .
Cada población celular puede usarse directamente en la próxima etapa o puede congelarse parcial o totalmente para almacenamientos a corto o largo plazo o para etapas posteriores. Además, las células de una población celular pueden suspenderse individualmente para proporcionar suspensiones unicelulares. La suspensión unicelular puede enriquecerse en tal medida que una suspensión unicelular sirva como la población celular previa al enriquecimiento. Entonces, una o más de las suspensiones unicelulares específicas para el antígeno forman conjuntamente la población celular enriquecida; las suspensiones unicelulares específicas para el antígeno pueden agruparse, por ej . , colocarse nuevamente en placas para su posterior análisis y/o producción de anticuerpos .
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para enriquecer una población celular para dar una población celular enriquecida que posee una frecuencia celular específica para el antígeno de entre alrededor de 50% y alrededor de 100% o aumentos de los mismos. Preferentemente, la población celular enriquecida posee una frecuencia celular específica para el antígeno mayor o igual a alrededor de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100%.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para enriquecer una población celular por la cual se aumenta la frecuencia de las células especificas para el antigeno al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, o aumentos de los mismos.
A lo largo de esta solicitud, el término "aumento" se usa para definir un valor numérico en mayor o menor grado de precisión, por ej . , lo más cerca posible a 10, 1, 0.1, 0.01, etc. El aumento se puede redondear a cualquier grado de precisión mensurable y el aumento puede no redondearse al mismo grado de precisión en ambos extremos de un rango. Por ejemplo, el rango de 1 a 100 o aumentos de los mismos varia tanto como 2 a 80, 5 a 50 y 0.4 a 98. Cuando un rango no tiene limite fijo, por ej . , un rango menor a 100, aumentos del mismo significa aumentos entre 100 y el limite mensurable. Por ejemplo,, menos de 100 o aumentos del mismo significa 0 a 100 o aumentos del mismo a menos que la propiedad, por ej . , la temperatura, no esté limitada por 0.
La especificidad para antigeno puede medirse con respecto a cualquier antigeno. El antigeno puede ser cualquier sustancia a la que pueda unirse un anticuerpo que incluye pero no se limita a, péptidos, proteínas o fragmentos de los mismos, carbohidratos; moléculas orgánicas e inorgánicas; receptores producidos por células animales, células bacterianas y virus; enzimas; agonistas y antagonistas de las rutas biológicas; hormonas; y citocinas. Ejemplos de antígenos incluyen de modo no taxativo IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13 , ??-10, VEGF, ???, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y Hepcidina. Los antigenos preferidos incluyen IL-6, IL-13, TNF-alfa, VEGF-alfa, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y Hepcidina. En un método que utiliza más de una etapa de enriquecimiento, el antigeno usado en cada etapa de enriquecimiento puede ser el mismo o diferente en cada etapa. Las múltiples etapas de enriquecimiento con el mismo antigeno pueden dar una población grande y/o diversa de células especificas para antigeno; las múltiples etapas de enriquecimiento con distintos antigenos pueden dar un población celular enriquecida con especificidad cruzada para los diferentes antigenos.
El enriquecimiento de una población celular puede llevarse a cabo por cualquier medio de selección celular conocido en la técnica para el aislamiento de células especificas para antigeno. Por ejemplo, una población celular puede enriquecerse por medio de técnicas cromatográficas , por e . , tecnología de cuentas Miltenyi o cuentas magnéticas. Las cuentas pueden unirse directa o indirectamente al antígeno de interés. En una modalidad preferida, el método de enriquecimiento de una población celular incluye al menos una etapa de enriquecimiento cromatográfica .
Una población celular también puede enriquecerse por cualquier técnica de ensayo de especificidad para antigeno conocida en la técnica, por ej . , un ensayo ELISA o ensayo de halógeno. Ensayos ELISA incluyen, de modo no taxativo, la inmovilización selectiva de antígenos (por ej . , captura de antígeno biotinilado por placas revestidas con estreptavidina, avidina o neutravidina) , revestimiento de placa para antigeno no especifico y a través de una estrategia de concentración de antigeno (por ej . , captura de antigeno selectivo seguido de la adición de un compañero de unión para generar un complejo heteromérico proteina-antigeno) . El antigeno puede estar unido directa o indirectamente a una matriz o soporte sólido, por ej . una columna. Un ensayo de halógeno comprende contactar las células con cuentas cargadas con antigeno y el anticuerpo anti-hospedador marcado especifico para el hospedador usado para el cultivo de linfocitos B. La marca puede ser, por ej . , fluoróforo. En una modalidad, al menos una etapa de enriquecimiento del ensayo se realiza en al menos una suspensión unicelular. En otra modalidad, el método de enriquecimiento de una población celular incluye al menos una etapa de enriquecimiento cromatográfico y al menos una etapa de enriquecimiento del ensayo.
Se conocen en la técnica métodos de "enriquecimiento" de una población celular por tamaño o densidad. Véase, por ej . , Patentes estadounidense 5,627,052. Estas etapas pueden usarse en el presente método adicionalmente para enriquecer la población celular por especificidad del antigeno.
Las poblaciones celulares de la presente invención contienen al menos una célula capaz de reconocer un antigeno. Las células que reconocen antigenos incluyen, de modo no taxativo, linfocitos B, células plasmáticas y progenies de las mismas. En una modalidad, la presente invención proporciona una población celular clonal que contiene un único tipo de linfocitos B específicos para antígeno, esto es, la población celular produce un anticuerpo monoclonal simple específico para un antígeno deseado .
En tal modalidad, se cree que la población clonal específica para antígeno de linfocitos B consiste predominantemente de células específicas para antígeno, células que secretan anticuerpos que se obtienen por medio del nuevo cultivo y el protocolo de selección provisto en la presente. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para la obtención de una población celular enriquecida que contiene al menos una célula específica para antígeno y que secreta un anticuerpo. En una modalidad, la presente invención proporciona una población celular enriquecida que contiene alrededor de 50% a alrededor de 100%, o aumentos de los mismos, o más de o igual a alrededor de 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de células especificas para antígeno y que secretan un anticuerpo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para aislar un linfocito B simple enriqueciendo una población celular obtenida a partir de un hospedador antes de las etapas de selección, por ej . , seleccionar un linfocito B particular de una población celular y/o seleccionar un anticuerpo producido por una célula particular. La etapa de enriquecimiento puede realizarse en una, dos, tres o más etapas. En una modalidad, se aisla un linfocito B simple a partir de una población celular enriquecida antes de confirmar si el linfocito B simple secreta un anticuerpo con especificidad de antigeno y/o una propiedad deseada.
En una modalidad, un método para enriquecer una población celular se usa en un método para la producción y/o selección de anticuerpos. Por tanto, la presente invención proporciona un método que comprende enriquecer una población celular antes de seleccionar un anticuerpo. El método puede incluir las etapas de: preparar una población celular que comprende al menos una célula especifica para antigeno, enriquecer la población celular mediante el aislamiento de al menos una célula especifica para antigeno para formar una población celular enriquecida, e inducir la producción de anticuerpos a partir de al menos una célula especifica para antigeno. En una modalidad preferida, la población celular enriquecida contiene más de una célula especifica para antigeno. En una modalidad, cada célula especifica para antigeno de la población enriquecida se cultiva en condiciones que proporcionen una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno antes de aislar una célula que produce anticuerpos de estos y/o de producir un anticuerpo que usa dicho linfocito B o una secuencia de ácido nucleico que corresponde a ese anticuerpo. A diferencia de técnicas previas donde los anticuerpos se producen a partir de una población celular con una baja frecuencia de células específicas para antígeno, la presente invención permite la selección de anticuerpos de entre una alta frecuencia de células especificas para antígeno. Debido a que se usa una etapa de enriquecimiento previo a la selección de anticuerpos, la mayoría de las células, preferente y virtualrnente todas las células, usadas para la producción de anticuerpos son especificas para antigeno. Mediante la producción de anticuerpos a partir de una población de células con una frecuencia aumentada de especificidad de antigeno, la cantidad y variedad de anticuerpos aumenta.
En los métodos de selección de anticuerpos de la presente invención, se selecciona preferentemente un anticuerpo luego de las etapas de enriquecimiento y cultivo que da como resultado una población clonal de linfocito5 B específicos para antigeno. Los métodos pueden comprender adicionalmente una etapa de determinar la secuencia de un anticuerpo seleccionado o porciones de este a partir de una o más células especificas para antigeno aisladas. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para determinar secuencias y este puede incluir determinar la secuencia de la cadena pesada, cadena ligera, región/es variables/s y/o región/es determinante/s de complementariedad (CDR) .
Además de la etapa de enriquecimiento, el método de selección de anticuerpos también puede incluir una o más etapas de análisis de la población celular para reconocimiento de antígenos y/o funcionalidad del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos deseados pueden tener características estructurales específicas, tal como unión a un epítopo particular o mimetismo de una estructura particular; actividad antagonista o agonista o actividad neutralizante, por ej . , inhibir la unión entre el antígeno y un ligando. En una modalidad, el análisis de la funcionalidad del anticuerpo depende del ligando.; El análisis de la funcionalidad del anticuerpo incluye pero no se limita a, un ensayo de interacción proteina-proteina in vitro¡ que recrea la interacción natural del ligando antigeno con la proteina recombinante receptora; y una respuesta con base en la célula que depende del ligando y se monitorea fácilmente (por ej . , respuesta de proliferación) . En una modalidad, el método para la selección de anticuerpos incluye una etapa de análisis de la población celular para la funcionalidad del anticuerpo mediante la medición de la concentración inhibitoria (IC50) . En una, modalidad, al menos una de las células aisladas especificas para antigeno produce un anticuerpo con un IC50 menor a aproximadamente 100, 50, 30, 25, 10 pg/mL o aumentos de los mismos.
Además de la etapa de enriquecimiento, I el método de selección de anticuerpos también puede incluir uria o más etapas de análisis de la población celular para la fuerza de unión al anticuerpo. La fuerza de unión al anticuerpo puede medirse por cualquier método conocido en la técnica (por ej . Biacore™) . En una modalidad, al menos una de las células aisladas y especificas para antigeno produce un anticuerpo que posee una elevada afinidad al antigeno, por ej . , una constante de disociación (Kd) menor a aproximadamente 5xl0~10 M-l, preferentemente alrededor de entre lxlO"13 y 5xl0"10, lxlO"12 y lxlO"10, lxlO"12 y 7 5xl0"u, lxlO-11 y 2xl0~u, alrededor de 1.5?10"? o menos, o aumentos de los mismos . En esta modalidad, se dice que los anticuerpos son de afinidad madura. En una modalidad preferida, la afinidad de los anticuerpos se puede comparar con o es mayor que la afinidad de cualquiera de Panorex® (edrecolomab) , Rituxan® (rituximab) , Herceptin® (traztuzumab) , ylotarg® (gentuzumab) , Campath® (alemtuzumab) , Zevalin™ (ibritumomab) , Erbitux™ (cetuximab) , Avastin™ (bevicizumab) , Raptiva™ (efalizumab) , Remicade® (infliximab) , Humira™ (adalimumab) y Xolair™ (omalizumab) . Preferentemente, la afinidad de los anticuerpos se puede comparar o es mayor que la afinidad de Humira™. La afinidad de un anticuerpo también puede aumentarse por medio de técnicas de maduración de afinidad conocidas. En una modalidad, se analiza al menos una población celular para determinar, al menos una, preferentemente ambas, la funcionalidad del anticuerpo y la fuerza de unión al antígeno.
Además de la etapa de enriquecimiento, el método de selección de anticuerpos también puede incluir una o más etapas de análisis de la población celular para la homología de secuencia de anticuerpos, en especial homología en humanos. En una modalidad, al menos una de las células aisladas y específicas para antígeno produce un anticuerpo que posee homología con un anticuerpo humano de alrededor de 50% a alrededor de 100%, o aumentos de los mismos, o más que alrededor de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95% homólogos. Los anticuerpos pueden humanizarse para aumentar la homología con una secuencia humana mediante técnicas conocidas en el arte tal como injerto de CDR o injerto de residuo determinante de selectividad (SDR) .
En otra modalidad, la presente invención también proporciona los anticuerpos mismos de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas anteriormente en cuanto a IC50, d y/o homología.
El protocolo de selección de linfocitos B descrito en la presente tiene varias ventajas intrínsecas con respecto a otros métodos para la obtención de linfocitos B que secretan anticuerpos y anticuerpos monoclonales específicos para los antígenos objetivo deseados. Estas ventajas incluyen, de modo no taxativo, las siguientes: Primero, se ha descubierto que cuando se utilizan estos procedimientos de selección con un antígeno deseado tal como IL-6 o TNF-alfa, estos métodos traen como resultado, de manera reproducible, linfocitos B específicos para antígeno capaces de generar lo que parece ser un complemento sustancialmente integral para los anticuerpos, esto es, anticuerpos que se unen a distintos epítopos del antígeno. Sin limitarse a la teoría, se plantea la hipótesis de que el complemento integral es atribuible a la etapa de enriquecimiento del antígeno que se realiza antes de la recuperación del linfocito B inicial. Además, esta ventaja permite el aislamiento y la selección de anticuerpos con diferentes propiedades ya que estas propiedades pueden variar dependiendo de la especificidad epitópica del anticuerpo particular .
Segundo, se ha descubierto que el protocolo de selección de linfocitos B produce de manera reproducible un cultivo clonal de linfocitos B que contiene un linfocito B simple o su progenie, secretando un anticuerpo monoclonal simple que en general se une al antígeno deseado con una afinidad de unión relativamente alta, esto es, afinidades de unión al antigeno picomolares o mejores. En cambio, los métodos anteriores de selección de anticuerpos tienden a producir pocos anticuerpos de alta afinidad y por lo tanto requieren de procedimientos de análisis exhaustivo para aislar un anticuerpo con potencial terapéutico. Sin limitarse a la teoría, se plantea la hipótesis de que el protocolo trae como resultado la inmunización in vivo de linfocitos B del hospedador (inmunización primaria) seguida de una segunda estimulación in vitro de linfocitos B (etapa secundaria de cebado del antígeno) que puede mejorar la capacidad y la propensión de los linfocitos B clónales recuperados para secretar un anticuerpo monoclonal simple de alta afinidad específico para el antígeno objetivo.
Tercero, se ha observado (tal como se muestra en la presente con linfocitos B específicos para IL-6) que el protocolo de selección de linfocitos B produce de manera reproducible linfocitos B enriquecidos que producen IgG que son, en promedio, altamente selectivos (específico para antígeno) del objetivo deseado. Se cree que los linfocitos B enriquecidos por antígeno recuperados por estos métodos contienen linfocitos B capaces de producir el complemento total deseado de especificidades epitópicas tal como se discute anteriormente.
Cuarto, se ha observado que los protocolos de selección de linfocitos B, aun cuando usados con antígenos pequeños, esto es, péptidos de 100 aminoácidos o menos, por ej . , 5-50 aminoácidos de largo, genera de manera reproducible un cultivo clonal de linfocitos B que secreta un único anticuerpo de alta afinidad al antigeno pequeño, por ej . , un péptido. Esto causa sorpresa ya que en general es bastante difícil y cuesta mucho trabajo y a veces no es posible producir anticuerpos de alta afinidad por péptidos pequeños. Por consiguiente, se puede usar la invención para producir anticuerpos terapéuticos a los objetivos péptidos deseados, por ej . , péptidos virales, bacterianos ó autoantígenos y de esta manera permite la producción de anticuerpos monoclonales con propiedades de unión muy específicas o aun la producción de un cóctel de anticuerpos monoclonales para diferentes objetivos péptidos, por ej . , diferentes cepas virales. Esta ventaja puede ser útil especialmente en el contexto de la producción de una vacuna terapéutica o profiláctica que posee la valencia deseada, tal como una vacuna contra el HPV que induce la inmunidad protectora para distintas cepas del HPV.
Quinto, el protocolo de selección de linfocitos B, en particular cuando se usa con linfocitos B derivados de conejos, tiende a producir de manera reproducible secuencias de anticuerpos específicos para antígeno que son muy similares a las inmunoglobulinas humanas endógenas (alrededor de 90% similar al nivel de aminoácidos) y que contienen CDR que poseen una longitud muy similar a las inmunoglobulinas humanas y por lo tanto requieren poca o ninguna modificación de secuencias (típicamente a lo sumo solo unos pocos residuos de CDR pueden modificarse en la secuencia de anticuerpo principal y no se introducen residuos exógenos flanqueantes) para poder eliminar posibles problemas de inmunogenicidad potencial. En particular, preferentemente el anticuerpo recombinante contendrá solo los residuos CDR1 y CDR2 del hospedador (conejo) requeridos para el reconocimiento del antígeno y la totalidad de CDR3. De ese modo, la alta afinidad de unión al antígeno de las secuencias de anticuerpo recuperadas producidas de acuerdo con el protocolo de selección de linfocitos B y anticuerpos permanece intacta o sustancialmente intacta aun con humanización.
En resumen, estos métodos pueden usarse para producir anticuerpos que exhiben mayores afinidades de unión con epítopos más distintos por el uso de un protocolo más eficaz que el ya conocido .
En una modalidad especifica, la presente invención proporciona un método para identificar un linfocito B simple que secreta un anticuerpo específico para un antígeno deseado y que opcionalmente posee al menos una propiedad funcional deseada tal como afinidad, avidez, actividad citolítica y similares, por medio de un proceso que incluye las siguientes etapas: a. inmunizar un hospedador contra un antígeno; b. cultivar linfocitos B del hospedador; c. enriquecer los linfocitos B cultivados para aumentar la frecuencia de las células específicas para antígeno; d. crear al menos una suspensión unicelular; e. cultivar una subpoblación a partir de la suspensión unicelular en condiciones que favorecen la supervivencia de un único linfocito B específico para antígeno por pocilio de cultivo; f. aislar linfocitos B de la subpoblación; y g. determinar si el linfocito B simple produce un anticuerpo especifico para el antigeno.
Típicamente, estos métodos comprenderán adicionalmente una etapa adicional de aislamiento y determinación de secuencia, parcial o total, de las secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo deseado. Estas secuencias o versiones modificadas o porciones de las mismas pueden expresarse en células hospedadoras deseadas para producir anticuerpos recombinantes a un antigeno deseado.
Tal como se observó anteriormente, se cree que la población clonal de linfocitos B comprende predominantemente linfocitos B que secretan anticuerpos que producen un anticuerpo contra el antígeno deseado. También se cree, basándose en resultados experimentales obtenidos con diversos antígenos y con diferentes poblaciones de linfocitos B, que los linfocitos B producidos por clonación y los linfocitos B aislados específicos para antígeno derivados de estos, producidos de acuerdo con la invención, secretan un anticuerpo monoclonal que típicamente tiene afinidad relativamente alta y además es capaz de producir eficazmente y de manera reproducible una selección de anticuerpos monoclonales de mayor variabilidad epitópica en comparación con otros métodos de derivación de anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos B cultivados específicos para antígeno. En un ejemplo de modalidad, la población de células inmunes usada en dichos métodos de selección de linfocitos B proviene de un conejo. Sin embargo, otro hospedador que produce anticuerpos incluyendo hospedadores no humanos y humanos, puede de manera alternativa ser usado como fuente de linfocitos B inmunes. Se cree que el uso de conejos como fuente de linfocitos B puede mejorar la diversidad de los anticuerpos monoclonales que pueden originarse por medio de estos métodos. También, las secuencias de anticuerpos derivados de conejos de acuerdo con la invención, poseen típicamente secuencias con un alto grado de identidad de secuencia con secuencias de anticuerpos humanos haciéndolas favorables para su uso en humanos dado que deberían poseer baja antigenicidad . En el transcurso de la humanización, el anticuerpo humanizado final posee un contenido mucho menor de residuo extraño/hospedador , normalmente restringido a un subgrupo de los residuos CDR del hospedador que difieren dramáticamente debido a su naturaleza contra la secuencia objetivo humana usada en injertos. Esto mejora la probabilidad de recuperación completa de actividad en la proteína del anticuerpo humanizada.
Los métodos de selección de anticuerpos que usan una etapa de enriquecimiento descrito en la presente incluyen una etapa para la obtención de una población celular que contiene células inmunes a partir de un hospedador inmunizado. Los métodos para la obtención de una población celular que contiene células inmunes a partir de un hospedador inmunizado son conocidos en la técnica y en general incluyen inducir una respuesta inmune en un hospedador y cultivar células a partir del hospedador para obtener una o más poblaciones celulares. La respuesta puede provocarse mediante la inmunización del hospedador contra un antígeno deseado. De manera alternativa, el hospedador usado como origen de tales células inmunes puede exponerse naturalmente al antigeno deseado tal como un individuo que fue infectado con un patógeno particular tal como una bacteria o virus o de manera alternativa ha montado una respuesta de anticuerpo especifica para el cáncer sufrido por el individuo .
Los animales hospedadores son bien conocidos en la técnica e incluyen, de modo no taxativo, cobayos, conejos, ratones, ratas, primates no humanos, humanos, asi como otros mamíferos y roedores, pollos, vacas, cerdos, cabras y ovejas. Preferentemente el hospedador es un mamífero, más preferentemente, un conejo, ratón, rata o humano. Al exponerse a un antígeno, el hospedador produce anticuerpos como parte de la respuesta inmune nativa al antígeno. Tal como se mencionó, la respuesta inmune puede ser de origen natural, como resultado de una enfermedad o puede ser inducida por la inmunización con el antígeno. La inmunización puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica, tal como, por una o más inyecciones del antígeno con o sin un agente para mejorar la respuesta inmune, tal como un adyuvante de Freund completo o incompleto. En otra modalidad, la invención también contempla la inmunización intraesplénica . Como una alternativa para inmunizar un animal hospedador in vivo, el método puede comprender inmunizar un cultivo de células hospedadoras in vitro.
Luego de permitir tiempo a la respuesta inmune (por ej . , según las mediciones de la detección de anticuerpos de suero) , células hospedadoras de animales se cultivan para obtener una o más poblaciones celulares. En una modalidad preferida, se analiza una población celular cultivada para determinar la fuerza de unión al anticuerpo y/o funcionalidad de anticuerpo Una población celular cultivada es preferentemente de al menos uno de bazo, nodulos linfáticos, médula ósea y/o células mononucleares de sangre periférica (PB C) . Las células pueden cultivarse a partir de más de una fuente y acumularse. Se pueden preferir algunas fuentes para ciertos antigenos. Por ejemplo, se prefiere el bazo, nodulos linfáticos y PBMC para IL-6; y se prefieren los nodulos linfáticos para TNF. La población celular se cultiva durante alrededor de 20 a alrededor de 90 dias o aumentos de los mismos luego de la inmunización, preferentemente durante alrededor de 50 a alrededor de 60 dias. Una población celular cultivada y/o una suspensión unicelular de la misma se puede enriquecer, analizar y/o cultivar para la selección de anticuerpos. La frecuencia de células especificas para antigeno dentro de una población celular cultivada es normalmente alrededor de 1% a alrededor de 5% o aumentos de los mismos.
En una modalidad, una suspensión unicelular de una población celular cultivada se enriquece, preferentemente usando cuentas Miltenyi. A partir de la población celular cultivada con una frecuencia de células especificas para antigeno de alrededor de 1% a alrededor de 5%, se deriva una población celular enriquecida con una frecuencia de células especificas para antigeno que se acerca al 100%.
El método de selección de anticuerpos usando una etapa de enriquecimiento incluye una etapa de producción de anticuerpos de al menos una célula específica para antígeno dé una población celular enriquecida. Los métodos de producción de anticuerpos in vitro son bien conocidos en la técnica y puede usarse cualquier método adecuado. En una modalidad, una población celular enriquecida, tal como una suspensión unicelular específica para antígeno de una población celular cultivada, se colocó en placas a diversas densidades celulares, tal como 50, 100, 250, 500 u otros aumentos entre 1 y 1000 células por pocilio. Preferentemente, la subpoblación comprende no más de alrededor de 10,000 células que secretan anticuerpos específicas para antígeno, más preferentemente alrededor de 50-10,000, alrededor de 50-5,000, alrededor de 50-1,000, alrededor de 50-500, alrededor de 50-250 células que secretan anticuerpos específicas para antígeno o aumentos de los mismos. Entonces, se cultivan estas subpoblaciones con un medio adecuado (por ej . , un medio acondicionado de linfocitos T activado, en particular 1-5% de un medio acondicionado de linfocitos T de conejo activado) en una capa de alimentación, preferentemente en condiciones que favorecen la supervivencia de una única célula de proliferación que secreta anticuerpos por pocilio de cultivo. La capa de alimentación, que en general comprende material celular irradiado, por ej . , células EL4B, no constituye parte de la población celular. Las células se cultivan en un medio adecuado por un período suficiente para la producción de anticuerpos, por ejemplo alrededor de 1 día a alrededor de 2 semanas, alrededor de 1 día a alrededor de 10 días, al menos alrededor de 3 días, alrededor de 3 a alrededor de 5 días, alrededor de 5 días a alrededor de 7 días, al menos alrededor de 7 días o aumentos de los mismos. En una modalidad, se cultiva simultáneamente más de una subpoblación . Preferentemente, sobrevive una célula simple que produce anticuerpos y progenie de esta en cada pocilio, proporcionando asi una población clonal de linfocitos B específicos para antigeno en cada pocilio. En esta etapa, la inmunoglobulina G (IgG) producida por la población clonal es altamente correlativa con la especificidad del antígeno. En una modalidad preferida, las IgG exhiben una correlación con la especificidad del antígeno que es mayor a alrededor del 50%, más preferentemente mayor al 70%, 85%, 90%, 95%, 99% o aumentos del mismo. Véase Figura 3 que muestra un ejemplo de correlación para IL-6. Las correlaciones se mostraron colocando cultivos de linfocitos B en condiciones limitantes para establecer productos simples de anticuerpos específicos para antígeno por pocilio. Se compararon las síntesis específicas para antígeno con las de IgG generales. Se observaron tres poblaciones: una IgG que reconoció un formato simple de antígeno (revestimiento biotinilado y directo) , IgG detectable y reconocimiento de antígeno sin tomar en cuenta la inmovilización y producción de IgG únicamente. La producción de IgG fue altamente correlativa con la especificidad para antígeno.
Opcionalmente se recoge un sobrenadante que contiene anticuerpos que pueden enriquecerse, analizarse y/o cultivarse para la selección de anticuerpos de acuerdo con las etapas descritas anteriormente. En una modalidad, el sobrenadante se enriquece (preferentemente por medio de un ensayo de especificidad del antigeno, en especial un ensayo ELISA) y/o se analiza para determinar la funcionalidad del anticuerpo.
En otra modalidad, la población enriquecida, preferentemente clonal, de linfocitos B específicas para antígeno a partir de la cual se analiza opcionalmente un supernadante descrito anteriormente para detectar la presencia del anticuerpo monoclonal secretado deseado se utiliza para el aislamiento de unos pocos linfocitos B, preferentemente un linfocito B simple que luego se prueba en un ensayo apropiado para confirmar la presencia de un linfocito B simple que produce anticuerpos en la población clonal de linfocitos B. En una modalidad, se aislan alrededor de 1 a alrededor de 20 células a partir de la población de linfocitos B, preferentemente menos de alrededor de 15, 12, 10, 5, o 3 células, o aumentos de los mismos, más preferentemente una célula simple. El ensayo se efectúa preferentemente por un ensayo de especificidad del antígeno, en especial un ensayo de halógeno. El ensayo de halógeno se puede realizar con la proteína de longitud completa o un fragmento de esta. El sobrenadante que contiene anticuerpos puede también analizarse para determinar al menos uno de: afinidad de unión al antígeno; agonismo o antagonismo de la unión del ligando al antígeno, inducción o inhibición de la proliferación de un tipo celular objetivo específico; inducción o inhibición de la lisis de una célula objetivo e inducción o inhibición de una vía biológica que involucre el antígeno.
La célula identificada especifica para antigeno puede usarse para encontrar las correspondientes secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo monoclonal deseado. (Un compendio AluI puede confirmar que se produce solo un tipo de anticuerpo monoclonal simple por pocilio) . Tal como se mencionó anteriormente, estas secuencias pueden mutarse, tal como por humanización, para proporcionarlas de manera adecuada para su uso en medicamentos para humanos.
Tal como se mencionó anteriormente, la población de linfocitos B enriquecida usada en el proceso también puede enriquecerse, analizarse y/o cultivarse adicionalmente para la selección de anticuerpos de acuerdo con las etapas descritas anteriormente que pueden repetirse o realizarse en distinto orden. En una modalidad preferida, se aisla, cultiva y se usa para la selección de anticuerpos al menos una célula de una población celular enriquecida, preferentemente clonal y especifica para antigeno.
Por tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un método que comprende: a. cultivar una población celular a partir de un hospedador inmunizado que cultiva una población celular; b. crear al menos una suspensión unicelular a partir de una población celular cultivada; c. enriquecer al menos una suspensión unicelular, preferentemente por cromatografía, para formar una primera población celular enriquecida; d. enriquecer la primera población celular enriquecida, preferentemente por el ensayo ELISA, para formar una segunda población celular enriquecida que es preferentemente clonal, esto es, contiene solo un único tipo de linfocito B especifico para antigeno. e. enriquecer la segunda población celular enriquecida, preferentemente por el ensayo de halógeno, para formar una tercera población celular enriquecida que contiene uno o pocos linfocitos B que producen un anticuerpo especifico para un antigeno deseado; y f. seleccionar un anticuerpo producido por una célula especifica para antigeno aislada de la tercera población celular enriquecida.
El método puede adicionalmente incluir una o más etapas de análisis de la población celular cultivada para la fuerza de unión al anticuerpo (afinidad, avidez) y/o la funcionalidad del anticuerpo. Las etapas de análisis adecuado incluyen, de modo no taxativo, métodos de análisis que detectan: ya sea que el anticuerpo producido por el linfocito B identificado especifico para antigeno produce un anticuerpo que posee mínima afinidad de unión al antígeno, ya sea que el anticuerpo agoniza o antagoniza la unión de un antígeno deseado para el ligando; ya sea que el anticuerpo induce o inhibe la proliferación de un tipo celular específico; ya sea que el anticuerpo induce o provoca una reacción citolítica contra células objetivo; ya sea que el anticuerpo se une a un epítopo específico; y ya sea que el anticuerpo modula (inhibe o agoniza) via/s biológica/s especifica/s que involucren el antigeno.
De manera similar, el método puede adicionalmente incluir una o más etapas de análisis de la segunda población celular enriquecida para determinar la fuerza de unión al anticuerpo y/o la funcionalidad del anticuerpo.
El método puede adicionalmente incluir una etapa de secuenciar las secuencias de polipéptidos o la secuencia de ácido nucleico correspondiente del anticuerpo seleccionado. El método también puede incluir una etapa de producción de. un anticuerpo recombinante usando la secuencia, un fragmento de la misma o una versión genéticamente modificada del anticuerpo seleccionado. Los métodos para la mutación de secuencias de anticuerpos para retener las propiedades deseadas son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen humanización, quimerización, producción de anticuerpos de cadena simple; estos métodos de mutación pueden producir anticuerpos recombinantes que poseen la función efectora deseada, inmunogenicidad, estabilidad, eliminación o adición de glicosilación y similares. El anticuerpo recombinante puede producirse por una célula recombinante adecuada que incluye pero no se limita a células de mamífero tales como CHO, COS, BHK, HEK-293, células bacterianas, células de levadura, células vegetales, células de insecto y células anfibias. En una modalidad, los anticuerpos se expresan en células de levadura poliploides, esto es, células de levadura diploides, en particular Pichia.
En una modalidad, el método comprende: a. inmunizar un hospedador contra un antigeno para producir anticuerpos hospedadores de levadura; b. analizar los anticuerpos hospedadores para determinar la especificidad del antigeno y neutralización; b. cultivar linfocitos B del hospedador; d. enriquecer los linfocitos B cultivados para crear una población celular enriquecida con una frecuencia aumentada de células especificas para antigeno; e. cultivar una o más subpoblaciones de la población celular enriquecida en condiciones que favorecen la supervivencia de un linfocito B simple para producir una población clonal en al menos un pocilio de cultivo; f. determinar si la población clonal produce un anticuerpo especifico para el antigeno. g. aislar un linfocito B simple; y h. secuenciar la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo producido por el linfocito B simple.
Métodos de humanización de anticuerpos En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para la humanización de cadenas pesada y ligera de anticuerpos. En esta modalidad, se sigue el siguiente método para la humanización de cadenas pesada y ligera: Cadena ligera 1. Identificar el aminoácido que es el primero que le sigue a la secuencia de péptidos de señal. Este es el comienzo de la Región Flanqueante 1. El péptido de señales comienza en la primera metionina de iniciación y tiene típicamente, pero no necesariamente, 22 aminoácidos de longitud para las secuencias de proteínas de cadena ligera de conejo. El comienzo del polipéptido maduro también puede determinarse de manera experimental secuenciando la proteína N-terminal o se puede prever usando un algoritmo de previsión. Este también es el comienzo de la Región Flanqueante 1 tal como se suele definir por los expertos en la materia .
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVL 1 en la Figura 2, que comienza con "AYDM" . 2. Identificar el final de la Región Flanqueante 3. Este tiene típicamente 86-90 aminoácidos que siguen al comienzo de la Región Flanqueante 1 y es típicamente un residuo de cisteína precedido por dos residuos de tirosina. Este es el final de la Región Flanqueante 3 tal como se suele definir por los expertos en la materia.
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVL 88 en la Figura 2, que termina con "TYYC" . 3. Usar la secuencia de cadena ligera de conejo del polipéptido que comienza por el principio de la Región Flanqueante 1 hasta el final de la Región Flanqueante 3 tal como se definió anteriormente y realizar una búsqueda de homología de secuencias para las secuencias de proteínas de anticuerpos más similares. Esta búsqueda será típicamente contra secuencias germinales humanas previa a la maduración del anticuerpo para reducir la posibilidad de inmunogenicidad; sin embargo, se puede usar cualquier secuencia humana. Típicamente se puede usar un programa del estilo de BLAST para buscar en una base de datos de secuencias las más homologas. Las bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos pueden encontrarse en varias fuentes tales como NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) .
Ejemplo: La secuencia de aminoácidos RbtVL a partir de residuos numerados 1 a 88 en la Figura 2 se compara en BLAST con una base de datos de lineas germinales de anticuerpos humanos. Las únicas tres secuencias principales devueltas se muestran en la Figura 2 como L12A, VI y Vx02. 4. En general, la secuencia de cadena ligera variable de la linea germinal humana más homologa luego se usa como base de la humanización. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica pueden decidir usar otra secuencia que no fuera de mayor homología tal como lo determina el algoritmo de homología, basado en otros factores que incluyen espacios de secuencias y similitudes en la región flanqueante.
Ejemplo: En la Figura 2, L12A era la secuencia de cadena ligera variable de la linea germinal humana más homologa y se usa como base para humanización de RbtVL. 5. Determinar la Región Flanqueante y el arreglo de CDR (FR1, FR2, FR3, CDR1 y CDR2) para el homólogo humano usado para humanización de cadena ligera. Esto es, usar la distribución tradicional tal como se describe en la materia. Alinear la secuencia de cadena ligera variable de conejo con el homólogo humano, mientras se mantiene la distribución de las regiones flanqueantes y CDR.
Ejemplo: En la Figura 2, la secuencia RbtVL se alinea con la secuencia homologa humana L12A y se indican los dominios flanqueante y CDR. 6. Reemplazar las regiones CDRl y CDR2 de la secuencia de cadena ligera homologa humana con las secuencias de CDRl y CDR2 de la secuencia de conejo. Si existieran diferencias de longitud entre las secuencias de CDR humana y de conejo entonces usar la totalidad de las secuencias de CDR de conejo y sus longitudes. Es posible que la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultantes puedan no alterarse si se realizan intercambios de secuencias mayores o menores o si se alteran residuos específicos, sin embargo los intercambios tal como fueron descritos han sido usados exitosamente pero no se excluye la posibilidad de que se permitan otros cambios.
Ejemplo: En la Figura 2, los residuos de aminoácidos de CDRl y CDR2 de la cadena ligera variable homologa humana L12A se reemplazan con secuencias de aminoácidos de CDRl y CDR2 de la secuencia de cadena ligera del anticuerpo de conejo RbtVL. Las regiones flanqueantes 1, 2 y 3 de L12A humanas no se alteran. La secuencia humanizada resultante se muestra a continuación como residuos de VLh enumerados del 1 al 88. Nótese que solo se subrayan los residuos que son distintos a la secuencia humana L12A y por tanto son los residuos de aminoácidos derivados de conejo. En este ejemplo solo 8 de 88 residuos son diferentes a la secuencia humana. 7. Luego de la región flanqueante 3 de la mueva secuencia híbrida creada en la Etapa 6, adjuntar la totalidad de la CDR3 de la secuencia de anticuerpos de cadena ligera de conejo. La secuencia de CDR3 puede tener diversas longitudes pero tiene típicamente 9 a 15 residuos de aminoácidos de longitud. La región CDR3 y el comienzo de la próxima región de la región flanqueante 4 se definen clásicamente y de manera que se puedan identificar por aquellos expertos en la técnica. Típicamente el comienzo de la región flanqueante 4 y por tanto luego del final de la CDR3 consiste en la secuencia "FGGG...", sin embargo puede existir alguna variación en estos residuos.
Ejemplo: En la Figura 2, la CDR3 de RbtVL (residuos de aminoácidos enumerados del 89 al 100) se agrega al final de la región flanqueante 3 en la secuencia humanizada indicada como VLh. 8. La Región Flanqueante 4 de la cadena ligera de conejo que es típicamente los últimos 11 residuos de aminoácidos de la cadena ligera variable y comienza como se indica en la Etapa 7 anterior y termina típicamente con la secuencia de aminoácidos "...VVKR", se reemplaza con el homólogo de la Región Flanqueante 4 de cadena ligera humana más cercana, normalmente de la secuencia germinal. Frecuentemente, esta región flanqueante 4 de cadena ligera humana es de secuencia ' FGGGTKVEIKR' . Es posible que otras secuencias de la Región Flanqueante 4 de cadena ligera humana que no son las más homologas o de otra manera diferentes, pueden usarse sin afectar la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante. Esta secuencia de la Región Flanqueante 4 de cadena ligera humana se agrega al final de la secuencia humanizada de cadena ligera variable que sigue inmediatamente la secuencia de CDR3 de la Etapa 7 anterior. Este es el final de la secuencia de aminoácidos humanizados de cadena ligera variable.
Ejemplo: En la Figura 2, la región flanqueante 4 (FR4) de la secuencia de cadena ligera de conejo RbtVL se muestra sobre una secuencia de FR4 humana homologa. La secuencia de FR4 humana se agrega a la secuencia de cadena ligera variable humanizada (VLh) enseguida del final de la región CD3 agregada en la Etapa 7 anterior .
Adicionalmente, las Figs. 34 y 35 representan secuencias de cadenas ligeras variables y pesadas variables anti-IL-6 humanizadas que fueron humanizadas a partir de regiones ligeras y pesadas variables en Abl de acuerdo con la invención. Estas regiones de cadena pesada y ligera humanizadas están contenidas, respectivamente, en los polipéptidos contenidos en la SEQ ID NO: 647 o 651 y en la SEQ ID NO: 652, 656, 657 o 658. La CDR2 de la región pesada variable humanizada en la SEQ ID NO: 657 (que contiene una sustitución de serina en la CDR2) está contenida en la SEQ ID NO: 658. Las alineaciones que ilustran variantes de las cadenas pesada y ligera se muestran en las Figs. 36 y 37, respectivamente, con diferencias de secuencia entre las regiones de CDR resaltadas. Los identificadores de secuencia de las secuencias de CDR y de los ejemplos de secuencias de codificación se resumen en la Tabla 1 anteriormente.
Cadena pesada 1. Identificar el aminoácido que es el primero que le sigue a la secuencia de péptidos de señal. Este es el comienzo de la Región Flanqueante 1. El péptido de señales comienza en la primera metionina de iniciación y tiene típicamente 19 aminoácidos de longitud para las secuencias de proteínas de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no necesariamente siempre, los residuos finales de aminoácidos 3 de un péptido señal de cadena pesada de conejo son "...VQC" seguido del comienzo de la Región Flanqueante 1. El comienzo del polipéptido maduro también se puede determinar de manera experimental secuenciando la proteína N-terminal o se puede prever usando un algoritmo de previsión. Este también es el comienzo de la Región Flanqueante 1 tal como se suele definir por los expertos en la materia .
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVL 1 en la Figura 2, que comienza con "QEQL..." 2. Identificar el final de la Región Flanqueante 3. Este tiene típicamente 95-100 aminoácidos que siguen al comienzo de la Región Flanqueante 1 y típicamente tiene la secuencia final "...CAR" (aunque la alanina también puede ser una valina) . Este es el final de la Región Flanqueante 3 tal como se .suele definir por los expertos en la materia.
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVH 98 en la Figura 2, que termina con "... FCVR" . 3. Usar la secuencia de cadena pesada de conejo del polipéptido que comienza por el principio de la Región Flanqueante 1 hasta el final de la Región Flanqueante 3 tal como se definió anteriormente y realizar una búsqueda de homología de secuencias para las secuencias de proteínas de anticuerpos más similares. Esta será típicamente contra una base de datos de secuencias germinales humanas previa a la maduración del anticuerpo para reducir la posibilidad de inmunogenicidad; sin embargo se puede usar cualquier secuencia humana. Típicamente se puede usar un programa del estilo de BLAST para buscar en una base de datos de secuencias las más homologas. Las bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos pueden encontrarse en varias fuentes tales como NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica ) .
Ejemplo: La secuencia de aminoácidos RbtVH a partir de residuos numerados 1 a 98 en la Figura 2 se compara en BLAST con una base de datos de líneas germinales de anticuerpos humanos. Las únicas tres secuencias principales devueltas se muestran en la Figura 2 como 3-64-04, 3-66-04 y 3-53-02. 4. En general, la secuencia de cadena pesada variable de la linea germinal humana más homologa luego se usa como base de la humanización. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica pueden decidir usar otra secuencia que no fuera la más homologa tal como lo determina el algoritmo de homología, basado en otros factores que incluyen espacios de secuencias y similitudes de marco.
Ejemplo: 3-64-04 en la Figura 2, era la secuencia de cadena pesada variable de la línea germinal humana más homologa y se usa como base para la humanización de RbtVH. 5. Determinar la región flanqueante y el arreglo de CDR (FR1, FR2, FR3, CDR1 y CDR2) para el homólogo humano usado para humanización de cadena pesada. Esto es, usar la distribución tradicional tal como se describe en la materia. Alinear la secuencia de cadena pesada variable de conejo con el homólogo humano, mientras se mantiene la distribución de las regiones flanqueantes y CDR.
Ejemplo: En la Figura 2, la secuencia RbtVH se alinea con la secuencia homologa humana 3-64-04 y se indican los dominios flanqueantes y CDR. 6. Reemplazar las regiones CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena pesada homologa humana con las secuencias de CDR1 y CDR2 de la secuencia de conejo. Si existieran diferencias de longitud entre las secuencias de CDR humana y de conejo entonces usar la totalidad de las secuencias de CDR de conejo y sus longitudes. Adicionalmente, puede ser necesario reemplazar los últimos tres aminoácidos de la región flanqueante 1 de cadena pesada humana con los últimos tres aminoácidos de la región flanqueante 1 de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no siempre, en la región flanqueante 1 de cadena pesada de conejo estos tres residuos siguen los residuos de glicina precedidos por un residuo de serina. Además, puede ser necesario reemplazar el aminoácido final de la región flanqueante 2 de cadena pesada humana con el aminoácido final de la región flanqueante 2 de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no necesariamente siempre, este es un residuo de glicina antecedido por un residuo de isoleucina en la región flanqueante 2 de cadena pesada de conejo. Es posible que la especificidad, la afinidad y/o la inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante puedan no resultar alterados si se realizan intercambios de secuencia más pequeños o más grandes o si se alteran residuos específicos; sin embargo los intercambios tal como fueron descritos fueron usados exitosamente pero no excluyen la posibilidad de que se permitan otros cambios. Por ejemplo, un residuo de aminoácido de triptófano ocurre típicamente cuatro residuos antes que el final de la región CDR2 de cadena pesada de conejo, mientras que el la CDR2 de cadena pesada humana este residuo es típicamente un residuo de serina. Se ha demostrado que el hecho de cambiar este residuo de triptófano de conejo por un residuo de serina humana en esta posición tiene un efecto mínimo o inexistente sobre la especificidad o afinidad del anticuerpo humanizado y por tanto minimiza adicionalmente el contenido de los residuos de aminoácidos que derivan de la secuencia de conejo en la secuencia humanizada .
Ejemplo: En la Figura 2, los residuos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la cadena pesada variable homologa humana se reemplazan por secuencias de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena ligera de anticuerpo de conejo RbtVH, salvo el residuo secuenciado que es triptófano en la secuencia de conejo (número de posición 63) y serina en la misma posición en la secuencia humana y se mantiene como el residuo de serina humano. Adicionalmente a los cambios de CDR1 y CDR2, los últimos tres aminoácidos de la región flanqueante 1 (posiciones 28-30) asi como el residuo final de la región flanqueante 2 (posición 49) se retienen como residuos de aminoácidos de conejo en vez de humanos. La secuencia humanizada resultante se muestra a continuación como residuos de VHh enumerados del 1 al 98. Nótese que solo se subrayan los residuos que son distintos a la secuencia humana 3-64-04 y por tanto son residuos de aminoácidos derivados de conejo. En este ejemplo solo 15 de 98 residuos son diferentes de la secuencia humana. 7. Luego de la región flanqueante 3 de la nueva secuencia híbrida creada en la Etapa 6, adjuntar la totalidad de la CDR3 de la secuencia de anticuerpos de cadena pesada de conejo. La secuencia de CDR3 puede tener diversas longitudes pero tiene típicamente 5 a 19 residuos de aminoácidos de longitud. La región CDR3 y el comienzo de la próxima región flanqueante 4 se definen clásicamente y de manera que puedan identificarse por aquellos expertos en la técnica. Típicamente el comienzo de la región flanqueante 4 y por tanto luego del final de la CDR3 consiste en la secuencia "WGXG..." (donde X es normalmente Q o P) ; sin embargo puede existir alguna variación en estos residuos.
Ejemplo: La CDR3 de RbtVH (residuos de aminoácidos enumerados del 99 al 110) se agrega al final de la región flanqueante 3 en la secuencia humanizada indicada como VHh. 8. La región flanqueante 4 de la cadena pesada de conejo que son típicamente los últimos 11 residuos de aminoácidos de la cadena pesada variable y comienza como se indica en la Etapa 7 anterior y termina típicamente con la secuencia de aminoácidos "...TVSS" se reemplaza con el homólogo de la región flanqueante 4 de cadena pesada humana más cercana, normalmente de la secuencia germinal. Frecuentemente, esta región flanqueante 4 de cadena pesada humana es de secuencia 'WGQGTLVTVSS" . Es posible que otras secuencias de la región flanqueante 4 de cadena pesada humana que no son las más homologas o de otra manera diferentes, pueden usarse sin afectar la especificidad, afinidad y/o inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante. Esta secuencia de la región flanqueante 4 de cadena pesada humana se agrega al final de la secuencia humanizada de cadena pesada variable que sigue inmediatamente la secuencia de CDR3 de la Etapa 7 anterior. Este es el final de la secuencia de aminoácidos humanizados de cadena pesada variable.
Ejemplo: En la Figura 2, la región flanqueante 4 (FR4) de la secuencia de cadena pesada de conejo RbtVH se muestra sobre una secuencia de FR4 pesada humana homologa. La secuencia de FR4 humana se agrega a la secuencia de cadena pesada variable humanizada (VHh) enseguida del final de la región CD3 que se agrega en la Etapa 7 anterior.
Métodos para la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos La invención también se dirige a la producción de anticuerpos descritos en la presente o fragmentos de los mismos. Los polipéptidos recombinantes que corresponden a los anticuerpos descritos en la presente o fragmentos de los mismos se secretan a partir de cepas poliploides, preferentemente diploides o tetraploides de levadura que puede aparearse. En un ejemplo de modalidad, la invención se dirige a métodos para la producción de estos polipéptidos recombinantes en forma secretada por periodos prolongados usando cultivos que comprenden levadura poliploide, esto es, al menos varios días a una semana, más preferentemente al menos un mes o varios meses y aun más preferentemente al menos 6 meses a un año o más. Estos cultivos de levadura poliploide expresarán al menos 10-25 mg/litro del polipéptido, más preferentemente al menos 50-250 mg/litro, aun más preferentemente al menos 500-1000 mg/litro y más preferentemente un gramo por litro o más de polipéptido/s recombinante/s .
En una modalidad de la invención, un par de células haploides de levadura marcadas genéticamente se transforman con vectores de expresión que comprenden subunidades de una proteina heteromultimérica deseada. Una célula haploide comprende un primer vector de expresión y una segunda célula haploide comprende un segundo vector de expresión. En otra modalidad, las células diploides de levadura serán transformadas con uno o más vectores de expresión que proporcionan la expresión y secreción de uno o más de los polipéptidos recombinantes . En aun otra modalidad, una célula haploide simple puede transformarse con uno o más vectores y usarse para producir una levadura poliploide mediante estrategias de fusión o apareamiento. En aun otra modalidad, un cultivo de levadura diploide puede transformarse con uno o más vectores que proporcionan la expresión y secreción de un/os polipéptido/s deseado/s. Estos vectores pueden comprender vectores, por ej . plásmidos linealizados u otros productos de ADN lineal que integran el genoma celular de la levadura al azar a través de la recombinación homologa o usando una recombinasa tal como Cre/Lox o Flp/Frt. Opcionalmente , vectores de expresión adicionales pueden introducirse en las células haploides o diploides; o el primer o segundo vector de expresión puede comprender secuencias de codificación adicional para la síntesis de heterotrímeros ; heterotetrámeros; etc. Los niveles de expresión de los polipéptidos no idénticos pueden calibrarse individualmente y ajustarse a través de una selección apropiada, número de copia de vector, fuerza del promotor e/o inducción y similares. Las células haploides transformadas se cruzan o fusionan genéticamente. Las cepas diploides o tetraploides resultantes se utilizan para producir y secretar proteínas totalmente ensambladas y funcionales biológicamente, anticuerpos humanizados descritos en la presente o fragmentos de los mismos.
El uso de células diploides o tetraploides para la producción de proteínas proporciona beneficios inesperados. Se pueden cultivar células para fines de producción, esto es, aumentado a escala y por períodos de tiempo extendidos, en condiciones que pueden ser perjudiciales para el cultivo de células haploides, cuyas condiciones pueden incluir una alta densidad celular; cultivo en medios mínimos; cultivo a bajas temperaturas; cultivo estable en ausencia de presión selectiva y que puede proporcionar el mantenimiento de una integridad de secuencia de genes heterólogos y mantenimiento de un alto nivel de expresión en el tiempo. Sin ánimo de limitarse a esto, los inventores teorizan acerca de que esos beneficios pueden surgir, al menos en parte, de la creación de dos cepas diploides de cepas haploides parentales distintas. Tales cepas haploides pueden comprender varias mutaciones autotróficas de poca importancia; estas mutaciones se complementan en la diploide ?? tetraploide, posibilitando el crecimiento y la producción mejorada en condiciones altamente selectivas.
Las células de levadura haploides capaces de apareamiento proporcionan un método genético que permita el apareamiento de subunidades de una proteína deseada. Las cepas de levadura haploide se transforman con cada uno de los dos vectores de expresión, un primer vector para dirigir la síntesis de una cadena de polipéptido y un segundo vector para dirigir la síntesis de una segunda cadena de polipéptidos no idénticos. Las dos cepas haploides se aparean para proporcionar un hospedador diploide donde se puede obtener una producción de proteínas objetivo optimizados.
Opcionalmente, se proporcionan secuencias de codificación no idénticas. Tales secuencias pueden estar presentes en vectores de expresión adicionales o en el primer o segundo vector de expresión. Tal como se conoce en la técnica, múltiples secuencias de codificación pueden expresarse independientemente de promotores individuales; o se pueden expresar de manera coordinada a través de la inclusión de un "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" que es un elemento que promueve una entrada de ribosomas internos al codón de iniciación tal como aTG de un cistrón (una región que codifica una proteína) causando una traducción del gen independiente de cap. Se describen elementos IRES funcionales en levadura en Thompson et ál. (2001) P . . A. S . 98:12866-12868.
En una modalidad de la invención, las secuencias de anticuerpo se producen en combinación con una cadena secretora J, que proporciona estabilidad mejorada de IgA (véase Patentes estadounidenses N° 5,959,177; y 5,202,422).
En una modalidad preferida, las dos cepas de levadura haploides son cada una auxotróficas y requieren un complemento de medios para el cultivo de células haploides. El par de auxotróficos son complementarios, de manera que el producto diploide crecerá en la ausencia de los complementos requeridos para las células haploides. Muchos de esos marcadores genéticos son conocidos en la levadura, e incluyen requerimientos de aminoácidos (por ej . met, lys, his, arg, etc.), nucleósidos (por ej . ura3, adel, etc.); y similares. Los marcadores de aminoácidos se preferirán para los métodos de la invención. De manera alternativa, las células diploides que contienen los vectores deseados pueden seleccionarse por otros medios, por ej . , por el uso de otros marcadores tales como proteina verde fluorescente, genes resistentes a antibióticos, diversos marcadores seleccionables dominantes y similares.
Se cruzan genéticamente dos células haploides transformadas y se seleccionan cepas diploides que surgen del evento de apareamiento por sus requerimientos nutricionales híbridos y/o espectro de resistencia a antibióticos. De manera alternativa, las poblaciones de dos cepas haploides transformadas se someten a esferoplasto y se fusionan y se regenera y selecciona la progenie diploide . Por medio de cualquier método, se pueden identificar las cepas diploides y se desarrollan de forma selectiva basándose en su habilidad de crecer en medios distintos de sus progenitores. Por ejemplo, las células diploides se pueden desarrollar en un medio mínimo que puede incluir antibióticos. La estrategia de síntesis diploide tiene ciertas ventajas. Las cepas diploides tienen el potencial de producir niveles mejorados de proteína heteróloga a través de una complementación más amplia para mutaciones subyacentes que pueden impactar en la producción y/o secreción de proteína recombinante . Además, una vez que se obtienen las cepas estables, cualquier antibiótico usado para seleccionar esas cepas no necesita necesariamente estar presente continuamente en el medio de cultivo.
Tal como se observa anteriormente, en algunas modalidades, se puede transformar una levadura haploide con uno o múltiples vectores y apareado o fusionado con una célula no transformada para producir una célula diploide que contiene el o los vectores. En otras modalidades, se puede transformar una levadura diploide con uno o más vectores que proporcionan la expresión y secreción de un polipéptido heterólogo deseado por medio de la célula de levadura diploide.
En una modalidad de la invención, se transforman dos cepas haploides con una biblioteca de polipéptidos , por e . , una biblioteca de anticuerpo de cadena pesada o ligera. Las células haploides transformadas que sintetizan los polipéptidos se aparean con las células haploides complementarias. Las células diploides resultantes se analizan para determinar la proteina funcional. Las células diploides proporcionan un medio para reunir rápidamente, convenientemente y económicamente una gran cantidad de combinaciones de polipéptidos para pruebas funcionales. Esta tecnología es en especial aplicable para la creación de productos de proteina heterodimérica, donde los niveles de síntesis de subunidad optimizados son críticos para la expresión y secreción de proteínas funcionales.
En otra modalidad de la invención, la relación del nivel de expresión de las dos subunidades se regula para poder maximizar la creación de productos. Los niveles de proteína de subunidad heterodimérica han demostrado anteriormente impactar la creación de productos finales (Simmons LC, J Immunol Methods . 1 de mayo de 2002 ; 263 ( 1-2 ) : 133-47 ) . La regulación puede lograrse previo a la etapa de apareamiento mediante la selección de un marcador presente en el vector de expresión. Se puede aumentar el nivel de expresión aumentando de forma estable el número de copia del vector. En algunos casos, se puede desear aumentar el nivel de una cadena relativa a otra de manera de alcanzar una proporción balanceada entre las subunidades del polipéptido. Los marcadores de resistencia a antibióticos son útiles para este fin, por ej . marcador de resistencia Zeocin™ (fleomicina) , resistencia a G418, etc. y proporcionan un medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa seleccionando transformadores resistentes a mayores niveles de Zeocin1*1 (fleomicina) o G418. La relación de proteínas, por ej . 1:1, 1:2, etc. de los genes de la subunidad pueden resultar importantes para la eficiente protección de proteínas. Aun cuando se usa el mismo promotor para transcribir ambas subunidades, muchos otros factores pueden contribuir al nivel final de proteína expresado y por tanto puede ser útil para aumentar el número de copias de un gen codificado relativo al otro. De manera alternativa, las cepas diploides que producen mayores niveles de un polipéptido relativos a cepas de vector de copia simple, se crean apareando dos cepas haploides y ambas tienen múltiples copias de vectores de expresión.
Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión antemencionados, apareados para formar cepas diploides y cultivados en medios nutritivos convencionales modificados según corresponda para la inducción de promotores, selección de los transformadores o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas. Se conoce en la técnica un número de medios mínimos adecuados para el cultivo de levadura. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como fosfato, HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos, elementos traza y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse en concentraciones apropiadas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como temperatura, pH y similares son aquellos previamente usados con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y será evidente para los expertos en la técnica.
Las proteínas secretadas se recuperan del medio de cultivo. Un inhibidor de proteasa, tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF) puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación y se pueden incluir antibióticos para prevenir el cultivo de contaminantes accidentales. La composición puede concentrarse, filtrarse, dializarse, etc., usando métodos conocidos en la técnica.
Las células diploides de la invención se cultivan para fines de producción. Tales fines de producción incluyen de forma deseada el cultivo en medios mínimos que carece de aminoácidos preforinados y otras biomoléculas complejas, por ej . medios que comprenden amoníaco como fuente de nitrógeno y glucosa como fuente de energía y carbono y sales como fuente de fosfato, calcio y similares. Preferentemente, tales medios de producción carecen de agentes selectivos tales como antibióticos, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc. Las células diploides pueden cultivarse con alta densidad celular, por ejemplo al menos alrededor de 50 g/L; más normalmente al menos de alrededor de 100 g/L; y al menos alrededor de 300, alrededor de 400, alrededor de 500 g/L o más.
En una modalidad de la invención, el cultivo de las células analizadas para los fines de producción se realiza en temperaturas bajas que pueden bajarse durante la fase logarítmica, durante la fase estacionaria, o ambas. El término "baja temperatura" se refiere a temperaturas de al menos alrededor de 15 °C, más normalmente al menos alrededor de 17 °C y tal vez alrededor de 20 °C y normalmente no mayores a alrededor de 25 °C, más normalmente no mayores a alrededor de 22 °C. En otra modalidad de la invención, la temperatura baja normalmente no es mayor que alrededor de 28 °C. La temperatura de cultivo puede impactar la producción de proteínas secretadas en su longitud completa en cultivos de producción y el hecho de reducir las temperaturas de crecimiento del cultivo puede aumentar fuertemente el rendimiento del producto intacto. Las temperaturas disminuidas parecen asistir el tráfico intracelular a través de las vías de procesamiento de plegamiento y postraduccionales usadas por el hospedador para generar el producto objetivo junto con una reducción de degradación de proteasa celular.
Los métodos de la invención proporcionan la expresión de proteina secretada activa preferentemente una proteína mamífera. En una modalidad, los "anticuerpos activos" secretados, tal como se usan en la presente, se refieren a un multímero correctamente plegado de al menos dos cadenas arregladas apropiadamente en pares y gue se unen con exactitud a su antígeno cognado. Los niveles de expresión de proteínas activas son normalmente al menos alrededor de 10-50 mg/litro del cultivo, más normalmente al menos alrededor de 100 mg/litro, preferentemente al menos alrededor de 500 mg/litro y pueden ser 1000 mg/litro o más.
Los métodos de la invención pueden proporcionar una estabilidad aumentada de las secuencias hospedadoras y heterólogas de codificación durante la producción. La estabilidad se evidencia, por ejemplo, mediante el mantenimiento de altos niveles de expresión de tiempo, cuando el nivel de expresión de partida disminuye en no más de alrededor de 20%, normalmente no más de alrededor de 10% y puede disminuir en no más de 5% de alrededor de 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones o más.
La estabilidad de las cepas también proporciona el mantenimiento de la integridad de las secuencias de genes heterólogos con el paso del tiempo, donde se mantiene la secuencia de la secuencia de codificación activa y los elementos necesarios de regulación transcripcional en al menos alrededor del 99% de las células diploides, normalmente en al menos alrededor del 99.9% de las células diploides y preferentemente en al menos alrededor del 99.99% de las células diploides de 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones o más. Preferentemente, sustancialmente todas las células diploides mantienen la secuencia de la secuencia de codificación activa y los elementos necesarios de regulación transcripcionales .
Otros métodos para la producción de anticuerpos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, métodos para la producción de anticuerpos quiméricos son ahora bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Patente estadounidense N° 4,816,567 de Cabilly et ál.; Morrison et ál., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. ét ál . , Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et ál., Nature, 312:643-46 (1984), cuyas descripciones se incorporan en la presente en su totalidad mediante esta referencia) .
Asimismo, otros métodos para la producción de anticuerpos humanizados son ahora bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Patente estadounidense N° 5,530,101, 5,585,089, 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et ál; Patente estadounidense N° 5,225,539 y 6,548,640 de Winter; Patente estadounidense N° 6,054,297, 6,407,213 y 6,639,055 de Cárter et ál; Patente estadounidense N° 6,632,927 de Adair; Jones, P.T. et ál, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et ál, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et ál, Science, 239:1534-36 (1988), cuyas descripciones se incorporan en la presente en su totalidad mediante esta referencia) .
Los polipéptidos del anticuerpo de la invención que poseen especificidad de unión a IL-6 también pueden producirse construyendo, usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica, un vector de expresión que contiene un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo en donde la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo proviene de una fuente celular no humana, preferentemente una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes remanentes de la cadena de anticuerpo proviene de una fuente celular humana.
Un segundo vector de expresión se produce usando los mismos medios convencionales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, dicho vector de expresión contiene un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo donde la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo proviene de una fuente celular no humana, preferentemente una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes remanentes de la cadena de anticuerpo proviene de una fuente celular humana.
Los vectores de expresión se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica para producir una célula hospedadora transfectada; esta célula hospedadora transfectada cultivada mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica para producir dichos polipéptidos de anticuerpos.
La célula hospedadora puede transfectarse conjuntamente con los dos vectores de expresión descritos anteriormente, el primer vector de expresión contiene ADN que codifica un operón y un polipéptido derivado de una cadena ligera y el segundo vector contiene ADN que codifica un operón y un polipéptido derivado de una cadena pesada. Los dos vectores contienen diferentes marcadores seleccionables, pero preferentemente alcanzan sustancialmente la misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. De manera alternativa, se puede usar un vector simple, este vector incluye ADN que codifica ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las secuencias de codificación para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprenden ADNc.
Las células hospedadoras usadas para expresar polipéptidos de anticuerpo pueden ser tanto células bacterianas, como ser E.coli, como una célula eucariota. En una modalidad preferida de la invención, se puede usar una célula mamifera de un tipo bien definido para este fin, tal como una linea celular de célula de mieloma o de ovario de hámster chino (CHO) .
Los métodos generales por los cuales se pueden construir los vectores, métodos de transfeccion requeridos para producir la célula hospedadora y métodos de cultivo requeridos para producir los polipéptidos de anticuerpo a partir de dichas células hospedadoras , todos incluyen técnicas convencionales. Aunque preferentemente la linea celular usada para producir el anticuerpo es una linea celular de mamífero, cualquier otra línea celular adecuada, tal como una línea celular de bacteria como ser una cepa bacteriana derivada de E.coli, o una linea celular de levadura, puede usarse de manera alternativa.
De manera similar, los polipéptidos de anticuerpo una vez producidos pueden estar purificados de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica, tal como por ejemplo, filtración de flujo cruzado, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de afinidad de columna y similares.
Los polipéptidos de anticuerpo descritos en la presente también pueden usarse para el diseño y síntesis de cualquier mimético peptídico o no peptídico que pueden ser útiles para las mismas aplicaciones terapéuticas que los polipéptidos de anticuerpo de la invención. Véase, por ejemplo, Saragobi et ál, Science, 253:792-795 (1991), cuyo contenido se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.
Ejemplos de modalidades de polinucleótidos y polipéptidos de cadena pesada y ligera Esta sección describe ejemplos de modalidades de polipéptidos de cadena pesada y ligera, así como ejemplos de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Estos ejemplos de polinucleótidos son adecuados para su expresión en el sistema de expresión Pichia descrito.
En algunas modalidades, la presente invención comprende polinucleótidos que poseen al menos 70 % , como al menos 75% , al menos- 80 % , al menos 85 % , al menos 90% , al menos 91 % , al menos 92 % , al menos 93% , al menos 94 % , al menos 95% , al menos 96% , al menos 97 % , al menos 98 % , al menos 99% o 100% de identidad con los polinucleótidos descritos en esta solicitud o que codifican polipéptidos descritos en la presente solicitud o que se hibridan con dichos polinucleótidos en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad moderada o rigurosidad alta, preferentemente aquellos que codifican polipéptidos (por ejemplo, una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento de anticuerpo, etc.) que poseen al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente, incluyendo, de modo no taxativo, la unión especifica a un polipéptido de IL-6. En otro aspecto, la invención comprende una composición que comprende tal polinucleótido y/o un polipéptido codificado por tal polinucleótido. En aun otro aspecto, la invención comprende un método para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la IL- 6 o que puede prevenirse, tratarse o mejorarse con un antagonista de IL- 6 tal como Abl (por ejemplo, caquexia, fatiga por cáncer, artritis, etc.) que comprende la administración ' de una composición que comprende tal polinucleótido y/o polipéptido.
En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena pesada comprenderá una o más secuencias de CDR de los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera descritos en la presente (incluidos los contenidos en los polipéptidos de cadena pesada y ligera descritos en la presente) y uno o más polipéptidos de la región flanqueante descritos en la presente, incluidos aquellos representados en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 y contenidos en las secuencias de polipéptidos de cadena pesada y ligera descritas en la presente. En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena pesada comprenderá una o más secuencias de región flanqueante 4 como se representa en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 o como se encuentra contenido en un polipéptido de cadena pesada o ligera descrito en la presente.
En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena ligera comprenderá una o más de las secuencias de CDR de los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera descritos en la presente (incluidos los contenidos en los polipéptidos de cadena pesada y ligera descritos en la presente) y uno o más de los polipéptidos de la región flanqueante descritos en la presente, incluidos aquellos representados en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 y contenidos en las secuencias de polipéptidos de cadena pesada y ligera descritas en la presente. En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena ligera comprenderá una o más secuencias de región flanqueante 4 como se representa en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 o como se encuentra contenido en un polipéptido de cadena pesada o ligera descrito en la presente.
En cualquiera de las modalidades descritas en la presente, ñas secuencias descritas pueden ser sustituidas entre ellas, a menos que el contexto lo indique de otra manera. El hecho de que secuencias particulares puedan sustituirse entre ellas, en caso de que esto ocurriera, se entiende que es de carácter ilustrativo y no limitante y también se entiende que dichas sustituciones se encuentran comprendidas aun cuando no se describieran ejemplos ilustrativos de sustituciones. Por ejemplo, cuando se describen uno o más de los polipéptidos de cadena ligera de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709, otro polipéptido de cadena ligera de Abl puede sustituirse a menos que el contexto lo indique de otra manera. De manera similar, cuando se describe uno de los polipéptidos de cadena pesada de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708, otro polipéptido de cadena pesada de Abl puede sustituirse a menos que el contexto lo indique de otra manera. Asimismo, cuando se describe uno de los polinucleótidos de cadena ligera de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701 o 705, puede sustituirse otro polinucleótido de cadena ligera de Abl, a menos que el cont exto lo indique de otra manera. De manera similar, cuando se describe uno de los polinucleótidos de cadena pesada de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 11, 663, 700, 703 o 707, puede sustituirse otro polinucleótido de cadena pesada de Abl, a menos que el contexto lo indique de otra manera. Adicionalmente, se entiende que la descripción de cualquier miembro de cualquiera de los siguientes grupos comprende la sustitución mediante cualquier otro miembro del grupo, como sigue: polipéptidos de cadena ligera de Ab2 (SEQ ID NO: 21 y 667), polinucleótidos de cadena ligera de Ab2 (SEQ ID NO: 29 y 669), polipéptidos de cadena pesada de Ab2 (SEQ ID NO: 22 y 668), polinucleótidos de cadena pesada de Ab2 (SEQ ID NO: 30 y 670), polipéptidos de cadena ligera de Ab3 (SEQ ID NO: 37 y 671), polinucleótidos de cadena ligera de Ab3 (SEQ ID NO: 45 y 673), polipéptidos de cadena pesada de Ab3 (SEQ ID NO: 38 y 672), polinucleótidos de cadena pesada de Ab3 (SEQ ID NO: 46 y 674), polipéptidos de cadena ligera de Ab4 (SEQ ID NO: 53 y 675) , polinucleótidos de cadena ligera de Ab4 (SEQ ID NO: 61 y 677), polipéptidos de cadena pesada de Ab4 (SEQ ID NO: 54 y 676), polinucleótidos de cadena pesada de Ab4 (SEQ ID NO: 62 y 678), polipéptidos de cadena ligera de Ab5 (SEQ ID NO: 69 y 679), polinucleótidos de cadena ligera de Ab5 (SEQ ID NO: 77 y 681), polipéptidos de cadena pesada de Ab5 (SEQ ID NO: 70 y 680), polinucleótidos de cadena pesada de Ab5 (SEQ ID NO: 78 y 682) , polipéptidos de cadena ligera de Ab6 (SEQ ID NO: 85 y 683), polinucleótidos de cadena ligera de Ab6 (SEQ ID NO: 93 y 685), polipéptidos de cadena pesada de Ab6 (SEQ ID NO: 86 y 684), polinucleótidos de cadena pesada de Ab6 (SEQ ID NO: 94 y 686), polipéptidos de cadena ligera de Ab7 (SEQ ID NO: 101, 119, 687, 693), polinucleótidos de cadena ligera de Ab7 (SEQ ID NO: 109 y 689), polipéptidos de cadena pesada de Ab7 (SEQ ID NO: 102, 117, 118, 688, 691 y 692), polinucleótidos de cadena pesada de Ab7 (SEQ ID NO: 110 y 690), polinucleótidos de CDR1 de cadena ligera de Abl (SEQ ID NO: 12 y 694), polinucleótidos de CDR3 de cadena ligera de Abl (SEQ ID NO: 14 y 695), polinucleótidos de CDR2 de cadena pesada de Abl (SEQ ID NO: 16 y 696) y polinucleótidos de CDR3 de cadena pesada de Abl (SEQ ID NO: 17 y 697) .
Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que codifican Abl se expresan de la siguiente manera: SEQ ID NO: 662: ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATG TGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA AGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGT CCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAG TGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACT ACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 663: ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGCT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTG GATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGG ATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGCCGATTCACCAT CTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCT ATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTG SEQ ID NO: 698: GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTA CTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAACGTACG SEQ ID NO: 700: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACT TGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 701: GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTA CTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T SEQ ID NO: 703: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACT TGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 705: ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTGTTTCTCTTTAGCAGCGCTTATTCCGCTATCCAGAT GACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCA GTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTG ATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGAC AGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGG GTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC TGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACG CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 707: ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTGTTTCTCTTTAGCAGCGCTTATTCCGAGGTGCAGCT GGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTG GATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGG GTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGCCGATTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTG CTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACTTGTGGGGCCAA GGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 720: ATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG CCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTG CCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCT SEQ ID NO: 721 : GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAA GTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTC CCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGT GGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTA CTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGG TCAAACGT SEQ ID NO: 722: ATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG CCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTG CCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCA AACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGT GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 723: GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTA CTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAACGT SEQ ID NO: 724: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACT TG SEQ ID NO: 725: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCAC AGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGCCGA TTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACAC GGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTGTGGGGCC AAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC Ensayos de análisis La invención también incluye ensayos de análisis diseñados para asistir a la identificación de enfermedades y trastornos asociados con IL-6 en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con IL-6.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la invención o fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, se usan para detectar la presencia de IL-6 en una muestra biológica obtenida de un paciente que presenta síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con IL-6. La presencia de IL-6 o niveles elevados de este al compararse con niveles de IL-6 previos a la enfermedad en una muestra biológica comparable, puede ser beneficioso para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con IL-6.
Otra modalidad de la invención proporciona un ensayo de diagnóstico o análisis para asistir al diagnóstico de enfermedades o trastornos asociados con IL-6 en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con IL-6 identificado en la presente, que comprenden ensayar el nivel de expresión de IL-6 en una muestra biológica de dicho paciente usando un anticuerpo anti-IL-6 modificado postraduccionalmente o fragmento de unión o variante del mismo. El anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de unión o variante del mismo pueden estar modificados postraduccionalmente para incluir un resto detectable tal como se establece previamente en la descripción.
El nivel de IL-6 en la muestra biológica se determina usando un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento de unión o variante del mismo tal como se establece en la presente y comparando el nivel de IL-6 en la muestra biológica contra el nivel estándar de IL-6 (por ej . , el nivel en muestras biológicas normales). El médico experto entenderá que puede existir variabilidad entre las muestras biológicas normales y lo tomará en cuenta al evaluar los resultados .
El ensayo mencionado anteriormente también puede ser útil en el monitoreo de una enfermedad o trastorno, donde el nivel de IL-6 obtenido en una muestra biológica de un paciente que se cree tiene una enfermedad o trastorno asociado con IL-6 se compara con el nivel de IL-6 en muestras biológicas anteriores en el mismo paciente, para poder establecer si el nivel de IL-6 en dicho paciente ha cambiado, por ejemplo, con un régimen de tratamiento.
La invención también se dirige a un método de diagnóstico por imágenes in vivo que detecta la presencia de células que expresan IL-6, que comprende administrar una cantidad eficaz desde el punto de vista del diagnóstico de una composición de diagnóstico. Dichos diagnósticos por imágenes in vivo son útiles para la detección y diagnóstico por imágenes de IL-6 que expresan tumores y metástasis y sitios inflamatorios que expresan IL-6, por ejemplo y pueden usarse como parte de un régimen de planificación para diseñar un protocolo de tratamiento efectivo para artritis o cáncer. El protocolo de tratamiento puede incluir, por ejemplo, uno o más de radiación, quimioterapia, terapia con citocina, terapia genética y terapia con anticuerpos, asi como un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento o variante del mismo .
Un médico experto entenderá que una muestra biológica incluye pero no se limita a suero, plasma, orina, saliva, mucosa, fluido pleural, fluido sinovial y fluido espinal.
Métodos para mejorar o reducir síntomas de o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con IL-6 En una modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6, tales como Abl, descritos en la presente son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con IL-6. Los antagonistas de IL-6 descritos en la presente (por ej . , Abl) pueden también administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz a pacientes que necesitan de un tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con IL-6 en forma de una composición farmacéutica tal como se describe en detalle a continuación.
En una modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6 descritos en la presente (por ej . , Abl) son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con la proteína C reactiva (CRP) elevada. Tales enfermedades incluyen cualquier enfermedad que presenta inflamación crónica, por e . , artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artropatía psoriática, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pénfigo, dermatomiositis , polimiositis, polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de egener, enfermedad de Kawasaki, vasculitis aislada del sistema nervioso central, arteritis de Churg-Strauss, poliarteritis microscópica, poliangiitis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis crioglobulinémica esencial, vasculitis reumatoide, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedad de Behcet, arteritis de Takayasu, enfermedad cardíaca isquémica, apoplejía, esclerosis múltiple, sepsis, vasculitis causada por infecciones virales (por ej . , hepatitis B, hepatitis C, VIH, citomegalovirus , virus Epstein-Barr, virus Parvo B19, etc.)/ enfermedad de Buerger, cáncer, cáncer avanzado, osteoartritis , esclerosis sistémica, síndrome de CREST, enfermedad de Reiter, enfermedad ósea de Pageit, síndrome de Sjogran, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fiebre mediterránea familiar, trombocitopenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis alcohólica, hepatitis viral incluyendo hepatitis B y C, otras enfermedades autoinmunes específicas de órganos, quemaduras, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma alérgico, otras afecciones alérgicas o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6 descritos en la presente, tales como anticuerpos anti-IL-6 (por ej . , Abl), variantes de los mismos o fragmentos de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con albúmina en suero reducida, por e . , artritis reumatoide, cáncer, cáncer avanzado, enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, traumatismo, quemaduras, otras enfermedades asociadas con albúmina en suero reducida o cualquier combinación de las mismas .
En otra modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6 descritos en la presente se administran a un paciente en combinación con otro agente activo. Por ejemplo, un antagonista de IL-6, tal como Abl, también puede administrarse conjuntamente con uno o más agentes quimioterapéuticos, tales como antagonistas de VEGF, antagonistas de EGF , platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por e . , vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ej . IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin®, o combinaciones de los mismos.
En una modalidad de la invención, los antagonistas de anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con la fatiga. Enfermedades y trastornos asociados con la fatiga incluyen de modo no taxativo, fatiga general, fatiga inducida por ejercicio, fatiga relacionada con cáncer, fibromialgia, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria y síndrome de fatiga crónica. Véase, por ejemplo, Esper DH, et ál, The cáncer cachexia syndrome: a review of metabolic and clinical manifestations , Nutr Clin Pract., 25 de agosto de 2005;20 (4):369-76; Vgontzas AN, et ál, IL-6 and its circadian' secretion in humans, Neuroiinmunomodulation, 2005; 12 (3) : 131-40; Robson-Ansley, PJ, et ál, Acute interleukin-6 administration impairs athletic performance in healthy, trained male runners, Can J Appl Physiol., agosto de 2004 ; 29 ( ) : 411-8 ; Shephard RJ., Cytokine responses to physical activity, with particular reference to IL-6: sources, actions, and clinical implications , Crit Rev Immunol., 2002 ; 22 ( 3) : 165-82 ; Arnold, C, et ál, Using an interleukin-6 challenge to evalúate neuropsychological performance in chronic fatigue syndrome, Psychol Med., agosto de 2002;32 (6) :1075-89; Kurzrock R., The role of cytokines in cancer-related fatigue, Cáncer, 15 de setiembre de 2001; 92 (6 Suppl) : 1684-8; Nishimoto N, et ál, Improvement in Castleman' s disease by humanized anti-interleukin-6 receptor antibody therapy, Blood, 1 de enero de 2000; 95 (1) :56-61; Vgontzas AN, et ál, Circadian interleukin-6 secretion and quantity and depth of sleep, J Clin Endocrinol Metab., agosto de 1999; 84 ( 8 ): 2603-7 ; y Spath-Schwalbe E, et ál, Acute effects of recombinant human interleukin 6 on endocrine and central nervous sleep functions in healthy men, J Clin Endocrinol Metab., mayo de 1998; 83 (5) : 1573-9; cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir la caquexia. Enfermedades y trastornos asociados con la caquexia incluyen, de modo no taxativo, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal y caquexia relacionada con la edad. Véase, por ejemplo, Barton, BE., Interleukin-6 and new strategies fox the treatment of cáncer, hyperproliferative diseases and paraneoplastic syndromes, Expert Opin Ther Targets, agosto de 2005; 9 ( 4 ): 737-52 ; Zaki MH, et ál, CNTO 328, a' monoclonal antibody to IL-6, inhibits human tumor-induced cachexia in nude mice, Int J Cáncer, 10 de setiembre de 2004; 111 (4) : 592-5; Trikha M, et ál, Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cáncer: a review of the rationale and clinical evidence, Clin Cáncer Res., 15 de octubre de 2003; 9 (13) : 4653-65; Lelli G, et ál, Treatment of the cáncer anorexia-cachexia syndrome : a critical reappraisal, J Chemother., junio de 2003; 15 (3) : 220-5; Argües JM, et ál, Cytokines in the pathogenesis of cáncer cachexia, , Curr Opin Clin Nutr Metab Care, julio de 2003 ; 6 ( ) : 01- 6 ; Barton BE., IL-6-like cytokines and cáncer cachexia: consequences of chronic inflammation, Immunol Res., 2001 ; 23 ( 1) : 41-58 ; Yamashita JI, et ál, Medroxyprogesterone acétate and cáncer cachexia: interleukin-6 involvement, Breast Cáncer, 2000;7 (2) : 130-5; Yeh SS, et ál, Geriatric cachexia: the role of cytokines, Am J Clin Nutr., agosto de 1999 ; 0 ( 2 ) : 183-97 ; Strassmann G, et ál, Inhibition of experimental cáncer cachexia by anti-cytokine and anti-cytokine-receptor therapy, Cytokines Mol Ther., junio de 1995; 1 ( 2) : 107-13; Fujita J, et ál, Anti-interleukin-6 receptor antibody prevents muscle atrophy in colon-26 adenocarcinoma-bearing mice with modulation of lysosomal and ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathways, Int J Cáncer, 27 de noviembre de 1996; 68 (5) : 637-43; Tsujinaka T, et ál, Interleukin 6 receptor antibody inhibits muscle atrophy and modulates proteolytic systems in interleukin 6 transgenic mice, J Clin Invest., 1 de enero de 1996; 97 ( 1 ) : 244-9; Emilie D, et ál, Administration of an anti-interleukin-6 monoclonal antibody to patients with acquired immunodeficiency syndrome and lymphoma: effect on lymphoma growth and on B clinical Symptoms, Blood, 15 de octubre de 1994;84 (8) :2472-9; and Strassmann G, et ál, Evidence for the involvement of interleukin 6 in experimental cáncer cachexia, J Clin Invest., mayo de 1992 ; 89 (5 ) : 1681-4 ; cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
En otra modalidad de la invención, los antagonistas de anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos autoinmunes. Enfermedades y trastornos asociados con autoinmunidad incluyen, de modo no taxativo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémíco (SLE) , artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriática, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedades de injerto versus huésped (GVHD) , síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 humanizados descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir artritis reumatoide y artritis idiopática juvenil sistémica. Véase, por ejemplo, Nishimoto N., Clinical studies in patients with Castleman's disease, Crohn' s disease, and rheumatoid arthritis in Japan, Clin Rev Allergy Immunol., junio de 2005; 28 (3) : 221-30; Nishimoto N, et ál, Treatment of rheumatoid arthritis with humanized anti-interleukin-6 receptor antibody: a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial, Arthritis Rheum. , junio de 200 ; 50 ( 6 ) : 1761-9; Choy E., Interleukin 6 receptor as a target for the treatment of rheumatoid arthritis, Ann Rheum Dis., noviembre de 2003; 62 Suppl 2:ii68-9; Nishimoto N, et ál, Toxicity, pharmacokinetics , and dose-finding study of repetitive treatment with the humanized anti-interleukin 6 receptor antibody MRA in rheumatoid arthritis. 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En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con el sistema óseo. Enfermedades y trastornos asociados con el sistema óseo incluyen, de modo no taxativo, osteoartritis, osteoporosis y enfermedad ósea de Paget. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 humanizados descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir la osteoartritis. Véase, por ejemplo, Malemud CJ. , Cytokines as therapeutic targets for osteoarthritis, BioDrugs, 2004 ; 18 (1 ) : 23-35 ; Westacott CI, et ál, Cytokines in osteoarthritis: mediators or markers of joint destruction? , Semin Arthritis Rheum. , febrero de 1996; 25 ( 4 ) : 254-72; Sugiyama T., Involvement of interleukin-6 and prostaglandin E2 in particular osteoporosis of postmenopausal women with rheumatoid arthritis, J Bone Miner Metab., 2001; 19 (2) : 89-96; Abrahamsen B, et ál, Cytokines and bone loss in a 5-year longitudinal study - hormone replacement therapy suppresses serum soluble interleukin-6 receptor and increases interleukin-1-receptor antagonist: the Danish Osteoporosis Prevention Study, J Bone Miner Res., agosto de 2000; 15 ( 8 ) : 1545-5 ; Straub RH, et ál, Hormone replacement therapy and interrelation between serum interleukin-6 and body mass index in postmenopausal women: a population-based study, J Clin Endocrinol Metab., marzo de 2000; 85 (3) : 1340-4; Manolagas SC, The role of IL-6 type cytokines and their receptors in bone, Ann N Y Acad Sci., 1 de mayo de 1998;840:194-204; Ershler WB, et ál, Immunologic aspects of osteoporosis , Dev Comp Immunol., noviembre-diciembre de 1997;21 (6) : 487-99; Jilka RL, et ál, Increased osteoclast development after estrogen loss: mediation by interleukin-6, Science, 3 de julio de 1992 ; 257 ( 5066) : 88-91 ; Kallen KJ, et ál, New developments in IL-6 dependent biology and therapy: where do we stand and what are the options?, Expert Opin Investig Drugs, setiembre de 1999; 8 ( 9) : 1327-49; Neale SD, et ál, The influence of serum cytokines and growth factors on osteoclast formation in Paget's disease, QJ , abril de 2002;95 (4) :233 - 40; Roodman GD, Osteoclast function In Paget's disease and múltiple myeloma, Bone, agosto de 1995;17(2 Suppl ) : 57S-61S ; Hoyland JA, et ál, Interleukin-6, IL-6 receptor, and IL-6 nuclear factor gene expression in Paget's disease, J Bone Miner Res., enero de 1994; 9 (1) :75-80; and Roodman GD, et ál, Interleukin 6. A potential autocrine/paracrine factor in Paget's disease of bone, J Clin Invest., enero de 1992; 89 (1) :46-52; cuyas descripciones se incorporan en la presente en su totalidad mediante esta referencia.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con cáncer. Enfermedades y trastornos asociados con cáncer incluyen, de modo no taxativo acantoma, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendríticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocitica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma quistico adenoide, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical, leucemia de linfocitos T del adulto, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atipico, carcinoma de células básales, carcinoma de tipo basal, leucemia de linfocitos B, linfoma de linfocitos B, carcinoma de los conductos de Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor de hueso, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar, tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocitica crónica, leucemia monocitica crónica, leucemia mielógena crónica, trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia neutrofilica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniofaringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberans, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de linfocitos B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario, tumor de seno endodérmico, cáncer endometrial, cáncer uterino endometrial, tumor endometrioide, linfoma de linfocitos T asociado a enteropatia, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de la familia de Ewing, sarcoma de la familia de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ducto biliar extrahepático, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de tubo falopiano, Fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células granulosas, leucemia de células pilosas, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, malignidad hematológica, carcinoma hepatocelular, linfoma hepatoesplénico de linfocitos T, síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, linfoma Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico, cáncer de mama inflamatorio, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia juvenil mielomonocitica, sarcoma Kaposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma léntigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer del labio y la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno óseo, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de vaina nerviosa periférica, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT, linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor mediastinal de células germinales, tumor mediastinal, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario oculto, carcinoma urotelial metastásico, tumor Mülleriano mixto, leucemia monocitica, cáncer de boca, tumor mucinoso, enfermedad de Castleman multicéntrica, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, micosis fungoides, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos , leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumór de células germinales del ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, enfermedad de Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer pancreático, cáncer pancreático, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis , paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, tumor perivascular de células epitelioides, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor parénquima pineal de diferenciación intermedia, pineoblastoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar , poliembrioma, linfoma precursor linfoblástico de linfocitos T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodermal primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer rectal, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio relacionado con el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcígeo, cáncer de la glándula salival, sarcoma, Schwannomatosis, carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasma secundario, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordones sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas, redondas y azules, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, somatoestatinoma, verruga del deshollinador, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma superficial diseminante, tumor neuroectodermal primitivo supratentorial , tumor epitelial superficial de ovario, sarcoma sinovial, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, leucemia linfocitica granular grande de linfocitos T, leucemia de linfocitos T, linfoma de linfocitos T, leucemia prolinfocitica de linfocitos T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma timico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células de transición, cáncer uracal, cáncer uretral, neoplasma urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumor de Warthin, tumor de Wilms, o cualquier combinación de los mismos así como resistencia a los fármacos en quimioterapia contra el cáncer y toxicidad de quimioterapia contra el cáncer. Véase, por ejemplo, Hirata T, et ál, Humanized anti-interleukin-6 receptor monoclonal antibody induced apoptosis of fresh and cloned human myeloma cells in vitro, Leuk Res., abril de 2003; 27 (4 ) : 343-9, Bataille R, et ál, Biologic effects of anti-interleukin-6 murine monoclonal antibody in advanced múltiple myeloma, Blood, 15 de julio de 1995 ;86 (2) :685-91; Goto H, et ál, Mouse anti-human interleukin-6 receptor monoclonal antibody inhibits proliferation of fresh human myeloma cells in vitro, Jpn J Cáncer Res., setiembre de 1994;85 (9) : 958-65; Klein B, et ál, Murine anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for a patient with plasma cell leukemia, Blood, 1 de setiembre de 1991 ; 78 ( 5 ) : 1198-20 ; auray S, et ál, Epstein-Barr virus-dependent lymphoproliferative disease: critical role of IL-6, Eur J Immunol., julio de 2000;30 (7) :2065-73; Tsunenari T, et ál, New xenograft model of múltiple myeloma and efficacy of a humanized antibody against human interleukin-6 receptor, Blood; 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and Tonini G, et ál, Oxaliplatin may induce cytokine-release syndrome in colorectal cáncer patients, J Biol Regul Homeost Agents, abril-junio de 2002;16 (2):105-9; cuyas descripciones se incorporan en la presente en su totalidad mediante esta referencia.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedad cardíaca isquémica, ateroesclerosis , obesidad, diabetes, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis , insuficiencia cardíaca aguda, síndrome metabólico, abortos naturales, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión y rechazo de transplante. Véase, por ejemplo, Tzoulaki I, et ál, C-reactive protein, interleukin-6, and soluble adhesión molecules as predictors of progressive peripheral atherosclerosis in the general population: Edinburgh Artery Study, Circulation, 16 de agosto de 2005 ; 112 ( 7 ) : 976-83, Epub 8 de agosto de 2005; Rattazzi M, et ál, C-reactive protein and interleukin-6 in vascular disease: culprits or passive bystanders?, J Hypertens., octubre de 2003; 21 ( 10 ) : 1787-803 ; Ito T, et ál, HMG-CoA reductase inhibitors reduce interleukin-6 synthesis in human vascular smooth muscle cells, Cardiovasc Drugs Ther., marzo de 2002; 16 (2) : 121-6; Stenvinkel P, et ál, Mortality, malnutrition, and atherosclerosis in ESRD: what is the role of interleukin-6?, Kidney Int Suppl., mayo de 2002 ;( 80 ) : 103-8 ; Yudkin JS, et ál, Inflammation, obesity, stress and coronary heart disease: is interleukin-6 the link?, Atherosclerosis, febrero de 2000 ; 148 ( 2 ) : 209-14 ; Huber SA, et ál, Interleukin-6 exacerbates early atherosclerosis in mice, Arterioscler Thromb Vasc Biol., octubre de 1999; 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En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con una crisis de citocina. Enfermedades y trastornos asociados con una crisis de citocina incluyen, de modo no taxativo, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , gripe aviar, viruela, gripe pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS), síndrome respiratorio agudo severo (SARS), sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) . Véase, por ejemplo, Cecil, R. L., Goldman, L., & Bennett, J. C. (2000). Cecil textbook of medicine. Philadelphia : .B. Saunders; Ferrara JL, et ál . , Cytokine storm of graft-versus-host disease: a critical effector role for interleukin-1, Transplant Proc. febrero de 1993;25(1 Pt 2) :1216-7; Osterholm MT, Preparing for the Next Pandemic, N Engl J Med. 5 de mayo de 2005 ; 352 ( 18 ) : 1839-42 ; Huang J, et ál . , An interferon-gamma-related cytokine storm in SARS patients, J Med Virol . febrero de 2005;75 (2) : 185-94; and Cheung CY, et ál., Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease? Lancet. 7 de diciembre de 2002; 360 (9348 ) : 1831-7.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos o variantes de los mismos, son útiles como una ayuda al insomnio.
Administración En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, así como combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo o variantes, se administran a un sujeto en una concentración de entre alrededor de 0.1 y 20 mg/kg, tal como alrededor de 0.4 mg/kg, alrededor de 0.8 mg/kg, alrededor de 1.6 mg/kg, o alrededor de 4 mg/kg, del peso corporal del sujeto receptor. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, asi como combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo o variantes, se administran a un sujeto en una concentración de alrededor de 0.4 mg/kg del peso corporal del sujeto receptor En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, así como combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo o variantes, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, o una vez cada cuatro semanas o menos. En otra modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, así como combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de como máximo una vez durante un período de aproximadamente una semana, como ser, como máximo una vez durante un período de aproximadamente dos semanas como ser, como máximo una vez durante un período de aproximadamente cuatro semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente ocho semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente doce semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente dieciséis semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente veinticuatro semanas.
Se entiende que la dosis eficaz dependerá de los atributos del sujeto receptor, tales como, por ejemplo, edad, sexo, estado de gravidez, índice de masa corporal, masa corporal magra, afección o afecciones para las que se proporciona la composición, otras afecciones médicas del sujeto receptor que puedan afectar el metabolismo o la tolerancia a la composición, niveles de IL-6 en el sujeto receptor y resistencia a la composición (por ejemplo, que surgen cuando el paciente desarrolla anticuerpos contra la composición) . Un experto en la técnica será capaz de determinar una dosis y una frecuencia de administración eficaces a través de experimentos de rutina, por ejemplo, guiándose por las descripciones de la presente y las enseñanzas en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006) . Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics . New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C, & Mycek, M. J. (2006) . Pharmacology . Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins; and Golan, D. E. (2008) . Principies of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa . , [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins .
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, asi como combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo o variantes, se administran a un sujeto como una formulación farmacéutica.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para administración a un mamífero. Tales composiciones pueden formularse específicamente para administración mediante una o mas rutas que incluyen, de modo no taxativo, bucal, epicutáneo, epidural, inhalación, intraarterial, intracardial, intracerebroventricular, intradermal, intramuscular, intranasal, infraocular, intraperitoneal , intraespinal , intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal mediante un enema o supositorio, subcutáneo, subdermal, sublingual, transdermal y transmucosal . Además, la administración puede ocurrir por medios de inyección, polvo, líquido, gel, gotas u otros medios de administración.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos de unión a IL-6 o variantes de los mismos, así como combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo o variantes, se pueden administrar opcionalmente en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivirales y anticitocina . Agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , Hepcidina, que incluyen anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores y anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen ácidos 2-Arilpropiónicos, Aceclofenac, Acemetacina, ácido Acetilsalicilico (Aspirina) , Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, ácidos Arilalcanoicos , Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenac, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico, ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxen, ácidos N-Arilantranilicos , Oxametacina, Oxaprozin, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglucósidos , Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinsa, Cloramfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina , Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido Fusídico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos , Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrólidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactams, Moxifloxacina , Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos , Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas , Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina. Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides , Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona . Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, araantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija antiretroviral, un potenciador sinérgico antiretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxuridina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, -0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltaraivir , penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovi , vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir y zidovudina. Se contempla también cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.
Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un portador, normalmente un liquido, donde se formula un agente terapéutico activo. En una modalidad de la invención, el agente terapéuticamente activo es un anticuerpo humanizado descrito en la presente, o uno o más fragmentos o variantes del mismo. El excipiente en general no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica y características de liberación. Se pueden encontrar ejemplos de formulaciones, por ejemplo, en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 19* Ed., Grennaro, A., Ed., 1995, que se incorpora en la presente mediante esta referencia.
Tal como se usa en la presente un "portador farmacéuticamente aceptable" o un "excipiente" incluye cualesquiera solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes isotónicos y de absorción que son fisiológicamente compatibles. En una modalidad, el portador es adecuado para administración parenteral. De manera alternativa, el portador puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esterilizadas y/o polvos esterilizados para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables esterilizadas. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conocen bien en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea compatible con el compuesto activo, se contempla el ' uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios a las composiciones.
En una modalidad de la invención que puede usarse para administrar anticuerpos de la invención de forma intravenosa, incluido Abl, para indicaciones en cáncer; la formulación de administración comprende, o de manera alternativa consiste en, alrededor de 10.5 mg/mL de anticuerpo, 25 mM de base de histidina, ácido fosfórico c.s.p. a pH 6 y 250 mM de sorbitol.
En otra modalidad de la invención que puede usarse para administrar anticuerpos de la invención de forma intravenosa, incluido Abl, para indicaciones en cáncer; la formulación de administración comprende, o de manera alternativa consiste en, alrededor de 10.5 mg/mL de anticuerpo, 12.5 mM de base de histidina HC1 (o 25 mM de base de histidina y ácido clorhídrico c.s.p. a pH 6), 250 mM de sorbitol y 0.015% (p/p) de polisorbato 80.
En otra modalidad de la presente invención se refiere además al uso de los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos de anticuerpos objeto de la presente para el tratamiento de cánceres específicos en combinación con quimioterapéuticos , preferentemente inhibidores de EGFR y/o radiación y preferentemente donde esta combinación se administra usando un régimen de dosificación mediante el cual el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo anti-IL-6 hace que las células cancerosas sean más sensibles a la acción de la radiación o el quimioterapéutico . Estos métodos, en una modalidad preferida, comprenderán el tratamiento de cáncer usando un inhibidor de EGFR y un anticuerpo anti-IL-6 de acuerdo con la invención, tal como Abl humanizado o ALD518. Ejemplos no taxativos de cánceres que se pueden tratar usando esta combinación incluyen avanzado y no avanzado, incluyendo cánceres de pulmón metastásico, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, (HNSCC) , cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer anal, glioblastoma multiforme, cánceres epiteliales, carcinomas de células renales, leucemia mielógena crónica y otras leucemias.
Ejemplos de inhibidores de EGFR que se pueden administrar en regímenes terapéuticos con anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención incluyen, a modo de ejemplo, Cetuximab (Erbitux) disponible en ImClone, Erlotinib (Tarceva) disponible en OSI Pharmaceuticals , Lapatinib (Tykerb) disponible en Glaxo, Panitimumab (Vectibox) disponible en Amgen, Sunitinib o Sutent (N- (2-dietilaminoetil) -5- [ (Z) - ( 5-fluoro-2-???-lH-indol-3-ilideno)metil] -2, -dimetil-lH-pirrol-3-carboxamida) comercializado por Pfizer, Gefitinib (Iressa) o N- ( 3-cloro-4-fluoro-fenil ) -7-metoxi-6- ( 3-morfolin-4-ilpropoxi ) quinazolin-4-amina comercializado por AstraZeneca, Zalutumumab en desarrollo clínico mediante GenMab y otros.
La cantidad de anticuerpo administrado en combinación con el quimioterapéutico puede variar de alrededor de 5-1000 mg, más típicamente de alrededor de 25-500 mg, por ej . , 50, 80, 100, 150, 160, 200, 240, 250, 300, 320, 350, 400, 480 mg de regímenes de dosificación. El anticuerpo se puede administrar mediante diversos medios, por ej . , intravenosa o subcutáneamente, y se puede administrar junto con (en las mismas o diversas composiciones de dosificación) o separado del quimioterapéutico, tal como un inhibidor de EGFR.
En una modalidad preferida, el cáncer tratado será un cáncer de pulmón tal como un cáncer de pulmón no microcitico, por ej . , carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes o adenocarcinoma o un cáncer de pulmón microcitico tal como carcinoma de células pequeñas (cáncer de células de avena) o carcinoma de células pequeñas combinadas. En una modalidad preferida, el cáncer de pulmón tratado comprenderá carcinoma de células escamosas . En algunos casos se usarán estos métodos para tratar pacientes con cáncer donde el paciente manifestó una tolerancia al quimioterapéutico particular, tal como un inhibidor de EGFR, por ej . , Erlotinib o sunitinib o imatinib, tal vez como resultado de un EGFR mutante. Tal como se describe en Yao et ál., Proc.Natl. Acad. Sci., EUA y Nishioka et ál., Leukemia 23:2304-2308 (2009) la resistencia de algunos tumores y líneas celulares, tales como cánceres de pulmón y leucémicos, a quimioterapéuticos puede implicar respuestas inflamatorias que dan como resultado una expresión aberrante de IL-6 que puede hacer que el tumor sea más resistente a la quimioterapia. Además, los anticuerpos anti-IL-6 y fragmentos objeto de la presente se pueden usar para tratar cánceres que se han hecho resistentes a la radioterapia mediante la administración de un anticuerpo anti-IL-6 de acuerdo con la invención antes, junto con o después de la radiación.
En una modalidad preferida de la invención donde los anticuerpos se pueden usar para administrar anticuerpos de la invención de forma subcutánea, incluido Abl, para indicaciones en artritis reumatoide; la formulación de administración comprende, o de manera alternativa consiste en, alrededor de 50 o 100 mg/mL de anticuerpo, alrededor de 5 mM de base de histidina, alrededor de 5 mM HC1 de histidina para alcanzar finalmente un pH 6, 250 mM de sorbitol y 0.015% (p/p) de polisorbato 80. En otra modalidad de la invención que puede usarse para administrar anticuerpos de la invención de forma subcutánea, incluido Abl, para indicaciones en artritis reumatoide; la formulación de administración comprende, o de manera alternativa consiste en, alrededor de 20 o 100 mg/mL de anticuerpo, alrededor de 5 mM de base de histidina, alrededor de 5 mM HC1 de histidina para alcanzar finalmente un pH 6, 250 a 280 mM de sorbitol (o sorbitol en combinación con sucrosa) y 0.015% (p/p) de polisorbato 80, dicha formulación posee un espacio libre de nitrógeno en los recipientes de envío.
Las composiciones farmacéuticas típicamente deben estar esterilizadas y estables en condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica está presente en una forma liofilizada. La composición puede formularse como solución, microemulsión, liposoma u otra estructura adecuada para altas concentraciones del fármaco. El portador puede ser un medio solvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La invención contempla adicionalmente la inclusión de un estabilizador en la composición farmacéutica .
En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede ocasionarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, el polipéptido alcalino puede formularse en una formulación de liberación en el tiempo, por ejemplo en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán el compuesto de la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada que incluye implantes y sistemas microencapsulados de liberación. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles , tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres , ácido poliláctico y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG) . Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Para cada una de las modalidades descritas, los compuestos pueden administrarse por una variedad de formas de dosificación. Se contempla toda forma de dosis biológicamente aceptable conocida por expertos en la técnica y combinaciones de la misma. Ejemplos de dichas formas de dosificación incluyen, de modo no taxativo, polvos reconstituibles, elíxires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas , gránulos dispersables , sellos, inhalantes, inhalantes en aerosol, parches, inhalantes en partículas, implantes, implantes de depósito, inyectables (que incluyen subcutáneos, intramusculares, intravenosos y intradermales ) , infusiones y combinaciones de los mismos.
La descripción anterior de varias modalidades ilustradas de la invención no pretende ser taxativa ni limitar la invención a la forma concreta descrita. Mientras que modalidades específicas y ejemplos de la invención se describen en la presente con fines ilustrativos, es posible realizar varias modificaciones equivalentes dentro del alcance de la invención, así como aquellos expertos en la técnica correspondiente reconocerán. Las enseñanzas de la invención proporcionadas en la presente pueden aplicarse con otros fines distintos de los ejemplos descritos anteriormente.
Estos y otros cambios se pueden realizar a la invención en vista de la descripción detallada antes mencionada. En general, en las reivindicaciones a continuación, los términos usados no deberán entenderse como limitantes de la invención a modalidades específicas descritas en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones. Por consiguiente, su descripción no limita la invención pero en cambio el alcance de la invención será determinado totalmente por las reivindicaciones a continuación.
La invención puede ponerse en práctica en formas distintas aquellas descritas particularmente en la descripción anterior y en los ejemplos. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la invención en vista de las enseñanzas anteriores y por lo tanto se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ciertas enseñanzas relacionadas con los métodos para obtener una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno descritos en la solicitud de patente provisional estadounidense N° 60/801,412 presentada el 19 de mayo de 2006, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Ciertas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados del conejo y modificaciones preferidas de secuencias para mantener la afinidad de unión al antigeno fueron descritas en la solicitud internacional N° 12/124,723, correspondiente al N° de expediente del representante 67858.704001, titulado "Novel Rabbit Antibody Humanization Method and Humanized Rabbit Antibodies", presentado el 21 de mayo de 2008, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Ciertas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando levadura que puede aparearse y métodos correspondientes fueron descritos en la solicitud de patente estadounidense N° 11/429,053 presentada el 8 de mayo de 2006, (publicación de solicitud de patente estadounidense N° US2006/0270045) , cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Ciertas enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-IL-6, métodos para la producción de anticuerpos o fragmentos de estos usando levadura que puede aparearse y métodos correspondientes fueron descritos en la solicitud de patente provisional estadounidense N° 60/924, 550 presentada el 21 de mayo de 2007, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Ciertas enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-IL-6 y métodos para el uso de estos anticuerpos o fragmentos de estos para dirigirse a determinadas enfermedades o trastornos, fueron descritos en la solicitud de patente provisional estadounidense N° 61/117,839, 61/119,861 y 61/117,811 presentadas el 25 de noviembre de 2008, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Ciertos polinucleótidos y polipéptidos de anticuerpos anti- IL-6 se describen en el listado de secuencias que acompaña esta presentación de solicitud de patente y cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
La totalidad de la descripción de cada documento citado en la presente (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos de periódico, resúmenes, manuales, libros u otras descripciones), se incorpora en la presente en su totalidad como referencia .
Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo hacer y usar la invención mencionada y no se pretende que limiten el alcance de lo que se entiende por la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ej . , cantidades, temperaturas, concentraciones, etc.) pero se tendrán en cuenta ciertos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se da en grados centígrados y la presión es de o cercana a la atmosférica.
EJEMPLOS En los siguiente ejemplos, el término "Abl" se refiere a un anticuerpo que contiene la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 702 y la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 704, salvo en los casos en que el contexto indique lo contrario.
Ejemplo 1 Producción de cultivo de anticuerpo de linfocitos B específicos enriquecido para el antígeno Los paneles de anticuerpos se obtienen inmunizando animales hospedadores de anticuerpos tradicionales para explotar la respuesta inmunitaria nativa a un antígeno objetivo de interés. Típicamente, el hospedador usado para la inmunización es un conejo u otro hospedador que produce anticuerpos usando un proceso de maduración similar y proporciona una población de linfocitos B específicos para antígeno produciendo anticuerpos de diversidad comparable, por e . , diversidad epitópica. La inmunización de antígeno inicial puede conducirse usando un adyuvante de Freund (CFA) y los refuerzos posteriores efectuados con un adyuvante incompleto. Alrededor de 50-60 días luego de la inmunización, preferentemente el día 55, se prueban las titulaciones de anticuerpos y se inicia la Selección de Anticuerpos (ABS) si se establecen titulaciones de anticuerpos apropiadas. Los dos criterios clave para la iniciación de ABS son el reconocimiento de antígenos potentes y la actividad modificadora de funciones en el suero policlonal.
En el momento en que se establecen titulaciones de anticuerpos se sacrifican animales y se aislan fuentes de linfocitos B. Estas fuentes incluyen: el bazo, ganglios linfáticos, médula espinal y células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se generan suspensiones unicelulares y las suspensiones celulares se lavan para hacerlas compatibles con almacenamientos a largo plazo a baja temperatura. Luego las células se congelan típicamente.
Para iniciar el proceso de identificación de anticuerpos, una pequeña fracción de las suspensiones celulares congeladas se descongela, lava y se coloca en un medio de cultivo tisular. Estas suspensiones luego se mezclan con una forma biotinilada del antígeno usada para generar la respuesta inmunitaria del animal y se recuperan células especificas para antigeno usando los métodos de selección de células con cuentas magnéticas de Miltenyi. Se conduce un enriquecimiento especifico usando cuentas de estreptavidina . La población enriquecida se recupera y se desarrolla en la próxima fase de aislamiento de linfocitos B específicos .
Ejemplo 2 Producción de cultivo clonal que contiene linfocitos B específicos para antígeno Los linfocitos B enriquecidos producidos de , acuerdo con el Ejemplo 1 luego se colocan en placas a diversas densidades celulares por pocilio en una placa de microtitulación de 96 pocilios. En general esto es a 50, 100, 250 o 500 células por pocilio con 10 placas por grupo. El medio se complementa con un medio acondicionado de 4% de linfocitos activados de conejo junto con 50K de fibroblastos EL4B irradiados y congelados. Estos cultivos permanecen inalterados durante 5-7 días en los que se recoge el anticuerpo secretado que contiene sobrenadante y se evalúa para propiedades objetivo en un marco de ensayo separado. El sobrenadante remanente se deja intacto y la placa se congela a -70 °C. En estas condiciones, el proceso de cultivo resulta típicamente en pocilios que contienen una población celular mixta que comprende una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno, esto es, un solo pocilio solo contendrá un anticuerpo monoclonal simple específico para el antígeno deseado.
Ejemplo 3 Análisis de los sobrenadantes del anticuerpo para el anticuerpo monoclonal de especificidad deseada y/o propiedades funcionales Los sobrenadantes que contienen anticuerpos que proceden del pocilio que contiene una población de linfocitos B específicos para antígeno producida de acuerdo con el Ejemplo 2, se analizan inicialmente para reconocer antígenos usando métodos ELISA. Este incluye la inmovilización selectiva de antígenos (por ej . , captura de antígeno biotinilado por placas revestidas por estreptavidina) , revestimiento de placa para antígeno no específico o de manera alternativa, a través de una estrategia de concentración de antígeno (por e . , captura de antígeno selectivo seguido de la adición de un compañero de unión para generar un complejo heteromérico proteína-antígeno) . Luego los sobrenadantes de pocilio positivo para antígeno se prueban opcionalmente en un ensayo de modificación de función que depende estrictamente del ligando. Un ejemplo de estos es un ensayo de interacción proteína-proteína in vitro que recrea la interacción natural del ligando del antígeno con la proteína receptora recombinante . De manera alternativa, se utiliza una respuesta basada en la célula que depende del ligando y se monitorea fácilmente (por ej . , respuesta de proliferación) . El sobrenadante que muestre un significativo reconocimiento y potencia de antígeno se considera un pocilio positivo. Las células que proceden del pocilio positivo original luego efectúan una transición a la fase de recuperación del anticuerpo.
Ejemplo 4 Recuperación de un linfocito B simple que produce anticuerpos de especificidad del antigeno deseada Las células se aislan de un pocilio que contiene una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno (producidos de acuerdo con el Ejemplo 2 o 3) que secretan una secuencia de anticuerpos simple. Las células aisladas luego se ensayan para aislar una célula simple que secreta anticuerpos. Las cuentas de estreptavidina Dynal se recubren con antígenos objetivo biotinilados en un medio tamponado para preparar microcuentas que contienen antígenos con viabilidad celular. Las próximas cuentas cargadas de antígeno, células que producen anticuerpos a partir de un pocilio positivo y un anticuerpo IgG H&L anti-hospedador marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (tal como se observa, el hospedador puede ser cualquier hospedador mamífero, por ej . , conejo, ratón, rata, etc.) se incuban juntos a 37 °C. Esta mezcla luego se coloca nuevamente en una pipeta en alícuotas en un portaobjetos de manera tal que cada alícuota tiene como promedio un linfocito B simple que produce anticuerpos. Las células específicas para antígeno y que secretan anticuerpos luego se detectan a través de microscopía de fluorescencia. El anticuerpo secretado se concentra localmente en cuentas adyacentes debido al antígeno unido y proporciona información de localización basándose en la señal fluorescente fuerte. Las células que secretan anticuerpos se identifican mediante detección de FITC en complejos anticuerpo-antígeno formados adyacentes a la célula secretora. La célula simple encontrada en el centro de este complejo luego se recupera usando un micromanipulador . La célula se congela instantáneamente en un tubo PCR de Eppendorf para almacenamiento a -80 °C hasta que se inicie la recuperación de la secuencia de anticuerpos.
Ejemplo 5 Aislamiento de secuencias de anticuerpos a partir de linfocitos B específicos para antígeno Las secuencias de anticuerpos se recuperan usando un método combinado basado en RT-PCR a partir de un linfocito B simple aislado de acuerdo con el Ejemplo 4 o un linfocito B especifico antigénico aislado a partir de la población clonal de linfocitos B obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2. Se diseñan cebadores para hibridarse en regiones conservadas y constantes de los genes de inmunoglobulina objetivo (pesada y ligera) , tal como secuencias de inmunoglobulina de conejo y se usa un paso de recuperación de PCR anidado en dos pasos. Se analizan amplicones de cada pocilio para integridad de recuperación y tamaño. Los fragmentos resultantes luego se digieren con . AluI para identificar genéticamente la clonación de la secuencia. Las secuencias idénticas presentan un patrón de fragmentación común en su análisis electroforético . Significativamente, este patrón común de fragmentación que prueba la clonación de células se observa en general aun en los pocilios originalmente colocados en placas hasta 1000 células/pocilio. Los fragmentos de amplicón original de cadena pesada y ligera se digieren por enzima de restricción con HindIII y Xhol o HindIII y BsiWI para preparar las piezas respectivas de ADN para clonación. Las digestiones resultantes luego se ligan en un vector de expresión y se transforman en bacterias para la propagación y producción de plásmidos . Se seleccionan colonias para la caracterización de secuencias.
Ejemplo 6 Producción recombinante de anticuerpo monoclonal de especificidad del antigeno deseada y/o propiedades funcionales Se establecen las secuencias de anticuerpo de longitud completa correcta para cada pocilio que contiene un anticuerpo monoclonal simple y se prepara una miniprep de ADN usando metodología de fase sólida de Qiagen. El ADN luego se usa para transfectar células de mamífero para producir anticuerpos de longitud completa recombinante. Se prueba el producto de anticuerpo bruto para el reconocimiento de antígeno y se encuentran propiedades funcionales para confirmar las características originales en la proteína recombinante de anticuerpo. Cuando fuera apropiado, se contemplan las transfecciones mamíferas transitorias a gran escala y se purifica el anticuerpo a través de cromatografía de afinidad de Proteína A. Se evalúa el Kd usando métodos estándar (ej . Biacore™) así como IC50 en un ensayo de potencia.
Ej&mplo 7 Preparación de anticuerpos de unión a IL-6 humana Usando el protocolo de selección de anticuerpos descrito en la presente, se puede generar un panel extenso de anticuerpos. Los anticuerpos poseen alta afinidad para IL-6 (pM Kd de simple a doble dígito) y demuestran un potente antagonismo de IL-6 en múltiples sistemas de análisis basados en células (T1165 y HepG2) . Además, la recolección de anticuerpos presenta distintos modos de antagonismo hacia los procesos conducidos por IL-6.
Estrategia de inmunización Se inmunizaron conejos con huIL-6 (R&R) . La inmunización consistió en una primera inyección subcutánea (se) de 100 µ? en un adyuvante de Freund completo (CFA) (Sigma) seguido de dos refuerzos, con dos semanas de separación, de 50 µg cada uno en adyuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma). Los animales se desangraron el día 55 y se determinaron las titulaciones de suero mediante ELISA (reconocimiento de antígeno) y mediante ensayo de proliferación no radiactivo (Promega) usando la linea celular T1165.
Evaluación de la titulación en la selección de anticuerpos El reconocimiento del antigeno se determinó mediante el revestimiento de placas Immulon 4 (Thermo) con 1 µg/mL de huIL-6 (50 µ?/???????) en solución salina tamponada de fosfato (PBS, Hyclone) durante la noche a 4°C. El día del ensayo, las placas se lavaron 3 veces con PBS /T een 20 (tabletas PBST, Calbiochem) . Las placas luego se bloquearon con 200 µL/pocillo de 0.5% de gelatina de piel de pescado (FSG, Sigma) en PBS durante 30 minutos a 37 °C. La solución de bloqueo se eliminó y las placas se transfirieron. Las muestras de suero se realizaron (sangrados y presangrados ) en una dilución inicial de 1:100 (todas las diluciones se realizaron en FSG 50 µL/pocillo) seguida de diluciones 1:10 a través de la placa (la columna 12 se dejó en blanco para control de fondo) . Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20. Se agregó FC-HRP cabra anti-conejo (Pierce) diluido 1:5000 a todos los pocilios (50 µ?,/pocillo) y las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron tal como se describe anteriormente. 50 L/pocillo de detención TMB-Stable (Fitzgerald Industries) se agregó a las placas y se dejó desarrollar el color, en general durante 3 a 5 minutos. La reacción de desarrollo se detuvo con 50 L/pocillo 0.5 M HCl. Las placas se leyeron a 450 nm. La densidad óptica (OD) contra la dilución se gráfico usando un software Graph Pad Prizm y se determinaron las titulaciones.
Evaluación de la titulación funcional La actividad funcional de la muestras se determinó mediante un ensayo de proliferación T1165. Las células T1165 se mantuvieron de manera rutinaria en un medio RPMI modificado (Hyclone) complementado con HEPES, piruvato de sodio, bicarbonato de sodio, L-glutamina, glucosa alta, penicilina/estreptomicina, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (todos complementos de Hyclone), 2-mercaptoetanol (Sigma) y 10 ng/mL de huIL-6 (R&D) . El día del ensayo, la viabilidad celular se determinó mediante azul de tripano (Invitrogen) y las células se sembraron a una densidad fija de 20,000 células/pocilio. Antes del sembrado, las células se lavaron dos veces en el medio descrito anteriormente sin IL-6 humana (centrifugando a 13000 rpm durante 5 minutos y eliminando el sobrenadante) . Luego del último lavado, las células se volvieron a suspender en el mismo medio usado para su lavado en un volumen equivalente a 50 pL/pocillo. Las células se separaron a temperatura ambiente.
En una placa de fondo redondo de 96 pocilios (Costar) , se agregaron muestras de suero comenzando en 1:100 seguido de una dilución de 1:10 a través de la placa (columnas 2 a 10) a 30 L/pocillo en replicones de 5 (filas B a F: dilución llevada a cabo en el medio descrito anteriormente sin huIL-6) . La columna 11 solo sirvió de medio para control de IL-6. 30 µ?/??????? de huIL-6 a una concentración 4x del EC50 final (concentración previamente determinada) se agregó a todos los pocilios (huIL-6 se diluyó en el medio descrito anteriormente) . Los pocilios se incubaron durante 1 hora a 37 °C para permitir que ocurra la unión del anticuerpo. Luego de 1 hora, 50 L/pocillo del complejo anticuerpo-antigeno (Ab-Ag) se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocilios (Costar) siguiendo el formato de mapa de placa dispuesto en la placa de fondo redondo. En la fila G, se agregó 50 L/pocillo de medio a todos los pocilios: (columnas 2 a 11) para control de fondo. Se agregó 50 pL/pocillo de la suspensión celular separada se agregó a todos los pocilios (columnas 2 a 11, filas B a G) . En las columnas 1 y 12 y filas A y H, se agregó 200 µL/pocillo de medio para prevenir la evaporación de pocilios de prueba y para minimizar el efecto borde. Las placas se incubaron durante 72 h a 37 °C en 4% de CO2. A las 72 h, se agregó 20 pL/pocillo de reactivos CellTiter96 (Promega) a todos los pocilios de prueba el protocolo del fabricante y las placas se incubaron durante 2 h a 37 °C. A las 2 h, las placas se mezclaron delicadamente en un agitador orbital para dispersar las células y permitir la homogeneidad en los pocilios de prueba. Las placas se leyeron a 490 nm de longitud de onda. La densidad óptica (OD) contra la dilución se graficaron usando un software Graph Pad Prizm y se determinaron las titulaciones funcionales. Se condujo una placa de control de ensayo tal como se describió anteriormente usando MAB2061 (R&D Systems) en una concentración inicial de 1 µ /G??? (concentración final seguida de diluciones 1:3 a través de la placa.
Cultivo de tejidos Una vez que las titulaciones aceptables se establecieron se sacrificó o sacrificaron los conejos. El bazo, los ganglios linfáticos y la sangre se cultivaron y procesaron de la siguiente manera : El bazo y los ganglios linfáticos se procesaron en una suspensión unicelular mediante disociación del tejido y abriendo camino mediante una tela metálica esterilizada a 70 m (Fisher) con un émbolo de una jeringa de 20 ce. Las células se recogieron en el medio RPMI modificado descrito anteriormente sin huIL-6 pero con baja glucosa. Las células se lavaron dos veces por centrifugación. Luego del último lavado, la densidad celular se determinó por azul de tripano. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos; se eliminó el sobrenadante. Las células se volvieron a suspender en el volumen apropiado de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) en FBS (Hyclone) y se dispensaron a 1 ml/recipiente . Los recipientes luego se almacenaron a -70 °C durante 24 h previo a colocarlo en un tanque de nitrógeno liquido (LN2) para su almacenamiento a largo plazo.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mezclando sangre con partes iguales del medio de baja glucosa descrito anteriormente sin FBS . 35 mL de una mezcla de sangre se colocó en capas cuidadosamente sobre 8 mL de Lympholyte Rabbit (Cedarlane) en un tubo cónico de 45 mL (Corning) y se centrifugó por 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente sin detenerse. Luego de la centrifugación, las capas PBMC se eliminaron cuidadosamente usando una pipeta de vidrio Pasteur (VWR) , se combinaron y colocaran en un recipiente limpio de 50 mL. Las células se lavaron dos veces con el medio modificado descrito anteriormente por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y la densidad celular se determinó por teñido de azul de tripano. Tras el último lavado, las células se volvieron a suspender en un medio de volumen apropiado de 10% de DMSO/FBS y se congelaron tal como se describió anteriormente.
Cultivo de linfocitos B El día en que se establece el cultivo de linfocitos B, se descongelaron recipientes de PBMC, esplenocito o ganglios linfáticos para su uso. Los recipientes se eliminaron del tanque Ln2 y se colocaron en un baño de agua a 37 °C hasta descongelarse. El contenido de los recipientes se transfirió a un tubo de centrifugado cónico de 15 mL (Corning) y se agregó al tubo suavemente 10 mL de RPMI modificado descrito anteriormente. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1.5K rpm y se eliminó el sobrenadante. Las células se volvieron a suspender en 10 mL de un medio nuevo. La densidad y viabilidad celular se determinaron mediante azul de tripano. Las células se lavaron nuevamente y se volvieron a suspender en células 1E07/80 L medio. Se agregó huIL-6 biotinilado (B huIL-6) a la suspensión celular en la concentración final de 3 ug/mL y sE incubó durante 30 minutos a 4°C. Se eliminó B huIL-6 no unido con dos lavados de 10 mL de fosfato tamponado (PBF) :Ca/Mg libre de PBS (Hyclone) , 2 mM de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-libre de biotina) . Luego del segundo lavado, las células se volvieron a suspender en células 1E07/80 yL PBF. Se agregó 20 L de cuentas MACS® de estreptavidina (Milteni ) /células 10E7 a la suspensión celular. Las células se incubaron a 4°C durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez con 2 mL de PBF/células 10E7. Luego de lavarse, las células se volvieron a suspender en células 1E08/500 pL de PBF y se separaron. Se prelavó una columna MACS® MS (Milteni) con 500 mL de PBF en un mecano magnético (Milteni) . La suspensión celular se aplicó a la columna a través de un prefiltro y se recogió una fracción no unida. La columna se lavó con 1.5 mL de tampón PBF. La columna se eliminó del mecano magnético y se colocó en un tubo limpio esterilizado de 5 mL de polipropileno tipo Falcon. Se agregó 1 mL de tampón PBF a la parte superior de la columna y se recogieron células seleccionadas positivas. El rendimiento y la viabilidad de fracciones celulares positivas y negativas se determinaron mediante teñido de azul de tripano. La selección positiva proporcionó un promedio de 1% de la concentración celular inicial.
Se estableció un análisis celular modelo para proporcionar información acerca de niveles de siembra para el cultivo. Se sembraron tres grupos de 10 placas (un total de 30 placas) en 50, 100 y 200 linfocitos B enriquecidos/pocilio. Además/ cada pocilio contenia 50K células/pocilio de células irradiadas EL-4.B5 (5,000 Rads) y un nivel apropiado de sobrenadante de linfocitos T (que varia de 1-5% dependiendo de la preparación) en un medio modificado de alta glucosa RPMI con un volumen final de 250 µ?a/??????. Los cultivos se incubaron durante 5 a 7 días a 37 °C en 4% de C02.
Identificación de linfocitos B que secretan anticuerpos selectivos Los cultivos se probaron para reconocimiento de antigeno y actividad funcional entre los días 5 y 7.
Análisis de reconocimiento de antigeno El formato ELISA usado es tal como se describió anteriormente a menos que 50 µL de sobrenadante de los pocilios de cultivos de linfocitos B (BCC) (todas las 30 placas) se usaron como fuente del anticuerpo. El medio acondicionado se transfirió a placas revestidas de antigeno. Luego de que se identificaran placas positivas, el sobrenadante se eliminó y se transfirió a una/s placa/s principal/es de 96 pocilios. Las placas de cultivo originales se congelaron eliminando todos los sobrenadantes salvo 40 L/pocillo y agregando 60 L/pocillo de 16% DMSO en FBS . Las placas se envolvieron en toalla de papel para enlentecer el congelado y se colocaron a -70 °C.
Análisis de actividad funcional Las placas principales se analizaron para determinar la actividad funcional en el ensayo de proliferación T1165, tal como se describió anteriormente, salvo la fila B que fue medio solo para control de fondo, la fila C que fue medio + IL-6 para control de proliferación positiva y las filas D-G y columnas 2-11 que fueron pocilios de BCC (50 yL/pocillo, puntos simples) . Se agregó 40 yL de IL-6 a todos los pocilios, salvo la fila del medio 2.5 veces la concentración de EC50 determinada para el ensayo. Luego de 1 h de incubación, el complejo Ab/Ag se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocilios tratado con cultivo celular (TC) . Se agregó 20 µ?. de suspensión celular en un medio RPMI modificado sin huIL-6 (T1165 a 20,000 células/pocilio) a todos los pocilios (100 µ? de volumen final por pocilio) . Se sustrajo el fondo y los valores OD observados se transformaron en % de inhibición.
Recuperación de linfocitos B Las placas que contenían pocilios de interés se eliminaron de -70°C y las células de cada pocilio se recuperaron con 5-200 L lavados de medio/pocilio. Los lavados se acumularon en un tubo de centrifugado esterilizado de 1.5 mL y las células se granularon durante 2 minutos a 1500 rpm.
El tubo se invirtió, el giro se repitió y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Las células se volvieron a suspender en 100 L/tubo del medio. Se agregó a la suspensión celular 100 µ?> de Dynabeads biotiniladas M280 de estreptavidina revestidas con IL-6 (Invitrogen) y 16 µ?· de IgG-FITC H&L cabra anti-conejo diluido 1:100 en el medio.
Se eliminó 20 µ?_ de una suspensión célula/cuentas/FITC y se prepararon 5 µ?. de gotas en un portaobjetos (Corning) previamente tratadas con Sigmacote (Sigma) , 35 a 40 gotas/portaobjetos. Se agregó una barrera impermeable de gueroseno (JT Baker) para sumergir las gotas y se incubó el portaobjetos durante 90 minutos a 37°C, 4% de C02 en la oscuridad.
Los linfocitos B específicos que producen anticuerpos pueden identificarse por un anillo fluorescente alrededor de ellos debido a la secreción de anticuerpo, reconocimiento del antígeno biotinilado asociado con cuentas y la detección subsiguiente mediante el reactivo de detección fluorescente IgG. Una vez que la célula de interés se identificó, la célula en el centro del anillo fluorescente se recuperó a través de un micromanipulador (Eppendorf ) . La célula simple que sintetiza y exporta el anticuerpo se transfirió en un tubo de microcentri fugado y se colocó en hielo seco. Luego de recuperar todas las células de interés, estas se transfirieron a -70°C para almacenamiento a largo plazo.
Ejemplo 8 Expresión de células de levadura Genes de anticuerpos: Los genes se clonaron y se interpreta que dirigieron la síntesis de un anticuerpo monoclonal de conejo humanizado quimérico.
Vector de expresión: El vector contiene los siguientes componentes funcionales: 1) un origen mutante ColEl de replicación que facilita la replicación del vector plásmido en células de la bacteria Escheríchia coli; 2) un gen bacteriano Sh ble que confiere resistencia al antibiótico Zeocin™ (fleomicina) y sirve como marcador seleccionable para transformaciones tanto de E. coli como de P. pastoris; 3) un cassette de expresión del promotor del gen de gliceraldehido deshidrogenasa (gen GAP) , fusionado a las secuencias que codifican la secuencia líder del factor de apareamiento Saccharomyces cerevisiae alfa pre pro secreción, seguido de secuencias que codifican la señal transcripcional de terminación de P. pastoris del gen alcohol oxidasa I (AOXl) P. pastoris . El gen marcador de resistencia Zeocin™ (fleomicina) proporciona un medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa mediante la selección de transformadores resistentes a niveles más altos de Zeocin™ ( fleomicina ) .
Cepas P. pastoris: Se pueden usar las cepas, de P.pastoris metí, lys3, ura3 y adel. Aunque cualesquiera dos sets complementarios de cepas auxotróficas pueden usarse para la construcción y el mantenimiento de cepas diploides, estas dos cepas están especialmente ubicadas para este método por dos razones. Primero, crecen más despacio que las cepas diploides que son el resultado de su apareamiento o fusión. Por tanto, si una pequeña cantidad de células haploides adel o ura3 siguen presentes en un cultivo o surgen a través de la meiosis u otro mecanismo, la cepa diploide crecerá más en el cultivo.
Segundo, es fácil monitorear el estado sexual de estas cepas dado que las colonias diploides Ade+ que surgen de su apareamiento son de color blanco o crema regular mientras que las células de todas las cepas que son mutantes haploides adel formarán una colonia con un color rosado distinto. Además, todas las cepas que sean mutantes haploides ura3 son resistentes al fármaco ácido 5-fluoro-orótico (FOA) y pueden identificarse sensiblemente colocando en placas muestras de un cultivo en un medio mínimo + placas de uracilo con FOA. En estas placas, solo las cepas del mutante ura3 que requiere uracilo (supuestamente haploides) pueden crecer y formar colonias. Por tanto, con cepas progenitoras haploides marcadas con adel y uraJ, se puede monitorear rápidamente el estado sexual de las resultantes cepas diploides que producen anticuerpos (haploide contra diploide) .
Métodos Construcción de vectores de expresión pGAPZ-alfa para la transcripción de genes de anticuerpo de cadena ligera y pesada. Los fragmentos de cadena ligera y pesada humanizada se clonaron en vectores de expresión pGAPZ a través de un proceso dirigido a PCR. Las construcciones humanizadas recuperadas se sometieron a amplificación en condiciones de un kit de polimerasa KOD estándar (Novagen) ((1) 94 °C, 2 minutos; (2) 94°C, 30 segundos (3) 55 °C, 30 segundos; (4) 72 °C, 30 segundos alternados a través de pasos 2-4 durante 35 veces; (5) 72 °C 2 minutos) usando los siguientes cebadores (1) AGCGCTTATTCCGCTATCCAGATGACCCAGTC directa de cadena ligera-solo se subraya el sitio Afel. El final de la secuencia de señal HSA se subraya dos veces, seguido de la secuencia para la secuencia de cadena ligera variable madura (no se subraya) ; la CGTACGTTTGATTTCCACCTTG inversa.
Cebador inverso de cadena ligera variable. El sitio BsiWI se subraya seguido del complemento inverso para el extremo 3 ' de la cadena ligera variable. Tras la digestión de la enzima de restricción con Afel y BsiWI se permite la inserción dentro del marco con el vector pGAPZ usando la secuencia líder HAS humana dentro del marco con la región constante de cadena ligera kappa humana para exportar. (2) Se realiza una estrategia similar para la cadena pesada. El cebador directo empleado es AGCGCTTATTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC. Solo se subraya el sitio Af l. El final de la secuencia de señal HSA se subraya dos veces, seguido de la secuencia para la secuencia de cadena pesada variable madura (no se subraya) . El cebador de cadena pesada inverso es CTCGAGACGGTGACGAGGGT . El sitio Xhol se subraya seguido del complemento inverso para el extremo 3' de la cadena pesada variable. Esto permite la clonación de la cadena pesada dentro del marco con la región IgG-yl CH1-CH2-CH3 previamente insertada dentro de pGAPZ usando una estrategia de clonación direccional comparable .
Transformación de vectores de expresión en cepas hospedadoras haploides adel ura3, metí y lys3 de P. pastoris . Todos los métodos usados para la transformación de cepas haploides P. pastoris y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris se describen en Higgins, D. R., y Cregg, J. M., Eds . 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ.
Previo a la transformación, cada vector de expresión se linealiza dentro de las secuencias del cebador GAP con Avrll para dirigir la integración de los vectores en el locus del cebador GAP del genoma P. pastoris . Las muestras de cada vector se transforman individualmente en cultivos electrocompetentes de cepas adel , ura3, metí y lys3 mediante electroporación y se seleccionaron transformadores exitosos en placas YPD Zeocin™ (fleomicina) por sus resistencia a este antibiótico. Las colonias resultantes se seleccionan, se estrian para colonias simples en placas de YPD Zeocin™ (fleomicina) y luego se examinaron por la presencia de un inserto de gen de anticuerpo mediante un ensayo PCR en ADN genómico extraído de cada cepa para el inserto de gen de anticuerpo adecuado y/o mediante la capacidad de cada cepa de sintetizar una cadena de anticuerpo mediante un método de transferencia de colonias/inmunotransferencia (Wung et ál. Biotechniques 21 808-812 (1996)). Las cepas haploides adel, metí y lys3 que expresan una de las tres construcciones de cadena pesada se recogen para construcciones diploides junto con una cepa haploide ura3 que expresa un gen de cadena ligera. Los genes de cadena pesada que expresan haploides se aparean con la cadena ligera apropiada haploide ura3 para generar una proteína secretora diploide.
El apareamiento de cepas haploides que sintetizan una cadena de anticuerpo simple y la selección de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetraméricos . Para aparear cepas haploides P. pastoris, cada cepa que produce una cadena pesada adel (o metí o lys3) a ser cruzada se estría a través de una placa rica en YPD y la cepa que produce una cadena ligera ura3 se estria a través de una segunda placa YPD (~10 estrias por placa) . Luego de uno o dos días de incubación a 30 °C, las células de una placa que contiene cepas de cadena pesada y una placa que contiene cepas de cadena ligera ura3 sé transfieren a una tela de terciopelo esterilizada en un bloque de placas réplica en un patrón cruzado de incubación de manera que cada cepa de cadena pesada contiene un parche de células mezcladas con cada cepa de cadena ligera. Las células colocadas en placas réplica cruzadas y estriadas luego se transfieren a una placa de apareamiento y se incuban a 25 °C para estimular la iniciación del apareamiento entre las cepas. Luego de dos días, las células en placas de apareamiento se transfieren nuevamente a un terciopelo esterilizado en un bloque de placas réplica y luego se transfieren a placas de medio mínimo. Estas placas se incuban a 30 °C durante tres días para permitir el crecimiento selectivo de colonias de cepas diploides prototróficas . Las colonias que surgen se eligen y se estrían sobre una segunda placa de medio mínimo para aislar la colonia simple y purificar cada cepa diploide . Las líneas celulares diploides resultantes se examinan luego para la producción de anticuerpos.
Las supuestas cepas diploides se prueban para demostrar que son diploides y que contienen ambos vectores de expresión para la producción de anticuerpos. Para diploidía, las muestras de una cepa se propagan en placas de apareamiento para estimularlas a someterse a meiosis y formar esporas. Los productos de esporas haploides se recogen y prueben para fenotipo. Si un porcentaje significativo de los productos de espora resultantes son auxótrofos simples o dobles se puede concluir que la cepa original debe haber sido diploide. Las cepas diploides se examinaron para la presencia de ambos genes de anticuerpo extrayendo el ADN genómico de cada uno y utilizando este ADN en reacciones PCR especificas para cada gen.
La fusión de cepas haploides que sintetizan una cadena de anticuerpo simple y la selección de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetraméricos . Como una alternativa al procedimiento de apareamiento descrito anteriormente, los cultivos individuales de anticuerpo de cadena simple que producen cepas haploides adel y ura3 se someten a esferoplasto y sus esferoplastos resultantes se fusionan usando polietilenglicol/CaCl2. Las cepas haploides fusionadas luego se incluyen en agar que contiene 1 M de sorbitol y un medio mínimo para permitir que las cepas diploides regeneren su pared celular y desarrollen colonias visibles. Las colonias resultantes se recogen del agar y se estrían en una placa de medio mínimo y las placas se incuban durante dos días a 30 °C para generar colonias a partir de células simples de líneas celulares diploides. Las supuestas líneas celulares diploides resultantes luego se examinan para diploidía y producción de anticuerpo tal como se describió anteriormente.
Purificación y análisis de anticuerpos. Una cepa diploide para la producción de anticuerpo de longitud total surge del apareamiento de la cadena ligera metí y la cadena pesada lys3 usando los métodos descritos anteriormente. Los medios de cultivo de los cultivos de frasco agitador o termentador de cepas de expresión diploide de P. pastoris se recogen y examinan para la presencia de la proteina de anticuerpo a través' de SDS-PAGE e inmunotransferencia usando anticuerpos dirigidos contra cadenas pesadas y ligeras de IgG humana o específicamente contra la cadena pesada de IgG.
Para purificar los anticuerpos secretados de levadura, los medios clarificados de un anticuerpo que produce cultivos se pasan a través de una columna de proteína A y luego de lavarse con 20 mM de fosfato de sodio, a pH 7.0, tampón de unión, la proteína unida a la proteína A se eluye usando 0.1 M de tampón de glicina HC1, pH 3.0. Las fracciones que contienen la mayoría total de proteínas se examinan mediante SDS-PAGE tamizado Coomasie blue e inmunotransferencia para proteínas de anticuerpos. El anticuerpo se caracteriza usando el ELISA descrito anteriormente para reconocimiento de IL-6.
Ensayo de actividad de anticuerpo . El anticuerpo recombinante derivado de levadura se evalúa para determinar la actividad funcional a través de un ensayo de proliferación celular T1165 conducido por IL-6.
Ejemplo 9 Neutralización de la respuesta en fase aguda mediante administración intravenosa de anticuerpo anti-IL-6 de Abl.
La IL-6 humana puede provocar una respuesta de fase aguda en ratas y una de las proteínas de fase aguda más relevante que se estimula en la rata es macroglobulina alfa-2 (A2M) . Se diseñó un estudio para evaluar la dosis del anticuerpo' Abl requerido para extirpar la respuesta A2M a una única inyección s.c. de 100 pg de IL-6 humana administrados una hora después de las diferentes dosis (0.03, 0.1, 0.3, 1 y 3 mg/kg) del anticuerpo Abl administrado de forma intravenosa (n=10 ratas/nivel de dosis) o IgGl humana policlonal como (n=10 ratas) . Se recuperó el plasma y la A2 se cuantificó mediante un kit intercalado de ELISA comercial (ICL Inc., Newberg OR; cat. no.- E-25A2M) . El criterio de valoración fue la diferencia en la concentración de A2M en plasma en el punto de la hora 24 (luego de Abl) . Los resultados se muestran en la Figura 4.
La ID50 para el anticuerpo Abl fue 0.1 mg/kg con supresión completa de la respuesta A2M a 0.3 mg/kg. Esto establece firmemente que la neutralización in vivo de la IL-6 humana puede lograrse mediante el anticuerpo Abl.
Ejemplo 10 Estudio modelo 1 de caquexia XF393 Introducción La linea celular de cáncer renal humano, R^F393, produce una gran pérdida de peso al transplantarse a ratones lampiños atímicos . La pérdida de peso comienza alrededor del día 15 luego del transplante con el 80% de los animales perdiendo al menos el 30% del peso corporal total alrededor de los días 18-20 luego del transplante. RXF393 secreta IL-6 humana y la concentración de IL-6 humana en plasma en estos animales es muy alta alrededor de 10ng/mL. IL-6 humana puede unirse al receptor de IL-6 soluble murino y activar las respuestas de IL-6 en el ratón. IL-6 humana es aproximadamente 10 veces menos potente que IL-6 murina en la activación de respuestas de IL-6 en el ratón. Los objetivos de este estudio fueron determinar el efecto del anticuerpo Ablen parámetros de supervivencia, peso corporal, proteina A amiloide sérica, hematología y crecimiento tumoral en ratones lampiños atímicos transplantados con la línea celular de cáncer renal humano, RXF393.
Métodos A ochenta ratones lampiños atímicos de 6 semanas de edad se les implantaron fragmentos de tumor RXF393 (30-40 mg) de forma subcutánea en el lado derecho. Los animales luego se dividieron en ocho grupos de diez ratones. A tres grupos se les dio ya sea 3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg de anticuerpo abl de forma intravenosa semanalmente el día 1, día 8, día 15 y día 22 luego del transplante (grupos de evolución) . A otros tres grupos se les dio ya sea 3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg de anticuerpo abl de forma intravenosa semanalmente el día 8, día 15 y día 22 luego del transplante (grupos de regresión) . Finalmente, a un grupo de control se le dio 30 mg/kg de IgG humano policlonal y a un segundo grupo de control se le dio solución salina tamponada con fosfato de forma intravenosa semanalmente el día 1, el día 8, día 15 y día 22 luego del transplante.
Los animales se sometieron a eutanasia ya sea el día 28 cuando el tumor alcanzó los 4,000 mm3 o cuando se debilitaron (>30% de pérdida de peso corporal) . Los animales se pesaron los días 1 y 6 y luego diariamente desde el día 9 al 28 luego del transplante. Se usó el promedio de porcentaje de peso corporal (MPBW) como principal parámetro para monitorear la pérdida de peso durante el estudio. Se calculó de esta manera: (peso corporal-peso del tumor) /peso corporal de referencia x 100. El peso del tumor se midió los días 1, 6, 9, 12, 15, 18, 22, 25 y 28 luego del transplante. Se sacó sangre bajo anestesia de cinco ratones en cada grupo los días 5 y 13 y todos los diez ratones en cada grupo se sometieron a eutanasia (en la mayoría de los casos el día 28) . Se analizó la sangre para concentración de proteína A amiloide hematológica y sérica (SAA) . A un grupo adicional de 10 ratones lampiños atímicos de 6 semanas de edad sin tumor se le sacaron muestras de sangre para estimar la concentración hematológica y de SAA para actuar como conjunto de valores de referencia .
Resultados - Supervivencia No se sometieron a eutanasia ni murieron animales del grupo del anticuerpo Abl previo a la fecha de finalización del estudio el día 28. En dos de los grupos de control, 15 animales (7/9 en el grupo de IgG humana policlonal y 8/10 en el grupo de solución salina tamponada con fosfato) fueron encontrados muertos o fueron sometidos a eutanasia debido a que estaban debilitados (>30 de pérdida de peso corporal) . El tiempo medio de supervivencia en ambos grupos de control fue 20 días.
Las curvas de supervivencia para dos de los grupos de control y los grupos de evolución del anticuerpo Abl (dosificados a partir del día 1 del estudio) se presentan en la Figura 5.
Las curvas de supervivencia para dos de los grupos de control y los grupos de regresión del anticuerpo Abl (dosificados a partir del día 8 del estudio) se presentan en la Figura 6.
Existió una diferencia estadísticamente significativa entre las curvas de supervivencia para los grupos de control de IgG humana policlonal (p=0.0038) y de solución salina tamponada con fosfato (p=0.0003) y la curva de supervivencia para los seis grupos del anticuerpo Abl. No hubo estadísticamente ninguna diferencia entre los dos grupos de control (p=0.97) .
Resultados - Tamaño del tumor El tamaño del tumor en los ratones supervivientes se estimó por palpación. En los primeros 15 días del estudio, ninguno de los ratones de ningún grupo se encontró muerto ni se sometió a eutanasia y por tanto la comparación de tamaños de tumor entre grupos estos días está libre de sesgos de muestreo. No se observó diferencia alguna en el tamaño del tumor entre los grupos de evolución o regresión de anticuerpo Abl y los grupos de control hasta el día 15. No se emprendió una comparación de los tamaños de tumor entre los ratones supervivientes en los grupos de control y tratamiento subsiguientes al comienzo de la mortalidad en los ratones (el día 15) , dado que el tamaño del tumor en ratones de control supervivientes estaba supuestamente sesgado y por lo tanto los resultados de esa comparación no serian significativos.
Como la administración del anticuerpo Abl promovió la supervivencia sin reducción aparente del tamaño del tumor, la IL-6 sérica elevada puede contribuir a la mortalidad mediante mecanismos independientes de crecimiento tumoral. Las observaciones soportan la hipótesis de que el anticuerpo Abl puede promover la supervivencia del paciente con cáncer sin afectar directamente el crecimiento tumoral, posiblemente potenciando el bienestar del paciente en general.
Resultados - Pérdida de peso El promedio del porcentaje de peso corporal ( PBW) (± SEM) contra el tiempo se muestra en la Figura 27. Comparado con otros controles, los ratones dosificados con Abl se protegieron contra la pérdida de peso. El día 18, el MPBW en ratones de control fue de 75%, correspondiente a una pérdida de peso promedio de 25%. En contraste, el mismo dia, el MPBW en grupos de tratamiento con Ab-1 se cambió mínimamente (entre 97% y 103%) . Hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las curvas de MPBW para controles (que reciben IgG humana policlonal o PBS) y 10 mg/kg de grupo de dosificación (p<0.0001) o 3 mg/kg y 30 mg/kg de grupos de dosificación (p<0.0005) . No hubo estadísticamente ninguna diferencia entre los dos grupos de control.
Fotografías representativas de los ratones de control y tratados con Abl (Figura 28) ilustran la condición demacrada de los ratones de control comparados con la apariencia normal ratón tratado con Abl al final del estudio (nótese sitios tumor visibles externamente en el lado derecho) .
Estos resultados sugieren que Abl puede ser útil para prevenir o tratar caquexia causada por IL-6 elevada en humanos.
Resultados - Plasma amiloide sérica A La concentración promedio en plasma amiloide sérica A (± SEM) contra el tiempo para dos grupos de control y los grupos de evolución (dosificados desde el dia 1 del estudio) y de regresión (dosificados desde el dia 8 del estudio) del anticuerpo Abl se presentaron en la Tabla 5 y gráficamente en la Figura 32.
Tabla 5: Plasma promedio SAA-anticuerpo Abl, todos los grupos contra grupos de control SAA se regula por aumento a través de la estimulación de hIL-6 y esta respuesta se correlaciona directamente con niveles circulantes de hIL-6 que surgen del tumor implantado. El marcador sustituto proporciona una lectura indirecta de hIL-6 activa. Por tanto en dos grupos de tratamiento descritos anteriormente existen niveles significativamente disminuidos de SAA debido a la neutralización de hIL-6 que derivan de un tumor. Este soporta adicionalmente que la discusión del anticuerpo Abl muestra eficacia in vivo.
Ejemplo 11 Estudio modelo 2 de caquexia RXF393 Introducción Se realizó un segundo estudio en el modelo de caquexia RXF-393 donde el tratamiento con el anticuerpo Abl comenzó en una etapa posterior (días 10 y 13 luego del transplante) y con una fase de tratamiento más prolongada (hasta 49 días luego del transplante) . El intervalo de dosificación con el anticuerpo Abl se acortó a 3 días de 7 y también se midió el consumo diario de alimentos. También hubo un intento de estandarizar los tamaños de tumor al momento de iniciar la dosificación con el anticuerpo Abl.
Métodos A ochenta ratones lampiños atimicos macho de 6 semanas de edad se les implantaron fragmentos de tumor RXF393 (30-40 mg) de forma subcutánea en el lado derecho. Se seleccionaron 20 ratones cuyos tumores alcanzaron entre 270-320 mg de tamaño y se dividieron en dos grupos. Un grupo recibió el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días y el otro grupo recibió 10 mg/kg de IgG humana policonal cada 3 días desde ese punto en el tiempo (día 10 luego del transplante) . Se seleccionaron otros 20 ratones cuando su tamaño de tumor alcanzó 400-527 mg de tamaño y se dividieron en dos grupos. Un grupo recibió el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días y el otro grupo recibió 10 mg/kg de IgG humana policonal cada 3 días desde ese punto en el tiempo (día 13 luego del transplante) . Los 40 ratones restantes no fueron más parte del estudio y se sometieron a eutanasia ya sea el día 49, cuando el tumor alcanzó 4,000 mm3 o cuando se tornaron muy debilitados (>30% de pérdida de peso corporal) .
Los animales se pesaron cada 3-4 dias a partir del día 1 al dia 49 luego del transplante. Se usó el promedio de porcentaje de peso corporal (MPBW) como principal parámetro para monitorear la pérdida de peso durante el estudio. Se calculó de esta manera: ((peso corporal - peso del tumor) /peso corporal de referencia) x 100. El peso del tumor se midió cada 3-4 días a partir del día 5 al día 49 luego del transplante. El consumo de alimento se midió (cantidad consumida en 24 horas por peso (g) por cada grupo de tratamiento) cada día por grupos tumorales de 270-320 mg y el día 13 por grupos tumorales de 400-527 mg.
Resultados - Supervivencia Las curvas de supervivencia para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) contra 10 mg/kg i.v la IgG humana policlonal cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) se presentan en la Figura 7.
La supervivencia mediana para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) fue 46 días y para 10 mg/kg i.v de IgG humana policlonal cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) fue 32.5 días (p=0.0071) .
Las curvas de supervivencia para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) contra 10 mg/kg i.v la IgG humana policlonal cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) se presentan en la Figura 8. La supervivencia mediana para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) fue 46.5 días y para 10 mg/kg i.v de IgG humana policlonal cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) fue 27 días (p=0.0481) .
Ejemplo 12 Evaluación de dosificación múltiple farmacocinetica de anticuerpo Abl en primates no humanos.
El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo a un único mono macaco masculino y un único femenino en solución salina tamponada con fosfato. Se eliminaron muestras de plasma en intervalos de tiempo fijo y el nivel de anticuerpo Abl se cuantificó a través del uso de un ensayo ELISA de captura de antígeno. Se capturó IL-6 (50 µ? de 3 ug/mL) en placas de microtitulación de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina . Las placas se lavaron y bloquearon con 0.5% de gelatina de piel de pescado. Las muestras de plasma diluida apropiadamente se agregaron e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se eliminaron y se aplicó un segundo anticuerpo anti-hFc-HRP conjugado y se dejó a temperatura ambiente.
Las placas luego se aspiraron y se agregó t B para visualizar la cantidad de anticuerpo. Los niveles específicos luego se determinaron mediante el uso de una curva estándar. Una segunda dosis de anticuerpo Abl se administró el día 35 a los dos mismos monos macacos y se replicó el experimento usando un plan de muestreo idéntico. Las concentraciones resultantes son entonces gráfico contra tiempo tal como se muestra en la Figura 9.
Este anticuerpo aglicosilado humanizado de longitud total expresado y purificado Pichia pastoris muestra características comparables con la proteína mamífera expresada. Además, las dosis múltiples de este producto muestran semividas reproducibles infiriendo que la plataforma de producción no genera productos que muestran inmunogenicidad mejorada.
Ejemplo 13 Caracterización mecánica del octeto de proteínas de anticuerpo La señalización de IL-6 depende de las interacciones entre IL-6 y dos receptores, IL-6R1 (CD126) y gpl30 (IL-6 transductora de señales). Para determinar el mecanismo de acción del anticuerpo, se realizaron estudios mecánicos usando interferometría de biocapas con un instrumento Octet Q (ForteBio; Menlo Park, CA) . Se realizaron estudios en dos configuraciones diferentes. En esta primera orientación, la IL-6 biotinilada (número de partes de sistemas R&D 206-IL-001MG/CF, biotinilada usando Pierce EZ-link sulfo-NHS-LC-LC-biotin número de producto 21338 de acuerdo con los protocolos del fabricante) se unieron inicialmente a un biosensor recubierto con estreptavidina (número de parte ForteBiol8-5006) . La unión se monitorea como un aumento de señal.
La IL-6 unida al sensor luego se incubó ya sea con el anticuerpo en cuestión o la solución diluyente sola. El sensor luego se incubó con una molécula de IL-6R1 soluble (número de producto de sistemas R&D 227-SR-025/CF) . Si la molécula de IL-6R1 no pudiera unirse, se entiende que el anticuerpo bloquea las interacciones de IL-6/IL-6R1. Estos complejos se incubaron con gpl30 (sistemas R&D 228-GP-010/CF) en presencia de IL-6R1 con fines de estabilidad. Si gpl30 no se uniera, se concluye que el anticuerpo bloqueó las interacciones de gpl30 con IL-6.
En la segunda orientación, el anticuerpo se unió a un biosensor recubierto con un reactivo especifico anti-humano IgGl Fe (número de parte ForteBiol8-5001 ) . La IL-6 se unió al anticuerpo inmovilizado y el sensor se incubó con IL-6R1. Si la IL-6R1 no interactúa con la IL-6, entonces se concluye que el anticuerpo de unión de IL-6 bloqueó las interacciones de IL-6/IL-6R1. En las situaciones en que se observa el anticuerpo/IL-6/IL-6R1, el complejo se incuba con gpl30 en presencia de IL-6R1. Si gpl30 no interactuara, se concluye entonces que el anticuerpo bloqueó las interacciones de IL-6/gpl30. Todos los estudios se realizaron en un volumen final de 200 \i , a 30C y 1000 rpms . Para estos estudios, se diluyeron todas las proteínas usando una muestra de tampón diluyente ForteBio (número de parte 18-5028) .
Los resultados se presentan en la Fig. 10 (A-E) y Fig. 11.
Ejemplo 14 Mapeo peptídico Para determinar el epítopo reconocido por Abl en IL-6 humana, el anticuerpo se usó en un ensayo basado en una transferencia Western. La forma de IL-6 humana utilizada en este ejemplo tuvo una secuencia de 183 aminoácidos de longitud (mostrado a continuación) . Se sintetizó comercialmente una biblioteca de 57 miembros de 15 péptidos de aminoácidos superpuestos que comprende esta secuencia y se unió covalentemente a una membrana de nitrocelulosa PepSpots (JPT Peptide technologies, Berlín, Alemania) . Las secuencias de 15 péptidos de aminoácidos superpuestos se muestran en la Figura 12 y corresponden a las SEQ ID NO: 590-646. Las bandas se prepararon y sondaron de acuerdo con recomendaciones del fabricante.
En resumen, las bandas se premojaron en metanol, se enjuagaron en PBS y se bloquearon por más de 2 horas en 10% de leche descremada en PBS/0.05% Tween (solución bloqueante). El anticuerpo Abl se usó en una dilución final de 1 mg/mL y se usó el anticuerpo secundario Anti-Humano-Kappa de ratón conjugado con HRP (Southern BioTech #9220-05) en una dilución de 1:5000. Las diluciones/incubaciones del anticuerpo se realizaron en una solución bloqueante. Las transformaciones se desarrollaron usando reactivos previos de Amersham ECL (GE# RPN2135) y señal quimioluminiscente documentados usando una cámara CCD (Alphalnnotec) . Los resultados de las bandas se muestran en las Figuras 13 y 14.
La secuencia de la forma de IL-6 humana utilizada para generar una biblioteca de péptidos se establece en: VPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPK MAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAK NLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM (SEQ ID NO: 1) .
Ejemplo 15 Abl tiene alta afinidad para IL-6.
Se usó una resonancia de plasmones superficiales para medir la tasa de asociación (Ka) , tasa de disociación (K¿) y constante de disociación (KD) para Abl para IL-6 de rata, , ratón, perro, humano y mono macaco a 25°C (Figura 15A) . La constante de disociación para IL-6 humana fue 4 pM, indicando una afinidad muy alta. Tal como se esperaba, la afinidad en general disminuyó con distancia filogenética de la humana. Las constantes de disociación de Abl para IL-6 de monos macacos, ratas y ratones fueron 31 pM, 1.4 nM y 0.4 nM, respectivamente. La afinidad de Abl para IL-6 de perro está por debajo del limite de cuantificación del experimento.
La alta afinidad de Abl para 11-6 de ratón, rata y mono macaco sugiere que Abl pueda ser usado para inhibir 11-6 de estas especies. Esta hipótesis se probó usando un ensayo de proliferación celular. En resumen, cada IL-6 de estas especies se usó para estimular la proliferación de células T1165 y se midió la concentración en la que Abl pudo inhibir el 50% de proliferación (IC5.0) . La inhibición coincide con las constantes de disociación medidas (Figura 15B) . Estos resultados demuestran que Abl puede inhibir la IL-6 nativa de estas especies y sugieren el uso de estos organismos para modelado in vitro o in vivo de inhibición de IL-6 por Abl.
Ejemplo 16 Evaluación de dosificación múltiple farmacocinética de anticuerpo Abl en voluntarios humanos sanos .
El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo en histidina y sorbitol a voluntarios humanos sanos. Las dosis de 1 mg, 3 mg, 10 mg, 30 mg o 100 mg se administraron a cada individuo en grupos de dosificación que contienen cinco a seis individuos. Las muestras de plasma se eliminaron en intervalos de tiempo fijos por hasta doce semanas. El plasma humano se recogió a través de venupunción en un tubo de extracción al vacio que contiene EDTA. El plasma se separó y usó para evaluar los niveles de circulación de Abl usando un anticuerpo monoclonal especifico para Abl, tal como sigue. Se recubrió una placa de microtitulación de 96 pocilios durante la noche con el anticuerpo monoclonal especifico para Abl en IX PBS durante la noche a 4 °C. Las etapas restantes se condujeron a temperatura ambiente. Los pocilios se aspiraron y se bloquearon posteriormente usando 0.5% de gelatina de piel de pescado (FSG) (Sigma) en IX PBS durante 60 minutos. Las muestras de plasma humano luego se agregaron e incubaron durante 60 minutos, luego se aspiraron, luego se agregó 50 L de 1 µg/mL de IL-6 biotinilada a cada pocilio y se incubaron durante 60 minutos. Los pocilios se aspiraron y se agregó 50 L de estreptavidina-HRP (Pharmingeñ) , en 1:5,000 diluidos en 0.5% FSG/PBS y se incubaron durante 45 minutos. El desarrollo se condujo usando métodos estándar empleando TMB para detección. Los niveles luego se determinaron mediante comparación con una curva estándar preparada en un formato comparable.
La concentración en plasma promedio de Abl para cada grupo de dosificación contra tiempo se muestra en la Figura 16. Los promedios de AUC y Cmáx aumentaron de forma lineal con la dosificación (Figuras 17 y 18, respectivamente). Para dosis de 30 mg y más, el promedio de la semivida de Abl en cada grupo de dosificación fue aproximadamente de entre 25 y 30 días (Figura 19) · Ejemplo 17 Farmacocinética de Abl en pacientes con cáncer avanzado .
El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo en solución salina tamponada con fosfato para cinco individuos con cáncer avanzado. Cada individuo recibió una dosis de 80 mg (n=2) o 160 mg (n=3) de Abl. Las muestras de plasma se tomaron semanalmente y el nivel de anticuerpo Abl se cuantificó como en el Ejemplo 16.
La concentración en plasma promedio de Abl en estos individuos como función del tiempo se muestra en la Figura 20. El promedio de semivida de Abl fue de aproximadamente 31 días.
Ejexaplo 18 Semivida sin precedentes de Abl .
En general, la semivida promedio de Abl fue de aproximadamente 31 días en humanos (para dosificaciones de 10 mg y más) y de aproximadamente 15-21 días en el mono macaco. La semivida de Abl en humanos y monos macacos no tiene precedentes cuando se compara con la semivida de otros anticuerpos anti-IL-6 (Figura 21) . Tal como se describe, el Abl surge de la humanización de un anticuerpo de conejo y se produce a partir de Pichia pastoris en forma aglicosilada . Estas características dan como resultado un anticuerpo con muy poca inmunogenicidad en humanos. Además, la falta de glicosilación evita que Abl interactúe con el receptor o complemento de Fe. Sin el ánimo de limitarse a la teoría, se cree que la semivida sin precedentes de Abl es al menos parcialmente atribuible a la humanización y/o falta de glicosilación. La secuencia y/o estructura particular de las superficies de unión al antígeno también pueden contribuir a la semivida de Abl .
Ejemplo 19 Efecto de Abl en la concentración de hemoglobina, concentración de lipidos en plasma y conteos de neutrófilos en pacientes con cáncer avanzado.
El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo en solución salina tamponada con fosfato a ocho individuos con cáncer avanzado (NSCLC, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma o mesotelioma) . Cada individuo recibió una dosis de 80 mg, 160 mg, o 320 mg de Abl. Se extrajeron muestras de sangre antes de la infusión y a intervalos de tiempo establecidos durante seis semanas y se determinó la concentración de hemoglobina, la concentración de lipidos en plasma y los conteos de neutrófilos. La concentración promedio de hemoglobina aumentó levemente (Fig. 22), asi como también el colesterol total y los triglicéridos (Fig. 23), mientras que los conteos promedio de neutrófilos disminuyeron levemente (Fig. 24) .
Estos resultados demuestran adicionalmente algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Abl a individuos con enfermedades crónicas. Debido a que la IL-6 es la citocina principal responsable de la anemia de enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer) , la neutralización de IL-6 mediante Abl aumenta la concentración de hemoglobina en estos individuos. De manera similar, debido a que la IL-6 es muy importante en el aumento de conteos de neutrófilos en la inflamación, la leve reducción observada en los conteos de neutrófilos confirma adicionalmente que Abl inhibe la IL-6. Finalmente, la IL-6 causa anorexia asi como también caquexia en estos pacientes; la neutralización de IL-6 mediante Abl hace que se recupere el apetito y se revierta la caquexia. El aumento de las concentraciones de lipidos en plasma refleja el estado nutricional mejorado de los pacientes. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran adicionalmente que Abl eficazmente revierte estas consecuencias adversas de la IL-6 en estos pacientes.
Ejemplo 20 Abl suprime la CRP en suero en voluntarios sanos y en pacientes con cáncer avanzado.
Introducción Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con determinadas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et ál. llevó a cabo análisis univariado y multivariado de concentraciones de CRP en suero preoperativas en pacientes con carcinoma hepatocelular para identificar factores que afectan la supervivencia y recurrencia de la enfermedad (Hashimoto, K . , et ál., Cáncer, 103 ( 9) : 1856-1864 (2005) ) . Se clasificó a los pacientes en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1.0 mg/dL ("grupo con CRP positiva") y aquellos con niveles de CRP en suero < 1.0 mg/dL ("grupo con CRP negativa") . Los autores describieron "una correlación importante entre el nivel de CRP en suero preoperatorio y el tamaño del tumor". Id. Además, los autores encontraron que "[l]as tasas de supervivencia general y supervivencia sin recurrencia en el grupo con CRP positiva fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas del grupo con CRP negativa." Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP preoperatorio en pacientes es un importante indicador predictivo independiente o prognosis pobre y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular .
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et ál. determinó que la CRP en suero era un predictor independiente e informativo de la mortalidad especifica del carcinoma de células renales (Karakiewicz, P.I., et ál., Cáncer, 110 ( 6) : 1241-1247 (2007)) . Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteina C reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer y particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Los voluntarios sanos recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de ya sea 100 mg (5 pacientes), 30 mg (5 pacientes), 10 mg (6 pacientes), 3 mg (6 pacientes) o 1 mg (6 pacientes) de anticuerpo monoclonal Abl, mientras que otros 14 voluntarios sanos recibieron placebo intravenoso. De manera comparativa, 2 pacientes con formas avanzadas de cáncer colorrectal recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de 80 mg del anticuerpo monoclonal Abl. No se administraron dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ahí semanalmente durante al menos 5 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó la concentración de CRP en suero en los pacientes.
Resultados Voluntarios sanos Tal como se menciona anteriormente, los niveles de CRP en suero son un marcador de inflamación; por consiguiente, los niveles de CRP de referencia son típicamente bajos en los individuos sanos. Los niveles de CRP de referencia bajos pueden hacer que una reducción adicional en los niveles de CRP sea difícil de detectar. Sin embargo, se detectó una reducción considerable de las concentraciones de CRP en suero en voluntarios sanos que recibieron todas las concentraciones del anticuerpo monoclonal Abl, en comparación con los controles (Fig. 25) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida y ocurrió al cabo de una semana de administración de anticuerpos y se prolongó al menos hasta que se realizó la medición final (8 o 12 semanas a partir de la administración del anticuerpo) .
Pacientes con cáncer A cinco pacientes con cáncer avanzado (cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, o NSCLC) con niveles elevados de CRP en suero se les dosificó 80 mg o 160 mg de Abl. Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en estos pacientes (Fig. 26A) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con 90% de reducción dentro de una semana a partir de la administración de Abl y se prolongó al menos hasta que se realizó la medición final (hasta doce semanas) . En la Fig. 26B se muestran los niveles de CRP de dos individuos representativos. En esos individuos, los niveles de CRP disminuyeron por debajo del rango de referencia normal (menos que 5 - 6 mg/1) dentro de una semana. Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 21 Abl mejoró la fuerza muscular, mejoró el peso y redujo la fatiga en pacientes con cáncer avanzado Introducción La pérdida de peso y fatiga (acompañadas por debilidad muscular) son síntomas muy comunes en pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer avanza. La fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular pueden tener efectos negativos considerables en la recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo, alterando estilos de vida y relaciones y afectando la voluntad o capacidad de los pacientes para continuar tratamientos contra el cáncer. Los métodos conocidos para abordar la fatiga, pérdida de peso y debilidad muscular incluyen rutinas regulares de entrenamiento y ejercicios, métodos para conservar la energía de los pacientes y tratamientos que abordan la fatiga inducida por anemia y la debilidad muscular. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para mejorar la fatiga, la pérdida de peso y debilidad muscular en pacientes con cáncer.
Métodos Cuatro pacientes con formas avanzadas de cáncer (cáncer colorrectal (2), NSCLC (1), colangiocarcinoma (1)) recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de ya sea 80 mg o 160 mg del anticuerpo monoclonal Abl . No se administraron dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba .
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ahí durante al menos 6 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó a los pacientes para determinar lo siguiente: a.) cualquier cambio en el peso; b.) fatiga medida usando el cuestionario de la subescala de fatiga Facit-F, una prueba reconocida a nivel médico para evaluar la fatiga (Véase, e.g., Celia, D . , Lai, J.S., Chang, C.H., Peterman, A., & Slavin, M. (2002). Fatigue in cáncer patients compared ith fatigue in the general population. Cáncer, 94(2), 528-538; Celia, D . , Eton, D.T., Lai , F J-S., Peterman, A.H & Merkel, D.E. (2002). Combining anchor and distribution based methods to derive minimal clinically important differences on the Functional Assessment of Cáncer Therapy anemia and fatigue scales. Journal of Pain & Symptom Management, 24 (6) 547-561.); y fuerza de prensión (una prueba reconocida a nivel médico para evaluar la fuerza muscular, típicamente empleando un dinamómetro de prensión) .
Resultados Cambio en el peso Los datos promediados para ambas concentraciones de dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl , demostraron un aumento de aproximadamente 2 kilogramos de peso por paciente durante el periodo de 6 semanas (Fig. 29) .
Fatiga Los datos promediados para ambas concentraciones de dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento en la puntuación media de la subescala de Facit-F FS de al menos aproximadamente 10 puntos en la población de pacientes durante el periodo de 6 semanas (Fig. 30) .
Fuerza de prensión Los datos promediados para ambas concentraciones de dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento en la fuerza de prensión media de al menos aproximadamente 10 puntos en la población de pacientes durante el periodo de 6 semanas (Fig. 31) .
Ejemplo 22 Abl para la prevención de la trombosis Estudios previos han demostrado que la administración de un anticuerpo anti-IL-6 puede dar como resultado conteos de plaquetas disminuidos. Emilie, D. et ál., Blood, 84(8) :2472-9 (1994); Blay et ál., Int J Cáncer, 72(3) :424-30 (1997). Estos resultados, aparentemente, se han visto como un indicador del peligro potencial debido a que las disminuciones adicionales de los conteos de plaquetas podrían ocasionar complicaciones, tal como sangrado. No obstante, los solicitantes han apreciado actualmente que la inhibición de la IL-6 restituye un perfil de coagulación normal, lo que dichos solicitantes prevén que evitará la trombosis. Los conteos de plaquetas disminuidos que son el resultado de la inhibición de IL-6 no representan un signo de peligro potencial sino que reflejan la restauración beneficiosa de la coagulación normal.
El mecanismo mediante el cual se restaura la coagulación normal se cree que es el resultado de la interacción entre la IL-6 y la reacción de fase aguda. En respuesta a los niveles de IL-6 elevados como, por ejemplo, en un paciente con cáncer, el hígado produce proteínas de fase aguda. Estas proteínas de fase aguda incluyen factores de coagulación, tales como el Factor II, el Factor V, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor XI, el Factor XII, los productos de la degradación de la F/fibrina, el complejo de trombina-antitrombina III, fibrinógenos , plasminógenos , protrombinas y factor de von Willebrand. Este aumento en los factores de coagulación se puede medir directamente o se puede deducir de las mediciones funcionales de la capacidad de coagulación. Los antagonistas de IL-6, tal como Abl, suprimen las proteínas de fase aguda, por ej . , Amiloide A Sérica (véase Figura 32 y Ejemplo 10) . Los solicitantes prevén actualmente que esta supresión de proteínas de fase aguda restaurará el perfil de coagulación normal y, por lo tanto, prevendrá la trombosis. La restauración de coagulación normal puede ocasionar un leve descenso en los conteos de plaquetas, pero el paciente aun así mantendrá la capacidad de coagulación normal y, por lo tanto, no presentará un riesgo aumentado de hemorragia. Tal tratamiento representará una vasta mejora en comparación con las terapias anticoagulación disponibles cuya utilidad está limitada por el riesgo de efectos colaterales adversos, tal como sangrado importante .
Los solicitantes observan que se obtendrán los mismos efectos beneficiosos de la inhibición de IL-6, independientemente del método de inhibición. Los métodos de inhibición de la IL-6 adecuados incluyen la administración de anticuerpos anti-IL-6, terapias antisentido, receptor de IL-6 soluble, etc., ya sea de forma individual o en combinaciones.
Ejemplo 23 Abl aumenta la concentración de albúmina en plasma en pacientes con cáncer avanzado.
Las concentraciones de albúmina en suero son reconocidas como indicadores predictivos de supervivencia y/o éxito en la recuperación de pacientes con cáncer. La hipoalbuminemia tiene una fuerte correlación con una evolución pobre del paciente en numerosas formas de cáncer. Por ejemplo, en un estudio ningún paciente sometido a quimioterapia sistémica por adenocarcinoma pancreático metastásico y con niveles de albúmina en suero menores a 3.5 g/dL respondió de forma satisfactoria a la quimioterapia sistémica (Fujishiro, M., et ál., Hepatogastroenterology, 47 (36) : 1744-46 (2000)) . Los autores concluyen que "[placientes con ... hipoalbuminemia ... podrían ser candidatos inapropiados para quimioterapia sistémica y podrían tratarse con otros enfoques experimentales o cuidados paliativos." Id.
De manera similar, Sénior y Maroni expresan que "[l]a reciente apreciación acerca de que la hipoalbuminemia es la predictora más poderosa de la mortalidad en enfermedades renales de etapa terminal destaca la importancia critica del consumo de proteínas adecuadas para esta población de pacientes." (J.R. Sénior and B.J. Maroni, Am. Soc. Nutr. Sci . , 129 : 313S-314S (1999) ) .
En al menos un estudio, los intentos por rectificar la hipoalbuminemia en 27 pacientes con cáncer metastásico mediante la infusión de albúmina intravenosa diaria de 20 g hasta que se alcanzaron los niveles de albúmina en suero normales (>3.5 g/dL) no tuvieron mucho éxito. Los autores mencionan que "[l]a infusión de albúmina para pacientes con cáncer en etapa avanzada tiene valor limitado en la práctica clínica. Los pacientes con PS 4 e hipoalbuminemia tienen una prognosis más pobre." (Demirkazik, A., et ál., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 21:.Abstr 2892 (2002)) .
Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que mejoren las concentraciones de albúmina en suero en pacientes con cáncer y que se ocupen de estados hipoalbuminémicos en pacientes con cáncer, particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Cuatro pacientes con formas avanzadas de cáncer (cáncer colorrectal (2), NSCLC (1), colangiocarcinoma (1)) recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de ya sea 80 mg o 160 mg del anticuerpo monoclonal Abl. No se administraron dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba .
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ahi durante al menos 6 semanas luego . de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó la concentración de albúmina en plasma en los pacientes.
Resultados Los datos promediados para ambas concentraciones de dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento de aproximadamente 5 g/L de concentración de albúmina en plasma por paciente durante el periodo de 6 semanas (Fig. 33).
Ejemplo 24 Abl suprime la CRP en suero en pacientes con cáncer avanzado .
Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con ciertas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et ál. llevó a cabo análisis univariado y multivariado de concentraciones de CRP en suero preoperatorias en pacientes con carcinoma hepatocelular para identificar factores que afectan la supervivencia y recurrencia de la enfermedad (Hashimoto, K., et ál., Cáncer, 103 ( 9) : 1856-1864 (2005) ) . Se clasificó a los pacientes en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1.0 mg/dL ("grupo con CRP positiva") y aquellos con niveles de CRP en suero < 1.0 mg/dL ("grupo con CRP negativa") . Los autores describieron "una correlación importante entre el nivel de CRP en suero preoperatorio y el tamaño del tumor". Id. Además, los autores encontraron que "[l]as tasas de supervivencia general y supervivencia sin recurrencia en el grupo con CRP positiva fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas del grupo con CRP negativa." Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP preoperatorio en pacientes es un importante indicador predictivo independiente de prognosis pobre y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular .
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et ál. determinó que la CRP en suero era un predictor independiente e informativo de la mortalidad especifica del carcinoma de células renales (Karakiewicz, P.I., et ál., Cáncer, 110 ( 6) : 1241-1247 (2007)) . Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteina C reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer y particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón no microcitico (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora ya sea de placebo (n=31 ) , 8 0 mg (n=2 9 ) , 160 mg (n= 32 ) , o 320 mg (n=32 ) del anticuerpo monoclonal Abl cada 8 semanas durante 2 4 semanas por un total de 3 dosis. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico potenciado con partículas de proteína C reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos con látex (es decir, Roche CRP Tinaquant©) . En resumen, aproximadamente 1 . 0 mL del suero de muestra del paciente se recogió y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón adecuado y el anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex se agregó a una muestra para comenzar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con antígenos en la muestra para formar un complejo de antígeno/anticuerpo . Luego de la aglutinación, esto se midió de forma turbidimétrica usando un analizador Roche/Hitachi Modular P.
Los pacientes fueron evaluados antes de la administración de la dosis y a partir de entonces en las semanas 2 , 4 , 8 y 12 . Al momento de cada evaluación, se analizó la concentración de CRP en suero de los pacientes.
Resultados Los datos promediados para cada concentración de dosis (placebo, 80 mg, 1 60 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl se graficaron en la Figura 38 . Todos los niveles de dosis del anticuerpo Abl demostraron una caída inmediata en las concentraciones de CRP con relación al placebo durante un período de 12 semanas. Los niveles de CRP mostraron avances al cabo de 8 semanas luego de la dosis. Los niveles de CRP cayeron por debajo de 5 mg/L en la semana 12. Los valores promedio de CRP demostraron disminuciones rápidas y sostenidas para todas las concentraciones de dosis con relación al placebo (Fig. 39) . Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 25 Abl suprime la CRP en suero en pacientes con cánceres avanzados .
Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con ciertas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et ál. llevó a cabo análisis univariado y multivariado de concentraciones de CRP en suero preoperatorias en pacientes con carcinoma hepatocelular para identificar factores que afectan la supervivencia y recurrencia de la enfermedad (Hashimoto, . , et ál . , Cáncer, 103 ( 9) : 1856-1864 (2005) ) . Se clasificó a los pacientes en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1.0 mg/dL ("grupo con CRP positiva") y aquellos con niveles de CRP en suero < 1.0 mg/dL ("grupo con CRP negativa") . Los autores describieron "una correlación importante entre el nivel de CRP en suero preoperatorio y el tamaño del tumor". Id. Además, los autores encontraron que "[l]as tasas de supervivencia general y supervivencia sin recurrencia en el grupo con CRP positiva fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas del grupo con CRP negativa." Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP preoperatorio en pacientes es un importante indicador predictivo independiente de prognosis pobre y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular .
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et ál . determinó que la CRP en suero era un predictor independiente e informativo de la mortalidad especifica del carcinoma de células renales (Karakiewicz, P.I., et ál., Cáncer, 110 ( 6) : 1241-1247 (2007)). Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteina C reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer y particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Ocho pacientes con diferentes formas avanzadas de cáncer (cáncer colorrectal (3), NSCLC (1), colangio (1) y mesotelioma (2)) recibieron una única infusión intravenosa de 1 hora de ya sea 80 mg (2 pacientes), 160 mg (3 pacientes) o 320 mg (3 pacientes) del anticuerpo monoclonal Abl. No se administraron dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba .
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ahí semanalmente durante al menos 8 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó la concentración de CRP en suero en los pacientes. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico potenciado con partículas de proteína C-reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos con látex (es decir Roche CRP Tinaquant®) . En resumen, aproximadamente 1.0 mL del suero de muestra del paciente se recogió y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón adecuado y el anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex se agregó a una muestra para comenzar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con antígenos en la muestra para formar un complejo de antígeno/anticuerpo . Luego de la aglutinación, esto se midió de forma turbidimétrica usando un analizador Roche/Hitachi Modular P.
Resultados Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Fig. 40) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con aproximadamente 90% de reducción dentro de una semana a partir de la administración de Abl y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se realizó la medición final (hasta doce semanas) . En todos los casos excepto un paciente con cáncer colorrectal, los niveles de CRP cayeron al rango de referencia normal o por debajo de este (menos que 5-6 mg/L) dentro de una semana. El paciente con cáncer colorrectal alcanzó niveles normales similares en la semana 4 del estudio. Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 26 Abl suprime la CRP en suero en pacientes con artritis reumatoide.
Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con artritis reumatoide. Los pacientes que padecen artritis reumatoide con niveles altos de CRP demostraron un deterioro casi total. Amos et ál., 1 Br. Med. J. 195-97 (1977) . Por el contrario, los pacientes con niveles bajos de CRP no mostraron progreso de la enfermedad, lo que sugiere que es necesario mantener bajos los niveles de CRP para tratar la artritis reumatoide de forma eficaz. Id. El seguimiento de la CRP durante los regímenes de tratamiento de la artritis reumatoide de oro, D-penicilamina, cloroquina o dapsona indicaron que dificultó el deterioro radiológico luego de los primeros 6 meses de tratamiento cuando se controlaron de manera constante los niveles de CRP. Dawes et ál., 25 Rheumatology 44-49 (1986). Se identificó una correlación altamente significativa entre la producción de CRP y la evolución radiológica. van Leeuwen et ál., 32 (Supp. 3) Rheumatology 9-13 (1997) . Otro estudio reveló que para pacientes con artritis reumatoide activa, la supresión de CRP elevada de manera anormal produjo una mejora en métricas funcionales de prueba, mientras que la elevación de CRP continuo se asocia con el deterioro en las mismas métricas. Devlin et ál., 24 J. Rheumatol. 9-13 (1997) . No se observó deterioro adicional sin una nueva elevación de la CRP, lo que indica la supresión de la CRP como un candidato viable para el tratamiento de la artritis reumatoide. Id. Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para reducir las concentraciones de proteína C reactiva (CRP) en pacientes con artritis reumatoide.
Métodos Se dividieron ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa y CRP =10 mg/L en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora ya sea de placebo (n=33), 80 mg (n=32), 160 mg (n=34), o 320 mg (n=28) del anticuerpo monoclonal Abl, una vez al comienzo del ensayo de 16 semanas y nuevamente en la semana 8. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico potenciado con partículas de proteína C reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos con látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®) . En resumen, aproximadamente 1.0 mL del suero de muestra del paciente se recogió y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón adecuado y el anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex se agregó a una muestra para comenzar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con antígenos en la muestra para formar un complejo de antígeno/anticuerpo . Luego de la aglutinación, esto se midió de forma turbidimétrica usando un analizador Roche/Hitachi Modular P. Se recogieron los datos de la concentración de CRP cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12 y al término de la prueba en la semana 16.
Resultados Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Fig. 41) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con una reducción inmediata de los niveles de CRP con relación al placebo dentro de una semana a partir de la administración de Abl y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se realizó la medición final (hasta dieciséis semanas) . En todos los casos, los .niveles de CRP cayeron al rango de referencia normal o por debajo de este (menos que 5-6 mg/L) dentro de una semana. Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con artritis reumatoide puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero y presenta un régimen eficaz de tratamiento .
Ejemplo 27 Abl alimenta la hemoglobina en pacientes con cáncer avanzado El anticuerpo Abl se dosificó a 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl en solución salina tampo'nada con fosfato a 93 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico. El grupo tratado con placebo se dosificó a 31 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico solo con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la dosificación (semana cero) y en las semanas dos, cuatro, ocho y doce y se determinó la concentración de hemoglobina. La concentración promedio de hemoglobina aumentó para aquellos que reciben el anticuerpo Abl mientras que la concentración promedio de hemoglobina de aquellos que reciben placebo no aumentó luego de las doce semanas al compararla con la concentración justo antes de la dosificación (semana cero) (Figuras 42 y 43) .
Un subgrupo de la población de estudio comenzó el estudio con niveles bajos de hemoglobina, estando la concentración de hemoglobina de referencia por debajo de 11 g/1. La concentración promedio de hemoglobina aumentó por encima de 11 g/l luego de ocho noches para aquellos que recibieron el anticuerpo Abl en dosis de 160 mg y 320 mg, mientras que la concentración promedio de hemoglobina de aquellos que recibieron el anticuerpo Abl en dosis de 80 mg o placebo no aumentó por encima de 11 g/l luego de ocho semanas (Fig. 44) .
Estos resultados demuestran adicionalmente algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Abl a individuos con enfermedades crónicas. Debido a que la IL-6 es la principal citocina responsable de la anemia en enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer) , la neutralización de IL-6 mediante Abl aumenta la concentración de hemoglobina en estos individuos.
Ejemplo 28 Abl aumenta la hemoglobina en pacientes con artritis reumatoide.
Los niveles de hemoglobina se analizaron en pacientes con artritis reumatoide durante el tratamiento con anticuerpo Abl. El anticuerpo Abl se dosificó a 80 mg, 160 mg o 320 mg en solución salina tamponada con fosfato a 94 individuos con artritis reumatoide. El grupo tratado con placebo de 33 individuos con artritis reumatoide se dosificó solo con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la dosificación (semana cero) y a la semana uno, dos, tres, cuatro, seis, ocho, diez, doce y dieciséis y se determinó la concentración de hemoglobina. La concentración promedio de hemoglobina aumentó para aquellos que reciben el anticuerpo Abl mientras que la concentración promedio de hemoglobina de aquellos que recibieron placebo no aumentó luego de las dieciséis semanas al compararla con la concentración justo antes de la dosificación (semana cero) (Figura 45) .
Estos resultados demuestran adicionalmente algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Abl a individuos con enfermedades crónicas. Debido a que la IL-6 es la citocina principal responsable de la anemia de enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer) , la neutralización de IL-6 mediante Abl aumenta la concentración de hemoglobina.
Ejemplo 29 Abl aumenta la albúmina en pacientes con cáncer avanzado Las concentraciones de albúmina en suero son reconocidas como indicadores predictivos de supervivencia y/o éxito en la recuperación de pacientes con cáncer. La hipoalbuminemia tiene una fuerte correlación con una evolución pobre del paciente en numerosas formas de cáncer. Por ejemplo, en un estudio ningún paciente sometido a quimioterapia sistémica por adenocarcinoma pancreático metastásico y con niveles de albúmina en suero menores a 3.5 g/dL respondió de forma satisfactoria a la quimioterapia sistémica (Fujishiro, M., et ál., Hepatogastroenterology, 47 (36) : 1744-46 (2000)). Los autores concluyen que "[placientes con ... hipoalbuminemia ... podrían ser candidatos inapropiados para quimioterapia sistémica y podrían tratarse con otros enfoques experimentales o cuidados paliativos." Id.
De manera similar, Sénior y Maroni expresan que "[l]a reciente apreciación acerca de que la hipoalbuminemia es la predictora más poderosa de la mortalidad en enfermedades renales de etapa terminal destaca la importancia critica del consumo de proteínas adecuadas para esta población de pacientes." (J.R. Sénior and B.J. Maroni, Am. Soc. Nutr. Sci . , 129 : 313S-314S (1999) ) .
En al menos un estudio, los intentos por rectificar la hipoalbuminemia en 27 pacientes con cáncer metastásico mediante la infusión de albúmina intravenosa diaria de 20 g hasta que se alcanzaron los niveles de albúmina en suero normales (>3.5 g/dL), no tuvieron mucho éxito. Los autores mencionan que "[l]a infusión de albúmina para pacientes con cáncer en etapa avanzada tiene valor limitado en la práctica clínica. Los pacientes con PS 4 e hipoalbuminemia tienen una prognosis pobre." (Demirkazik, A., et ál., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 21:Abstr 2892 (2002)) .
Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que mejoren las concentraciones de albúmina en suero en pacientes con cáncer y que se ocupen de estados hipoalbuminémicos en pacientes con cáncer, particularmente aquellos con cánceres avanzados.
Métodos El anticuerpo Abl se. dosificó a 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl en solución salina tamponada con fosfato a 93 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico. Cada individuo recibió una dosificación de [sic] . El grupo tratado con placebo de 31 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico sé dosificó solo con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la dosificación (semana cero) y en la semanas dos, cuatro, ocho y doce y se determinó la concentración de albúmina.
Resultados La concentración promedio de albúmina aumentó para aquellos que recibieron el anticuerpo Abl mientras que la concentración promedio de albúmina de aquellos que recibieron placebo no aumentó luego de las doce semanas al compararla con la concentración justo antes de la dosificación (semana cero) (Figura 46) . El cambio en los valores de albúmina de referencia para todos los grupos de concentración de dosis se gráfica en la Figura 47.
Un subgrupo de la población del estudio comienza el estudio con niveles bajos de albúmina definida como concentración de albúmina de referencia menor o igual a 35 g/L. La concentración promedio de albúmina inicialmente aumentó con todas las dosificaciones del anticuerpo Abl sobre el placebo, pero solo los pacientes que recibieron 160 mg o 320 mg demostraron niveles de albúmina sostenidos sobre 35 g/L tras 8 semanas de estudio (Figura 48). El grupo de dosificación de 80 mg demostró un aumento inicial pero disminuyó gradualmente luego de la semana 2 y no aumentó a más que 35 g/L durante las 8 semanas en las que los datos se encontraban disponibles (Id.) .
Ejemplo 30 Abl mejoró el peso y redujo la fatiga en pacientes con cáncer avanzado La pérdida de peso, la fatiga y la debilidad muscular son síntomas muy comunes en pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer avanza. La fatiga y la pérdida de peso pueden tener efectos negativos considerables en la recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo alterando estilos de vida y relaciones y afectando la voluntad o capacidad de los pacientes para continuar tratamientos contra el cáncer. Los métodos conocidos para abordar la fatiga y la pérdida de peso incluyen rutinas regulares de entrenamiento y ejercicios, métodos para conservar la energía de los pacientes y tratamientos que abordan la fatiga inducida por anemia. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para mejorar la fatiga y la pérdida de peso en pacientes con cáncer.
Métodos Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón no microcitico (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora ya sea de placebo (n=31), 80 mg (n=29) , 160 mg (n=32), o 320 mg (n=32) del anticuerpo monoclonal Abl cada 8 semanas durante 24 semanas por un total de 3 dosis.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ahí durante al menos 12 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó a los pacientes para determinar lo siguiente: a.) cualquier cambio en el peso y b.) fatiga medida usando el cuestionario de la subescala de fatiga Facit-F, una prueba reconocida a nivel médico para evaluar la fatiga (Véase, e.g., Celia, D., Lai, J.S., Chang, C.H., Peterman, A., & Slavin, M. (2002). Fatigue in cáncer patients compared with fatigue in the general population. Cáncer, 94(2), 528-538; Celia, D., Eton, D.T., Lai , F J-S., Peterman, A.H & Merkel, D.E. (2002). Combining anchor and distribution based methods to derive minimal clinically important differences on the Functional Assessment of Cáncer Therapy anemia and fatigue scales. Journal of Pain & Symptom Management, 24 (6) 547-561.).
Resultados Cambio en el peso Los datos promediados de cambio en el peso de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl durante 12 semanas se grafican en la Figura 49. El cambio de porcentaje promedio en el peso corporal de cada concentración de dosis se gráfica en la Figura 50. Los datos promediados de masa corporal magra para los grupos de concentración de dosis se grafican en la Figura 51.
Fatiga La fatiga promediada de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostró aumentos en la puntuación de subescala Facit-F FS promedio para algunos de los grupos de concentración de dosis en la población de pacientes por un periodo de 8 semanas (Figura 52) . El cambio de la puntuación de se subescala Facit-F de referencia se gráfica en la Figura 53.
Ejemplo 31 Abl disminuye niveles de dímero-D en pacientes con cáncer avanzado Las concentraciones del dímero-D se reconocen como herramientas de diagnóstico útiles para predecir los riesgos de eventos trombóticos en pacientes. (Adam et ál . , 113 Blood 2878-87 (2009)) Los pacientes negativos para el dimero-D tienen una baja probabilidad de trombosis. Por ejemplo, el análisis del dímero-D puede descartar trombosis venosa profunda de extremidad inferior en pacientes. (Wells et ál., 349 N. Engl . J. Med. 1227-35 (2003)) La evaluación clínica en combinación con la prueba del dímero-D negativa puede disminuir de forma eficaz la instancia de embolismo pulmonar hasta 0.5%. (Van Belle et ál., 295 JAMA 172-79 (2006); Kruip et ál., 162 Arch. Intern. Med. 1631-35 (2002); Wells et ál., 135 Ann. Intern. Med. 98-107 (2001)) Los análisis del dimero-D pueden ser útiles para controlar el progreso del tratamiento de trastornos de coagulación. Un estudio indicó que el tratamiento anticoagulación para tromboembolia venosa aguda dio como resultado una disminución gradual de las concentraciones del dimero-D. (Adam et ál., 113 Blood 2878-87 (2009); Schutgens et ál., 144 J. Lab. Clin. Med. 100-07 (2004)) Este descubrimiento llevó a la conclusión de que se podría usar el control de los niveles del dímero-D para evaluar el grado de respuesta al tratamiento. (Adam et ál., 113 Blood at 2883) En los pacientes con cáncer, los análisis del dímero-D pueden tener importancia adicional, ya que el cáncer aumenta la frecuencia de trombosis. (Adam et ál., 113 Blood 2878-87 (2009)). Un estudio con pacientes oncológicos indicó que las concentraciones del dímero-D tienen un alto valor de predicción negativa y una alta sensibilidad en el diagnóstico1 de la embolia pulmonar. ( ing et ál., 247 Radiology 854-61 (2008)). La trombosis venosa profunda se puede excluir de forma similar en pacientes con cáncer con bajas probabilidades de desarrollar trombosis venosa profunda y una prueba negativa para el dímero-D, si bien tal combinación es menos probable en pacientes oncológicos. (Lee et ál., 123 Thromb. Res. 177-83 (2008)). Puede ser necesario un umbral más alto de resultado del dimero-D negativo en pacientes con cáncer. (Righini et ál., 95 Haemost. 7 15 - 19 ( 200 6 ) ) Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para la trombosis que mejoren las concentraciones de dimero-D en pacientes con cáncer y que se dirijan a estados de dimero-D elevado en pacientes con cáncer, en particular aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón no microcitico (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=31 ) , 80 mg (n=2 9 ) , 1 60 mg (n=32 ) o 320 mg (n= 32 ) del anticuerpo monoclonal Abl cada 8 semanas durante un periodo de 24 semanas para un total de 3 dosis. Se recogieron los datos de la concentración del dimero-D de las primeras 8 semanas de tratamiento. La concentración de los datos del dimero-D se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico del dimero-D. En resumen, el ensayo se basa en el cambio de turbidez de una suspensión de microparticulas que se mide mediante fotometría. Se recogieron alrededor de 1 . 5 mL de la muestra de plasma de citrato de sodio del paciente y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. Se mezcló una suspensión de microparticulas de látex recubiertas por un enlace covalente con anticuerpos monoclonales específicos para el dimero-D con el plasma de prueba cuyo nivel de dímero-D se pretendía analizar. Las reacciones antígeno- anticuerpo que llevan a una aglutinación de las microparticulas de látex indujeron un aumento en la turbidez del medio de reacción. Este aumento en la turbidez se reflejó mediante un aumento en la absorbancia y esta última se midió de forma fotométrica utilizando un analizador STAGO STA. El aumento en la absorbancia fue una función del nivel del dimero-D presente en la muestra de prueba.
Resultados En la Figura 54 se grafican los datos promediados para cada concentración de dosificación (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl . Las barras de error se omitieron en la gráfica para mayor claridad. En la Figura se gráfica 55 el cambio porcentual a partir del punto de referencia en la concentración de dimero-D. Todos los niveles de dosificación del anticuerpo Abl demostraron una disminución en los niveles del dimero-D en comparación con placebo durante el periodo de 8 semanas .
Ejemplo 32 Eficacia y seguridad de Abl en pacientes con NSCLC avanzado El objetivo principal de este estudio fue determinar la eficacia y seguridad de ALD518 o Abl humanizado en pacientes con NSCLC avanzado.
Métodos: Se dosificaron 124 pacientes (pts) con NSCLC, ECOG 0-3, pérdida de peso en los 3 meses anteriores1 >5% de peso corporal, hemoglobina (Hb) >7g/dL y proteina C reactiva (CRP) > 10mg/L. Los pts fueron aleatorizados a 1 de 4 grupos (n~30/grupo) . Se administraron intravenosamente 80mg, 160mg o 320mg de placebo o ALD518 cada 8 semanas. A los pts se les hizo un seguimiento durante 24 semanas. Los datos incluyeron hematología, química clínica, CRP y eventos adversos (AE) .
Resultados: 29 pts completaron los tratamientos y las evaluaciones de estudio, 38 no pudieron completar cada visita, 52 fallecieron de enfermedad progresiva y 5 se retiraron debido a eventos adversos. No hubo toxicidades que limitan la dosis (DLT) o reacciones a la infusión. 84 pts tuvieron AE graves de los cuales 1 se consideró posiblemente relacionado con la administración de ALD518 (hemorragia rectal) . A continuación se presentan los valores (±SD) medios para Hb, hematocrito (Hct) , Hb corpuscular media (MCH) y albúmina: a p<0.0001 b p=0.0002 0 p=0.001 (prueba t pareada en comparación con dosis previa) 38/93 pts tratados con ALD518 y 10/31 administrados con placebo tienen una dosis previa de Hb = llg/dL. 24 de estos pts con ALD518 y 7 de estos pts con placebo permanecieron en el estudio en la semana 4. 14/24 pts con ALD518 y 0/7 con placebo aumentaron su Hb desde < llg/dL a = 12g/dL.
Conclusión: ALD518 aumentó Hb, Hct, MCH y albúmina en pts con NSCLC y aumentó la Hb hasta = 12g/dL en 58% de los pts con una Hb = llg/dL en el punto de referencia. Esto indica además que ALD518 se puede administrar como un agente estimulante no eritropoyético para tratar la anemia relacionada con el cáncer.
Ejemplo 33 Abl alcanzó ACR 20/50/70 en pacientes con artritis reuma oide .
La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que ataca principalmente el sinovio de las articulaciones. La enfermedad ocasiona inflamación dolorosa y potencialmente incapacitante, con una aparición que ocurre típicamente entre los 40 y 50 años. La interpretación de la eficacia del tratamiento con fármaco en artritis reumatoide se vuelve difícil debido a la cantidad de herramientas de evaluación objetivas y subjetivas que se pusieron a disposición a lo largo del tiempo. El American College of Rheumatology [Colegio Estadounidense de Reumatología] ("ACR") emitió un conjunto estandarizado de medidas para la artritis reumatoide para facilitar la evaluación de la mejora de la enfermedad en pruebas clínicas. Felson et ál., 36 Arthritis & Rheumatism 729-40 (1993).
Métodos Se dividieron ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa y CRP =10 mg/L en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=33), 80 mg (n=32) , 160 mg (n=34) o 320 mg (n=28) del anticuerpo monoclonal Abl, una vez al comienzo de la prueba de semana 16 y de nuevo en la semana 8. Se recogieron los datos de la concentración de CRP cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12 y al finalizar la prueba en la semana 16.
Se realizó la evaluación de acuerdo con los protocolos estandarizados del American College of Rheumatology para determinar el porcentaje de mejora de pacientes durante el ensayo clínico y fue realizada por una persona capacitada en la técnica para evaluar la artritis reumatoide. La evaluación se basó en las mediciones de actividad, incluyendo el conteo de articulaciones débiles, el conteo de articulaciones inflamadas, la evaluación del dolor del paciente, las evaluaciones globales de la actividad de la enfermedad realizadas por el médico y la evaluación de laboratorio de la tasa de sedimentación de eritrocitos o el nivel de CRP. Id. La evaluación de dolor del paciente se basó en el Stanford Health Assessment Questionnaire Disability Index (HAQ DI) [índice de discapacidad del Cuestionario de evaluación de la salud de Stanford] . Los pacientes que alcanzan un aumento del 20% en las mediciones de actividad para la artritis reumatoide durante un análisis clínico se clasifican como que alcanzan ACR 20. De modo similar, los pacientes que alcanzan mejoras del 50% y 70% se clasifican como ACR 50 y ACR 70, respectivamente.
Resultados Una cantidad considerable de pacientes que padecen artritis reumatoide alcanzó ACR 20 o mayor durante el transcurso del estudio (Fig. 56) . Los pacientes presentaron una mejora rápida en los sistemas dentro de las primeras 4 semanas del estudio, asi como una mejora estable y continua a lo largo del transcurso de la evaluación de 16 semanas (Figs. 57, 58 y 59) . Los mayores resultados se presentaron en pacientes que recibieron el nivel de dosificación de 320 mg, donde el 43% alcanzó un estado de ACR 70 durante el estudio (Fig. 59) .
El análisis de los componentes individuales de la evaluación de ACR demostró ganancias en todos los componentes (Fig. 60) . Los valores de HAQ DI demostraron un cambio clínicamente significativo en comparación con placebo durante el transcurso de la evaluación (Fig. 61) . Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Fig. 61). La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con una reducción inmediata de los niveles de CRP con respecto al placebo dentro de una semana de la administración de Abl y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se realizó la medición final (hasta dieciséis semanas) . En todos los casos, los niveles de CRP cayeron hasta el intervalo de referencia normal o por debajo de este (menos de 5-6 mg/L) dentro de una semana. Por consiguiente, la administración de Abl puede ocasionar una mejora rápida y sostenida de los pacientes con artritis reumatoide, según se prueba mediante la mejora significativa en los valores de ACR durante la evaluación clínica y presenta un régimen de tratamiento eficaz.
Ejemplo 34 Abl alcanzó valores de DAS28 y EULAR mejorados en pacientes con artritis reumatoide Introducción La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que ataca principalmente el sinovio de las articulaciones. La enfermedad causa inflamación dolorosa y potencialmente incapacitante, con una aparición que ocurre típicamente entre los 40 y 50 años. La interpretación de la eficacia del tratamiento con fármaco en artritis reumatoide se vuelve difícil debido a la cantidad de herramientas de evaluación objetivas y subjetivas que se pusieron a disposición con el tiempo. El American College of Rheumatology [Colegio Estadounidense de Reumatología] ("ACR") emitió un conjunto estandarizado de medidas para la artritis reumatoide para facilitar la evaluación de la mejora de la enfermedad en pruebas clínicas. Felson et ál., 36 Arthritis & Rheumatism 729-40 (1993).
La actividad inflamatoria asociada con la artritis reumatoide se mide utilizando una cantidad de variables a través de criterios de respuesta validados como el Disease Activity Score [índice de actividad de la enfermedad] (DAS) , DAS28 y EULAR. El DAS es un índice clínico de la actividad de la enfermedad artritis reumatoide que combina información de articulaciones inflamadas, articulaciones débiles, la respuesta de fase aguda y la salud general. Fransen, J., et ál., Clin. Exp. Rheumatol. , 23 (Suppl. 39): S93-S99 (2005) . El DAS 28 es un índice similar al DAS original, pero utiliza un conteo de 28 articulaciones débiles (intervalo 0-28), un conteo 28 de articulaciones inflamadas (intervalo 0-28), la ESR (tasa de sedimentación de eritrocitos) y una evaluación opcional de la salud general en una escala análoga visual (intervalo 0-100) . Id. Los criterios de respuesta de la European League against Rheumatism [Liga europea contra el reumatismo] (EULAR) clasifican a los pacientes utilizando la cantidad individual de cambio en el DAS y en los valores de DAS (bajos, moderados, altos) que alcanzaron en una de las siguientes clasificaciones: buena, moderada o sin respuesta. Id.
Métodos Se dividieron ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=33) , 80 mg (n=32), 160 mg (n=34) o 320 mg (n=28) del anticuerpo monoclonal Abl, una vez al comienzo de la prueba de semana 16 y de nuevo en la semana 8. Se recogieron los datos de los valores de DAS28 y EULAR cada semana durante ías primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12 y al finalizar la prueba en la semana 16. Se realizó la evaluación de acuerdo con los protocolos estandarizados de DAS28 y EULAR para determinar los valores respectivos de pacientes durante el ensayo clínico y fue realizada por una persona capacitada en la técnica para la evaluación de artritis reumatoide.
Resultados Los pacientes que reciben 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl demostraron mejores valores de DAS28 con respecto a los pacientes que reciben placebo durante el transcurso de 16 semanas, tal como se presenta en la Fig. 62 como un cambio promedio a partir del valor de DAS28 de referencia. Adicionalmente, un porcentaje considerable de pacientes que reciben 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl alcanzaron las clasificaciones "Buena" o "Moderada" con respecto a los pacientes que reciben placebo durante el transcurso de 16 semanas. (Fig. 63) .
Por lo tanto, la administración de Abl puede dar como resultado mejores valores de DAS28 y EULA en artritis reumatoide en comparación con los pacientes que reciben placebo.
Ejemplo 35 Seguridad, farmacocinótica (PK) y faxmacodinámica (PD) de Abl en sujetos humanos Tal como se describe en la presente, se administró un anticuerpo humanizado derivado de Abl (ALD518 o Abl humanizado) que contiene las secuencias variables ligera y pesada en las SEQ ID NO: 19 y 20 a pacientes con artritis reumatoide. Este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgGl, aislado y humanizado contra la IL-6 que se ha demostrado que tiene una semivida (t½) de aproximadamente 30 días en humanos. En estudios de pacientes con RA, intravenoso (IV) con este anticuerpo (Abl humanizado) ha demostrado: eficacia durante 16 semanas con respuestas rápidas de American College of Rheumatology (ACR) ; supresión completa y duradera de la proteina C reactiva (CRP) ; buena tolerancia y un perfil de seguridad coherente con la biología del bloqueo de IL-6. Este anticuerpo humanizado se une a la IL-6 con alta afinidad, previniendo la interacción y señalización mediadas a través de IL-6R. Se han demostrado respuestas rápidas e importantes al tratamiento administración intravenosa (IV) de Abl humanizado en pacientes con RA. En este ejemplo estudiamos la seguridad, farmacocinética y farmacodinámica de la administración subcutánea (SC) de Abl humanizado en sujetos saludables.
El objetivo de este estudio es evaluar la seguridad, farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de una única inyección SC de este anticuerpo humanizado en sujetos masculinos saludables .
Métodos : En este estudio controlado por placebo, doble ciego y de fase I, se aleatorizaron 27 sujetos 2:1 para recibir una única dosis de Abl humanizado o placebo en los siguientes grupos: 50 mg SC de Abl humanizado, 100 mg SC de Abl humanizado o 100 mg IV de Abl humanizado (n=6 activos y n=3 placebo por grupo). El objetivo principal fue evaluar la seguridad de Abl humanizado SC contra placebo durante 12 semanas. Se evaluaron las concentraciones en plasma de concentraciones en suero y Abl humanizado de la proteína C reactiva (CRP) como objetivos secundarios. Las evaluaciones se realizaron diariamente en la Semana 1 y luego en el Día 10, Semanas 2, 4, 6 y 8, y luego mensualmente hasta la Semana 12. El estudio fue sin cegamiento en la Semana 12 y los sujetos con Abl humanizado se controlaron hasta la Semana 24.
Población y diseño de estudio El estudio incluyó 27 sujetos masculinos saludables (de entre 18 y 65 años) . Los sujetos fueron dosificados en tres grupos de tratamiento de nuevo sujetos cada uno, se aleatorizaron 2:1 para recibir una única dosis de Abl humanizado o placebo en el Día 1 (Figura 64) . Los tratamientos con Abl humanizado por grupo fueron: infusión IV de 100 mg de Abl humanizado durante 60 minutos inyección SC de 50 mg de Abl humanizado (1 mL) inyección de 100 mg de Abl humanizado (1 mL) El estudio fue sin cegamiento en la Semana 12, luego de lo cual los sujetos con placebo interrumpieron el análisis y los sujetos con BMS-945429 se controlaron hasta la Semana 24 (Figura 64) .
Evaluaciones de inmunogenicidad y seguridad El objetivo principal del estudio fue evaluar la seguridad de Abl humanizado SC en comparación con placebo durante 12 semanas. La seguridad fue controlada durante 12 semanas para todos los sujetos. El estudio fue sin cegamiento e;n la Semana 12 y los sujetos con Abl humanizado se controlaron hasta la Semana 24.
Los análisis de seguridad de laboratorio fueron realizados antes de la dosis en la detección y Día -1, y luego de la dosis los Días 2 y 7, semanas 2, 4, 6, 8 y 12 para todos los sujetos, y las Semanas 16, 20 y 24 luego de la dosis para aquellos aleatorizados a Abl humanizado. Los anticuerpos Abl anti-humanizados se midieron mediante el ensayo por iinmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) . Las muestras de sangre se recogieron el Día 1 (antes de la dosis) y Semana 12 luego de la dosis para todos los sujetos, y la Semana 24 luego de la dosis para aquellos aleatorizados a Abl humanizado.
Evaluaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas Las concentraciones de CRP en suero y Abl humanizado en plasma se evaluaron mediante ELISA. Para todos los sujetos, las muestras se recogieron en la detección, antes de la dosis el Día 1 y luego de la dosis los Días 2 y 7 y Semanas 2, 4, 6, 8 y 12. Para los sujetos aleatorizados a Abl humanizado, se recogieron más muestras en las Semanas 16, 20 y 24 luego de la dosis.
Análisis estadístico Se incluyeron todos los sujetos que recibieron una dosis de Abl humanizado o placebo en el análisis de seguridad. Se incluyeron todos los sujetos que recibieron una dosis de Abl humanizado o placebo en los análisis de inmunogenicidad y PD. Se incluyeron todos los sujetos que recibieron una dosis de Abl humanizado en los análisis PK (n=18) . Todas las muestras PK para los sujetos con placebo se confirmaron como la cuantificación que sigue a continuación.
La estadística descriptiva se generó para las concentraciones de CRP en suero y parámetros de Abl humanizado en plasma, datos de seguridad y demografía del punto de referencia. Se usó la prueba Wilcoxon Rank Sum para comparar las concentraciones de CRP para los tratamientos de Abl humanizado contra placebo.
Resultados : Resumen Durante las 24 semanas, no hubo fallecimientos o AE graves y no hubo retiros debido a AE . Casi todos los sujetos (89%) experimentaron AE, que fueron leves o moderados excepto un caso de gastroenteritis grave en el grupo de 50 mg SC de Abl humanizado. Las reacciones en el sitio de inyección en 5/12 sujetos de Abl humanizado SC, 1/6 sujetos con placebo SC y 1/3 sujetos con placebo IV (no se informaron sujetos con Abl humanizado IV) . Estos fueron leves excepto un caso de eritema y pruritis moderadas en el grupo de 100 mg SC de Abl humanizado. Aumentos en los conteos de neutrófilos y bilirrubina directos por debajo del límite de normal fueron más comunes en los sujetos que reciben Abl humanizado en comparación con placebo; todos fueron CTC de Grado 1 o 2. La semivida del Abl humanizado fue similar en todos los grupos (intervalo medio: 30.7-33.6 días) . El Tm^x medio de Abl humanizado fue más prolongado después de la administración SC (~1 semana) que luego de la administración IV (~finalización de la infusión) . La PK del Abl humanizado fue proporcional a la dosis en términos de AUC y Cmáx en dosis de 50 mg y 100 mg. Con base en el AUC0- (dia*ug/mL) de 237, 452 y 764 para el Abl humanizado de grupos 50 mg SC, 100 mg SC y 100 mg IV, respectivamente, la biodisponibilidad de Abl humanizado fue ~60% para los grupos SC contra IV. Los sujetos que reciben Abl humanizado experimentaron reducciones rápidas y sostenidas en la CRP en suero (Figura 66) .
Disposición del sujeto y demografía de referencia Un total de 27 sujetos se inscribió y completó el estudio (n=18 con Abl humanizado y n=9 con placebo) . No se retiraron sujetos debido a ninguna razón.
Todos los sujetos fueron masculinos; 23/27 sujetos fueron caucásicos y 4/27 fueron asiáticos. La edad promedio fue 29 (intervalo 20-59) y fue similar en todos los grupos. La altura y el peso promedio también fueron comparables en general en todos los grupos, aunque el grupo con placebo IV fue un poco menor.
Seguridad e inmunogenicidad hasta la Semana 12 para Abl humanizado y placebo En la Figura 67 se presenta un resumen de la seguridad. Para los grupos con Abl humanizado SC, un total de 11/12 (91%) pacientes experimentó un evento adverso (AE) en comparación con: 6/6 (100%) para el grupo con Abl humanizado IV; 4/6 (66.6%) para el grupo con placebo SC y 3/3 (100%) para el grupo con placebo IV.
En los grupos: No se informaron fallecimientos o AE graves y no hubo retiros debido a AE .
La mayoría de los AE fueron leves o moderados en intensidad.
Un caso de gastroenteritis en un sujeto con 50 mg SC de Abl humanizado se consideró grave pero no serio, y no se relacionó con la medicación de estudio.
No se detectaron anticuerpos Abl anti-humanizados en ningún sujeto durante este período.
Reacciones en el sitio de inyección.
Las reacciones en el sitio de inyección se informaron en 26% (7/27) de sujetos, y todas ocurrieron antes de la Semana 12 (Figura 68) . Las reacciones en el sitio de inyección ocurrieron en 5/12 sujetos con Abl humanizado SC y 1/6 sujetos con placebo SC. En los grupos IV, 0/6 sujetos con Abl humanizado y 1/3 sujetos con placebo experimentaron reacciones en el sitio de inyección. Todas las reacciones en el sitio de inyección fueron leves excepto en un sujeto con 100 mg SC de Abl humanizado con eritema y pruritis moderados en el sitio de inyección. No ocurrieron reacciones en el sitio de inyección después de la Semana 12 en ninguno de los grupos de Abl humanizado. Se observaron reacciones en el sitio de infusión en 0/6 sujetos que reciben Abl humanizado IV y 1/3 sujetos con placebo IV (pruritis en el sitio de infusión) .
Evaluaciones clínicas de laboratorio La Figura 69 muestra incidencias de niveles aumentados de aminotransferasa de alanina (ALT) y aminotransferasa de aspartato (AST) y bilirrubina en los grupos con Abl humanizado y placebo. Todos los niveles de ALT y AST fueron Grado 1 según los Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) [Criterios de terminología común para eventos adversos], y ningún nivel fue =3 veces el límite superior de la normalidad (ULN) . Todos los aumentos en la bilirrubina directa y total fueron CTCAE de Grado 1 o 2 y ningún sujeto cumplió con los criterios de daño en el hígado inducido por fármacos. Solamente un sujeto (grupo con 100 mg SC de Abl humanizado) tuvo bilirrubina total fuera del intervalo (26 pmol/L, intervalo 0-24 pmol/L) en la Semana 24.
También se observaron disminuciones esporádicas en los conteos de neutrófilos y plaquetas en los grupos con Abl humanizado y placebo (Figura 69). Conteos de neutrófilos por debajo del límite inferior de la normalidad fueron más comunes en los sujetos que reciben Abl humanizado que placebo pero todas las disminuciones fueron CTCAE de Grado 1 o 2. Solamente un sujeto (grupo con 50 mg SC de Abl humanizado) tuvo neutropenia leve constante en la Semana 24 (1.6 x 109/L en la Semana 24) . Las reducciones en los conteos de plaquetas fueron todas CTCAE de Grado 1 (nivel más bajo 134 x 109/L) y ningún sujeto tuvo un conteo de plaquetas bajo pasada la Semana 8.
Farmacocinética La biodisponibilidad de Abl humanizado fue de 60% para grupos de Abl humanizado SC de 50 y 100 mg en comparación con grupos de Abl humanizado IV de 100 mg en función de AUCo— promedio (Figura 70). La semivida del Abl humanizado fue similar en todos los grupos (intervalo promedio: 30.7-33.6 días) (Figura 70) . La concentración máxima en plasma (Cm¿x) de Abl humanizado SC se redujo en comparación con IV (Figura 65) . El tiempo medio para la concentración máxima en plasma (Tmáx) de Abl humanizado fue mayor luego de la administración de Abl humanizado SC (aproximadamente a la semana) que luego de la administración de Abl humanizado IV (aproximadamente al final de la infusión) .
Farmacodinámica Los niveles de CRP se redujeron en todos los sujetos que recibieron Abl humanizado sin consideración de la dosis o via de administración. (Figuras 66 y 71) de las semanas 4 a 12, los niveles de CRP fueron significativamente menores en los sujetos que recibieron Abl humanizado en comparación con placebo (valor p no ajustado <0.05; Figura 66). En sujetos con Abl humanizado, los niveles de CRP se redujeron hasta <20% de niveles pre dosis en: 72% (13/18) de sujetos en la semana 1; 73% (11/15) de sujetos en la semana 12 y 56% (10/18) de sujetos en la semana 24.
Conclusiones : En este estudio de Fase I, en general, el Abl humanizado de anticuerpo anti-IL-6 se toleró bien al administrarse en una dosis SC única en sujetos masculinos sanos. En general, las reacciones en el sitio de inyección fueron leves. No se detectaron anticuerpos Abl anti-humanizados . Los cambios en los conteos de enzimas, neutrofilos y plaquetas hepáticos fueron reversibles. La biodisponibilidad de Abl humanizado SC fue aproximadamente 60% de la observada con Abl humanizado IV. La semivida de Abl humanizado fue aproximadamente 30 días, sin consideración de la vía de administración. Estos datos concuerdan con los datos previos usando Abl humanizado IV. El Abl humanizado subcutáneo llevó a rápidas e importantes reducciones de la CRP en suero. Las reducciones de CRP observadas durante las primeras 12 semanas del estudio se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación. Estos datos preliminares soportan el desarrollo y la evaluación prolongados de Abl humanizado Se para el tratamiento de pacientes con RA.
En resumen, en este estudio de Fase I, el Abl humanizado de anticuerpo anti-IL-6 se toleró bien al administrarse en una dosis SC única; las reacciones en el sitio de inyección fueron en general leves. La biodisponibilidad de Abl humanizado SC fue ~60% de Abl humanizado IV, y la semivida fue ~30 dias. Se observaron reducciones rápidas e importantes en la CRP, que se mantuvieron durante 24 semanas de evaluación.
Ejemplo 36 Efecto de Abl sobre la actividad de la enfermedad evaluada por DAS28 Tal como se describe anteriormente, ALD518* es un anticuerpo monoclonal anti-IL-6 humanizado aislado con una semivida de ~30 dias, que contiene las secuencias pesada y ligera variables humanizadas comprendidas en las SEQ ID NO: 19 y 20. Estas secuencias pesada y ligera variables humanizadas derivan de un anticuerpo de conejo principal que se une específicamente a IL-6 humano cuyo anticuerpo se describe en dicha aplicación incorporada como Abl. ALD518 se une a IL-6 con alta afinidad, evitando la interacción y señalización mediadas por IL-6R soluble y unido a membrana. Respuestas de ACR rápidas y significativas se han demostrado con ALD518* en pacientes con RA. En este ejemplo informamos el impacto de ALD518 en la actividad de la enfermedad evaluada por DAS28 durante 16 semanas.
Métodos: Se aleatorizaron pacientes con RA activa y una respuesta inadecuada a MTX 1:1:1:1 para ALD518* con 80, 160 o 320 mg intravenoso o placebo durante estudio de Fase II controlado por placebo, doble ciego, de 16 semanas. Los pacientes recibieron dos infusiones IV de ALD518 (Día 1 y Semana 8), mientras se continuaba con dosis estables de MTX. La valoración de eficacia primaria fue la proporción de pacientes que alcanzaron ACR20 en la Semana 12; la actividad de la enfermedad se evaluó mediante la valoración de la actividad de la enfermedad (DAS28) en función de la proteína C reactiva (CRP) como valoración secundaria. La proporción de pacientes que alcanzaron una disminución definida por DAS28 (valores <2.6), bajo estado de la actividad de la enfermedad (LDAS; valor =3.2) y buenas respuestas de EULAR (DAS28 actual =3.2 y mejora a partir de la referencia >1.2) se evaluaron para el intento modificado de tratar a la población y se presentan para pacientes con datos disponibles (según lo observado) . Los valores P se basan en pruebas Chi-cuadrado.
Resultados: De 127 pacientes aleatorizados y tratados, 116 completaron la prueba. En el punto de referencia, la edad promedio fue 52.3 años y la duración de RA fue 6.8 años. En las semanas 4, 12 y 16, la proporción de los pacientes que alcanzaron LDAS y remisión fueron mayores que placebo para todas las dosis de ALD518*; las diferencias fueron significativas en comparación con placebo (p<0.05) para todas las evaluaciones salvo ALD518* 80 mg en la semana 4 (p=0.056). De manera similar, las respuestas de EULAR fueron significativamente mejores para todas las dosis de ALD518* en comparación con placebo (p<0.01) en las semanas 4, 12 y 16. Hubo una tendencia hacia mayores respuestas con dosis mayores de ALD518*.
Se reportaron SAE en dos pacientes ALD518 (ambos tenían aumentos importantes de enzimas hepáticas y discontinuaron el tratamiento) . En general, las elevaciones de enzimas hepáticas >2xULN ocurrieron en el 17% de ALD518* en comparación con 0% de pacientes tratados con placebo; la frecuencia fue la más alta en los 320 mg grupos de dosis. Aumentos modestos en el colesterol total se observaron (aumento medio en la semana 16=1.1 mmol/L para ALD518* en comparación con 0.2 mmol/L para placebo). Nueve pacientes con ALD518 tuvieron neutropenias transitorias de Grado II y dos tuvieron neutropenias de Grado III. No hubo reacciones a la infusión ni infecciones graves en ningún grupo de tratamiento ni inmunogenicidad evidente.
Conclusiones: En este estudio de Fase II, el inhibidor novedoso del IL-6 ALD518 resultó en mejoras rápidas e importantes en la actividad de la enfermedad sostenidas durante 16 semanas de evaluación en pacientes con RA y una respuesta no adecuada de MTX. ALD518 se toleró bien con un perfil de seguridad conforme a la biología del bloqueo de IL-6.
Ejemplo 37 Administración de Abl Métodos: Pacientes con RA activa se aleatorizaron en una prueba controlada por placebo, doble ciego de 16 semanas que compara múltiples infusiones iv de ALD518 (80, 160 o 320mg) . Los pacientes recibieron una infusión cada 8 semanas se mantuvieron en una dosis estable de MTX a lo largo de la prueba. Las evaluaciones incluyeron respuestas a ACR 20/50/70 y DAS28. Se evaluó la seguridad en todos los pacientes. Para retiros anticipados, el análisis de LOCF se usó para variables continuas e imputación que no responde para variables categóricas.
Resultados: Se aleatorizaron 132 pacientes; 127 se dosificaron. La duración de la enfermedad promedio fue 6.6 años; el valor DAS28 promedio fue 6.2 y HAQ-DI promedio fue 1.72. 11 pacientes no completaron la prueba de 16 semanas: 320mg-3, 160mg-1, 80mg-3, placebo-4 : 4 suspendieron el tratamiento debido a eventos adversos (80mg-2, 320mg-2) , con 2 SAE (80mg-l, 320mg-l) . Elevaciones en las enzimas hepáticas (LFT) >2xULN se observaron en 17% de ALD518 en comparación con 0% placebo. Hubo aumentos modestos en colesterol total (aumento promedio por la semana 16 = 1.1 mmol/L ALD518 en comparación con 0.2 mmol/L placebo) . 9 pacientes con ALD518 tuvieron neutropenias transitorias grado 2; 2 pts tuvieron neutropenias transitorias de grado 3. No hubo infecciones graves en ningún grupo de tratamiento. Las infusiones de ALD518 se toleraron bien sin reacciones a la infusión o inmunogenicidad evidente. En las semanas 4 y 16, las respuestas de ACR (análisis de imputación que no responde) y mejoras en valores de DAS28 fueron: Conclusión: ALD518 o Abl humanizado es el primer mAb para IL-6, en oposición a un mAb del receptor anti-IL-6 receptor, para mostrar una mejora importante, rápida y sostenida en la actividad de la enfermedad en RA. ALD518 en dosis que varían de 80 a 320mg en forma de 2 infusiones IV a pts con RA activa fue bien tolerado con aumentos de LFT y colesterol total y neutropenia transitoria observada en algunos pacientes. No hubo reacciones a la infusión asociadas con la administración de ALD518 ni inmunogenicidad detectable .
LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias biológicas referidas en la presente se proporcionan a continuación.
SEQ ID NO: 1 VPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSN CESSKEALAENNLNLPK MAEKDGCFQSGFNEETCLVKI ITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQK AK NLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM SEQ ID NO: 2 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWYQQKPGQR PKLLIYRASTLASGVSSRF GSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTEVV VKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN SEQ ID NO: 3 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEW IGIIYGSDETAYAT AIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDAKFNLWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 4 QASQSINNELS SEQ ID NO: 5 RASTLAS SEQ ID NO: 6 QQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 7 NYYVT SEQ ID NO: 8 IIYGSDETAYAT AIG SEQ ID NO: 9 DDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 10 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATG TGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA AGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGT CCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAG TGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACT ACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT SEQ ID NO: 11 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGCT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTG GATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGG ATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGCCGATTCACCAT CTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCT ATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTGTGGGGCCAAGGCACC CTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG SEQ ID NO: 12 CAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCC SEQ ID NO: 13 AGGGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 14 CAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 15 AACTACTACGTGACC SEQ ID NO: 16 ATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGC SEQ ID NO: 17 GATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTG SEQ ID NO: 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLE VGIIYGSDETAYATWAIG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVT VRQAPGKGLEWVGIIYGSDETAYATSAIG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 20 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAP LLIYRASTLASGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 21 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTINCQASETIYSWLSWYQQKPGQP PKLLIYQASDLASGVPSRFSGSGAGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYSGSNVDNVFGGGTE V VKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK SEQ ID NO: 22 METGLRWLLLVAVL GVQCQEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLNDHAMGWVRQAPGKGLE YIGFINSGGSARYASWAEGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCVRGGAVWSIHSFDPWGPG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 23 QASETIYS LS SEQ ID NO: 24 QASDLAS SEQ ID NO: 25 QQGYSGSNVDNV SEQ ID NO: 26 DHAMG SEQ ID NO: 27 FINSGGSARYASWAEG SEQ ID NO: 28 GGAVWSIHSFDP SEQ ID NO: 29 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATG TGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTGAGACCATTTACAGTTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGCAGCCT CCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGATTCAGCGGCAG TGGGGCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACT ACTGTCAACAGGGTTATAGTGGTAGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG SEQ ID NO: 30 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCA GCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTTACCTGCACAGCCT CTGGATTCTCCCTCAATGACCATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAA TACATCGGATTCATTAATAGTGGTGGTAGCGCACGCTACGCGAGCTGGGCAGAAGGCCGATTCAC CATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCA CCTATTTCTGTGTCAGAGGGGGTGCTGTTTGGAGTATTCATAGTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGG ACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG SEQ ID NO: 31 CAGGCCAGTGAGACCATTTACAGTTGGTTATCC SEQ ID NO: 32 CAGGCATCCGATCTGGCATCT SEQ ID NO: 33 CAACAGGGTTATAGTGGTAGTAATGTTGATAATGTT SEQ ID NO: 34 GACCATGCAATGGGC SEQ ID NO: 35 TTCATTAATAGTGGTGGTAGCGCACGCTACGCGAGCTGGGCAGAAGGC SEQ ID NO: 36 GGGGGTGCTGTTTGGAGTATTCATAGTTTTGATCCC SEQ ID NO: 37 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQASQSVYDNNYLSWFQQKPG QPP LLIYGASTLASGVPSRFVGSGSGTQFTLTITDVQCDDAATYYCAGVYDDDSDNAFGGGTEV VV RTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF SEQ ID NO: 38 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSVYYMNWVRQAPGKGLEW IGFITMSDNINYASWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARSRGWGTMGRLDLWGPGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 39 QASQSVYDNNYLS SEQ ID NO: 40 GASTLAS SEQ ID NO: 41 AGVYDDDSDNA SEQ ID NO: 42 VYYMN SEQ ID NO: 43 FITMSDNINYAS AKG SEQ ID NO: 44 SRGWGT GRLDL SEQ ID NO: 45 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATT TGCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCA GTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGG CAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCGT GGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCACAGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCA CTTACTATTGTGCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATAATGCCTTCGGCGGAGGGACCGAGGTG GTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT SEQ ID NO: 46 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGCT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACCCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTG GATTCTCCCTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGG ATCGGATTCATTACAATGAGTGATAATATAAATTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCAT CTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCT ATTTCTGTGCCAGGAGTCGTGGCTGGGGTACAATGGGTCGGTTGGATCTCTGGGGCCCAGGCACC CTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG SEQ ID NO: 47 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTACTTATCC SEQ ID NO: 48 GGTGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 49 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NO: 68 AGTCGTGGCTGGGGTGCAATGGGTCGGTTGGATCTC SEQ ID NO: 69 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQSVDDNNWLGWYQQ RG QPPKYLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGGFSGNIFAFGGGTEVV V RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN F SEQ ID NO: 70 METGLRWLLLVAVL GVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEW IGI IGGFGTTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLRITSPTTEDTATYFCARGGPGNGGDIWGQGTLVT VSSAST GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD SEQ ID NO: 71 QASQSVDDNNWLG SEQ ID NO: 72 SASTLAS SEQ ID NO: 73 AGGFSGNIFA SEQ ID NO: 74 SYAMS SEQ ID NO: 75 I IGGFGTTYYATWAKG SEQ ID NO: 76 GGPGNGGDI SEQ ID NO: 77 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATT TGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCGCCTGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA ACTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTGATGATAACAACTGGTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACGAGGG CAGCCTCCCAAGTACCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAA AGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCA CTTACTACTGTGCAGGCGGTTTTAGTGGTAATATCTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG 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ACTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTGATGATAACAACTGGTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACGAGGG CAGCCTCCCAAGTACCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAA AGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCA CTTACTACTGTGCAGGCGGTTTTAGTGGTAATATCTTTGCT SEQ ID NO: 682 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTG GCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGG ATCGGAATCATTGGTGGTTTTGGTACCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCAT CTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAGAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCT ATTTCTGTGCCAGAGGTGGTCCTGGTAATGGTGGTGACATC SEQ ID NO: 683 MDTRAPTQLLGLLLL LPGATFAAVLTQTPSPVSVPVGGTVTIKCQSSQSVYNNFLSWYQQKPGQ PP LLIYQASKLASGVPDRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYDDDADNA SEQ ID NO: 684 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSDYA SWVRQAPGKGLEW IGIIYAGSGSTWYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDGYDDYGDFDRLDL SEQ ID NO: 685 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATT TGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGTACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA AGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAATTTCTTATCGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG CCTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCAGATAGGTTCAGCGG CAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTT ACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 686 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACGCTCACCTGCACAGTCTCTG GAATCGACCTCAGTGACTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGG ATCGGAATCATTTATGCTGGTAGTGGTAGCACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCAC CATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCA CCTATTTCTGTGCCAGAGATGGATACGATGACTATGGTGATTTCGATCGATTGGATCTC SEQ ID NO: 687 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWYQQKSGQR PKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 688 METGLR LLLVAVLSGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYMTWVRQAPGKGLEW IGMIYGSDETAYANWAIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 689 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATG TGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCA AATGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAATCAGGGCAGCGT CCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAG TGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACT ACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 690 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCTCAGGTGTCCAGTGTCAGTCGCT GGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTG GATTCTCCCTCAGTAACTACTACATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGG ATCGGAATGATTTATGGTAGTGATGAAACAGCCTACGCGAACTGGGCGATAGGCCGATTCACCAT CTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCT ATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTG SEQ ID NO: 691 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYMTWVRQAPGKGLEWVGMIYGSDETAYANWAIG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 692 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYMTWVRQAPGKGLEWVGMIYGSDETAYANSAIG RFTISRDNS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 693 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGS GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREA VQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 694 CAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCC SEQ ID NO: 695 CAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCT SEQ ID NO: 696 ATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC SEQ ID NO: 697 GATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACTTG SEQ ID NO: 698 GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTA CTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAACGTACG SEQ ID NO: 699 AIQMTQSPSSLSAS GDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRT SEQ ID NO: 700 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACT TGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 701 GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTA CTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T SEQ ID NO: 702 AIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL S GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLS ADYE HKVY ACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC SEQ ID NO: 703 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACT TGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACC 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Claims (271)

REIVINDICACIONES
1. Un método para prevenir, tratar o diagnosticar una enfermedad o afección asociada con la IL-6, que comprende la administración de un anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo a un sujeto que lo necesita, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende: un polipéptido que comprende una cadena ligera: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 709, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723; y un polipéptido que comprende una cadena pesada: un polipéptido que tiene al. menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 657, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une específicamente a IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con IL-6.
2. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido de cadena ligera incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709.
3. El método de la reivindicación 2, donde una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: SEQ ID NO: 2, una secuencia de cadena ligera humana, de conejo o de primate no humano y una cadena ligera de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab'9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, donde la sustitución da como resultado el remplazo, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 709 y la secuencia donante.
4. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido de cadena pesada incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657.
5. El método de la reivindicación 4, donde una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: SEQ ID NO: 3, una secuencia dé cadena pesada humana, de conejo o de primate no humano y una cadena pesada de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, donde la sustitución da como resultado el remplazo, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 657 y la secuencia donante.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5; una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4 ; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120; una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 81.8% de identidad (idéntica en hasta al menos 9 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 71.4% de identidad (idéntica en hasta al menos 5 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 résiduos) con la SEQ ID NO: 6; y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 60% de identidad (idéntica en hasta al menos 3 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7 ; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 87.5% de identidad (idéntica en hasta al menos 14 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena ligera y al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada.
9. Un método para prevenir o tratar una enfermedad o afección asociada con la IL-6, que comprende la administración de un anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo a un sujeto que lo necesita, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende : dos o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden : una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma especifica a la IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con la IL-6.
10. Un método para prevenir o tratar una enfermedad o afección asociada con la IL-6, que comprende la administración de un anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo a un sujeto que lo necesita, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende : dos o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden : una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma especifica a la IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con la IL-6.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR1 de cadena pesada, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada y ligera están comprendidos en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Fab, Fab', F(ab' >2, Fv, scFv, IgNAR, SMIP, anticuerpo de camélido o nanoanticuerpo .
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde las regiones flanqueantes (FR) 1, 2, 3 y 4 en las regiones pesadas y ligeras variables de dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo, respectivamente, son FR humanas no modificadas o modificadas por la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos FR humanos con los correspondientes residuos FR de la cadena pesada o ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, donde dichas FR de cadena ligera humana 1, 2 y 3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y donde dicha FR4 de cadena ligera humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 2; y donde dichas FR de cadena pesada humana 1, 2 y 3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor dé la SEQ ID NO: 3 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y donde dicha FR4 de cadena pesada humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 3.
15.' El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 22 días en un sujeto humano saludable.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 25 días en un sujeto humano saludable.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 30 días en un sujeto humano saludable.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión (Kd) a IL-6 menor a alrededor de 50 picomolar o una tasa de disociación (Koff) de IL-6 menor o igual a 10~4 S"1.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une específicamente al o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o compite por la unión al o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que consiste esencialmente en los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y SEQ ID NO: 704 o los polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
20. El método de la reivindicación 19, donde dicha unión al o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o competencia por la unión al o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta humana o fragmento del mismo se establece (n) por mapeo epitópico usando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan todo el largo del polipéptido de IL-6 humana nativa e incluye (n) uno o más residuos comprendidos en fragmentos de IL-6 que se seleccionan de aquellos que respectivamente comprenden residuos de aminoácidos 37-51, residuos de aminoácidos 70-84, residuos de aminoácidos 169-183, residuos de aminoácidos 31-45 y/o residuos de aminoácidos 58-72 de la SEQ ID NO: 1.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo está aglicosilado .
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo contiene una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, semivida, proteólisis y/o glicosilación.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, de cadena simple o quimérico.
24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende adicionalmente una Fc humana.
26. El método de la reivindicación 25, donde dicha Fc humana está derivada de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgGl6, IgG17, IgG18 o IgG19.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde una o más actividades asociadas con la IL-6 son una actividad in vivo que comprende: albúmina en suero disminuida, proteina C-reactiva elevada ("CRP"), fatiga, fiebre, anorexia (pérdida de apetito), pérdida de peso, caquexia, debilidad, escala de pronóstico de Glasgow ("GPS") disminuida, dimero-D en suero elevado, perfil de coagulación anormal o cualquier combinación de los mismos.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde una o más de la o las actividades asociadas con la IL-6 son una actividad in vitro que comprende: estimular de la proliferación de células T1165, unión de IL-6 a IL-6R, activación (dimerización) de la glicoproteina transductora de señales gpl30, formación de multimeros IL-6/IL-6R/gpl30, estimulación de la producción de haptoglobina mediante células HepG2 modificadas para expresar el receptor de IL-6 humana o cualquier combinación de los mismos.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se expresa a partir de una célula recombinante .
30. El método de la reivindicación 29, donde la célula se selecciona de una célula de insecto, bacteriana, de levadura y de mamífero .
31. El método de la reivindicación 30, donde la célula es una célula de levadura.
32. El método de la reivindicación 31, donde la célula es una célula de levadura diploide.
33. El método de la reivindicación 31, donde la célula de levadura es una levadura Pichia.
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-33, donde la enfermedad o afección asociada con la IL-6 que comprende: cáncer, enfermedad o afección asociada con hipercoagulación, una enfermedad o afección asociada con una CRP en suero elevada, una enfermedad o afección asociada con hipoalbuminemia, un trastorno inflamatorio, un trastorno viral, un síndrome consuntivo, un trastorno autoinmunitario o una combinación de los mismos.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-33, donde la enfermedad o afección asociada con IL-6 comprende: fatiga general, fatiga inducida por el ejercicio, fatiga relacionada con el cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal, caquexia relacionada con la edad, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatia psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil sistémica, osteoartritis , osteoporosis , enfermedad ósea de Paget, osteoartritis, miéloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de células renales, enfermedad de Castleman multicéntrica, cáncer de ovario, tolerancia a fármacos en quimioterapia contra el cáncer, toxicidad de quimioterapia contra el cáncer, enfermedad cardíaca isquémica, ateroesclerosis , obesidad, diabetes, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular , fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis, insuficiencia cardíaca aguda, síndrome metabólico, abortos naturales, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis , enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, rechazo de transplante, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), crisis de citocina, gripe aviar, gripe H1N1, gripe porcina, gripe H5N1, viruela, gripe pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS), síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) .
36. El método de la reivindicación 34, donde la enfermedad o afección asociada con la hipercoagulación comprende: cáncer, trombosis venosa aguda, embolia pulmonar, trombosis durante el embarazo, necrosis cutánea hemorrágica, coagulación intravascular diseminada aguda o crónica (DIC) , formación de coágulos por cirugía, reposo prolongado, inmovilización prolongada, trombosis venosa, meningococcemia fulminante, apoplejía trombótica aguda, oclusión coronaria aguda, oclusión arterial periférica aguda, embolia pulmonar masiva, trombosis venosa axilar, trombosis venosa iliofemoral masiva, oclusión de cánulas arteriales, oclusión de cánulas venosas, cardiomiopatía, enfermedad venooclusiva hepática, hipotensión, disminución del rendimiento cardíaco, disminución de la resistencia vascular, hipertensión pulmonar, disminución de la distensibilidad pulmonar, leucopenia, tro bocitopenia, trombocitopenia inducida por heparina (HIT) , trombocitopenia y trombosis inducidas por heparina (HITT) , fibrilación auricular, implante de una válvula cardíaca prostética, propensión genética a padecer trombosis, factor V Leiden, mutación del gen de la protrombina, polimorfismo de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) , polimorfismo del receptor plaquetario, traumatismo, fracturas, quemaduras o cualquier combinación de las mismas.
37. El método de la reivindicación 34, donde la enfermedad o afección asociada con la CRP en suero elevada comprende enfermedades inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artropatía psoriática, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pénfigo, dermatomiositis, polimiositis, polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Kawasaki, vasculitis aislada del sistema nervioso central, arteritis de Churg-Strauss , poliarteritis microscópica, poliangiitis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis crioglobulinémica esencial, vasculitis reumatoide, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedad de Behcet, arteritis de Takayasu, enfermedad cardiaca isquémica, apoplejía, esclerosis múltiple, sepsis, vasculitis causada por infecciones virales, enfermedad de Buerger, cáncer, cáncer avanzado, osteoartritis , esclerosis sistémica, síndrome de CREST, enfermedad de Reiter, enfermedad ósea de Paget, síndrome de Sjogran, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fiebre mediterránea familiar, trombocitopenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedades tiroideas autoinmunes, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis alcohólica, hepatitis viral hepatitis B, hepatitis C, otras enfermedades autoinmunes específicas de órganos, quemaduras, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma alérgico, otras afecciones alérgicas o cualquier combinación de los mismos.
38. El método de la reivindicación 34, donde la enfermedad o afección asociada con la hipoalbulinemia comprende: cáncer, cáncer avanzado, artritis reumatoide, SIDA, enfermedad cardíaca, enfermedad hepática, deshidratación, desnutrición, exposición al plomo, malaria, enfermedad respiratoria, vejez, hipotiroidismo, tuberculosis, hipopituitarismo, neurastenia, hipernatremia, hiponatremia, enfermedad renal, esplénica, espondilitis anquilosante, síndrome del declive (retraso del crecimiento), enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, traumatismos, quemaduras o cualquier combinación dé los mismos.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-38, donde el cáncer comprende acantoma, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocitica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendríticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma quístico adenoide, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical , leucemia de linfocitos T del adulto, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer ,anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atípico, carcinoma de células básales, carcinoma de tipo basal, leucemia de linfocitos B, linfoma de linfocitos B, carcinoma de los conductos de Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor de hueso, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar, tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castle an, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocitica crónica, leucemia monocitica crónica, leucemia mielógena crónica, trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia neutrofilica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniof ringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberans, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de linfocitos B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario, tumor de seno endodérmico, cáncer endometrial, cáncer uterino endometrial, tumor endometrioide, linfoma de linfocitos T asociado a enteropatia, ependimoblastoma , ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de la familia de Ewing, sarcoma de la familia de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ducto biliar extrahepático, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de tubo falopiano, Fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células granulosas, leucemia de células pilosas, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, malignidad hematológica, carcinoma hepatocelular , linfoma hepatoesplénico de linfocitos T, síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, linfoma Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico, cáncer de mama inflamatorio, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia juvenil mielomonocitica, sarcoma aposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma léntigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer del labio y la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno óseo, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de vaina nerviosa periférica, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, ' linfoma MALT, linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor mediastinal de células germinales, tumor mediastinal, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de erkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario oculto, carcinoma urotelial metastásico, tumor Mülleriano mixto, leucemia monocítica, cáncer de boca, tumor mucinoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, micosis fungoides, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales del ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, enfermedad de Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer pancreático, cáncer pancreático, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis, paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, tumor perivascular de células epitelioides, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor parénquima pineal de diferenciación intermedia, .pineoblastoma , pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma precursor linfoblástico de linfocitos T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodermal primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer rectal, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio relacionado con el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcigeo, cáncer de la glándula salival, sarcoma, Schwannomatosis , carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasma secundario, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordones sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas, redondas y azules, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, somatoestatinoma, verruga del deshollinador, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma superficial diseminante, tumor neuroectodermal primitivo supratentorial, tumor epitelial superficial de ovario, sarcoma sinovial, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, leucemia linfocítica granular grande de linfocitos T, leucemia de linfocitos T, linfoma de linfocitos T, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células de transición, cáncer uracal, cáncer uretral, neoplasma urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Warthin, tumor de Wilms o cualquier combinación de los mismos.
40. El método de la reivindicación 39, donde el cáncer comprende: cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcitico, colangiocarcinoma, mesotelioma, enfermedad de Castleman, carcinoma de células renales o cualquier combinación de los mismos .
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-40, donde antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el sujeto presentaba o se encontraba en riesgo de desarrollar uno o más de los siguientes síntomas: albúmina en suero disminuida, proteína C reactiva elevada ("CRP") , fatiga, fiebre, anorexia (pérdida de apetito) , pérdida de peso, caquexia, debilidad, escala de pronóstico de Glasgow ("GPS") disminuida, dímero-D en suero elevado, perfil de coagulación anormal y cualquier combinación de los mismos.
42. El método de la reivindicación 41, donde dicho síntoma es un efecto secundario de otro agente terapéutico administrado al sujeto antes de, junto con o luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-40, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz para la prevención o el tratamiento de uno o más síntomas asociados con una IL-6 elevada.
44. El método de la reivindicación 43, donde la cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra entre alrededor de 0.1 y 20 mg/kg de peso corporal del sujeto que la recibe.
45. El método de la reivindicación 41, que comprende además controlar al sujeto para evaluar dichos síntomas luego de la administración del anticuerpo de Abl.
46. El método de la reivindicación 41, donde dicho síntoma se presenta antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
47. El método de la reivindicación 46, donde dicho síntoma se mejora o restaura a un estado normal dentro de aproximadamente 1-5 semanas desde la administración del anticuerpo de Abl.
48. El método de la reivindicación 47, donde dicho síntoma luego se mantiene mejorado durante todo el período entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo de Abl.
49. El método de la reivindicación 41, donde el perfil de coagulación del sujeto se evalúa mediante la medición del nivel en suero de uno o más del dímero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y factor de von Willebrand del sujeto.
50. El método de la reivindicación 41, donde el perfil de coagulación del sujeto se evalúa mediante una medición funcional de la capacidad de coagulación.
51. El método de la reivindicación 50, donde la medición funcional de la capacidad de coagulación se selecciona del tiempo de protrombina (PT) , la tasa de protrombina (PR), la tasa normalizada internacional (INR) o cualquier combinación de los mismos .
52. El método de la reivindicación 41, comprende además: medir la tasa normalizada internacional (INR) del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar al sujeto el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si la INR del sujeto es menor a alrededor de 0.9.
53. El método de la reivindicación 41, que comprende además: medir la tasa normalizada internacional (INR) del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar al sujeto el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si la INR del sujeto es menor a alrededor de 0.5.
54. El método de cualquiera de las reivindicaciones 52-53, donde la INR del sujeto se aumenta a más de aproximadamente 0.9 dentro de las 4 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo al sujeto.
55. El método de la reivindicación 41, que comprende además: medir el nivel de dimero-D en suero del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si el nivel de dimero-D en suero del sujeto es mayor al rango de referencia normal.
56. El método de la reivindicación 55, donde el nivel de dimero-D en suero del sujeto se disminuye a menos del limite superior del rango de referencia normal dentro de las 4 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo al sujeto.
57. El método de la reivindicación 41, que da como resultado una mejora prolongada en el perfil de coagulación del suj eto .
58. El método de la reivindicación 41, donde el perfil de coagulación del sujeto mejora considerablemente dentro de alrededor de 2 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
59. El método de la reivindicación 58, donde el perfil de coagulación del sujeto se mantiene considerablemente mejorado aproximadamente 12 semanas luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo al sujeto.
60. El método de la reivindicación 41, que comprende además: medir la temperatura corporal del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si la temperatura corporal del sujeto es mayor a alrededor de 38°C.
61. El método de la reivindicación 41, que comprende además: medir el peso corporal del sujeto 1 antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si el peso del sujeto disminuyó en aproximadamente un 5% o más dentro de aproximadamente 30 días o si el índice de masa corporal magra del sujeto es menor a alrededor de 17 kg / m2 (sujeto masculino) o menor a alrededor de 14 kg / m2 (sujeto femenina) .
62. El método de la' reivindicación 41, que comprende además: medir la fuerza muscular del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si la fuerza muscular del sujeto disminuyó en un porcentaje mayor a aproximadamente el 20% dentro de aproximadamente 30 días.
63. El método de la reivindicación 41, que da como resultado una mejora prolongada de la caquexia, la debilidad, la fatiga y/o la fiebre en el sujeto.
64. El método de la reivindicación 41, donde la masa corporal del sujeto se aumenta en aproximadamente 1 kilogramo dentro de aproximadamente 4 semanas de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
65. El método de la reivindicación 41, donde la caquexia del sujeto se mejora considerablemente dentro de alrededor de 4 semanas de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo .
66. El método de la reivindicación 65, donde la caquexia del sujeto se evalúa mediante la medición de la masa corporal total, la masa corporal magra, el índice de masa corporal magra y/o la masa corporal magra apendicular del sujeto.
67. El método de la reivindicación 66, donde la medición de la masa corporal del sujeto descuenta (resta) el peso estimado del o de los tumores del paciente y/o la o las recolecciones de fluido extravascular .
68. El método de la reivindicación 66, donde la caquexia del sujeto se mantiene considerablemente mejorada aproximadamente 8 semanas luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
69. El método de la reivindicación 41, donde la debilidad del sujeto se mejora considerablemente dentro de alrededor de 2 semanas de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo .
70. El método de la reivindicación 69, donde la debilidad del sujeto se mantiene considerablemente mejorada aproximadamente 12 semanas luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
71. El método de la reivindicación 41, donde la fatiga del sujeto se mejora considerablemente dentro de alrededor de 1 semana de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo .
72. El método de la reivindicación 71, donde la fatiga del sujeto se mide a través de la prueba FACIT-F FS .
73. El método de la reivindicación 72, donde el resultado del FACIT-F FS del sujeto se mejora en al menos alrededor de 10 puntos .
74. El método de la reivindicación 71, donde la fatiga del paciente permanece considerablemente mejorada aproximadamente 12 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
75. El método de la reivindicación 41, donde la fiebre del sujeto se mejora considerablemente dentro de alrededor de 1 semana de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo .
76. El método de la reivindicación 75, donde la fiebre del sujeto se mantiene considerablemente mejorada aproximadamente 12 semanas luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
77. El método de la reivindicación 41, donde dicho sujeto presenta un nivel de CRP en suero elevado antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
78. El método de la reivindicación 41, donde dicho sujeto presenta un nivel de albúmina en suero reducido antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
79. El método de la reivindicación 41, mediante el cual mejora la Escala de Pronóstico de Glasgow (GPS) del paciente.
80. El método de la reivindicación 41, que comprende además: medir el nivel de CRP en suero del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si el nivel de CRP en suero del sujeto es al menos aproximadamente 5 mg/L .
81. El método de la reivindicación 41, donde el nivel de CRP en suero del sujeto se reduce a menos de aproximadamente 10 mg/L dentro de 1 semana de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
82. El método de la reivindicación 41, donde el nivel de CRP en suero del sujeto se reduce a menos de aproximadamente 5 mg/L dentro de 1 semana de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
83. El método de la reivindicación 41, donde el nivel de CRP en suero del sujeto se reduce a menos de aproximadamente 1 mg/L dentro de 1 semana de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
84. El método de la reivindicación 41, que da como resultado una reducción prolongada del nivel de CRP en suero del suj eto .
85. El método de la reivindicación 81, donde 14 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
86. El método de la reivindicación 81, donde 21 dias luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
87. El método de la reivindicación 81, donde 28 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
88. El método de la reivindicación 81, donde 35 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
89. El método de la reivindicación 81, donde 42 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
90. El método de la reivindicación 81, donde 49 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
91. El método de la reivindicación 81, donde 56 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
92. El método de la reivindicación 41, que comprende además: medir el nivel de albúmina en suero del sujeto antes de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo y administrar el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo si el nivel de albúmina en suero del sujeto es menor a aproximadamente 35 g/L.
93. El método de la reivindicación 92, donde el nivel de albúmina en suero del sujeto se aumenta hasta más de aproximadamente 35 g/L dentro de alrededor de 5 semanas de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
94. El método de la reivindicación 41, que da como resultado un aumento prolongado del nivel de albúmina en suero del sujeto.
95. El método de la reivindicación 94, donde 42 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de albúmina en suero del sujeto se mantiene superior a 35 g/L.
96. El método de la reivindicación 94, donde 49 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de albúmina en suero del sujeto se mantiene superior a 35 g/L.
97. El método de la reivindicación 94, donde 56 días luego de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo el nivel de albúmina en suero del sujeto se mantiene superior a 35 g/L.
98. El método de la reivindicación 41, donde el nivel de albúmina en suero del sujeto se aumenta en alrededor de 5 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas de la administración del anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo.
99. El método de la reivindicación 41, que comprende además el control del sujeto para evaluar el perfil de coagulación.
100. El método de la reivindicación 41, donde el sujeto presentó un nivel de dimero-D en suero elevado antes del tratamiento .
101. El método de la reivindicación 41, donde el sujeto presentó un nivel de proteina C reactiva (CRP) en suero elevado antes del tratamiento.
102. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-101, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo se administra al sujeto con una frecuencia de como 1 máximo una vez por periodo de aproximadamente cuatro semanas .
103. El método de la reivindicación 102, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por periodo de aproximadamente ocho semanas.
104. El método de la reivindicación 103, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por periodo de aproximadamente doce semanas.
105. El método de la reivindicación 104, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente dieciséis semanas.
106. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-40, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo de se administra en una cantidad eficaz desde el punto de vista del diagnóstico para la detección de sitios de enfermedad que expresen IL-6.
107. El método de la reivindicación 106, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se acopla de forma directa o indirecta a un radionúclido, fluoróforo u otra etiqueta detectable que facilita la detección del anticuerpo en sitios de enfermedad que expresan la IL-6.
108. El método de la reivindicación 106, que se utiliza para detectar tumores o metástasis que expresan la IL-6.
109. El método de la reivindicación 106, que se utiliza para detectar la presencia de sitios de inflamación asociados con células que expresan la IL-6.
110. El método de la reivindicación 106, donde se utilizan los resultados para facilitar el diseño de un régimen terapéutico apropiado .
111. El método de la reivindicación 106, donde dicho régimen terapéutico incluye radioterapia, quimioterapia o una combinación de las mismas.
112. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-101, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se administra conjuntamente con otros agentes terapéuticos que comprende: agentes quimioterapéuticos, estatinas, citocinas, agentes inmunosupresores , agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes anti-debilidad, agentes antifatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, agentes citotóxicos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, agentes antivirales, agentes anti-citocina, otros agentes terapéuticos o cualquier combinación de los mismos.
113. El método de la reivindicación 112, donde el agente quimioterapéutico comprende: antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esferoides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrogeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas, IL-12, IL-2, antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos.
114. El método de la reivindicación 112, donde el anticoagulante comprende: abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxa™/Pradax™) , desirudina (Revasc™/Iprivask™) , dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta™/Exarta™) o cualquier combinación de los mismos.
115. El método de la reivindicación 112, donde la estatina comprende: atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas .
116. El método de la reivindicación 112, donde el otro agente terapéutico es un antagonista de un factor que comprende factor de necrosis tumoral alfa, interferón gama, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor que induce la proteólisis, factor que inhibe la leucemia o cualquier combinación de los mismos.
117. El método de la reivindicación 112, donde el agente anti-caquexia comprende: cannabis, dronabinol (Marinol™) , nabilona (Cesamet) , cannabidiol, cannabicromeno, tetrahidrocannabinol, Sativex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
118. El método de la reivindicación 112, donde el agente anti-náusea o agente antiemético comprende: antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos, antihistaminas, aprepitant, benzodiazepinas , cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides , cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jenjibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet), antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
119. El método de la reivindicación 112, donde el otro agente terapéutico comprende tamoxifeno, antagonistas de BCL-2, estrógenos, bisfosfonatos, teriparatida, ranelato de estroncio, alendronato de sodio (Fosamax) , risedronato (Actonel) , raloxifeno, ibandronato (Boniva) , Obatoclax, ABT-263, gosipol, gefitinib, receptor del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de tirosina cinasa, erlotinib, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico, psoralenos, trioxisaleno, metoxsaleno, bergapteno, retinoides, etretinato, acitretina, infliximab (Remicade®) , adalimumab, infliximab, etanercept, Zenapax™, Ciclosporina, Metotrexato, factor de estimulación de colonias de granulocitos , filgrastim, lenograstim, Neupogen, Neulasta, ácidos 2-Arilpropiónicos , Aceclofenac, Acemetacina, Ácido acetilsalicílico (Aspirina) , Alclofenac, Alminoprofeno , Amoxiprina, Ampirona, Ácidos arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Díclofenac, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico, ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranílieos , Oxametacina, Oxaprozin, Oxicamos, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglucósidos , Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriáxona , Cefuroxima, Cefalosporinas , Cloramfenicol , Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazoiidona, ácido Fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos , Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, acrólidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactams , Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontosil', Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol , Sulfanilimida, Sulfasalazina , Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas , Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina. Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides , Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides , Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona . Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija antiretroviral, un potenciador sinérgico antiretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir , foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxuridina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, loviriida, maraviroc, M -0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltamivir , penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir , valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina o cualquier combinación de los mismos.
120. El método de la reivindicación 112, donde el agente citotóxico, agente quimioterapéutico o agente inmunosupresor comprende: 1-deshidrotestosterona, 1-metilnitrosourea, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, Abatacept, abraxano, acitretina, aclarubicina, Actinio-225 (225Ac) , actinomicina, Adalimumab, inhibidores de la desaminasa de adenosina, Afelimomab, Aflibercept, Afutuzumab, Alefacept, alitretinoina, alquil sulfonatos, agentes alquilantes, altretamina, alvocidib, ácido aminolevulinico/metil aminolevulinato, aminopterina, aminopterina, amrubicina, amsacrina, amsacrina, anagrelida, Anakinra, antracenodionas , antraciclinas , antraciclinas , antraciclinas, antramicina (AMC) ; agentes antimitóticos, antibióticos, anticuerpos anti-CD20, antifolatos, globulina Anti-linfocitos, Antimetabolitos , globulina Anti-timocitos , trióxido arsénico, Aselizumab, asparaginasa, destructores de asparagina, Astatina-211 ( 11At) , Atlizumab, Atorolimumab, atrasentán, Avastin™, azacitidina, Azatioprina, azelastina, aziridinas, Basiliximab, anticuerpos BAYX, Belatacept, Belimumab, belotecán, bendamustina, Bertilimumab, bexaroteno, bisantreno Bismuto-213 (213Bi), Bismuto-212 (212Bi) , bleomicina, bleomicina, bleomicina, anticuerpos BLyS, bortezomib, busulfán, busulfán, inhibidores de Calcineurina, caliqueamicina, camptotecina, camptotecinas , capecitabina , carboplatina (paraplatina) , carbocuona, carminomicina, carmofur, carmustina, carmustina (BSNU) , anticuerpos CAT, anticuerpos CDlla, anticuerpos CD147/Basigina, anticuerpos CD154, anticuerpos CD18, anticuerpos CD20, anticuerpos CD23, anticuerpos CD3, anticuerpos CD4, anticuerpos CD40, anticuerpos CD62L/L-selectina, anticuerpos CD80, inhibidores de CDK, Cedelizumab, celecoxib, Certolizumab pegol, clorambucilo, clorambucilos , Ciclosporina, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatinos, cladribina, Clenoliximab, clofarabina, colchicina, anticuerpos del componente complemento 5, Cobre-67 (67Cu) , corticosteroides , anticuerpos CTLA-4, proteínas de fusión a CTLA-4, inhibidores de Ciclofilina, ciclofosfamidas, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, ribonucleasas citotóxicas, dacarbazina, Daclizumab, dactinomicina, dactinomicina (actinomicina D) , daunorubicina, daunorubicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina ) , decitabina, Deforolimus, demecolcina, detorubicina, dibromomanitol, dietilcarbamazina, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, dihidroxi antracina diona, toxina de la difteria, inhibidores de la ADN polimerasa, docetaxel, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, doxorrubicina (adriamicina) , DXL625, Eculizumab, Efalizumab, efaproxiral, antagonistas de EGFR, elesclomol, elsamitrucina, Elsilimomab, emetina, antagonistas del receptor de endotelina, epipodofilotoxinas , epirubicina, epotilonas, Erbitux™, Erlizumab, estramustina, Etanercept, bromuro de etidio, etoglucid, etopósido, fosfato de etopósido, Everolimus, Faralimomab, inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de FKBP, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, Fontolizumab, fotemustina, Galiximab, Galio-67 (67Ga) , Gantenerumab, Gavilimomab, gemcitabina, glucocorticoides , Golimumab, Gomiliximab, gramicidina D, Gusperimus, Herceptin®, hidrazinas, hidroxiurea, agentes hipometilantes, idarubicina, Idarubicina, ifosfamida, antagonistas de IL-1, antagonistas del receptor de IL-1, IL-12, anticuerpos IL-12, antagonistas de IL-12R, anticuerpos IL-13, IL-2, inhibidores de IL-2, receptor de IL-2/anticuerpos CD25, anticuerpos IL-6, imatinib mesilato, anticuerpos de Inmunoglobulina E, inhibidores de I P deshidrogenasa, Infliximab, Inolimomab, anticuerpos de Integrina, anticuerpos de Interferón, interferones , anticuerpos de Interleucina 5, anticuerpos del receptor de Interleucina-6, interleucinas, Yodo-125 (125I), yodo-131 (131I), Ipilimumab, irinotecán, ixabepilona, Keliximab, larotaxel, Plomo-212 (212Pb) , Lebrilizumab, Leflunomida, Lenalidomida, Lerdelimumab, leucovorina, anticuerpos LFA-1, lidocaina, inhibidores de lipoxigenasa, lomustina (CCNU) , lonidamina , lucantona, Lumiliximab, Lutetio-177 (177Lu) , Macrólidos, manosulfán, Mas 1imomab, masoprocol, mecloretamina, melfalán, Mepolizumab, mercaptopurina, Metelimumab, Metotrexato, inhibidores del ensamblaje de microtúbulos , potenciadores de la estabilidad de microtúbulos, mitramicina, mitobronitol, mitoguazona, mitomicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, orolimumab, inhibidores de mTOR, Muromonab-CD3 , mustinas, ácido Micofenólico, mitotano (0, P ' - ( DDD) ) , Natalizumab, nedaplatina, Nerelimomab, nimustina, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, ácido nordihidroguaiarético, oblimersén, ocrelizumab, Ocrelizumab, Odulimomab, ofatumumab, olaparib, Omalizumab, ortataxel, Otelixizumab, oxaliplatina, oxaliplatina, paclitaxel (taxol) , Pascolizumab, antagonistas de PDGF, pegaspargasa, pemetrexed, Pentostatina, Pertuzumab, Pexelizumab, inhibidores de fosfodiesterasa, Fósforo-32 (32P) , Pimecrolimus Abetimus, pirarubicina, pixantrona, platinos, plicamicina , inhibidores de poli-ADP ribosa polimerasa, sodio porfimer, derivados de porfirina, prednimustina, procaina, procarbazina, procarbazina, propranolol, inhibidores de proteasoma, exotoxinas pseudomonas, toxina Pseudomonas, inhibidores de la síntesis de purina, puromicina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, radioisótopos, radioterapia, raltitrexed, ranimustina, Reslizumab, agonistas del receptor retinoide X, retinoides, Renio-186 (186Re) , Renio-188 (188Re) , inhibidores de ribonucleótido reductasa, ricina, Rilonacept, Rituxan®, Rovelizumab, rubitecán, Ruplizumab, Samario-153 (153Sm), satraplatina, Escandio-47 (47Sc) , moduladores del receptor selectivo de andrógeno, seliciclib, semustina, antagonistas de las hormonas sexuales, Siplizumab, Sirolimus, inhibidores de esteroides aromatasa, esteroides, estreptozocina, estreptozotocina, Tacrolimus, talaporfina, Talizumab, taxanos, taxoles, tegafur, Telimomab aritox, temoporfina, temozolomida, temsirolimus, Temsirolimus , Teneliximab, tenipósido, Teplizumab, Teriflunomida, tesetaxel, testolactona, tetracaina, Talidomida, tioepa clorambucilo, tiopurinas tioguanina, TioTEPA, inhibidores de timidilato sintasa, tiazofurina, tipifarnib, anticuerpos de linfocitos T, antagonistas de TNF, anticuerpos de TNF, proteínas de fusión de TNF, proteínas del receptor de fusión de TNF, inhibidores TNF-alfa, Tocilizumab, inhibidores de topoisomerasa , topotecán, Toralizumab, trabectedina, Tremelimumab, treosulfano, tretinoina, triazenos, triazicuona, trietilenomelamina, tetranitrato de triplatina, trofosfamida, anticuerpos monoclonales específicos del antígeno tumoral, inhibidores de tirosina cinasa, uramustina, Ustekinumab, valrubicina, Valrubicina, Vapaliximab, antagonistas de VEGF, Vepalimomab, verteporfina, vinblastina, alcaloides de la vinca, vincristina, vindesina, vinflunina, vinorelbina, Visilizumab, vorinostat, Itrio-88 (88Y), Itrio-90 (90Y) , Zanolimumab, zileutón, Ziralimumab, Zolimomab aritox, zorubicina, Zotarolimus o cualquier combinación de los mismos .
121. El método de la reivindicación 112, donde el otro agente activo es uno o más agonistas, antagonistas o moduladores de un factor que comprende: TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , Hepcidina o cualquier combinación de los mismos.
122. El método de la reivindicación 112, donde el antagonista de IL-6 comprende: anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos antisentido, polipéptidos, moléculas pequeñas o cualquier combinación de los mismos .
123. El método de la reivindicación 122, donde el ácido nucleico antisentido comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos de una secuencia que codifica la IL-6, el receptor de IL-6 alfa, el gpl30, la p38 MAP cinasa, JA 1, JAK2, JAK3 o SY .
124. El método de la reivindicación 122, donde el antagonista de IL-6 es un anticuerpo anti-IL-6.
125. El método de la reivindicación 122, donde el ácido nucleico antisentido comprende ADN, ARN, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino) , ácido nucleico glicólico, ácido nucleico treósico o cualquier combinación de los mismos. El método de la reivindicación 122, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del mismo comprende: Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, un fragmento de unión a la IL-6 o cualquiera de los anteriores, una variante de cualquiera de los anteriores o cualquier combinación de los mismos.
126. El método de la reivindicación 122, donde el polipéptido del antagonista de IL-6 comprende un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3 y SYK.
127. El método de la reivindicación 126, donde el fragmento tiene al menos 40 aminoácidos de longitud.
128. El método de la reivindicación 122, donde el antagonista de IL-6 comprende una IL-6 soluble, un receptor de IL-6 alfa, un gpl30, una p38 MAP cinasa, JA 1, JAK2, JAK3, SYK o cualquier combinación de los mismos.
129. El método de la reivindicación 112, donde el antagonista de IL-6 está acoplado a un resto que aumenta la semivida .
130. El método de cualquiera de las reivindicaciones 112-129, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo está directa o indirectamente acoplado a uno o más de dichos agentes terapéuticos adicionales.
131. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-101, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo está directa o indirectamente acoplado a una etiqueta detectable.
132. El método de la Reivindicación 131, donde la etiqueta detectable comprende: tintes fluorescentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes, estreptavidina, avidina, biotina, materiales radioactivos, enzimas, sustratos, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, luciferasa, rodamina, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina, cloruro de dansilo, luminol, luciferina, aecuorina, Yodo 125 (125I), Carbono 14 (14C), Azufre 35 (35S), Tritio (3H), Fósforo 32 (32P) o cualquier combinación de los mismos.
133. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-30 o las reivindicaciones 34-128, , donde el anticuerpo Abl se administra al sujeto en forma de uno o más ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo Abl.
134. El método de la reivindicación 133, donde dichos uno o más ácidos nucleicos se introducen al sujeto que los recibe como un virus, un liposoma, un complejo de lípido catiónico, un complejo de polímero catiónico o un complejo de nanoparticulas .
135. El método de la reivindicación 133, donde dichos uno o más ácidos nucleicos están compuestos por codones preferidos humanos o de levadura.
136. El método de la reivindicación 133, donde dichos uno o más ácidos nucleicos están comprendidos en un vector.
137. El método de la reivindicación 136, donde el vector es un vector viral plásmido o recombinante .
138. El método de la reivindicación 133, donde dichos uno o más ácidos nucleicos comprenden las secuencias de polinucleótido de cadena pesada y ligera de la SEQ ID NO: 723 y SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
139. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo Abl comprende: (a) polipéptidos de cadena pesada y ligera que comprenden: SEQ ID NO: 709 y SEQ ID NO: 657; SEQ ID NO: 702 y SEQ ID NO: 704; SEQ ID NO: 706 y SEQ ID NO: 708; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; (b) un polipéptido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de los polipéptidos de (a) ; (c) un polinucleótido que se híbrida en condiciones de hibridación de restricción alta o moderada a cualquiera de las secuencias de polinucleótidos de cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11; (d) un polinucleótido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de polinucleótido de cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11; (e) un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos de (c) o (d) .
140. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo Abl y otro compuesto terapéutico, donde el anticuerpo Abl comprende: un polipéptido de cadena ligera que comprende: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 709, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723; y un polipéptido de cadena pesada que comprende: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 657, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma específica a la IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con la IL-6 y donde el otro compuesto terapéutico comprende: agentes quimioterapéuticos , estatinas, citocinas, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes antidebilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, un agente citotóxico, otro compuesto terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
141. La composición de la reivindicación 140, donde el polipéptido de cadena ligera incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709.
142. La composición de la reivindicación 141, donde una o más de las sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: SEQ ID NO: 2, una secuencia de cadena ligera humana, de conejo o de primate no humano y una cadena ligera de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, donde la sustitución da como resultado el remplazo, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 709 y la secuencia donante.
143. La composición de la reivindicación 142, donde el polipéptido de cadena pesada incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657.
144. La composición de la reivindicación 143, donde una o más de las sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: SEQ ID NO: 3, una secuencia de cadena pesada humana, de conejo o de primate no humano y una cadena pesada de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, donde la sustitución da como resultado el remplazo, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 657 y la secuencia donante.
145. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-144, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5; una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: ' 6; una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120; una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
146. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-144, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDRl de cadena ligera que tiene al menos 81.8% de identidad (idéntica en hasta al menos 9 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4 ; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 71.4% de identidad (idéntica en hasta al menos 5 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDRl de cadena pesada que tiene al menos 60% de identidad (idéntica en hasta al menos 3 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 87.5% de identidad (idéntica en hasta al menos 14 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
147. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 145-146, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena ligera y al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada.
148. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo Abl y otro compuesto terapéutico, donde el anticuerpo Abl comprende: dos o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4 ; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden : una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma especifica a la IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con la IL-6 y donde el otro compuesto terapéutico comprende: agentes quimioterapéuticos , estatinas, citocinas, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes antidebilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, un agente citotóxico, otro compuesto terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
149. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo Abl y otro compuesto terapéutico, donde el anticuerpo Abl comprende: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden : una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma especifica a la IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con la IL-6 y donde el otro compuesto terapéutico comprende: agentes quimioterapéuticos , estatinas, citocinas, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes antidebilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, un agente citotóxico, otro compuesto terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
150. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 148-149, donde dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada .
151. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 148-149, donde dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR1 de cadena pesada, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada.
152. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 144-147, donde dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada y ligera están comprendidos en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Fab, Fab1, F(ab')2/ Fv, scFv, IgNAR, SMIP, anticuerpos de camélido o nanoanticuerpos .
153. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 148-151, donde las regiones flanqueantes (FR) 1, 2, 3 y 4 en las regiones pesadas y ligeras variables de dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo, respectivamente, son FR humanas no modificadas o modificadas por la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos FR humanos con los correspondientes residuos FR de la cadena pesada o ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, donde dichas FR de cadena ligera humana 1, 2 y 3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 que se extiende desde el comienzo de la FRl hasta el final de la FR3 y donde dicha FR4 de cadena ligera humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 2; y donde dichas FR de cadena pesada humana 1, 2 y 3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 3 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y donde dicha FR4 de cadena pesada humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 3.
154. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-153, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 22 días en un sujeto humano saludable.
155. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-153, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 25 días en un sujeto humano saludable.
156. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-153, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una semivida in vivo de al menos alrededor de 30 días en un sujeto humano saludable.
157. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-156, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión (Kd) para IL-6 menor a alrededor de 50 picomolar o una tasa de disociación ( off) de IL-6 menor o igual a 10"4 S"1.
158. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-157, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma especifica al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o compite para unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que consiste esencialmente en los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y SEQ ID NO: 704 o los polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
159. La composición de la reivindicación 158, donde dicha unión al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o competición de unión al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo se establece mediante mapeo epitópico utilizando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan toda la longitud del polipéptido de IL-6 humana nativa e incluye uno o más residuos comprendidos en los fragmentos de IL-6 seleccionados de aquellos que comprenden respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, los residuos de aminoácidos 169-183, los residuos de aminoácidos 31-45 y/o los residuos de aminoácidos 58-72 de la SEQ ID NO: 1.
160. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-159, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo está aglicosilado .
161. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-160, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo contiene una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación .
162. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-161, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, de cadena simple o quimérico.
163. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-162, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende Fab, Fab', F(ab' )2/ Fv o scFv.
164. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-163, donde dicho anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo comprende adicionalmente una Fc humana.
165. La composición de la reivindicación 164, donde dicha Fc humana proviene de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
166. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-165, donde dichas una o más actividades asociadas con la IL-6 son una actividad in vivo que comprende: albúmina en suero disminuida, proteina C reactiva ("CRP") elevada, fatiga, fiebre, anorexia (pérdida de apetito) , pérdida de peso, caquexia, debilidad, escala de pronóstico de Glasgow ("GPS") disminuida, dimero-D en suero elevado, perfil de coagulación anormal o cualquier combinación de los mismos.
167. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-165, donde una o más de la o las actividades asociadas con la IL-6 es una actividad in vitro que comprende: estimulación de la proliferación de células T1165, unión de IL-6 a IL-6R, activación (dimerización) de la glicoproteina transductora de señales gpl30, formación de multímeros IL-6/IL-6R/gpl30, estimulación de la producción de haptoglobina mediante células HepG2 modificadas para expresar el receptor de IL-6 humana o cualquier combinación de los mismos.
168. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-167, donde el anticuerpo Abl o fragmento de, anticuerpo se expresa a partir de una célula recombinante .
169. La composición de la reivindicación 168, donde la célula se selecciona de una célula de insecto, bacteriana, de levadura y de mamífero.
170. La composición de la reivindicación 169, donde la célula es una célula de levadura.
171. La composición de la reivindicación 170, donde la célula es una célula de levadura diploide.
172. La composición de la reivindicación 171, donde la célula de levadura es una levadura Pichia.
173. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-172, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se administra conjuntamente con otros agentes terapéuticos que comprenden: agentes quimioterapéuticos, estatinas, citocinas, agentes inmunosupresores , agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes anti-debilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, agentes citotóxicos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, agentes antivirales, agentes anti-citocina, otros agentes terapéuticos o cualquier combinación de los mismos .
174. La composición de la reivindicación 173, donde el agente quimioterapéutico comprende antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas , antagonistas de IL-12, IL-2, IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos .
175. La composición de la reivindicación 173, donde el anticoagulante comprende: abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán ( PradaxaTO/Pradax™) , desirudina (Revascm/Iprivaskm) , dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta'VExarta™) o cualquier combinación de los mismos.
176. La composición de la reivindicación 173, donde la estatina comprende: atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas.
177. La composición de la reivindicación 173, donde el otro agente terapéutico es un antagonista de un factor que comprende factor de necrosis tumoral alfa, interferón gama, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor que induce la proteólisis, factor que inhibe de la leucemia o cualquier combinación de los mismos.
178. La composición de la reivindicación ,173, donde el agente anti-caquexia comprende: cannabis, dronabinol (Marinol™) , nabilona (Cesamet) , cannabidiol, cannabicromeno, tetrahidrocannabinol , Sativex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
179. La composición de la reivindicación 173, donde el agente anti-náusea o agente antiemético comprende': antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos , antihistaminas , aprepitant, benzodiazepinas, cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides, cannabis, casopitant, clorproraazina , ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jenjibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet) , antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
180. La composición de la reivindicación 173, donde el otro agente terapéutico comprende tamoxifeno, antagonistas de BCL-2, estrógenos, bisfosfonatos, teriparatida, ranelato de estroncio, alendronato de sodio (Fosamax), risedronato (Actonel) , raloxifeno, ibandronato (Boniva) , Obatoclax, ABT-263, gosipol, gefitinib, receptor del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de tirosina cinasa, erlotinib, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico, psoralenos, trioxisaleno, metoxsaleno, bergapteno, retinoides, etretinato, acitretina, infliximab (Remicade®) , adalimumab, infliximab, etanercept, Zenapax™, Ciclosporina, Metotrexato, factor de estimulación de colonias de granulocitos , filgrastim, lenograstim, Neupogen, Neulasta, ácidos 2-Arilpropiónicos , Aceclofenac, Acemetacina, Ácido acetilsalicilico (Aspirina) , Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Ácidos arilalcanoicos , Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenac, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico , ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranílieos , Oxametacina, Oxaprozin, Oxicamos, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglicosidas , Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina,. Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas , Cloramfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido Fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, anamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrólidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactams, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontosil, Pirazinamida , Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina . Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona , Betametasona, Corticosteroides , Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoi,des , Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona . Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija antiretroviral, un potenciador sinérgico antiretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxuridina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, K-0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir , valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina o cualquier combinación de los mismos .
181. La composición de la reivindicación 173, donde el agente citotóxico, agente quimioterapéutico o agente inmunosupresor comprende: 1-deshidrotestosterona, 1-metilnitrosourea, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, Abatacept, abraxano, acitretina, aclarubicina, Actinio-225 (225Ac) , actinomicina, Adalimumab, inhibidores de la desaminasa de adenosina, Afelimomab, Aflibercept, Afutuzumab, Alefacept, alitretinoina, alquil sulfonatos, agentes alquilantes, altretamina, alvocidib, ácido aminolevulinico/metil aminolevulinato, aminopterina, aminopterina, amrubicina, amsacrina, amsacrina, anagrelida, Anakinra, antracenodionas, antraciclinas, antraciclinas, antraciclinas , antramicina (AMC) ; agentes antimitóticos, antibióticos, anticuerpos anti-CD20, antifolatos, globulina Anti-linfocitos, Antimetabolitos , globulina Anti-timocitos, trióxido arsénico, Aselizumab, asparaginasa, destructores de asparagina, Astatina-211 ( At) , Atlizumab, Atorolimumab, atrasentán, Avastin™, azacitidina, Azatioprina, azelastiná, aziridinas, Basiliximab, anticuerpos BAYX, Belatacept, Belimumab, belotecán, bendamustina, Bertilimumab, bexaroteno, bisantreno Bismuto -213 (213Bi), Bismuto-212 (212Bi), bleomicina, bleomicina, bleomicina, anticuerpos BLyS, bortezomib, busulfán, busulfán, inhibidores de Calcineurina, caliqueamicina, camptotecina, camptotecinas , capecitabina, carboplatina (paraplatina) , carbocuona, carminomicina, carmofur, carmustina, carmustina (BSNU) , anticuerpos CAT, anticuerpos CDlla, anticuerpos CD147/Basigina, anticuerpos CD154, anticuerpos CD18, anticuerpos CD20, anticuerpos CD23, anticuerpos CD3, anticuerpos CD4, anticuerpos CD40, anticuerpos CD62L/L-selectina, anticuerpos CD80, inhibidores de CDK, Cedelizumab, celecoxib, Certolizumab pegol, clorambucilo, clorambucilos , Ciclosporina, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatinos, cladribina, Clenoliximab, clofarabina, colchicina, anticuerpos del componente complemento 5, Cobre-67 (67Cu) , corticosteroides, anticuerpos CTLA-4, proteínas de fusión a CTLA-4, inhibidores de Ciclofilina, ciclofosfamidas, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, ribonucleasas citotóxicas, dacarbazina, Daclizumab, dactinomicina, dactinomicina (actinomicina D) , daunorubicina , daunorubicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina) , decitabina, Deforolimus, demecolcina, detorubicina, dibromomanitol, dietilcarbamazina, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, dihidroxi antracina diona, toxina de la difteria, inhibidores de la ADN polimerasa, docetaxel, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, doxorrubicina (adriamicina) , DXL625, Eculizumab, Efalizumab, efaproxiral, antagonistas de EGFR, elesclomol, elsamitrucina, Elsilimomab, emetina, antagonistas del receptor de endotelina, epipodofilotoxinas , epirubicina, epotilonas, Erbitux™, Erlizumab, estramustina, Etanercept, bromuro de etidio, etoglucid, etopósido, fosfato de etopósido, Everolimus, Faralimomab, inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de FKBP, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, Fontolizumab, fotemustina, Galiximab, Galio-67 (67Ga) , Gantenerumab, Gavilimomab, gemcitabina, glucocorticoides , Golimumab, Gomiliximab, gramicidina D, Gusperimus, Herceptin®, hidrazinas, hidroxiurea, agentes hipornetilantes , idarubicina, Idarubicina, ifosfamida, antagonistas de IL-1, antagonistas del receptor de IL-1, IL-12, anticuerpos IL-12, antagonistas de IL-12R, anticuerpos IL-13, IL-2, inhibidores de IL-2, receptor de IL-2/anticuerpos CD25, anticuerpos IL-6, imatinib mesilato, anticuerpos de Inmunoglobulina E, inhibidores de IMP deshidrogenasa, Infliximab, Inolimomab, anticuerpos de Integrina, anticuerpos de Interferón, interferones , anticuerpos de Interleucina 5, anticuerpos del receptor de Interleucina-6, interleucinas, Yodo-125 (125I) , yodo-131 (131I) , Ipilimumab, irinotecán, ixabepilona, Keliximab, larotaxel, Plomo-212 (212Pb) , Lebrilizumab, Leflunomida, Lenalidomida, Lerdelimumab, leucovorina, anticuerpos LFA-1, lidocaina, inhibidores de lipoxigenasa, lomustina (CCNU) , lonidamina, lucantona, Lumiliximab, Lutetio-177 (177Lu) , Macrólidos, manosulfán, Maslimornab, masoprocol , mecloretamina, melfalán, Mepolizumab, mercaptopurina, Metelimumab, Metotrexato, inhibidores del ensamblaje de microtúbulos , potenciadores de la estabilidad de microtúbulos, mitramicina, mitobronitol , mitoguazona, mitomicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, Morolimumab, inhibidores de mTOR, uromonab-CD3, mustinas, ácido Micofenólico, mitotano (O, P' - (DDD) ) , Natalizumab, nedaplatina, Nerelimomab, nimustina, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas , ácido nordihidroguaiarético, oblimersén, ocrelizumab, Ocrelizumab, Odulimomab, ofatumumab, olaparib, Omalizumab, ortataxel, Otelixizumab, oxaliplatina, oxaliplatina, paclitaxel (taxol) , Pascolizumab, antagonistas de PDGF, pegaspargasa, pemetrexed, Pentostatina, Pertuzumab, Pexelizumab, inhibidores de fosfodiesterasa, Fósforo-32 (32P) , Pimecrolimus Abetimus, pirarubicina, pixantrona, platinos, plicamicina, inhibidores de poli-ADP ribosa polimerasa, sodio porfimer, derivados de porfirina, prednimustina, procaina, procarbazina, procarbazina, propranolol, inhibidores de proteasoma, exotoxinas pseudomonas, toxina Pseudomonas, inhibidores de la síntesis de purina, puromicina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, radioisótopos, radioterapia, raltitrexed, ranimustina, Reslizumab, agonistas del receptor retinoide X, retinoides, Renio-186 (186Re) , Renio-188 ( 188Re) , inhibidores de ribonucleótido reductasa, ricina, Rilonacept, Rituxan®, Rovelizumab, rubitecano, Ruplizumab, Samario-153 (153Sm) , satraplatina, Escandio-47 (4 Sc) , moduladores del receptor selectivo de andrógeno, seliciclib, semustina, antagonistas de las hormonas sexuales, Siplizumab, Sirolimus, inhibidores de esteroides aromatasa, esteroides, estreptozocina, estreptozotocina, Tacrolimus, talaporfina, Talizumab, taxanos, taxoles, tegafur, Telimomab aritox, temoporfina, temozolomida, temsirolimus, Temsirolimus, Teneliximab, tenipósido, Teplizumab, Teriflunomida, tesetaxel, testolactona, tetracaina, Talidomida, tioepa clorambucilo, tiopurinas tioguanina, TioTEPA, inhibidores de timidilato sintasa, tiazofurina, tipifarnib, anticuerpos de linfocitos T, antagonistas de TNF, anticuerpos de TNF, proteínas fusión de TNF, proteínas del receptor de fusión de TNF, inhibidores TNF-alfa, Tocilizumab, inhibidores de topoisomerasa, topotecán, Toralizumab, trabectedina , Tremelimumab, treosulfano, tretinoina, triazenos, triazicuona, trietilenomelamina, tetranitrato de triplatina, trofosfamida, anticuerpos monoclonales específicos del antígenos tumoral, inhibidores de tirosina cinasa, uramustina, Ustekinumab, valrubicina, Valrubicina, Vapaliximab, antagonistas de VEGF, Vepalimomab, verteporfina, vinblastina, alcaloides de la vinca, vincristina, vindesina, vinflunina, vinorelbina, Visilizumab, vorinostat, Itrio-88 (88Y), Itrio-90 (90Y), Zanolimumab, zileutón, Ziralimumab, Zolimomab aritox, zorubicina, Zotarolimus o cualquier combinación de los mismos.
182. La composición de la reivindicación 173, donde el otro agente activo es uno o más agonistas, antagonistas o moduladores de un factor que comprende: TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , Hepcidina o cualquier combinación de los mismos.
183. La composición de la reivindicación 173, donde el antagonista de IL-6 comprende: anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos antisentido, polipéptidos , moléculas pequeñas o cualquier combinación de los mismos.
184. La composición de la reivindicación 183, donde el ácido nucleico antisentido comprende al menos aproximadamente 10 nucléotidos de una secuencia de codifica IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAK1, JA 2, JAK3 o SYK.
185. La composición de la reivindicación 183, donde el ácido nucleico antisentido comprende ADN, ARN, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino) , ácido nucleico glicólico, ácido nucleico treósico o cualquier combinación de los mismos.
186. La composición de la reivindicación 183, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del mismo comprende: Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, un fragmento de unión a IL-6 de cualquiera de los anteriores, una variante de cualquiera de los anteriores o cualquier combinación de los mismos .
187. La composición de la reivindicación 183, donde el polipéptido del antagonista de IL-6 comprende un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3 o SYK.
188. La composición de la reivindicación 187, donde el fragmento tiene al menos 40 aminoácidos de longitud.
189. La composición de la reivindicación 183, donde el antagonista de IL-6 comprende una IL-6 soluble, receptor de IL-6 alfa, gpl30, p38 MAP cinasa, JA 1, JA 2, JA 3 , SYK o cualquier combinación de los mismos.
190. La composición de la reivindicación 173, donde el antagonista de IL-6 está acoplado a un resto de semivida creciente .
191. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 170-190, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo está directa o indirectamente acoplado a uno o más de dichos agentes terapéuticos adicionales.
192. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-167, donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo está directa o indirectamente acoplado a una etiqueta detectable.
193. La composición de la reivindicación 192, donde la etiqueta detectable comprende: tintes fluorescentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes, estreptavidina, avidina, biotina, materiales radioactivos, enzimas, sustratos, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, luciferasa, rodamina, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina, cloruro de dansilo, luminol, luciferina, aecuorina, Yodo 125 (125I) , Carbono 14 (14C), Azufre 35 (35S), Tritio (3H) , Fósforo 32 (32P) o cualquier combinación de los mismos.
194. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-193, donde el anticuerpo Abl se administra al sujeto en forma de uno o más ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo Abl.
195. La composición de la reivindicación 194, donde dichos uno o más ácidos nucleicos se introducen al sujeto que los recibe como un virus, un liposoma, un complejo de lipido catiónico, un complejo de polímero catiónico o un complejo de nanopartículas .
196. La composición de la reivindicación 194, donde dichos uno o más ácidos nucleicos están compuestos por codones preferidos humanos o de levadura.
197. La composición de la reivindicación 194, donde dichos uno o más ácidos nucleicos están comprendidos en un vector.
198. La composición de la reivindicación 194, donde el vector es un vector viral plásmido o recombinante .
199. La composición de la reivindicación 194, donde dichos uno o más ácidos nucleicos comprenden las secuencias de polinucleótido de cadena pesada y ligera de la SEQ ID NO: 723 y SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
200. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-193, donde el anticuerpo Abl comprende: (a) polipéptidos de cadena pesada y ligera que comprenden: SEQ ID NO: 709 y SEQ ID NO: 657; SEQ ID NO: 702 y SEQ ID NO: 704; SEQ ID NO: 706 y SEQ ID NO: 708; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; (b) un polipéptido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de los polipéptidos de (a) ; (c) un polinucleótido que se híbrida en condiciones de hibridación de restricción alta o moderada a cualquiera de las secuencias de polinucleótidos de cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11; (d) un polinucleótido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de polinucleótido de cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11; (e) un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos de (c) o (d) .
201. Un método para tratar la artritis reumatoide mediante la administración subcutánea de una dosificación eficaz de un anticuerpo anti-IL-ß que tiene la misma especificidad epitópica que Abl o un anticuerpo que compite con Abl para la unión a IL-6 a un paciente que lo necesita.
202. El método de la reivindicación 201, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 709, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723; y un polipéptido de cadena pesada que comprende: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 657, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700; donde el anticuerpo Abl o fragmento de anticuerpo se une de forma específica a la IL-6 y antagoniza una o más actividades asociadas con la IL-6
203. El método de la reivindicación 201, donde la dosificación subcutánea es al menos alrededor de 50 o 100 mg .
204. El método de la reivindicación 201, donde la eficacia de dicha administración subcutánea se determina mediante al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento de la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control.
205. El método de la reivindicación 201, donde dicha administración subcutánea resulta en una mejora de la enfermedad según se manifiesta por alguno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control .
206. El método de la reivindicación 205, donde dicha administración subcutánea resulta en una mejora prolongada en la enfermedad (observada al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16 semanas luego de la administración del anticuerpo) según se manifiesta por al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control.
207. El método de cualquiera de las reivindicaciones 201- 206, donde dicho paciente recibió previamente o sigue recibiendo metotrexato .
208. El método de cualquiera de las reivindicaciones 201- 207, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 90% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO:19 o 20.
209. El método de cualquiera de las reivindicaciones 201-207, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 95% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO: 19 o 20.
210. El método de cualquiera de las reivindicaciones 201-207, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 98% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO: 19 o 20.
211. El método de cualquiera de las reivindicaciones 201-207, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO: 19 o 20.
212. Un método para tratar artritis reumatoide mediante administración intravenosa o subcutánea de un anticuerpo anti-IL- 6 que tiene la misma especificidad epitópica que Abl mediante la administración intravenosa de una dosificación de alrededor de ( +/- 20%) 80, 160 o 320 mg de dicho anticuerpo a un paciente que lo necesita.
213. El método de la reivindicación 212, donde al paciente se le administra dicha dosificación cada 8 semanas o 2 meses.
214. El método de la reivindicación 212, donde dicha dosificación se administra al menos dos veces.
215. El método de la reivindicación 212, donde la primera dosificación es el dia uno y la segunda dosificación es durante la semana 8 (la semana 8 después del día 0) .
216. El método de la reivindicación 212, que mejora al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones intravenosas de control.
217. El método de la reivindicación 212, donde dicha administración intravenosa resulta en una mejora en la enfermedad según se manifiesta por al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones intravenosas de control.
218. El método de la reivindicación 217, donde dicha administración subcutánea resulta en una mejora prolongada de la enfermedad (observada al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16 semanas después de la administración del anticuerpo) según se manifiesta por al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control.
219. El método de cualquiera de las reivindicaciones 212- 218, donde dicho paciente recibió previamente o sigue recibiendo metotrexato .
220. El método de cualquiera de las reivindicaciones 212-218, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 90% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en la SEQ ID NO: 19 o 20.
221. El método de cualquiera de las reivindicaciones 212-218, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 95% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en la SEQ ID NO: 19 o 20 de las solicitudes incorporadas en la presente mediante esta referencia.
222. El método de cualquiera de las reivindicaciones 212-218, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 98% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en la SEQ ID NO: 19 o 20.
223. El método de cualquiera de las reivindicaciones 212-218, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en la SEQ ID NO: 19 o 20.
224. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 está comprendido en una composición formulada para inyección subcutánea o intravenosa .
225. Una composición para el tratamiento comprende una dosificación subcutánea eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 que tiene la misma especificidad epitópica que Abl o un anticuerpo que compite con Abl para la unión a IL-6 a un paciente que lo necesita.
226. La composición de acuerdo con la reivindicación 225, • donde la dosificación subcutánea es al menos alrededor de 50 o 100 mg.
227. La composición de acuerdo con la reivindicación 225, donde la eficacia de dicha administración subcutánea se determina mediante al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control.
228. La composición de acuerdo con la reivindicación 225, donde dicha administración subcutánea resulta en una' mejora en la enfermedad según se manifiesta por alguno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control.
229. La composición de acuerdo con la reivindicación 225, donde dicha administración subcutánea resulta en una mejora prolongada en la enfermedad (observada al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16 semanas luego de la administración del anticuerpo) según se manifiesta por al menos uno de los siguientes: (i) valores de DAS-28 mejorados, (ii) valores de EULAR mejorados, (iii) valores de LDAS mejorados, (iv) valores de ACR mejorados, (v) un aumento en la albúmina en suero, (vi) una reducción en la CRP con respecto a pacientes que son tratados con dicho anticuerpo o pacientes que reciben placebo o formulaciones subcutáneas de control.
230. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 225-229, que comprende además metotrexato.
231. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 225-230, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 90% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO: 19 o 20 de las solicitudes incorporadas en la presente mediante esta referencia.
232. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 225-230, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 95% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO:18 o 19 y SEQ ID NO: 20.
233. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 225-230, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene secuencias de pesada y ligera variables que son al menos 98% idéntico [sic] tiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO: 19 o 20 de las solicitudes incorporadas en la presente mediante esta referencia.
234. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 225-230, donde dicho anticuerpo anti-IL-6 contiene las secuencias pesada y ligera variables contenidas en SEQ ID NO: 19 o 20.
235. Un método para prevenir o tratar una enfermedad o un trastorno asociado con IL-6 o una enfermedad o un trastorno que se puede tratar mediante la administración de un antagonista de IL-6, que comprende administrar una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 225-230.
236. El método de la reivindicación 235, donde dicha enfermedad es artritis reumatoide.
237. El método de la reivindicación 235, donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en: fiebre, caquexia, debilidad, cáncer, trombosis e hipoalbuminemia .
238. El método de la reivindicación 235, donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en: fatiga general, fatiga inducida por el ejercicio, fatiga relacionada con el cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal, caquexia relacionada con la edad, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) , polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedad crónica de injerto versus huésped (GVHD) , síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil sistémica, osteoartritis , osteoporosis , enfermedad ósea de Paget, osteoartritis , mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de células renales, enfermedad de Castleman multicéntrica, cáncer de ovario, tolerancia a fármacos en quimioterapia contra el cáncer, toxicidad de quimioterapia contra el cáncer, enfermedad cardíaca isquémica, ateroesclerosis, obesidad, diabetes, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheiraer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis , insuficiencia cardiaca aguda, síndrome metabólico, abortos naturales, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, rechazo de transplante, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , gripe aviar, viruela, gripe pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS) , síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) .
239. Un método de uso de un anticuerpo anti-IL-6 o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención para prevenir o aliviar el comienzo de la enfermedad injerto contra huésped (GVHD) , o reincidencia de leucemia en un sujeto que recibe células, tejidos u órganos transplantados.
240. El método de la reivindicación 239, donde el sujeto tiene o recibe un transplante de célula madre hematopoyética (HCT) , transplante de médula ósea (BMT) .
241. El método de la reivindicación 239, donde el sujeto tiene o recibe células, tejidos u órganos transplantados que contienen potencialmente células dendríticas.
242. El método de la reivindicación 239, donde el sujeto tiene o recibe células, tejidos u órganos trahsplantados que contienen potencialmente células dendríticas plasmocitoides BDCAA4+.
243. El método de la reivindicación 242, donde las células, tejidos u órganos transplantados comprenden células pancreáticas, hepáticas o de la piel.
244. Un método para pretratar células, tejidos u órganos que se usan para el transplante para reducir el riesgo de GVHD o leucemia que comprende poner en contacto dichas células, tejidos u órganos in vitro con un antagonista de IL-6 para poder reducir la expresión de IL-6.
245. El método de la reivindicación 244, donde las células, tejidos u órganos también se ponen en contacto con un antagonista de IL-10.
246. Un método para reducir el riesgo de una recaída de leucemia en sujeto con leucemia que tiene o recibe células, tejidos u órganos transplantados, en particular aquellos que probablemente contienen células dendríticas mediante la administración anterior, concomitante o posterior al transplante de una cantidad de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención suficiente como para prevenir o reducir el riesgo de recaída de leucemia.
247. El método de la reivindicación 246, donde dicha leucemia incluye leucemias crónicas y leucemias agudas.
248. El método de la reivindicación 246, donde dicha leucemia incluye leucemia mielógena crónica (CML) , leucemia mielógena aguda (AML) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia de células pilosas, leucemia prolinfocítica de linfocitos T (T-PLL) y leucemia linfocítica granular grande.
249. Un régimen de tratamiento para el cáncer que incluye la administración de al menos un agente quimioterapéutico y/o radiación, donde la eficacia de dicho agente quimioterapéutico o radiación contra el cáncer está potenciado por la administración adicional de un tumor de anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo que se selecciona de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl 3, Abl4, Abl5, Abl 6, Abl7, Abl8, Abl 9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, y variantes quiméricas o humanizadas de los mismos y un fragmento de unión a IL-6 de cualquiera de los anteriores.
250. Un método para tratar o prevenir mucositis en un paciente en riesgo de desarrollar mucositis como resultado de quimioterapia o radioterapia, mediante la administración de una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 de acuerdo con la invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el comienzo de mucositis .
251. El método de la reivindicación 250, donde la mucositis es mucositis oral o grastrointesinal .
252. El método de la reivindicación 250, donde el paciente tratado tiene uno o más síntomas de mucositis oral.
253. El método de la reivindicación 250, donde el paciente tratado tiene uno o más síntomas de mucositis gastrointestinal.
254. El método de la reivindicación 250, donde el paciente tiene un cáncer que se selecciona de cáncer de cuello y cabeza, cáncer esofágico, cáncer de garganta, cáncer de pulmón, cánceres gastrointestinales tales como cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, asi como cánceres hematológicos tales como mieloma múltiple, leucemia y linfoma.
255. El método de la reivindicación 250, donde el paciente tiene o recibe un transplante autólogo de células madre o médula ósea.
256. El método de la reivindicación 250, donde el paciente tiene mieloma múltiple.
257. Un método para potenciar el efecto de un agente quimioterapéutico o radiación contra un cáncer tratado en un paciente que comprende administrar un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención en una cantidad eficaz para potenciar el efecto de dicho agente quimioterapéutico o radiación que se administra adicionalmente a dicho cáncer tratado.
258. El método de la reivindicación 257, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del anticuerpo se administra antes, al mismo tiempo o después de la administración de dicho agente quimioterapéutico o radiación.
259. El método de la reivindicación 257, donde el agente quimioterapéutico es un inhibidor de EGFR.
260. El método de la reivindicación 259, donde dicho inhibidor de EGFR se selecciona del grupo que consiste en Cetuximab (Erbitux) disponible en ImClone, Erlotinib (Tarceva) disponible en OSI Pharmaceuticals, Gefitinib (Iressa) disponible en AstraZeneca, Lapatinib (Tykerb) disponible en Glaxo, Panitimumab (Vectibox) disponible en Amgen, Sunitinib o Sutent (N- (2-dietilaminoetil) -5- [ (Z) - ( 5-fluoro-2-oxo-lH-indol-3-ilideno) metil ] -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxamida) comercializado por Pfizer, Gefitinib o N- ( 3-cloro-4-fluoro-fenil ) -7-metoxi-6- ( 3-morfolin-4 -ilpropoxi ) quinazolin-4-amina comercializado por AstraZeneca y Zalutumumab en desarrollo clínico por GenMab.
261. El método de la reivindicación 259, donde el paciente tiene un cáncer que ha mostrado resistencia a determinado agente quimioterapéuticomo radiación luego de al menos una ronda de quimioterapia o radiación.
262. El método de la reivindicación 259, que reduce o previene que el cáncer tratado invada o haga metástasis en otros lugares del cuerpo.
263. El método de la reivindicación 259, que resulta en apoptosis aumentada de las células cancerosas tratadas.
264. El método de la reivindicación 259, donde el cáncer tratado se selecciona de cánceres avanzados y no avanzados incluyendo cánceres metastizados, tales como cáncer de pulmón metastásico y no metastásico, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, (HNSCC) , cáncer de faringe, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer anal, glioblastoma multiforme, cánceres epiteliales, carcinomas de células renales, leucemia mielógena crónica y aguda y otras leucemias .
265. El método de la reivindicación 264, donde el cáncer es cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) o leucemia mielógena aguda (AML) .
266. El método de la reivindicación 264 o 265, donde el agente quimioterapéutico es erlotinib o sunitinib.
267. El método de la reivindicación 265, donde el cáncer del sujeto ha desarrollado una resistencia a dicho agente quimioterapéutico antes de la administración de dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo.
268. El método de la reivindicación 259, donde se realiza una biopsia previa a la terapia con el anticuerpo anti-IL-6 que indica que el cáncer tratado comprende células que expresan niveles elevados de IL-6.
269. El método de la reivindicación 259, donde se realiza imagenología in vivo usando un anticuerpo anti-IL-6 o fragmento de anticuerpo previo a dicho tratamiento, que revela niveles aumentados de IL-6 en uno o más sitios del cáncer tratado.
270. El método de la reivindicación 257, donde se determina que dicho paciente expresa niveles elevados de IL-6 antes del tratamiento .
271. Un método para identificar cánceres que son potencialmente resistentes a los efectos de un agente quimioterapéutico o radiación, ensayando IL-6 usando un anticuerpo de acuerdo con la invención para poder detectar si los niveles elevados de IL-6 están presentes en el lugar del cáncer tratado .
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