DD211359A5

DD211359A5 - Verfahren zur herstellung eines mikroorganismus

Info

Publication number: DD211359A5
Application number: DD83251287A
Authority: DD
Inventors: Eva Dworkin-Rastl; Marc-Bruce Dworkin; Guenther Adolf; Peter Meindl; Gerhard Bodo; Peter Swetly
Original assignee: Thomae Gmbh Dr K
Priority date: 1982-05-28
Filing date: 1983-05-26
Publication date: 1984-07-11
Also published as: FI831818A0; ATE42114T1; DK164742B; IL68790A; FI831818L; DE3220116C2; GR79236B; SG38692G; JPH0678774A; KR840004944A; JPS5925689A; DE3220116A1; IL68790A0; MX9202815A; ES522762A0; EP0095702B1; NO168538C; EP0095702A1; ES529360A0; ZA833845B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung der Genprodukte zweier oder mehrerer verwandter, aber nicht notwendigerweise miteinander kreuzhybridisierender Gene. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens fuer die Herstellung von Mikroorganismen, die die genetische Information zur Biosynthese von Interferonen des Typs a oder Typs b in gentechnologisch entsprechend konstruierten Plasmiden tragen und dadurch die grundlegende Voraussetzung fuer ein mikrobielles Verfahren zur Synthese dieser Interferone darstellen. Erfindungsgemaess wird aus cDNA, die mit geeigneter RNA als Matrize synthetisiert worden war, eine Klonbank hergestellt und daraus diejenigen Klone, die die genetische Information fuer die Biosynthese der gewuenschten Genprodukte enthalten, unter Verwendung einer cDNA als Hybridisierungsprobe, die mit einem in der Genfamilie konservierten Oligonukleotid als Primer synthetisiert worden war, oder unter Verwendung des Oligonukleotids selbst als Hybridisierungsprobe identifiziert, der ausgewaehlte Klon nach ueblichen Methoden kultiviert und das beim Wachstum erhaltene Genprodukt nach ueblichen Methoden isoliert.

Description

Mikrobiologisch hergestellte 0(- und ß-Interferone, DNA-Sequenzen,' die für diese Interferone codieren, Mikroorganismen, die diese genetische Information enthalten, und Verfahren zu ihrer Herstellung

Aus der Literatur sind drei Typen von Humaninterferonen bekannt, nämlich Leukocyten-Interferon (Interferon-Sf, Kurzbezeichnung: IFN-K)₇ Fibroblasten-Interferon (Interferon-ß, Kurzbezeichnung: IFN-ß) und Immuninterferon (Interferon-γ , Kurzbezeichnung: IFN--γ) (siehe W. E. Stewart II "The Interferon System", Springer-Verlag Wien-New York, 2. Auflage (1981)). Menschliche Leukocyten oder menschliche myeioblastoide Zellen, welche mit Virus stimuliert sind, produzieren Leukocyten-Interferon, menschliche Fibroblasten, welche mit Virus oder einer geeigneten Nukieinsäure induziert sind, Fibroblasten-Interferon und menschliche T-Lymphocyten, welche mit Mitogen, z.B. Concanavalin, induziert sind, Immuninterferon.

Außerdem ist bekannt, daß menschliche Zellen des B-Lymphocyten-Typs, wie sie beispielsweise durch die Zellinien NC-37, Namalwa, Akuba oder RPMI 1788 repräsentiert werden, nach Stimulation durch Virus gleichzeitig Leukocyten-Interferon und Fibroblasten-Interferon produzieren (siehe Journal of General Virology 3JS/ 51-59 (1977)). Hierbei können die Mengenverhältnisse an produziertem IFN- &, und IFN-ß durch die Wahl der Induktionsbedingungen

variiert werden (siehe Journal of Interferon Research 2^ im Druck (1982)). Beispielsweise erhält man aus mit Sendaivirus induzierten Zellen verschiedener Zellinien folgende Mengenverhältnisse an IPN-K und IFN-ß:

	Prozent Interferon-Aktivität, neutralisiert	IFN-ß IFN-K + IFN-ß
ZeIlinie	durch spezifische Antiseren gegen	34 ^98
—	IPN-K	52 >97
Namalwa	52	27 >98
NC-37	40	29 ^98
Akuba	85
RPMI 1788	68

Desweiteren brachte molekulares Klonieren von IFN-BC-Genen aus Leukocyten (siehe Nature j284, 316-320 (1980); Science 209, 1343-1347 (1980) und EP-A1-O.O32.134) und aus myeloblastoiden iZellen (siehe Nature £87, 411-416 (1980), ibid £90, 20-26 (1981) nand GB-A-2.079.291) das Ergebnis, daß IFN-Ä durch eine Genfamilie codiert wird, welche aus mindestens 10 voneinander unterscheidbaren Genen besteht, was wiederum zur Folge hat, daß die Genprodukte dieser DNA-Sequenzen kein einheitliches Protein darstellen? das heißt, daß IFN-βί eine Mischung aus einander ähnlichen Proteinen darstellt. Diese Subtypen wurden als IFN-K

.1,2,3 (siehe Nature ,287, 401-408 (1980) und Gene JMS-, 379-

394 (1981)) oder LeIFN A,B,C...... (siehe Nature 290, 20-26 ; (1981) in der Literatur bezeichnet.

!Demgegenüber wurde für IFN-ß eine einheitliche DNA-Sequenz ge-

!funden; das heißt, für Fibroblasteninterferon codiert nur ein !Einzelgen, und es sind daher auch keine Subtypen bekannt (siehe Nature 285, 542-547 (198O)),

Obwohl, anders als innerhalb der IFN- K-Genfamilie, zwischen IFN- K-Genen und dem IFN-ß-Gen keine Kreuzhybridisierung stattfindet, weisen die Sequenzen etwa 45 % Homologie auf (siehe Nature ^£5, 547-549 (198O)). Hierbei ist der längste Sequenzabschnitt, bei welchem vollständige Homologie zwischen den (5 von 7) funktioneilen IFN-c(-Genen und dem IFN-ß-Gen besteht, 13 Nukleotide lang. Dieses Tridekanukleotid ist literatürbekannt (siehe Eur. J. Cell. Biol 2_5, 8-9 (1981)). Die dieses Tridekanukleotid enthaltenden IFN- K-Gene sind LeIFN B,C,D,F,G; in LeIFN A und H sind nur 12 der 13 Nukleotide vorhanden (siehe Nature 2^0, 20-26 (1981)).

!Die Herstellung der Interferone des Typs K und des Typs ß läßt :sich überraschenderweise nun dadurch verbessern, daß man aus !einem in an sich bekannter Weise erhaltenen Gemisch von Bakterien, die verschiedenste rekombinante DNA-Moleküle enthalten, mit Hilfe dieses Tridekanukleotids durch Koloniehybridisierung .diejenigen identifiziert, die die Information für Interferon itragen, wobei IFN-PC- und IFN-ß-Sequenzen in demselben Arbeitsgang gewonnen werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die gleichzeitige Isolierung von Mikroorganismen und deren in üblicher Weise erhältlichen Mutanten, die die genetische Information für die Interferone des Typs K oder des Typs ß tragen und somit die grundlegende Voraussetzung für die Produktion dieser Interferone daristellen:

Zur Erreichung des erfindungsgemäßen Zieles kann man beispielsweise in folgender Weise verfahren:

Auswahl einer geeigneten Zellinie, die nach Induktion, z.B. nach Sendaivirusinduktion, sowohl IFN-K als auch IFN-ß produziert. Als menschliche Zellen des B-Lymphocyten-Typs kommen beispielsweise die Zellinien Namalwa, NC-37, Akuba oder RPMI 1788 in Betracht, vorzugsweise jedoch die Zellinie Namalwa.

Die ausgewählten Zellen werden zweckmäßigerweise zum Zeitpunkt maximaler IFN-mRNA-Synthese denaturiert, zweckmäßigerweise 6-12 Stunden, vorzugsweise jedoch 9 Stunden, nach der Virusinduktion. Nach Abtrennen der Zellkerne wird aus dem Zellcytoplasma die RNA durch Phenolextraktion und Alkoholfällung gereinigt, nachfolgend durch Oligo (dT)-Zellulose-Chromatographie die PoIy(A) RNA isoliert und diese durch Gradientenzentrifugation im Hinblick auf interferonspezifische Sequenzen angereichert (siehe linke Spalte der Figur 1).

Die so gereinigte PoIy(A) RNA wird als Matrize zur Herstellung von einzelsträngiger cONA mittels des Enzyms Reverse Transkriptase verwendet. Der zu diesem Einzel-DNA-Strang komplementäre zweite DNA-Strang wird mittels DNA-Polymerase I synthesiert. Die cDNA-Synthese und die Synthese des komplementären zweiten DNA-Stranges erfolgt in einer Lösung, welche die Deoxynucleosidtriphosphate des Adenosins, Thymidins, Guanosins und Cytidins enthält, Die erhaltene doppelsträngige cDNA-Mischung wird anschließend an beiden Strangenden durch das Enzym S1 Nuklease so modifiziert, daß überhängende Einzelstrangregionen entfernt !werden, und jene doppelsträngigen DNA-Moleküle mittels Gradien-'ten-Zentrifugation isoliert, welche mindestens 600 Basenpaare ,aufweisen. Die so erhaltene cDNA-Mischung wird mittels des Enzyms Terminale Transferase durch Oligodeoxycytidin-Anlagerung ;am 3.'-Ende beider Stränge um etwa 15 Nukleotide verlängert, womit ein Bestandteil der Synthese rekombinater Moleküle fertiggestellt ist (siehe linke Spalte der Figur 1).

Als zweite Komponente wird ein zirkuläres doppelsträngiges Plasimid, vorzugsweise aus Escherichia coli stammend, z.B. Escheirichia coli Plasmid pBR322, mittels Restriktionsendonuklease Pst I linearisiert und analog der cDNA-Mischung durch Anlagerung von Oligodeoxyguanidin an die 3'-Enden des Moleküls so modifiziert, daß überhängende Oligodeoxyguanidinenden entstehen. Diese Enden können mit den freien Oligodeoxycytidinenden der cDNA-Moleküle stabile DNA Doppelstrang-Regionen bilden (siehe rechte Spalte der Figur 1).

Mit den so hergestellten Hybridplasmiden, z.B. aus pBR322 und cDNA, wird ein Mikroorganismus als Wirt, z.B. Escherichia coli HB 101, transformiert, in dem die Replikation und Expression dieser DNA erfolgt.

;Aus den so hergestellten Klonen werden nun diejenigen, welche !für IFN-R oder für IFN-ß spezifische Sequenzen enthalten, durch Koloniehybridisierung nachgewiesen. Als Probe dient radioaktiv markierte cDNA, welche durch reverse Transkription von IFN-mRNA™ hältiger RNA, mit dem für Interferonsequenzen spezifischen Tridekanukleotid 5'dCCTTCTGGAACTG3' als Primer, synthetisiert wird.

Hierzu wird das Tridekanukleotid radioaktiv am Ende markiert,

32 vorzugsweise mit γ - P-ATP und T4-Polynukleotid-Kinase. Die Herstellung des Iniationskomplexes für die Reverse-Transkriptase-Reaktion mit einem Überschuß des markierten Tridekanukleotids und PoIy(A) RNA aus Sendaivirus-induzierten Zellen erfolgt analog den vorstehend beschriebenen Bedingungen (siehe Figur 2). Eine so hergestellte eDNA trägt also nur dann eine radioaktive Markierung, wenn der Initiationskomplex für die Reverse Transkriptase-Reaktion mit dem Tridekanukleotid stattgefunden hat, da ja die Markierung ausschließlich in diesem Segment enthalten ist. Hierdurch wird erfindungsgemäß eine hohe Selektivität für das Erkennen der DNA mit einer zum Tridekanukleotid komplementären DNA™Sequenz und damit für {£ - und ß~Interferon-DNA gewährleistet» Das Sichtbarmachen jener transformierten Bakterienkolonien, welche Hybridplasmide mit zum eingesetzten Tridekanukleotid komplementären DNA-Sequenzen enthalten, erfolgt durch Autoradiographie (siehe Figur 3). Auf diese Weise wurden von etwa 13000 transformierten Bakterienklonen 190 Klone isoliert, welche mit der durch das Tridekanukleotid initiierten cDNA ein ,positives Signal ergaben, das heißt, etwa 1 % aller Klone der Genbank enthalten die spezifische Sequenz dCCTTCTGGAACTG.

Der Nachweis der interferonspezifischen Nukleinsäuresequenzen in den rekombinanten DNA-Molekülen erfolgt durch RNA-Transfer-Hybridisierung, Hybridisolierung, Restriktionskartierung und Nukleinsäuresequenzierung. Der biologische Nachweis der gebildeten Interferonpolypeptide erfolgt durch Bestimmung der antiviralen Aktivität, die Bestimmung des Interferontyps durch immunologische Methoden.

"Dte auf diese Weise isolierten Interferongene können dann in Bakterien, aber auch in anderen Organismen, wie z.B. Hefe, zur Expression gebracht werden, wobei durch Vorschalten eines Promotors in Kombination mit einer Ribosomenbindungsseguenz Werte bis zuro können.

bis zuro etwa 10 -fachen der Spontanexpression erzielt werden

Durch die vorliegende Erfindung ist es somit erstmals gelungen, durch die Wahl von Zellen des B-Lymphocyten-Typs als Ausgangsmaterial zur Isolierung der erforderlichen RNA und unter Verwendung eines interferonspezifischen Oligonukleotids als Primer für die als Hybridisierungsprobe verwendete cDNA das erfindungsigemäße Ziel zu erreichen, zwei verwandte Genklassen, nämlich die 2 Genklassen XFN-fiC und IFN-ß, in einem Arbeitsgang zu isolieren und hierauf ihre Verwendbarkeit für die Produktion von interferones* zn zeigen.

:Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Beispiel A

Auswahl einer geeigneten Zellinie zur Produktion von PoIy(A) RNA_a welche humane IFN-K und IFN-ß-mRNA enthält:

Verschiedene humane Zellinien wurden mit Sendaivirus zur Interferonproduktion nach literaturbekannten Verfahren induziert und aus den Zeilüberständen nach 24-48 Stunden der Gehalt an -EFN-K und IFN-ß durch Neutralisation mit typspezifischen Antiseren bestimmt. Die gefundenen Mengenverhältnisse zwischen IFN-IC und IFN-ß in einigen der getesteten Zellinien sind in der Tabelle auf Seite 2 zusammengestellt. Dabei zeigt sich, daß Namalwa Zellen z.B. etwas mehr als 50 % IFN-ίζ und bis zu etwa 50 % IFN-ß nach Sendaivirus Induktion produzieren.

Der Neutralisationstest wurde wie folgt durchgeführt:

Ungefähr 10 Interferon-Einheiten aus den überständen der mit Sendaivirus induzierten Zellkulturen wurden 60 - 90 Minuten bei 37°C inkubiert mit:

1. Antiserum gegen IFN-SC; endgültige Verdünnung 1:100; (erhalten von Research Resources Branch, National Institutes of Allergy and Infections Diseases, Bethesda Md, USA).

2. Antiserum gegen Human ß-IFN; endgültige Verdünnung 1:300;

(erhalten von Dr. Y. H. Tan, University of Calgary, Canada).

|3. Mischung aus 1. und 2.

Nach der Inkubation wurde die Rest-Interferonaktivität im Plaguereduktionstest (siehe Journal of Interferon Research 2, im Druck - (1982)) bestimmt.

Beispiel B

Herstellung von PoIy(A) RNA, welche menschliche IFN-K und IFN-ßmRNA enthält, aus Sendaivirus induzierten Namalwazellen

Züchtung der Namalwazellen und Induktion mit Sendaivirus erfolgte nach literaturbekannten Methoden (siehe Methods in Enzymology, VoI 78A, pp. 69-75 (1981), Academic Press, New York). Der Zeitpunkt der mRNA Präparation wurde mit 9 Stunden (6-12 Stunden) nach der Induktion mit Sendaivirus gewählt, da nach diesem Intervall der Anteil an interferonspezifischer mRNA ein Maximum erreicht.

Die Zellen wurden 20 Minuten bei 1000 g abzentrifugiert, einmal in NP-40-Puffer (0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl₃, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) gewaschen und in NP 40-Puffer mit 0,5 % des nicht ionischen Detergens NP-40 (Shell) und 2 mg/ml Bentonit resuspendiert. Nach 5 Minuten im Eisbad wurden die Zellkerne durch Sentrifugation wie oben pelletiert, die (RNA-hältige) cytoplasnnatische Fraktion (überstand) wurde nach Zugabe von 2 % SDS, 5 mM EDTA und 50 mM Tris-HCl, pH 9, 3 χ mit Phenol-Chloroform xmä 1 χ mit Chloroform extrahiert und die RNA anschließend alkoholgefällt. PoIy(A)⁺RNA wurde nach literaturbekannter Methode (Proc. Natl. Acad. Sei USA, 6£, 1408-1412 (1972)) durch pligo-(dT)-Zellulose-Chromatographie gereinigt und durch Zentrifugation in einem 5-20 % Saecharosegradienten in 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5, 1 mM EDTA (20 Stunden bei 25000 U/min mit einem Spinco SW 27-Rotor) der Molekülgröße nach aufgetrennt und !Moleküle der Größenordnung zwischen 6 S (Sedimentationsein-Iheiten) und 18S (der Einfachheit halber "12S-RNA" genannt) gesammelt (siehe linke Seite der Figur 1).

Der Gehalt an Interferon-spezifischer mRNA (IFN-Ä und IFN-ßmRNA) wurde durch Mikroinjektion von "12S-RNA" in Xenopus laevis-Oocyten (siehe J. Embryol. and Exper. Morph. 20, 401-414 (1968)) und Messen der Interferonaktivität im Oocytenüberstand bestimmt. Dabei ergab 1 pg injizierter "12S-RNA" einen mittleren Interferontiter von etwa 1000 Internationalen Interferoneinheiten (I.E.) bezogen auf den Interferonstandard 69/19:

	Einheiten	Prozent Interferon	IFN-Ä + IFN-B
	Interferon	aktivität neutrali	>98
Menge "12S"-Poly (A)⁺RNA	pro ml Oocyten überstand	siert durch Anti-
aus Sendaivirus-indu	1 000	seren gegen:
zierten Namalwazellen	IFN-Ä
1 pg	80

Etwa 80 % dieser Aktivität war also durch Antiserum gegen i(-Typ Interferon neutralisierbar, während die gesamte Aktivität nur durch ein Gemisch aus Anti-p^ und Anti-ß-Interferon-Antiserum neutralisierbar war.

Beispiel C

!Herstellung einer Naxnalwa-cDNA-Klonbank

!Die PoIy(A) KNA, weiche eine Molekülgröße zwischen 6-18S besitzt ("12S-RNA") (sieh© Beispiel B) wurde als Matrize zur Herstellung von einzelsträngiger cDNA verwendet, wobei 40 pg/ml PoIy(A) RNA in 50 mM Tris-HCi, pH 8,3, 10 mM MgCl₃, 100 mM KCl, 1 mM dNTPs, 0,4 mM DTT, 4 mM Na-Pyrophosphat, 20 pg/ml Oligo(dT)₁₂_₁₈ (PL- Biochemicals), 25 pg/ml Actinomycin D mit 100 Einheiten/ml AMV Reverse Transkriptase (Dr. J. Beard, Life Sciences, Inc. ⁽ 49

^th

street, South, St. Petersburg, Florida 33707, USA)

45 Minuten bei 44-45°C inkubiert wurden. Anschließend wurde der

RNA-Anteil des RNA-DNA-Hybrides durch einstündige Inkubation in 0,3 M NaOH bei 50⁰C entfernt, dani neutralisiert und äthanolgefällt.

0,3 M NaOH bei 50⁰C entfernt, danach die einzelsträngige cDNA

Der zum Einzel-DNA-Strang komplementäre zweite DNA-Strang wurde unter folgenden Bedingungen synthetisiert: 30 pg/ml einzelsträngige cDNA wurden in 0,12 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,9, 10 mM ;MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs mit 300 Einheiten/ml DNA Polymerise I (Boehringer Mannheim) 6 Stunden bei 15°C inkubiert, dann iphenolextrahiert und äthanolgefällt.

Die so hergestellte doppelsträngige cDNA-Mischung wurde an den beiden Strangenden derart modifiziert, daß überhängende Einzelstrangregionen entfernt wurden. Dazu wurde die DNA in 0,3 M NaCl, 30 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1 mM ZnCl₂ mit 1250 Einheiten/ ml S1-Nuklease (Miles Laboratories) 30 Minuten bei 37°C inkubiert, hierauf wurde phenolextrahiert und äthanolgefällt. Die so hergestellte "blunt ended" doppelsträngige cDNA wurde auf einem 5-20 % Saccharosegradienten in 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5, 1 mM EDTA, aufgetrennt und jene Fraktionen isoliert, ;welehe eine Länge von mindestens 600 Basenpaaren aufwiesen.

Von dieser cDNA-Mischung wurden 0,5 pg durch Oligodeoxycytidin-Milagerung am 3'Ende beider Stränge, durch Inkubation in 140 mM Kaliujscacöäylat/ pH 6_tB, 30 mM Tris-HCl, pH 6,9, 2 mM CoCl₂, 0,1 HiM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 5 pM dCTP mit 500 Einheiten/ml 'Terminaler Transferase, A Minuten bei 37°C, um etwa 15 Nukleoitiäe verlängert. Mit diesem Schritt ist die cDNA-Mischung, als lein Bestandteil der rekömbinanten Moleküle, fertiggestellt !(siehe linke Seit® Fig. 1).

Als zweite Komponente wurde das Escherichia coli-Plasmid pBR322, ein zirkuläres doppelsträngiges DNA Molekül, herangezogen. Ein Aliquot von 2 pg pBR322 wurde durch die Restriktionsendonuklease Pst I linearisiert und in ähnlicher Weise wie die cDNA-Mischung durch Anlagerung von Oligodeoxyguanidin an die 3' Enden des Moleküls derart modifiziert, daß überhän-

gende Oligodeoxyguanidinenden erzeugt wurden (rechte Seite der Figur 1). Diese Oligodeoxyguanidinenden können mittels Basenpaarung mit den freien Oligodeoxycytidinenden der cDNA Moleküle stabile DNA Doppelstrang-Regionen erzeugen. Dazu werden die beiden Komponenten dieser Reaktion in 0,1 M NaCl, 1 inM EDTA, •20 mM Tris-HCl, pH 8, 10 Minuten bei 65°C, dann 2,5 Stunden bei '45⁰C, dann über Nacht bei 37°C inkubiert.

[Durch diese Methode wird die Pst I Restriktionsendonuklease- :Spaltstelle regeneriert und kann in der Folge benützt werden, um die cDNA-Inserte aus dem Vektorhybrid herauszuschneiden.

Die nach dieser Methode hergestellten Hybridplasmide aus pBR322 und Namalwa-cDNA wurden zur Transformation von Escherichia coli ΉΒ 101 nach literaturbekannter Methode (Proc. Natl. Acad. Sei, USA 6!9, 2110-2114 (1972)) verwendet. Mit dieser Methode wurden 30 000 Klone transformierter E.coli Zellen erhalten und einzeln in Mikrotiterplatten aufgeteilt.

Beispiel D

!Herstellung einer bezüglich IFN-SC und IFN-ß-DNA Sequenzen !spezifischen Hybridisierungsprobe unter Benutzung eines synthetischen Trldekanukleotldg_5,'dCCTTCTGGAACTG3 '

'Die dieser Erfindung zugrunde liegende Selektionsmethode für !transformierte E.coli Klone, welche Interferonsequenzen enthal-

jten, basiert auf der Verwendung eines synthetischen Tridekanuikleotids mit der Sequenz: 5^fdCCTTCTGGAACTG3·. Diese Sequenz stellt das längste, nicht unterbrochene DNA Segment dar, in welchem Homologie zwischen den meisten IFN-R Genen und dem IFN-ß Gen vorliegt. Die Synthese des Tridekanukleotids wurde bereits beschrieben. Das Tridekanukleotid wurde in 50 mM Tris- !HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin, 1 pM ³²P-—ATP mit 60 Einheiten/ml T4-Polynukleotidkinase (Bethesda

Reserach Laboratories) 30 Minuten bei 37 C zu einer spezifischen Aktivität von etwa 500 Ci/mMol am 5' Ende des Moleküls markiert.

Dieses endmarkierte Tridekanukleotid wurde als Primer für (ein~ zelsträngige) cDNA-Synthese verwendet, wobei als Matrize PoIy-(A) RNA aus Sendaivirus-induzierten Namalwazellen (siehe Beispiel B) diente. Die Reaktion wurde bei einem 5-10 fachen mo~ llaren Überschuß von Primer gegenüber RNA in 50 mM Tris-HCl, IpTT 8,3, 60 mM KCl, 5 mM DTT, 50 pg/ml Actinomycin D, 4 mM MgCl₃, 4 mM Natriumpyrophosphat, 0,5 mM dNTPs mit 100 Einheiten/ml AMV !Reverse Transkriptase 90 Minuten bei 37°C durchgeführt. Nach !Entfernung des RNA-Anteiles des RNA-DNA-Hybrides durch einstündige Inkubation in 0,3 M NaOH bei 50°C und anschließende Neutralisation mit 0,3 M Essigsäure ist die cDNA als Hybridisiexungsprobe verwendbar. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in Figur 2 wiedergegeben. Eine so hergestellte cDNA trägt demnach die radioaktive Markierung nur in Molekülen, die vom interferonspezifischen Tridekanukleotid als Primer ausgehend synthetisiert worden sind und zeigt somit eine hohe Spezifität für das Erkennen von Interferon-DNA-Sequenzen in Hybridisierungen.

!Koloniehybridisierung mit Tridekanukleotid-gepriroter cDNA

hier dargestellte Methode dient der Erkennung jener transjformierten Bakterienklone, welche Hybridplasmide mit zum Trideikanükleotid komplementären DNA Sequenzen enthalten. Dazu wurden ^!Zellen von einzelnen geklonten Transformanten auf 22 χ 15 cm Witrozellulosefilter (Porengröße 0,45 pm, Millipore oder Schleicher & Schuell) transferiert, zu einer Koloniegröße von 2 mm Durchmesser auf den Filtern gezüchtet und nach literaturbekannter Methode für die Koloniehybridisierung vorbereitet (Proc. Natl. Acad. Sei USA Jl' 3961-3965 (1975) und Analytical

Biochemistry 9jB, 60-63 (1979)). Die Nukleinsäurehybridisierung mit endmarkierter cDNA (siehe Beispiel D) wurde in 50 % Formamid, 4 χ SET (1 χ SET = 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8), 1 χ Denhardt's Lösung (0,02 % BSA, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon), 0,5 mg/ml denaturierter und gescherter :Lachssperma DNA, 0,1 % Natriumpyrophosphat und 0,1 % SDS für ;48 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die Filter wurden hierauf in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid und 0,2 χ SSC (1 χ «SC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumeitrat) bei 2O-25°C mehrere !Stunden (6-8 Stunden) gewaschen und dann mit einer Lösung aus Vx SSC gespült. Die Filter wurden bei 20-25°C getrocknet und bei, -70°C mit einem Röntgenfilm (Kodak XR) exponiert. Die Figur 3 zeigt ein typisches Ergebnis eines derartigen Versuches: Auf der abgebildeten Fläche wurden 1536 Bakterienkolonien gezüchtet und durch Koloniehybridisierung gescreent. Der Pfeil zeigt auf ein Beispiel eines transformierten Bakterienklons, dessen Hybridplasmid-DNA mit der radioaktiven Probe ein Signal ergibt, Insgesamt wurden durch Screenen von etwa 13000 transformierten Bakterienkolonien 190 Klone isoliert, welche mit der durch das Tridekanukleotid initiierten cDNA aus Sendaivirus-induzierten Namalwazellen ein positives Signal ergaben; sie wurden auf 2 Mikrotiter-platten (P1 und P2) gesammelt. ,Demnach enthielten etwa 1 % aller Klone der Klonbank die spezifische Sequenz dCCTTCTGGÄACTG.

!Bei&p_iel__F

;Analyse der Sequenzkomplexität der mit Tridekanukleotid-geprim-

iter cDNA hybridisierenden Klone

Um die Anzahl der Klone mit verschiedener Sequenz (Sequenzkomiplexität) in den 190 Tridekanukleotid-positiven Klonen (siehe Beispiel E) festzustellen, wurden von verschiedenen Klonen die ,cDNA-Inserte durch Pst !-Verdauung (siehe Beispiel C), Elektrophorese in 0,8 % Agarosegelen und Elution der gewünschten Bande (durch Ausscheiden des die Bande beinhaltenden Gelstückchens

und elektrophoretische Elution der DNA aus der Agarose in einen Dialysenschlauch) isoliert und nach literaturbekannter Methode durch Nick-Translation mit ³²P markiert (J. Mol. Biol. 113, ;237-251 (1977)). Abdrücke der Tridekanukleotid-positiven Klone (Mikrotiterplatten P1 und P2) und einer willkürlich ausgewählten !Mikrotiterplatte (E52) wurden auf Nitrozellulosefilter transferiert, aufgezüchtet, für Koloniehybridisierung vorbereitet

32 (siehe Beispiel E) und mit den verschiedenen P-markierten IeBKA-Inserten hybridisiert. Die Hybridisierungen wurden durchgeführt wie in Beispiel E beschrieben, nur daß in die Hybridiisierungslösung auch 50 pg/ml poly (U) und 10 /ig/ml PoIy(I): !poly (C) zugegeben wurden und die Filter nach der Hybridisierung in 50 % Formamid und 1 χ SSC gewaschen wurden. Die Figur 4 zeigt das Ergebnis eines solchen Experiments mit den Inserten der Klone P1H1 und P2H10 als Probe. (P1H1 ist der Klon mit der Position H1 auf der Mikrotiterplatte P1, P2H10 hat die Position H10 auf der Mikrotiterplatte P2.) Es zeigte sich, daß Klon P1H1 mit mehr als 90 % aller Tridekanukleotid-positiven Klone der Platten P1 und P2, wie auch mit einigen Klonen der Platte E52 hybridisiert (Figur 4, Teil A). Die Identität vieler dieser kloniertsn Sequenzen wurde später durch Restriktionsanalyse bestätigt. Klon P2H10 hybridisierte außer mit sich selbst auch mit den Klonen der Positionen 1C12, 1F12, E52E1 (Figur 4, Teil .B-). Klone P1A6 und P2B10 wurden auch auf diese Weise analysiert und hybridisierten jeweils nur mit sich selbst (dieses Ergebnis wird in Figur 4 nicht gezeigt). Aus diesen Resultaten konnte abgeleitet werden, daß in der Sammlung der 190 Tridekanukleotidpositiven Klone vermutlich weniger als 10 qualitativ verschiedene Sequenzen vorhanden sind, wobei P1H1, P2H10, P1A6 und P2B10 irier solcher verschiedener Sequenzen darstellen.

- 15 Beispiel G RNA-Transfer-Hybridlsierungen

Um herauszufinden, ob ein bestimmter Tridekanukleotid-positiver !Bakterienklon Interferonseguenzen enthalten könnte, wurde getestet, ob seine Plasmid-DNA mit einer in Namalwazellen durch iSendaivirus induzierten mRNA hybridisiert. Dazu wurde PoIy(A) JRNA von induzierten und nicht induzierten Namalwazellen analog der in Beispiel B angegebenen Weise isoliert, durch Inkubation eine Stunde bei 50°C in 1 M Glyoxal, 50 % DMSO, 10 mM Natrium» phosphatpuffer, pH 7 denaturiert, auf einem 1,4 % Agarosegel aufgetrennt, nach literaturbekannter Methode (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 5201-5205 (198O)) auf Nitrozellulosefilter transferiert und mit durch Nick-Translation P-markierter (siehe Beispiel F) Plasmid-DNA hybridisiert. Plasroid-DNA, die von einem induzierten Gen abstammt, wird in dieser Versuchsarsordnung nur mit RNA aus induzierten Zellen hybridisieren, nicht aber mit' RNA aus uninduzierten Zellen. Figur 5 zeigt die Autoradiographie :eines solchen Experiments: induzierte RNA ("i") ist jeweils in der linken Spalte eines Paares, nicht-induzierte RNA ("η") in der rechten Spalte. Die zur Hybridisierung verwendeten Plasmid-DNAs Sind P1H1 (A), P1F12 (B,D), P2H10 (C), P1A6 (E), P2B10 (F). Von den getesteten Plasmiden hybridisierten P1F12, P2H10 und JP1A6 nur mit RNA aus induzierten Zellen, während P1H1 und P2B10 auch mit RNA aus nicht induzierten Zellen ein Signal ergaben. Die Molekülgröße der mit P1F12 und P2H10 hybridisierenden RNA liegt bei 11-12S, die Größe der mit P1A6 hybridisierenden RNA !bei 12-14S. Diese Molekülgrößen sind für IFN-ß bzw. IFN-&-mRNA 'literaturbekannt. Die Plasmide P1F12, P2H10 und P1A6 wurden daher weiter untersucht, um ihren Gehalt an Interferon-DNA-Seguenzen eindeutig festzustellen.

- 16 -

Beispiel H

Biologischer Nachweis von Interferonaktivität in den Translatiorisprodukten hybrid-isolierter RNA

Ein auf biologischer Testung basierender Nachweis, ob ein bestimmtes Hybridpiasmid Interferon-DNA-Sequenzen enthält oder nicht, wurde für die Plasmide P1F12, P2H10, P1H1 und P2B1O -durchgeführt. Das Prinzip dieses Nachweises ist folgendermaßen: die zu testende Plasmid-DNA wird auf einem Nitrozellulosefilter fixiert und hierauf unter Hybridisierungsbedingungen mit PoIy(A)⁺RNA aus induzierten Namalwazellen (siehe Beispiel B) inkubiert. Enthält die gebundene DNA Interferonsequenzen, so wird Interferon-mRNA damit hybridisieren. Die nicht hybridi-

_;. sierte RNA wird in der Folge weggewaschen, die hybridisierte RNA von der DNA herabgeschmolzen und in Xenopus laevis-Oocyten injiziert. Oocyten können injizierte mRNA in Proteine übersetzen (siehe Beispiel B). Handelt es sich bei der hybridisierten mRNA um Interferon-mRNA, so wird in den Oocyten Interferon-Protein 'entstehen, dessen antivirale Eigenschaften im Plaquereduktionstest (siehe Bei-spiel A) nachgewiesen werden können. Im Detail wurde dieser Versuch so durchgeführt: 10 jig linearieierte Plasmid-DNA wurden in 200 pl 0,5 N NaOH denaturiert, mit 200 nl 0,5 N Essigsäure +2Ox SET (Zusammensetzung von SET siehe Beispiel E) neutralisiert und durch Filtration auf 0 •2,5 cm Nitrosellulosefilter gebunden. Die Filter wurden bei Zinsraertemperatur getrocknet, 2 Stunden bei 80°C gebacken und dann eine Stünde bei 53°C oder auch bei 37°C in 50 % Formamid, ;20 mM PIPES, pH 6,5, 0,4 M NaCl, 5 mM EDTA, 10 % Dextransulfat, 1 % SDS, 20 pg/ml E.coli tRNA, 50 pg/ml PoIy(A) prähybridisiert und im selben Puffer nach Zugabe von 14-40 fig induzierter Namalwa PoIy(A)⁺RNA 5 Stunden lang hybridisiert. Hierauf wurden die Filter 3 χ 20 Minuten bei 25°C in 0,2 - 1 χ SET, 0,2 % SDS, 1 % Dextransulfat, 5 pg/ml tRNA, dann 2 χ 10 Minuten bei 25 C in 2 mM EDTA, pH 8,0, 0,2 % SDS, 1 % Dextransulfat, 5 ytig/ml tRNA, dann 1 χ 5 Minuten bei 60⁰C in 2 mM EDTA, pH 8,0, 0,2 % SDS, 5 ug/ml tRNA gewaschen. Die hybridisierte RNA wurde 4 Minuten

bei tOO C in 1 ml H₂O + 10 ^ig tRNA eluiert. Nach Chromatographie auf einer Oligo(dT)-Zellulose Säule (siehe Beispiel B) wurde die ΈΝΑ äthanolgefällt, in 5 μΐ H_0 aufgenommen und in Xenopus ilaevis-Oocyten injiziert. Die Oocytenüberstände wurden nach zweitägiger Inkubation bei Zimmertemperatur abgenommen und in Plaquereduktionstest auf Interferonaktivität getestet.

Das Ergebnis brachte eine Bestätigung der von den RNA-Transfer-'Hybridisierungen (Beispiel G) nahegelegten Vermutung, nämlich idaß Klone P1F12 und P2H10, nicht aber die Klone P1H1 und P2B10 ilnterferon-DNA-Inserte trugen. Durch Neutralisation der erhaltenen Interferonaktivität mit spezifischen Antiseren gegen IFN-& oder iFN-ß (siehe Beispiel A) konnte gezeigt werden, das ies sich bei den Inserten der Klone P1F12 und P2H10 um IFN-ß-DNA-| !Sequenzen handelte.

Klon	Interferonaktivität (Einheiten/ml Oocytenüberstand)	Prozent Neutralisation durch Antiserum gegen IFN-X XFN-fi
P1F12 P2K10 P1H1 P2B10	S^* 50 /S/ 50 < 2 <2	S8 98

Beispiel I

~ und .Sequenzanalyse., der Klone von IFN-ß-Typ

Die cDNA-Inserte der Klone P1F12 und P2H10 wurden mit Hilfe ivon Restriktionsenäonukleasen untersucht, wobei das Vorhandensein und, im gegebenen Fall, die Positionen der Spaltstellen der Enzyme Bam HI, BgI II, Eco RI, Hin dill, Pst I und Pvu II !ermittelt wurden. Ein Vergleich der Restriktionskarten von

P1F12 und P2H10 mit dem literaturbekannten Gen für IFN-ß (Gene K), 11-15 (198O)) ist in der Figur 6 wiedergegeben: Alle drei Klone werden von Pvu II, Pst I und BgI II geschnitten/ wobei die Entfernungen zwischen den einzelnen Spaltstellen für jeden Klon dieselben sind. Zum letzten Beweis für die Identität der Inserts der Klone P1F12 und P2H10 mit dem IFN-ß-Gen wurden nach der Methode von Maxam und Gilbert (Proc. Nat. Acad. Sei USA JA' ^56O~ 564 (1977)) Teile ihrer DNA-Sequenzen ("rechts" (3¹) der Pvu II-ttnd BgI !!-Schnittstellen) ermittelt und mit der publizierten IFN-ß-Sequenz verglichen. Die Sequenzen von P1F12 und P2H10 zeigen vollständige Übereinstimmung mit dem IFN-ß-Gen; sie sind in Figur 7 dargestellt.

Beide Klone haben„am 5'Ende nicht die vollständige IFN-ß-Sequenz, es fehlen ihnen etwa 60 Nukleotide der für reifes Protein codierenden Region. Am 3'-Ende ist P1F12 vollständig, auch P2H10 enthält die gesamte 3'-Region von IFN~ß-cDNA inklusive der von PoIy(A)RNA herstammenden Poly(dA)-Sequenzen. P2H10 erstreckt sich jedoch noch beträchtlich (1400 Basenpaare) weiter: 3' vom """__ Poly(dA) liegt ein Bereich mit der Sequenz Oligo(dC), gefolgt von einer Sequenz unbekannten Ursprungs; DNA-Sequenzanalyse verschiedener Abschnitte dieser zusätzlichen Region von P2H10 ergab keine Homologie mit dem IFN-ß-Gen. Es zeigte sich weiters, daß die mit Klon P2H10 kreuzhybridisierenden Klone P1C12 und E52E1 (beschrieben in Beispiel F) mit eben dieser zusätzlichen Region von P2H10 hybridisieren und nicht mit dem IFN-ß-Anteil.

Beispiel _J

Analyse des IFN-& -Tyjg ...Klons _P1A6

Der Klon P1A6 hybridisiert mit virus-induzierter Namalwa-RNA in der Region von 12-14S (beschrieben in Beispiel G). Er enthält ein cDNA-Insert von etwa 900 Basenpaaren/ das, wie Restriktionsanalyse ergab, keine Spaltstellen für die Enzyme Bam HI, BgI II, Eco RI, Hin dill, Pst I und Pvu II aufweist (siehe Figur 6).

Der Beweis dafür, daß Klon P1A6 IFN-·( -Sequenzen beinhaltet, wurde wieder durch DNA-Sequenzanalyse erbracht: die Sequenz des cDNA-Inserts von P1A6 wurde von den das Insert begrenzenden Pst I-Spaltstellen nach innen ermittelt (siehe Figur 8) und mit den von Goeddel et al. (Nature 290, 20-26 (1981)) beschriebenen IFN-PC -Sequenzen verglichen. Es zeigte sich, daß Klon P1A6 eine um 49 Basenpaare kürzere Variante von LeIFN C darstellt. Das Vorhandensein von Poly(A)-Sequenzen am 3'-Ende von P1A6 weist darauf hin, daß Klon P1A6 von einer kürzeren mRNA abstammt als der publizierte Klon LeIFN C. Die für LeIFN C-Protein codierende !Region ist jedoch vollständig vorhanden.

Beispiel K

Identifikation und Analyse eines weiteren IFN- x( -Typ Klons (1F7)

!Klon P1A6 war der einzige IFN- K-Typ-Klon, der aus der Kollektion der 190 Tridekanukleotid-positiven Klone (siehe Beispiel E) Identifiziert werden konnte. Um weitere IFN- K-Typ-Klone zu ermitteln, wurden 1800 Klone der ursprünglichen cDNA-Klonbank (Beispiel C) durch Kolonxehybridisxerung (wie in Beispiel F beischrieben) mit dem cDNA-Insert des Klons P1A6 hybridisiert. Ein weiterer IFN- K-Klon (Klon 1F7) wurde auf diese Weise gefunden. Restriktionsanalyse und teilweise DNA-Sequenzierung des cDNA Inserts von 1F7 ergaben, daß es sich bei 1F7 um eine um 175 Basenpaare längere Variante des Klontyps LeIFN A (Goeddel et al., siehe oben) handelt. 1F7 enthält wie LeIFN A je 2 Spaltstellen" ;für die Enzyme BgI II und Pvu II (Figur 6); die ermittelten DNA-Sequenzen am 5'- und am 3'-Ende des Inserts sind in Figur 8 angegeben .

Desweiteren wurden Teile der DNA-Sequenz des IFN-Ä-Typ Klons (1F7) nach der Dxdeoxy-Methode (siehe Messing et al. in Nuc. Acid. Res. j), 309 (1981) und Gardner, R.C. .et. al.._tin Nuc. Acid. Res. 9_, 2871 (1981)) mit einem Universal-Primer analysierte Für die Positionen 120 bis 327 wurde folgende Teilsequenz gefunden:

...... CCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACG TGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCA TCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGAC

tcatctgctgcttgggatgagaccctcctagacaaattcta

im Vergleich zu der literaturbekannten Sequenz des IFN-ÄA Typs (siehe D.V. Goeddel et al. in Nature 29O _f 20 (1981)) weist die neue DNA-Sequenz des IFN-K-Typ Klons (1F7) im Bereich der Nucleotide Nr. 120-327 folgende Unterschiede auf: In Position 137 und 170 wurde jeweils das Nukleotid A durch G ersetzt.

Beispiel L

Interferonaktivität in Lysaten von E.coli HBI01, transformiert mit dem hybriden Plasmid 1F7 ___

iLysate von mit P1A6 oder 1F7 transformierten Bakterienkulturen wurden auf ihren Gehalt an biologisch aktivem Interferon unterisucht. Dazu wurden 100 ml Bakterienkultur in L-Broth-Medium zu einer optischen Dichte von 0,6-0,8 gezüchtet, durch Zentri- fugation 10 Minuten bei 7000 U/min pelletiert, 1 χ in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 30 mM NaCl gewaschen und schließlich in 1,5 ml desselben Puffers suspendiert« Nach Inkubation mit 1 mg/ml Lysozym 30 Minuten auf Eis wurden die Bakterien 5 χ gefroren und getaut, und hierauf die Zellbruchstücke durch Zentrifugation eine Stunde bei 40000 U/min entfernt. Der Überstand wurde steril filtriert und im Plaquereduktionstest auf Interferonaktivität getestet. In auf diese Weise gewonnenen Lysaten von Klon 1F7 konnten etwa 500 Einheiten pro ml Interferon nachgewiesen werden; Klon 1A6 ergab in diesem Test keine Aktivität, was vermutlich auf eine andere Orientierung des Inserts im Plasmidvektor zurückgeführt werden kann.

Beispiel M

Verbesserung der Expression des von 1F7 codierten Interferontyps

Um gute Expression eines Genes zu erreichen, müssen auf DNA-Ebene drei Voraussetzungen erfüllt werden: erstens muß vor dem Gen ein Promotor (eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle) liegen, zweitens muß die abgelesene RNA vor dem Initiationscodon der Translation eine Ribosomenbindungsseguenz (RBS) tragen und drittens muß der Abstand zwischen RBS und Initiationscodon eine geeignete Länge haben.

;Zur Expression des von 1F7 codierten Interferons wurde als Promotorsequenz der literaturbekannte Promotor des Tryptophanoperons von Serratia marcescens (Nature 276, 684-689 (1978)) genommen und als RBS eine literaturbekannte DNA-Sequenz (Proc. Natl. Acad.. Sei. USA 28, 5543-5548 (1981)). Zur Ermittlung des optimalen Abstandes zwischen der RBS und dem Initiationscodon von 1F7 wurde folgende Strategie gewählt: die 1F7-CDNA-Sequenz iwurde mit der für doppelsträngige DNA spezifischen Exonuklease IBAL 31 kurz verdaut, wodurch ein Gemisch von Molekülen verschieidener Länge erhalten wurde«. Diese Moleküle wurden hierauf mit Hilfe von synthetischen Linkersequenzen in geeigneter Weise in ein "Expressionsplasmid" ligiert, das heißt, in ein Plasmid, das Promotor und RBS enthielt. E.coli HB1O1 wurde mit diesen !Plasmiden transformiert und einzelne Transfοrmanten wurden auf Interferonsproduktion getestet.

Im Detail wurde der Versuch folgendermaßen durchgeführt: 0,5 1 jag 1F7-Insert wurden in 100 pl 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,6 M NaCl, 12 mM MgCl₂, 12 mM CaCl₃, 1 mM EDTA 3 min bei 30°C mit 0,5 Einheiten BAL-31 (Bethesda Reserach Laboratories) inkubiert. Hierauf wurde die Reaktion durch Zugabe von 300 iil 15 mM EDTA, pH 7,8, beendet, es wurde 10 min auf 65 C erwärmt, mit Phenol und Äther extrahiert und äthanolgefällt. Der Niederschlag wurde in 10 μΐ 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP, zusammen mit 30 - 60 pMol phosphorylierten Hin dlll-Linkern

(Bethesda Research Laboratories) aufgenommen und mit 0,5 - 1 Einheiten T4-Ligase (Bethesda Research Laboratories) über Nacht bei 14 c inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen 10 min auf 65 C beendet, 2 M NH4~Acetat zugegeben und die Interferongene von nicht ligierten Linkern durch Fällung mit 0,6 Volumen Isopropanol gereinigt. Die Fällung wurde in 30 - 50 μΐ 33 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 66 mM K-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 100 pg/ml BSA gelöst und mit 30 - 50 Einheiten Hin dill 2-3 Stunden lang verdaut. Die Reaktion wurde durch Erhitzen 10 min auf 65°C beendet und nach Zugabe von 2 M NH.-Acetat wurden die Interferongene mit 0,6 Volumen Isopropanol gefällt. Der Niederschlag wurde in 10 ul 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl₀, 1 mM DTT,

-2

0,5 mM ATP aufgelöst und mit Hilfe von 10 Einheiten T4-Ligase mit 0,2 pg Hin dlll-linearisiertem, phosphatasebehandeltem Expressionsplasmid pER103 über Nacht bei 14°C ligiert. pER103 ist ein pBR322-Derivat, das die Promotorsequenz des Tryptophanoperons von S.marcescens und eine literaturbekannte RBS enthält (siehe oben); es kann mit Hin dill in der Nähe der RBS lineariisiert werden« Die so erhaltenen Plasmide wurden zur Transformation von E.coli HB 101 verwendet und die Interferonproduktion einzelner Transformanten wurde auf die in Beispiel L beschriebene Weise getestet. Es ergäbe sich eine Steigerung der Inter-

4 feronexpression bis zum etwa 10 -fachen Wert der Spontanexipression.

Die vorstehend erwähnten Eigenschaften belegen, daß die erfindungsgemäß hergestellten rekombinanten DNA-Moleküle Sequenzen !enthalten, die für Ä- oder ß~Interferon codieren, wobei anhand eines dieser erfindungsgemäß erhaltenen Plasmide die Expression von Interferon des Typs K gezeigt wird.

Beispielsweise wurden folgende'Mikroorganismen und rekombinante-DNA-Moleküle bei der Hinterlegungsstelle "Deutsche Sammlung von Mikro-Organismen, Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen" am 17. Mai 1982 unter den DSM-Nummern

2362 (1F7), 2363 (P1A6),

2364 (P1F12) und

2365 (P2H10)

hinterlegt und sind der Öffentlichkeit gemäß Budapester Vertrag zugänglich.

Verwendete Begriffe und Abkürzungen

Antiserum: ATP: Autoradiographieι

Basenpaar: blunt ends:

BSA: (d)C: CDNA:

cDNA-Pool: codieren:

DNA-Sequenz:

DTTs EDTA s Elektrophorese:

Expression:

(Deoxy) Adenosin

ein Serum, das Antikörper beinhaltet Adenosintriphosphat

fotographische Methode zum Nachweis von Radioaktivität

2 komplementäre Nukleotide, z.B. A-T, G-C vollständig basengepaarte Enden eines DNA-Doppelstrangmoleküls, zum Unterschied von überhängenden Einzelstrang-Enden Bovinserumalbumin (Deoxy) Cytidin eine zu RNA komplementäre DNA Gemisch aus cDNAs verschiedener Sequenz die Information für etwas tragen; DNA trägt in der Nukleotidsequenz die Information für die Aminosäuresequenz eines Proteins Diine thy lsulf oxid Deoxyribonukleinsäure

eine lineare Anordnung von Nukleotiden, welche durch Phosphodiesterbindungen verknüpft sind. Dithiothreitol

Äthylendinitrilotetraessigsäure Trennung von (DNA oder RNA-) Molekülen nach Molekülgröße im elektrischen Feld umsetzung der Information eines Gens in mRNA durch Transkription und in weiterer Folge in Polypeptid (Protein) durch Translation

Filterhybridisierung:

(d)G: Gen:

'Genfamilien:

Genprodukt: Gradient: Homologie (von DNA Sequenzen):

Hybrid:

Hybridisierung (von Nukleinsäuren) :

Hybridisierungs- probe:

!Hybridplasmid:

_: IPN-* : : IPN-B: IFN-γ : in vitro: Induktion (von Interferonproduktion) :

Hybridisierung von Nukleinsäuren, wobei ein Partner filtergebunden ist (Deoxy) <3uanosin

Abschnitt auf der DNA, der die Information für ein bestimmtes Transkript (RNA-Molekül) trägt, das in weiterer Folge in ein Protein übersetzt werden kann.

Familien von Genen, die für nahe verwandte Produkte (Subtypen) codieren

RNA (Transkript), Protein (Translationsprodukt) siehe Saccharosegradient

Verwandtschaft zwischen DNA-Sequenzen, die sich in einer ähnlichen Nukleotidabfolge zeigt stabiler Komplex von zwei zueinander zumindest zum Teil komplementären DNA-Strängen

Ausbildung von stabilen Komplexen zwischen zueinander komplementären einzelnen DNA- oder RNA-Strängen

radioaktiv markierte Nukleinsäure, die zur Auffindung von dazu komplementären Sequenzen dient Plasmid, das einen DNA-Abschnitt aus einem fremden Organismus enthält Inosin

Leukocyteninterferon Fibroblasteninterferon Immuninterferon im Reaktionsglas

Stimulation von Zellen zur Synthese von Interferon durch Behandlung mit Induktoren (Viren, doppelsträngige RNA, Mitogene)

Initiationscodon: Initiationskomplex:

Insert, cDNA-Insert:

ifion:

Klonbank, cDNA-Klonbank:

Xlonieren:

iKoloniehybridisierung:

'komplementär:

!Kreiizhybridisierung; jiigieren:

IMikrotiterplatte:

Mitogen:

molekulares Klonieren: mRNA:

•Neutralisation:

Sequenz AUG der mRNA, die den Beginn der Translation signalisiert Verbindung von Reverser Transkriptase mit mRNA und Primer, die den Beginn der cDNA-Synthese ermöglicht das Stück fremder DNA (z.B. eine cDNA), das sich in einem Hybridplasmid befindet

Bakterienkolonie, von einem einzelnen Bakterium abstammend eine Sammlung von Bakterienklonen, die alle ein Hybridplasmid mit einem cDNA-Insert beinhalten das Herstellen von Klonen; zumeist verstanden als das Herstellen von Klonen, die ein Hybridplasmid beinhalten

Hybridisierung mit filtergebundenen denaturierten Bakterienkolonien zueinander passend (Nukleotide in der DNAs A ist komplementär zu T, G ist komplementär zu C) Hybridisierung zwischen nicht identischen, aber homologen DNA-Sequenzen kovalentes Verknüpfen von DNA-Sequenzen mit Hilfe des Enzyms Ligase Platte mit 9β Vertiefungen, die durch die Koordinanten 1-12 und A-Z charak- ' terisiert sind

Substanz, die Zellen zur Mitose (Zellteilung) stimuliert siehe Klohieren

Messenger RNA, ist eine für Proteine codierende RNA

Inaktivierung eines Antigens durch Antikörper

dNTPs:

Nukleotide:

Oligonukleotide Oligo(C):

©llgo(dT) :

Oligo(dT)-Zellulose:

PIPES: Plasmid:

PoIy(A) oder (dA) : PoIy(A)⁺RNA:

PoIy(C) oder (dc):

PoIy(I):

PoIy(I):poly (C):

PoIy(U):

Primer:

Probe: Promotor: RBS:

Mischung der 4 Nukleotide dATP, dTTP, dCTG, dGTP

Bausteine einer DNA oder RNA; (d)A, (d)C, (d)G, (d)T

wenige miteinander durch Phosphodiesterbindungen verknüpfte Nukleotide Oligomeres von C-Resten, durch Phosphodiesterbindungen verknüpft Oligomeres von dT-Resten, durch Phosphodiesterbindungen verknüpft an Zellulose gebundene Oligo(dT)-Reste, zur Chromatographie von PoIy(A) RNA Piperazin-N,N'-bis(2-Sthansulfonsäure) zirkuläre, extrachromosomale Bakterien-DNA, die selbständig repliziert Polymeres von A- oder dA-Resten, durch Phosphodiesterbindungen verknüpft mRNA, welche am 3'Ende der Nukleinsäureseguenz eine homopolymere Region von PoIy(A) besitzt

Polymeres von C- oder dG-Resten, durch Phosphodiesterbindungen verknüpft Polymeres von I-Resten, durch Phosphodiesterbindungen verknüpft doppelsträngige Nukleinsäure, deren Stränge PoIy(I) und PoIy(C) sind Polymeres von U-Resten, durch Phosphodiesterbindungen verknüpft Oligonukleotid, komplementär zu einem Teil eines RNA-Moleküls, von dem ausgehend cDNA-Synthese erfolgt siehe Hybridisierungsprobe DNA-Sequenz, an die RNA-Polymere bindet siehe Ribosomenbindungsseguenz

xekombinante DNA:

Replikation (von DNA): .Restriktionsanalyse:

iRestriktionsendonuiktease:

Restriktionskartierungj !Reverse Transkription:

Ribosomenbindungssequenz:

RNA: !RNA-Polyiaerase:

Saccharosegradient:

SDS: !Screening :

Seguenzkomplexität:

Bubtypen: JCd)T:

Transformant:

Transformationι 'Transkription:

'Translation:

DNA-Sequenz, welche aus DNA-Abschnitten verschiedener Herkunft besteht, die in vitro miteinander verknüpft worden sind Duplizierung eines DNA-Moleküles Kartierung eines DNA-Moleküls im Hinblick auf Spaltstellen von Restriktionsendonukleasen

Enzym, das bei einer bestimmten DNA-Sequenz den DNA-Doppelstrang spaltet siehe Restriktionsanalyse Herstellung einer cDNA-Kopie mit einem RNA-Molekül als Matrize und einem Oligonukleotid als Primer

Teil der mRNA, der ans Ribosom binden kann

Ribonukleinsäure

Enzym, das einen zu DNA komplementären RNA-Strang synthetisieren kann Mittel zur Auftrennung eines Gemisches von (RNA-)Molekülen nach ihrer GröBe Natriumdodecylsulfat Durchsuchen im Hinblick auf eine bestimmte Eigenschaft

ein Wert für die Anzahl qualitativ verschiedener DNA-Sequenzen in einer bestimmten Menge DNA siehe Genfamilien (Deoxy) Thymidin

Bakterium, das fremde DNA durch Transformation erhalten hat Einschleusen fremder DNA in Bakterien

Kopierung von mRNA von einer dazu komplementären DNA-Sequenz Umsetzung der Information von mRNA in ein Polypeptid (Translationsprodukt)

Tridekanukleotid:

Tridekanukleotidpositiv:

Tris:

iU:

Vektor:

IVektorhybrid:

Oligpnukleotid mit 13 Nukleotidbestandteilen

mit dem Tridekanukleotid hybridisierend

Trishydroxymethylaminomethan Oridin

Vehikel zum Einschleusen fremder DNA in

Bakterien, meist ein Plasmid siehe Hybridplasmid

- 30 Kurze Beschreibung der Illustrationen;

Fig. 1 : .

ist eine schematische Darstellung der Herstellung einer cDNA-Klonbank.

Fig. 2;

_ist eine schematische Darstellung der Herstellung einer cDNA als Hybridisierungsprobe, die bezüglich ihres Gehalts an IFN-CC und IFN-ß-spezifischen DNA Sequenzen durch Verwendung eines spezifischen Tridekanukleotid-Primers angereichert ist.

Fig. 3:

zeigt das Ergebnis der Koloniehybridisierung einer Klonbank mit Tridekanukleotid-initiierter cDNA aus Namalwazellen. Die Darstellung zeigt eine Autoradiographie eines Nitrozellulosefilters, welches 1536 verschiedene Klone trägt. Der Pfeil zeigt auf ein Beispiel eines Tridekanukleotid-positiven Klons.

Fig. 4;

zeigt die Kolonie-Hybridisierungsreaktion von zwei Tridekanukleotid-positiven Klonen (Klone P1H1 und P2H1O) mit der Gesamtheit der 190 Tridekanukleotid-positiven Klone (Mikrotiterplatten P1 und P2) und einer willkürlich gewählten Mikrotiterplatte (E52) als Kontrolle.

Fig. 5;

zeigt die Autoradiographie einer Filterhybridisierung von PoIy(A)⁺RNA aus induzierten und nicht induzierten Namalwazellen imit mehreren Plasmiden. Die virusinduzierte PoIy(A) RNA ("i" in der linken Spalte jedes Paares) und die PoIy(A) RNA aus nicht induzierten Namalwazellen ("n" in der rechten Spalte jedes Paares) wurden durch Elektrophorese nach Molekülgröße aufgetrennt, bevor der Transfer auf Nitrozellulosefilter, die Hybridisierung der Filter mit radioaktiv markierter Plasmid-DNA und anschließende Autoradiographie erfolgten.

- - 31 -

Fig. 6r

zeigt den schematischen Vergleich der Restriktionskarten von vier DNA-Inserten aus rekombinanten DNA-Molekülen dieser Erfindung. Die DNA-Inserte der Plasmide P1F12 und P2H1O zeigen dabei Homologie zu IFN-ß-DNA Restriktionsmustern, die DNA-Inserte der Plasmide P1A6 und 1F7 zeigen Homologie zu zwei unter schiedlichen Subtypen von IFN- ^-DNA.

.!Big. 7;

zeigt Ausschnitte der (identischen) Nukleotidseguenzen von 2 Klonen mit IFN-ß-DNA-Spezifität (Klone P1F12 und P2H1O).

zeigt die Nukleotidseguenzen der 3' und 5' terminalen Segmente von 2 Inserten mit IFN-J^-DNA-Spezifitat (Klone P1A6 und 1F7). Die unterstrichene Sequenz ATG ist das Initiationscodon für die Translation.

Claims

AP G 12 11/251 287 (62 404 /12) Erf indungs ans pruch

1« "Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus und seine in üblicher V^:/eise erhältlichen Mutanten, welcher die genetische Information für die Biosynthese von Interferon des Typs el· oder des Typs ^ in einem Hydridplasmid enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man aus cIMA, die mit KEA aus induzierten menschlichen Zellen des B-Lymphocyten-Typs als Matrize synthetisiert worden war, eine entsprechend Klonbank herstellt und daraus diejenigen Hone, in denen das Hybridplasmid die genetische Information für die Biosynthese der Interferone des Typs öCoder des Typs ρ enthält, unter Verwendung einer οΠΝΑ als Hybridisierungsprobe, die mit Interferonsequenzen beinhaltender RKA als Matrize und einem interferonspezifischen Oligonukleotid als Primer synthetisiert worden war, oder unter Verwendung des Oligonukleotids selbst als Hybridisierungsprobe identifiziert, und den so ausgewählten Klon nach üblichen Methoden kultiviert.

2» Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Escherichia coli verwendet wird.

3* Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Escherichia coli Stamm HB 101 verwendet wird»

4· Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet ,daß die cDNA-Komponente in dem Hybridplasmid des Klons PIA6, P1P12 oder P2H10 enthalten ist.

-atölL1$64* 156097

AP C 12 N/251 287 (62 404 /12)

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß als Hybridplasmid pBR322(Pst)PLAG, pBR322 (Pat) 1F7, pBR322(Pst)P1F12 oder pBR322(Pst) P2H10 verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Biosynthese von Interferon des Typs a codierende DNA-Sequenz des Hybridplasraids ρ BR322(Pst) 1F7 die Teilsequenz der Formel

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...rtcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacg tgactttggatttccccaggaggagtttggcaaccagttccaaaaggctgaaacca tccctgtcctccatgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggac

TCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTAj enthält.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als interferonspezifisches Oligonukleotid das Tridekanukleotid 5^fdCCTTCTGGAACTG3^f verwendet wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als menschliche Zellen des B-Lymphocyten-Typs Zellen der Zellinie NC-37» Namalwa, Akuba oder RPMI 1788 verwendet v/erden.

HterziuLJetten Zeichnungen