FI82072C - Ifn-2(arg)-interferoner kodande polydeoxiribonukleotider, dessa interferoner kodande dna-sekvenser, denna genetiska information innehaollande mikro-organismer och deras framstaellningsfoerfarande. - Google Patents
Ifn-2(arg)-interferoner kodande polydeoxiribonukleotider, dessa interferoner kodande dna-sekvenser, denna genetiska information innehaollande mikro-organismer och deras framstaellningsfoerfarande. Download PDFInfo
- Publication number
- FI82072C FI82072C FI831818A FI831818A FI82072C FI 82072 C FI82072 C FI 82072C FI 831818 A FI831818 A FI 831818A FI 831818 A FI831818 A FI 831818A FI 82072 C FI82072 C FI 82072C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ifn
- dna
- clone
- arg
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title description 47
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 25
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 title description 10
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 title 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 title 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 title 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 53
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 42
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 12
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 12
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims description 6
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 241000894007 species Species 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 44
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 phosphodiester compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 101001028702 Homo sapiens Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037173 Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Human genes 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 108700027921 interferon tau Proteins 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- IIYFAKIEWZDVMP-UHFFFAOYSA-N tridecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCC IIYFAKIEWZDVMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 240000000662 Anethum graveolens Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100026688 Interferon epsilon Human genes 0.000 description 1
- 101710147309 Interferon epsilon Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 241001590997 Moolgarda engeli Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241001325209 Nama Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229950010248 loretin Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- VQTGUFBGYOIUFS-UHFFFAOYSA-N nitrosylsulfuric acid Chemical compound OS(=O)(=O)ON=O VQTGUFBGYOIUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002962 plaque-reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1 82072 IFN-a2(Arg)-interferoneja koodaava polydeokslribonukelotidit, näitä interferoneja koodaavat DNA-sekvenssit, tämän geneettisen informaation sisältävät mikro-organismit ja näiden valmistusmenetelmät - I FN-ct2(Arg)-interf eroner kodande polydeoxiribo-nukleotider, dessa interferoner kodande DNA-sekvenser, denna genetiska information innehällande mikro-organismer och deras framställningsförfarande
Kirjallisuudesta tunnetaan kolmen tyyppisiä ihmisen interferoneja, nimittäin leukosyytti-interferonit (interferoni-a, lyhennys: IFN-α), fibroblasti-interferonit (interferoni-S, lyhennys: IFN-B) ja immunointerferon it (interferoni-τ, lyhennys: IFN-τ) (kts. W.E. Stewart II "The Interferon System", Springer-Verlag Wien-New York, 1. painos (1981)). Ihmisen leukosyytit tai ihmisen myeloblastoidiset solut, joita on kiihotettu viruksella, tuottavat leukosyytti interferonia, ihmisen fibroblastit, jotka on indusoitu viruksella tai sopivalla nukleiinihapolla, fibroblasti-interferonia ja ihmisen T-lymfosyytit, jotka on indusoitu mitogeeni1 la, esimerkiksi konkanavaliini 1 la, immunointerferonia.
Lisäksi tiedetään, että ihmisen B-lymfosyytti-tyyppiset solut, joista esimerkkejä ovat esimerkiksi soluiinjat NC-37, Namalwa, Akuba tai RPMI 1788, tuottavat viruksella kiihottamisen jälkeen samanaikaisesti leukosyytti-interferonia ja fibroblasti-inter-feronia (kts. Journal of General Virology 38., 51-59 ( 1977)). Tuotetun IFN-α- ja IFN-ö-määrän suhdetta voidaan tällöin muuttaa indusointiolosuhteiden valinnalla (kts. Journal of Interferon Reseach 2.» painossa (1982)). Sendai-viruksel la Indusoiduista, eri soluiinjojen soluista saadaan esimerkiksi seuraavat suhteelliset määrä IFN-α- ja IFN-B-interferonia: 2 82072
Interferoni-aktiivisuusprosentti, neutraloitu Solulinja spesifisillä antiseerumeilla _________LFN-α__1 FN-B______I FN-a + I FN-8__
Namalwa 52 34 > 98 NC-37 40 52 > 97
Akuba 85 27 > 98 RPM I 1788_68__ 29__> 98_
Leukosyyteistä (kts. Nature 284. 316 - 320 (1980); Science 209.
1343 - 1 347 ( 1980) ja EP-A1-0,032,134) ja myelob 1astoidista soluista (kts. Nature 287, 411 - 416 (1980), ibid 290. 20 - 26 (1981) ja QB-A-2.079.291 ) saatujen IFN-a-geenien mo 1eku1aarinen kloonaus tuotti lisäksi tuloksena sen, että IFN-a-interferonia koodaa geeniperhe, joka muodostuu vähintään 10:stä keskenään erilaisesta geenistä, minkä seurauksena on jälleen se, että näiden DNA-sekvenssien geenituotteet eivät ole mikään yhtenäinen proteiini; so. IFN-α on keskenään samankaltaisten proteiinien seos. Näistä subtyypeistä on kirjallisuudessa käytetty merkintöjä iFN-a 1,2,3... (kts. Nature 287. 401 - 408 (1980) ja Gene J5, 379 - 394 (1981)) tai LelFN A,B,C... (kts. Nature 290.
20 - 26 ( 1981 ) .
Sitä vastoin IFN-β-interferoni 1 le saatiin yhtenäinen DNA-sek-venssi; so. bibrob1asti-interferonia koodaa vain yksi geeni, jolloin ei myöskään tunneta mitään subtyyppejä (kts. Nature ' 285. 542 - 547 (1980)).
Vaikkakin toisaalta (FN-a-geeniperheen sisällä, IFN-a-geenien ja IFN-B-geenin välillä ei tapahdu mitään ristihybridisoitu-mista, on sekvensseillä homologia noin 45 % (kts. Nature 285.
547 - 549 ( 1980)). Tällöin on pisin sekvenssipa 1 a, jossa homologia on täydellinen (5 - 7) funktionaalisten IFN-a-geen ien ja IFN-Ö-geenin välillä, 13 nukleotidiä pitkä.
Tämä tridekanuk1eotidi, jonka kaava on 5'-dCCTTCTGGAACTG-3’ 3 82072 lFN-a-geenit ovat LelFN B,C,D,F,G; alatyypeissä LelFN A ja H on vain 12 nukleotidiä 13 nukleotidistä (kts. Nature 290. 20 - 26 (1981)).
Tämän edellä mainitun tridekanukleotidin avulla voidaan käyttämällä edellä esitettyä menetelmää löytää uusi klooni 1F7, joka koodaa uutta I FN-ct2(Arg): a. Tämä klooni sisältää IFN-a2(Arg):a koodaavan osasekvenssin, jonka kaava on 120 C CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC 153 TGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAC GAG 195 TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC 237 CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG 279 GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC 321 TA 323 Tämä uusi IFN-a2(Arg) eroaa kaikista julkaisussa Nature 287. 408-41 1 ( 1980) kuvatuista interferoneista aminohappojen 18 - 84 alueella, nimittäin Arg:n suhteen asemissa 23 ja 34.
Tyypin a interferonien valmistusta voidaan yllättäen parantaa siten, että bakteereiden, jotka sisältävät erilaisia rekom-binantti-DNA-molekyylejä, sinänsä tunnetulla tavalla saadusta seoksesta identifioidaan tämän tridekanukleotidin avulla pesäkehybridisoimalla ne, joissa on informaatio interferonista, jolloin saadaan IFN-a-sekvenssit.
Valitut solut denaturoidaan tarkoituksenmukaisesti maksimaalisen lFN-mRNA-synteesin hetkellä, tarkoituksenmukaisesti 6-12 tuntia, parhaiten kuitenkin 9 tuntia virus-indusoinnin jälkeen. Solutumien erottamisen jälkeen puhdistetaan solu-sytoplasmasta RNA uuttamalla fenolilla ja seostamalla alkoholilla, minkä jälkeen eristetään poly(A)+RNA oligo (dt)- 4 82072 se 11u1oosa-kromatografian avulla ja tämä rikastetaan interferon ispesifisten sekvenssien suhteen gradienttisentrifu-goimalla (kts. kuvion 1 vasen pystyrivi).
Näin puhdistettua po1y(A)+RNA käytetään matriisina, kun käänteisdtranskirptaasi-entsyymi n avulla valmistetaan yksi-säkeistä cDNA. Tämän yksisäkeisen DNA:n kanssa komplementaarinen toinen DNA-säie syntetisoidaan DNA-po1ymeraasin I avulla. cDNA-synteesi ja komplementaarisen toisen DNA-säikeen synteesi tapahtuu liuoksessa, joka sisältää adenosiinin, tymidiinin, guanosiinin ja sytidiinin deoksinuk1eosiditri-fosfaattia. Saatu kaksisäikeisen cDNA:n seos modifioidaan tämän jälkeen säikeen kummassakin päässä S1 nuk1eaasientsyymi 11ä siten, että yksittäisten säikeiden esiinpistävät alueet poistetaan. Qradienttisentrifugoima11 a eristetään jokainen kaksi-säikeinen DNA-mo1ekyy1i, jossa on vähintään 600 emäsparia. Terminaalisen transferaasi-entsyymin, joka liittää oligode-oksisytidiinin kummankin säikeen 3’-päähän, avulla jatketaan näin saatua cDNA-seosta noin 15 nukleotidin verran, jolloin on valmistettu rekombinantti-molekyylin synteesin yksi kompo-netti (kts. kuvion 1 vasen pystyrivi).
Toisena komponettina 1 inearisoidaan restriktioendonuk1eaasin Pst I avulla ympyrän muotoinen kaksisäikeinen plasmidi, parhaiten Escherichia co1i bakteerista peräisin oleva, esimerkiksi Escherchia coli plasmidi pBR322, ja modifioidaan analogisesti cDNA-seoksen kanssa molekyylin 3'-päissä liittämällä oligo-deoksiguanidiinia siten, että muodostuu esiinpistävät oligo-deoksiguanidiiiinipäät. Näistä päistä voidaan cDNA-molekyy1 in vapaiden o 1igodeoksisytidiinipäiden kanssa muodostaa stabiilit kaksisäikeiset DNA-alueet (kts. kuvion 1 oikea pystyrivi).
Näin valmistetuilla hybridip1asmidei11 a, jotka esimerkiksi on muodostettu pBR322 plasmidista ja cDNA-mo1ekyy1istä, trans- 5 82072 formoidaan isäntänä käytetty mikro-organismi, esimerkiksi Escherichia coli HB 101, jossa tapahtuu tämän DNA:n replikoi-tuminen ja ekspressio.
Pesäkehybridisoinnin avulla osoitetaan näin valmistetuista klooneista ne, jotka sisältävät a tai S-interferonille spesifiset sekvenssit. Koettimena käytetään radioaktiivisesti leimattua cDNA:a, joka syntetisoidaan käänteistranskriptoimalla IFN-mRNA-pitoinen RNA primeerinä käytetyn, interferonisekvens-sille spesifisen tridekanuk1eotidin, 5'dCCTTCTQQAACTG3’, kanssa. Tätä varten leimataan radioaktiivisesti tridekanukleo-tidin pää, parhaiten /-32P-ATP ja T4-polynukleotidi-kinaasi1 la. Käänteis-transkriptaasireaktion aloituskompleksin valmistaminen tapahtuu analogisesti edellä kuvattujen olosuhteiden (kts. kuvio 2) kanssa käyttämällä ylimäärä leimattua tridekanuleo-tidia ja Sendai-viruksella indusoiduista soluista saatua po1y(A)+RNA. Näin valmistetussa cDNArssa on radioaktiivinen leimaus siten myös silloin, kun käänteistranskriptaasireaktion aloituskomp1eksi tridekanukleotidin kanssa on muodostunut, koska leimaus on juuri vain tässä segmentissä. Tällä tavoin mahdollistetaan keksinnön mukaisesti hyvä se 1ektiivisyys havaita DNA-sekvenssi, ja siten et- ja Q-interferoni-DNA.
Kukin transformoitu bakteeripesäke, joka sisältää hybridi-plasmideja, joissa on käytetyn tridekanuk1eotidin kanssa komplementaarisia DNA-sekvenssejä, tehdään näkyväksi auto-radiograafisesti (kts. kuvio 3). Noin 13000:sta transformoidusta bakteerik 1oonista eristettiin tällä tavoin 190 kloonia, jotka tridekanukleotidi1 la aloitetun cDNA:n kanssa antoivat positiivisen signaalin, so. noin 1 * geenipankin kaikista klooneista sisältää spesifisen cDDTTCTGGAACTG-sekvenssin.
Interferonispesifisten nukleiinihapposekvenssien osoittaminen rekombinantti-DNA-mo1ekyyleissä tapahtuu RNA-transfeeri-hybri- s 82072 disoimalla, eristämällä hybridit, restriktiokartoittama11 a ja sekvenssoima11 a nukleiinihapot. Muodostuneen interferoni-polypeptidin biologinen osoittaminen tapahtuu määrittämällä antiviraa1inen aktiivisuus ja interferonityypin määrittäminen immunologisin menetelmin.
Tällä tavoin eristetyt IFN-a2(Arg)-geenit voidaan tämän jälkeen ekspressiota varten viedä bakteereihin, mutta myös muihin organismeihin, kuten esimerkiksi hiivoihin, jolloin voidaan päästä noin jopa 104-kertaiseen spontaaniekspressioon, kun eteen kytketään promoottori yhdistelmänä ribosomien sitoutu-missekvenssin kanssa.
Seuraavat esimerkit selventävät keksintöä lähemmin:
Es imerkk i A
Sopivan solulinian valinta sellaisen Po1v(A)+RNA:n. .joka sisältää ihmisen iFN-a- .ia iFN-B-mRNA. tuottamiseksi:
Interferonin tuottamista varten indusoidaan kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä erilaisia ihmisen solulinjoja Sendai-virukse11 a ja 24 - 48 tunnin kuluttua määritetään solujen supernatanteista IFN-a- ja IFN-ö-pitoisuus neutraloimalla tyyppispesifisi11ä antiseerumeilla, a- ja S-inter-feronien saadut suhteelliset määrät eräissä testatuissa so 1u1injoissa on koottu taulukkoon sivulla 2. Tällöin osoittautuu, että esimerkiksi Nama1wa-so1ut tuottavat Sendai-virusindusoinnin jälkeen hieman yli 50 % IFN-a- ja noin 50 % asti IFN-Ö-interferonia.
Neutr a 1 i so i nt i test i suoritetaan seuraavasti: ;
Noin 10 interferoni-yksikköä Sendai-virukse11 a indusoitujen so 1 uvi1jemien supernatanteista ja seuraavia komponentteja τ 82072 inkuboitiin yhdessä 37®C:ssa 60 - 90 minuuttia: 1. Antiseerumi IFN-α-interferonia vastaan; loppulaimennus 1:100; (saatu: Research Resources Bransh, National Institutes of Allergy and Infections Diseases, Bethesda Md, USA).
2. Antiseerumi ihmisen B-FN-interferonia vastaan; loppulaimennus 2:300; (saatu: Dr. Y.H. Tan, University of Calgary, Kanda).
3. Komponenttien 1. ja 2. seos.
Inbuboinnin jälkeen määritettiin interferonin jäännösaktii-visuus plakki-reduktiotestissä (kts. Journal of Interferon Research £, painossa (1982)).
Esimerkki B
Polv(A)+RN:n. joka sisältää ihmisen IFN-α- ia IFN-B-mRNA. valmistaminen Sendai-viruksella indusoiduista Namalwa-soluista
Namalwa-solujen viljely ja indusointi Sendai-viruksella tapahtui kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (kts. Methods in Enzymology, Voi 78A. sivut 69 - 75 (1981), Academic Press,
New York). mRNA-valmisteen ajankohdaksi valittiin 9 tuntia (6 - 12 tuntia) Sendai-virusindusoinnin jälkeen, koska inter-feronispesifisen mRNA:n osuus saavuttaa maksimiarvon tämän ajan jälkeen.
Solut erotettiin sentrifugoimalla 20 minuuttia (1000 g), pestiin kerran NP-40-puskurissa (01,14 M NaCl, 1,5 nM MgCl, 10 mM tris HCl, pH 7,4) ja suspendoitiin uudelleen NP-40- 8 82072 puskuriin, joka sisälsi 0,5 % ei-ioni11ista detergenttiä NP-40 (Shell) ja 2 mg/ml hentoniittia. Pidettiin 5 minuuttia jäähauteella ja sen jälkeen solutumat pelletoitiin sentri-fugoimalla edellä kuvatulla tavalla, (RNA-pitoinen) syto-plasmajae (supernatantti), kun oli ensin lisätty 2 % SDS, 5 mM EDTA ja 50 mM tris-HC1-puskuria, pH 9, uutettiin kolme kertaa feno 1i-kloroformi11 a ja kerran k 1oroformi11 a ja tämän jälkeen RNA seostettiin alkoholilla. Poly(A)+RNA puhdistettiin kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (Proc. Natl. Acad.
Sei USA, £9, 1408 - 1412 (1972)) o 1igo(dT)-se 11u1oosa-kroma-tograafisesti ja erotettiin molekyy1ikoon perusteella sentri-fugoimalla 5-20 prosenttisessa sakkaroosigradientissa 10 mM natriumasetaattipuskurissa, pH 5,5, 1 mM EDTA (20 tuntia, 25000 kierr./min., Spinco SW 27-roottori) ja kerättiin yhteen molekyylit, joiden koko oli välillä 6 S (sedimentaatioyksikköä) ja 18 S (yksinkertaisuuden vuoksi käytetään nimitystä "12S-RNA") (kts. kuvion 1 vasen pystyrivi).
Interferoni-spesifisen mRNA:n (IFN-a ja IFN-B-mRNA) pitoisuus määritettiin mikroinjisoimal1 a "12S-RNA” Xenopus laevis-oosyytteihin (kts. J. Embryol . and Expre. Morph. 20., 404-414 (1968)) ja mittaamalla interferoniaktiivisuus oosyyttisuperna-tantissa. 1 pg insijoitua "12S-RNA" antoi tällöin keskimääräiseksi interferonitiitteriksi noin 1000 lE-yksikköä (International Interferoneinheit) laskettuna interferoni-standardista 69/19:
Prosentuaalinen interferoniakti i-visuus, jonka neut- "12S"-po1y(A)+RNA- Interferoni- raloi seuraavien määrä Sendai-viruk- yksikköja/ml interferonien vessel la indusoiduista oosyyttisuper- täinen antiseerumi
Nama 1wa-so1uista__natantt i__IFNa IFNa + IFN-6 1 pg 1000 ’ 80 2 98 9 82072
Noin 80 % tästä aktiivisuudesta voitiin siten neutraloida ct-tyyppisen interferonin vastaisella antiseerumilla, kun taas koko aktiivisuus voitiin neutraloida vain anti-α- ja anti-ö-interferoni-antiseerumi n seoksella.
Esimerkki C
Nama1wa-cDNA-k1ooni-pankin valmistaminen
Yksisäikeisen cDNA:n valmistamiseen käytettiin matriisina po1y(A)+RNA:a, jonka molekyylikoko oli välillä 6-18S ("125-RNA”) (kts. esimerkki B), jolloin 40 pg/ml po1y(A)+RNA seoksessa, jonka koostumus oli 50 mM tris-HCl, pH 8,3, 10 MgCl2, 100 mM «Cl, 1 mM dNTPs, 0,4 mM DTT, 4 mM Na-pyrofosfaatti, 20 Mm/ml oiigo(dT)12-ia (PL-Biochemicals) ja 25 pg/ml aktino-mysiini D, ja 100 yksikköä/ml AMV-käänteistranskriptaasia (Dr. J. Beard, Life Sciences, Inc. 1590,5 49th Street, South, St. Petersburg, Florida 33707, USA) inkuboitiin 45 minuuttia 44 - 45°C:ssa. Tämän jälkeen RNA-DNA-hybridin RNA-osa poistettiin inkuboimalla yksi tunti 0,3 M natriumhydroksidissa 50°C:ssa ja tämän jälkeen yksisäkeinen cDNA neutraloitiin ja seostettiin etanolilla.
Yksisäkeisen DNA:n kanssa komplementaarinen toinen DNA-säie syntetisoitiin seuraavissa olosuhteissa: 30 pg/ml yksisäi-keistä cDNA seoksessa, jonka koostumus oli 0,12 M kalium-fosfaattipuskuri, pH 6,9, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs, ja 300 yksikköä/ml DNA polymeraasia I (Boehringer Mannheim) inkuboitiin 6 tuntia 15°C:ssa, minkä jälkeen uutettiin fenolilla ja seostettiin etanolilla.
Näin valmistettu kaksisäikeinen cDNA-seos modifoitiin säikeen kummassakin päässä siten, että yksittäissäikeiden esiinpis-tävät alueet poistettiin. Tätä varten DNA seoksessa, jonka Ό 82072 koostumus oli 0,3 m NaCl, 30 mM natriumasetaatti, pH 4,5, 1 mM ZnCl2, ja 1250 yksikköä/ml S1-nekloaasia (Miles Laboratories) inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen uutettiin fenolilla ja seostettiin etanolilla. Näin valmistettu "tasapäinen" kaksisäikeinen cONA erotettiin 5-20 %:lla sakkaroosigradienti11 a 10 mM natriumasetaattipuskurissa, pH 5,5, 1 mM EDTA, ja eristettiin jokainen jae, jonka pituus oli vähintään 600 emäsparia.
Tästä cDNA-seoksesta pidennettiin 0,5 pg noin 15 nukleotidilla liittämällä kummankin säikeen 3'-päähän oligodeoksi-sytidiiniä inkuboimalla 4 minuuttia 37°C:ssa seoksessa, jonka koostumus oli 140 mM ka 1iumkakody1aatti, pH 6,9, 30 mM tris-HCl, pH 6,9, 2 mM C0CI2, 0,1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 5 μΜ dCTP, kun mukana oli 500 yksikköä/ml terminaalista transferaasia. Tämän vaiheen avulla saadaan valmiiksi cDNA-seos, joka on rekombinanttimo1ekyy1in yksi komponentti (kts. kuvion 1 vasen laita).
Toisena komponenttina käytettiin Escherichia coli-plasmidia pBR322, joka on ympyrän muotoinen kaksisäikeinen DNA-mole-kyyli. 2 pg pBR322-p1asmidia 1inearisoitiin restriktioendo-nukleaasilla Pst I ja modifioitiin samalla tavoin kuin cDNA-seos liittämällä molekyylin 3’-päihin oiigodeoksiguanidi inia siten, että saatiin esiinpistävät o 1igodeoksiguanidiinipäät (kuvion 1 oikea sivu). Stabiilit kaksisäikeiset DNA-alueet voidaan muodostaa näistä oiigodeoksiguanidiinipäistä emäs-parittamalla cDNA-molekyy1 in vapaiden o 1igodeoksisytidiini-päiden kanssa. Tätä varten inkuboitiin tämän reaktion kumpaakin komponenttia 10 minuuttia 65°C:ssa, tämän jälkeen 2,5 tuntia 45°C:ssa ja sen jälkeen yön yli 37°C:ssa seoksessa, jonka koostumus oli 0,1 m NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM tris-HCL, pH 8.
11 82072 Tällä menetelmällä regeneroidaan Pst I restriktioendonuk1e-aasin lohkaisukohdat ja voidaan käyttää myöhemmin hyödyksi cDNA-inserttien poistamiseen vektorihybridistä.
Tästä cDNA-seoksesta pidennettiin 0,5 pg noin 15 nukleotidilla liittämällä kummankin säikeen 3’-päähän oligodeoksi-sytidiiniä inkuboimalla 4 minuuttia 37°C:ssa, jonka koostumus oli 140 mM ka 1iumkakody1aatti, pH 6,9, 30 mM tris-HCl, pH 6,9, 2 mM CoCl, 0,1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 5 pM dCTP, kun mukana oli 500 yksikköä/ml terminaalista transferaasia. Tämän vaiheen avulla saadaan valmiiksi cDNA-seos, joka on rekombinanttimo1ekyy1 in yksi komponentti (kts. kuvion 1 vasen laita).
Toisena komponenttina käytettiin Escherichia co1i-p1asmidia pBR322, joka on ympyrän muotoinen kaksisäikeinen DNA-molekyy1i. 2 pg pBR322-plasmidia 1inearisoitiin restriktioendonukleaa-silla Pst I ja modifioitiin samalla tavoin kun cDNA-seos liittämällä molekyylin 3’-päihin oiigodeoksiguanidi in ia siten, että saatiin esiinpistävät oiigodeoksiguanidiinipäät (kuvion 1 oikea sivu). Stabiilit kaksisäikeiset DNA-alueet voidaan muodostaa näistä oiigodeoksiguanidiinipäistä emäsparittomalla cDNA-mo1ekyy1in vapaiden o 1igodeoksisytidiinipäiden kanssa.
Tätä varten inkuboitiin tämän reaktion kumpaakin komponenttia 10 minuuttia 65°C:ssa, tämän jälkeen 2,5 tuntia 45°C:ssa ja sen jälkeen yön yli 37°C:ssa seoksessa, jonka koostumus oli 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM tris-HCl, pH 8.
Tällä menetelmällä regeneroidaan Pst I restriktioendonuk-leaasin lohkaisukohdat ja voidaan käyttää myöhemmin hyödyksi cDNA-inserttien poistamiseen vektorihybridistä.
Tällä menetelmällä pBR322-plasmidista ja Namalwa-cDNA:sta valmistetut hybridip1asmidit käytettiin Escherichia coli 12 82072 HB 101 bakteerin transformoimiseen kirjallisuudesta tunnetulla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei, USA 69., 2110-2114 (1972)). Tällä menetelmällä saatiin 30 000 kloonitransformoitua E.coli solua, jotka yksitellen laitettiin mikrotiit-terilevyihin.
Esimerkki D
IFN-a- ia IFN-B-DNA-sekvenssien suhteen spesifisen hybridi-soi nt i koett imen vaImistamiiiiiinen käyttämällä synteettistä 5'dCCTTCTQQAACTQ3’-tridekanuk1eotidia Tämän keksinnön pohjana oleva, transformoitujen E.coli kloonien, jotka sisältävät interferonisekvenssejä, selektio-menetelmä perustuu siihen, että käytetään synteettistä trideka-nukleotidia, jolla on sekvenssi: 5'dCCTTCTGGAACTG3'. Tämä sekvenssi esittää pisintä, katkaisematonta DNA-segmenttiä, jossa esiintyy homologiaa useimpien IFN-a-geenien ja IFN-B-geenin välillä. Tridekanukleotidin synteesi on jo kuvattu. Tridekanukleotidiseos, jonka koostumus oli 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCli, 5 mM DTT, 0,1 mM spermidiini, 1 pm 32p— -ATP, leimattiin käyttämällä 60 yksikköä/ml T4-poly-nukleotidikinaasia (Bethesda Research Laboratories) 30 minuutin ajan 37°C:ssa niin, että molekyylin 5'-päässä saatiin spesifiseksi aktiivisuudeksi noin 500 Ci/mMol.
Tätä päässä leimattua tridekanukleotidia käytettiin (yksi-säikeisen) cDNA-synteesin primeerinä, jolloin matriisina toimi poly(A)+RNA, joka oli saatu Sendai-viruksel1 a indusoiduista Namalwa-so1uista (kts. esimerkki B). Reaktio suoritettiin käyttämällä 5 - 10 kertaista primeerin mooliy1imäärää RNA:han verrattuna seoksessa, jonka koostumus oli 50 mM tris-HCl, pH 8,3, 60 mM KC1, 5 mM DTT, 50 pg/ml aktinomysiini D, 4 mM MgCl2j 4 mM natriumpyrofosfaatti, 0,5 mM dNTPs, ja 100 yksikköä/ml AMV käänteistranskriptaasia 90 minuutin 13 82072 aikana 37°C:ssa. RNA-DNA-hybridin RNA-osa poistettiin inku-boimalla yksi tunti 0,3 M natriumhydroksidissa 50°C:ssa ja sen jälkeen neutraloitiin 0,3 M etikkahapolla, jolloin saatiin hybridisointikoettimena käyttökelpoista cDNA:a. Tämä menetelmä on esitetty kaavioi 1isesti kuviossa 2. Näin valmistetussa cDNA:ssa on siten radioaktiivinen leimaus vain niissä molekyyleissä, jotka on syntetisoitu lähtemällä primeerinä käytetystä interferonispesifisestä tridekanukleotidista, ja sillä on siten suuri spesifisyys, jolla interferoni-DNA-sekvenssi voidaan tunnistaa hybridisoinnissa.
Esimerkki E
Pesäkkeiden hvbridi sointi tridekanuk1eotidi11 a priimatulla cDNA:11a Tässä esitettyä menetelmää käytetään tunnistamaan ne transformoidut bakteerikloonit, jotka sisältävät hybridip1asmideja, joissa on tridekanukleotidin kanssa komplementaarisia DNA-sekvenssejä. Tätä varten yksittäin kloonattujen transformant-tien solut siirrettiin 22 x 15 cm nitrosel1uloosasuodattime 1 le (huokoskoko 0,45 pm, Millipore tai Schleicher & Schuell), kasvatettiin suodattimi 11 a halkaisijaltaan 2 mm pesäkekokoon ja esikäsiteltiin pesäkehybridisointia varten kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72. 3961-3965 (1975) ja Analytical Biochemistry 98., 60 - 63 (1979)). Nukleiinihappohybridisointi päässä leimatulla cDNA:lla (kts. esimerkki D) suoritettiin 48 tunnin aikana 37°C:ssa seoksessa, jonka koostumus oli 50 % formamidi, 4 x SET = 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM tris-HCl, pH 8), 1 x Denhardt’in liuos (0,02 % BSA, 0,02 % Ficoll, 0,02 % po1yvinyy1ipyrro1i-doni), 0,5 mg/ml denaturoitu ja pilkottu lohisperma-DNA,
0,1 % natriumpyrofosfaatti ja 0,1 % SDS. Tämän jälkeen suodatinta pestiin useita tunteja (6-8 tuntia) 20 - 25°C:ssa liuoksessa, jonka koostumus oli 50 % formamidia ja 0,2 x SSC
14 82072 (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumasetaatti), minkä jälkeen huuhdeltiin 1 x SSC-1iuokseΠa. Suodatin kuivattiin 20 - 25°C:ssa ja valotettiin -70°C:ssa röntgenfiImi 11ä (Kodak XP). Kuviossa 3 on esitetty tyypillinen tällaisen kokeen tulos: Kuvatulla pinnalla kasvatettiin 1536 bakteeri-pesäkettä ja seulottiin pesäkehybridisoinnin avulla. Nuolella on osoitettu eräs esimerkki transformoidusta bakteerik 1oonista, jonka hybridiplasmidi-DNA antaa signaalin radioaktiivisen koettimen kanssa. Seulomalla eristettiin noin 13000:sta transformoidusta bakteeripesäkkeesta yhteensä 190 kloonia, jotka antoivat positiivisen signaalin Sendai-virukse11 a indusoiduista Nama1wa-so1uista saadun, tridekanuk1eotidi11 a aloitetun cDNA:n kanssa, nämä koottiin kahdelle mikrotiitteri1evy11 e (P1 ja P2). Tämän mukaan noin 1 % kloonipankin kaikista klooneista sisälsi sepsifisen dCCTTCTGGAACTG-sekvenss i n.
Esimerkki F
Tr i dekanuk 1 eot i d i 1 1 a priimatun cDNA : n kanssa hvdr ibisoitu.ien kloonien sekvenssikomp1eksisuuden analyysi
Niiden 190 tridekanuk1eotidi-positiivisen kloonin joukossa olevien kloonien, joilla on erilainen sekvenssi, lukumäärän määrittämiseksi (sekvenssikomp1eksisuus) (kts. esimerkki E) eristettiin eri klooneista cDNA-insertit pilkkomalla Pst I-entsyymi 11ä (kts. esimerkki C), elektroforesoimalla 0,8 % agaroosigee 1issä ja eluoimalla halutut vyöhykkeet (leikkaamalla vyöhykkeen sisältävä geelipala ja eluoimalla e 1ektroforeet-tisesti DNA agaroosista dia 1yysi1etkussa) ja 32P-1 eimattiin Nick-trans1atoima11 a kirjallisuudesta tunnetulla menetelmällä (J. Mol. Biol. 113. 237 - 251 (1977)). Tridekanuk1eotidiposi-tiivisten kloonien jäljenteet (mikrotiitteri1evyt P1 ja P2) ja mielivaltaisesti valittu mikrotiitterilevy (E52) siirrettiin nitroselluloosafiltteri1 le, kasvatettiin, esikäsiteltiin pesäkehybridisointia varten (kts. esimerkki E) ja hybridisoi- 15 82072 tiin erilaisilla 32P-leimatui1 la cDNA-insertei1lä. Hybridi-sointi suoritettiin samalla tavoin kuin esimerkissä E paitsi, että hybridisointi1 luokseen lisättiin myös 50 pg/ml poly(U) ja 10 Mg/ml poly(l) : poly(C) ja hybridi soinnin jälkeen suodatin pestiin liuoksessa, jonka koostumus oli 50 % form-amidi ja 1 x SSC. Klooni P1A6 analysoitiin tällä tavoin ja hybridisoitiin vain itsensä kanssa.
Esimerkk i__G
RNA-transfeeri-hybridisointi
Jotta voitaisiin havaita, sisältääkö jokin määrätty trideka-nuk1eotidi-positiivinen bakteeriklooni mahdollisesti inter-feronisekvenssejä, testattiin, indusoituuko sen plasmidi-DNA Nama1wa-so1uissa Sendai-virukse11 a indusoidun mRNA:n kanssa. Tätä varten eristettiin esimerkissä B kuvatulla tavalla poly(A)+RNA indusoiduista ja indusoimattomista Namalwa-soluista, denaturoitiin inkuboimalla yksi tunti 50°C:ssa seoksessa, jonka koostumus oli 1 M glyoksaali, 50 % DMSO, 10 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7, erotettiin 1,4-prosent-tisella agaroosigeeli1lä, siirrettiin kirjallisuudesta tunnetulla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77., 5201-5205 (1980)) nitroselluloosasuodattimelle ja hybridisoitiin Nick-translatoimalla 32P-1eimatun (kts. esimerkki F) plasmidi-DNA:n kanssa. Indusoidusta geenistä peräisin oleva plasmidi-DNA hybridisoituu tässä koejärjestelyssä vain indusoiduista soluista saadun RNA:n kanssa, mutta ei indusoimattomista soluista saadun RNA:n kanssa. Kuvassa 4 on esitetty erään tällaisen kokeen autoradiografia: Indusoitu RNA ("i") on aina parin vasempana osana ja indusoimaton RNA ("n") oikeana osana.
Hybridisointiin käytetty plasmidi-DNA, P1A6 hybridisoituu vain indusoiduista soluista saadun RNA:n kanssa. P1A6:n kanssa hybridisoituvan RNA:n mo 1ekyy1ikoko on 12-14S. Plasmidin P1A6 16 82072 tutkimista jatkettiin sen vuoksi edelleen, jotta voitaisiin yksiselitteisesti vahvistaa sen interferonipitoisuus.
Esimerkki H
I FN-ct-tv ypp i sen kloonin P1A6 analyysi
Klooni P1 A6 hybridisoituu virus-indusoidun Nama1wa-RNA:n kanssa alueella 12-14S (kuvattu esimerkissä G). Se sisältää noin 900 emäsparia cDNA-insertin, jossa restriktioana1yysin perusteella ei ole mitään 1ohkaisukohtia entsyymeille Bam Hl,
Bgl I, Eco Rl, Hin dill, Pst I ja Pvu II (kts. kuvio 5).
Todistus siitä, että klooni P1A6 sisältää IFN-a-sekvenssejä, saatiin jälleen DNA-sekvenssiana 1yysin avulla: Kloonin P1A6 cDNA-insertin sekvenssi selvitettiin inserttiä rajoittavasta Pst I - 1ohkaisukohdasta käsin sisäänpäin (kts. kuvio 6) ja verrattiin Goeddel'in et ai. (nature 290. 20-26 (1981)) kuvaamien I FN-ct-sekvenss i en kanssa. Klooni P1A6 osoittautui 49 emäsparia lyhyemmäksi kloonin LelFN C muunnokseksi.
Po 1y(A)-sekvenssien mukanaolo kloonin P1A6 3'-päässä viittaa siihen, että klooni P1A6 on peräisin lyhyemmästä mRNA:sta kuin julkaistu klooni LelFN C. LelFN C-proteiinia koodaava alue on kuitenkin mukana täydellisesti.
Esimerkki I
Toisen I FN-a-tvvppisen kloonin (1F7) identifiointi .ia analyysi
Klooni P1A6 oli ainoa I FN-ct-tyypp i nen klooni, joka voitiin tunnistaa 190 tridekanuk1eotidi-positiivisen kloonin kokoelmasta (kts. esimerkki E). Jotta saataisiin muita IFN-a-tyyp-pisiä klooneja hybridisoitiin 1800 alkuperäisen cDNA-klooni-pankin (esimerkki C) kloonia pesäkehybridisoinni11 a (kuten on kuvattu esimerkissä F) kloonin P1A6 cDNA-insertin kanssa. Tällä
II
it 82072 tavoin löydettiin vielä yksi IFN-e-klooni (klooni 1F7). Kloonin 1F7 cDNA-insert in restriktibana1yysi ja osittain DNA-sekven-sointi osoitti, että 1F7 ja 175 emäsparia pidempi kloonityypin LelFN A (Goeddel et ai., kts. edellä) muunnos. 1F7 sisältää kuten myös LelFN A 2 lohkaisukohtaa entsyymeille Bgl II ja Pvu II (kuvio 5); selvitetyt DNA-sekvenssit insertin 5'- ja 3'-päissä on annettu kuviossa 6.
Lisäksi analysoitiin osia IFN-a-tyyppisen kloonin (1F7) DNA-sekvenssistä Universa1-Primer-1 aittee11 a dideoksimene-telmällä (kts. Messing et ai., Nuc. Acid. Res. 9., 309 (1981) ja Gardner, R.C. et ai., Nuc. Acid. Res. 9., 2871 ( 1981) asemille 120 - 327 saatiin seuraava osasekvenssi:
.....CCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACG
TGAXRRRGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTCAAACCA TCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGAC TCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTA.....
verrattuna IFN-A-tyypin kirjallisuudesta tunnettuun sekvenssiin (kts. D.V. Goeddel et ai., Nature 290. 20 (1981)) on IFN-a-tyyppisen kloonin (1F7) uudella DNA-sekvenssi11ä nukleotidien no. 120-327 alueella seuraavat erot:
Kohdissa 137 ja 170 on kummallakin kertaa nukleotidit A korvattu nukleotidilla G.
Esimerkki J
Interferoniaktiivisuus hvbridiplasmidi1 la 1F7 transformoitujen E.coli HB 101 bakteereiden Ivsaateissa
Plasmideilla P1A6 tai 1F7 transformoitujen bakteerivi1jelmien lysaateista määritettiin biologisesti atkviisen interferonin pitoisuus. Tätä varten kasvatettiin 100 ml bakteerivi1jelmää L-Broth-a1ustassa optiseen tiheyteen 0,6 - 0,8 asti, pelletoi- is 82072 tiin sentrifugoima11 a 10 minuuttia (700 kierr ./min.), pestiin 1 x 50 mM tris-HCl-puskuriSsa, pH 8, 30 mM Nad, ja lopuksi suspendoitiin 1,5 ml:aan samaa puskuria. Inkuboitiin 30 minuuttia jäillä yhdessä 1 mg/ml lysotsyymin kanssa, bakteerit pakastettiin ja sulatettiin viisi kertaa ja tämän jälkeen so 1ujäännökset poistettiin sentrifugoima11 a yksi tunti nopeudella 40000 kierr./min. Supernatantti sterii1isuodatettiin ja testattiin interferoniaktiivisuus p1akkireduktiotestissä. Tällä tavoin saaduista kloonin 1F7 lysaateista voitiin osoittaa noin 500 yksikköä interferonia ml:ssa; kloonista 1A6 ei tässä testissä saatu mitään aktiivisuutta, mikä luultavasti voi johtua insertin toisenlaisesta orientoitumisesta p1asmidivektorissa.
Esimerkki K
Kloonin 1F7 koodaaman interferonitvvpin ekspression parantaminen
Jotta geeni saataisiin ekspressoitumaan hyvin, on DNA:n täytettävä kolme edellytystä: Ensiksikin geenin edessä on oltava promoottori (RNA-po1ymeraasin sitoutumiskohta), toiseksi luetun RNA:n on ennen translaation aloituskodonia omattava ribosomien sitoutumissekvenssi (RBS) ja kolmanneksi RBS:n ja a 1 oituskodonin välisen etäisyyden on oltava sopivan : pituinen.
Kloonin 1F7 koodaaman interferonin ekspressiota varten otettiin promoottorisekvenssiksi Serratia marcescens bakteerin trypto-faanioperonin kirjallisuudesta tunnettu promoottori (Nature 276 . 684 - 689 ( 1978)) ja ribosomien sitoutumissekvenssiksi kirjallisuudesta tunnettu DNA-sekvenssi (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78_, 5543-5548 ( 1981 )). RBS: n ja kloonin 1F7 aloituskodonin välisen optimaalisen etäisyyden selville saamiseksi valittiin seuraava strategia: 1F7-cDNA-sekvenssi pilkottiin lyhyeksi
II
19 82072 kaksisäikeise 1 1 e DNA: 11 e spesifisellä BAL 31 eksonuk1eaasi11 a, jolloin saatiin eripituisten molekyylien seos. Tämän jälkeen nämä molekyylit ligatoitiin synteettisten yhdistäjäsekvenssien avulla sopivalla tavalla "ekspressioplasmidiksi", so. plasmi-diksi, joka sisältää promoottorin ja RBS:n. E.coli HB 101 transformoitiin tällä plasmidilla ja yksittäisistä transfor-manteista testattiin interferonin tuottokyky.
Koe suoritettiin yksityiskohtaisesti seuraavasti: 0,5 - 1 ug 1F7-inserttiä ja 0,5 yksikköä BAL-31-entsyymiä (Bethesda Research Laboratories) inkuboitiin 3 minuuttia 30°C:ssa 100 piissä seosta, jonka koostumus oli 20 mM tris-HCl, pH 8,1, 0,6 M NaC1, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2, 1 mM EDTA. Tämän jälkeen reaktio lopetettiin lisäämällä 300 μΐ 15 mM EDTA, pH 7,8,lämmitettiin 10 minuuttia 65°C:ssa, uutettiin fenolilla ja eetterillä ja seostettiin etanolilla. Sakka ja 30 - 60 pMol fosfory-loituja Hin dl I I-yhdistäjiä (Bethesda Research Laboratories) otettiin 10 pl:aan seosta, jonka koostumus oli .70 mM tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,04 mM ATP, lisättiin 0,5-1 yksikköä T4-ligaasia (Bethesda Research Laboratories) ja inkuboitiin yön yli 14°C:ssa. Reaktio lopetettiin kuumentamalla 10 minuuttia 65°C:ssa, lisättiin 2 M ammoniumasetaattia ja inter-feronigeenistä puhdistettiin pois 1igatoitumattoman yhdistäjät saostamalla 0,6 tilavuudella isopropanolia. Sakka liuotettiin 30-50 p1:aan seosta, jonka koostumus oli 33 mM tris-asetaat-ti, pH 7,9, 66 mM K-asetaatti, 10 mM Mg-asetaatti, 100 ug/ml BSA ja pilkottiin 30 - 50 yksiköllä Hin dl II entsyymiä 2-3 tuntia. Reaktio lopetettiin kuumentamalla 10 minuuttia 65°C:ssa, lisättiin 2 M ammoniumasetaattia ja sen jälkeen interferonigeeni seostettiin 0,6 tilavuudella isopropanolia. Sakkaa liuotettiin 10 pilaan seosta, jonka koostumus oli 70 mM tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 mM ATP, ja ligatoitiin yön aikana 14°C:ssa 0,2 pg:n kanssa Hin dI I I - 1inearisoi-tua, fosfataasikäsiteltyä ekspressiop1asmidia pER103 käyttä 20 82072 mällä apuna 10-2 yksikköä T4-ligaasia. pER103 on pBR322-johdos, joka käsittää S.marcescens-bakteerin tryptofaanioperonin promoottorisekvenssin ja kirjallisuudesta tunnetun RBS (kts. edellä); se voidaan linearisoida RBS:n läheisyydessä Hin dl II-entsyymillä. Näin saatuja plasmideja käytettiin E.coli HB 101 bakteereiden transformointiin ja yksittäisten transformanttien interferonin tuottokyky testattiin esimerkissä J kuvatulla tavalla. Tulokseksi saatiin, että interferoniekspressio oli kasvanut noin 104-kertaiseen arvoon spontaaniekspressiosta.
Seuraavat mikro-organismit ja rekombinantti-DNA-molekyylit talletettiin 17.5.1982 tai 1etuskokoelmaan "Deutsche Sammlung von Mikro-Organismen, Griesebachstrasse 8, 3400 Göttingen" DSM-numeroi11 a 2362 ( 1F7) ja 2363 (P1A6) ja ovat saatavissa Budapestin sopimuksen mukaisesti.
Käytetyt käsitteet ja lyhennykset (d)A: (Deoksi) adenosiini
Antiseerumi: Seerumi, joka sisältää vasta-aineen ATP: Adenosiinitrifosfaatti
Autoradiografia: Radioaktiivisuuden fotograafinen osoitus- menetelmä
Emäspari: 2-komp1ementaarista nukleotidia, esim.
A-T, G-C
Tasapäät: Kaksisäikeisen DNA-molekyy1 in täysin emäs- parilliset päät, erona esiinpistävistä yksittäissäikeiden päistä BSA: Häränseerumialbumiini (d)C: (Deoksi) sytidiini
cDNA: RNA:n kanssa komplementaarinen DNA
cDNA-pooli: Sekvenssiltään erilaisten c-deoksiribo- nukleiinihappojen (cDNA) seos 21 82072
Koodata: Sisältää jostakin informaatiosta; DNA sisältää nukleotidisekvenssissä informaation proteiinin aminohapposekvenssistä DMSO: Dimetyylisulfoksidi DNA: Deoksiribonukleiinihappo DNA-sekvenssi: Lineaarinen nukleotidien järjestys, jotka on liitetty fosfodiesteriyhdistei1lä DTT: Ditiotreitoii EDTA: Etyleenidinitrilotetraetikkahappo E1ektroforeesi: (DNA- tai RNA-) molekyylien erottaminen molekyylien koon perusteella sähkökentässä
Ekspressio: Geenin informaation siirtäminen mRNA-mole- kyyliin transkriptoimal1 a ja edelleen poly-peptidiin (proteiiniin) translaation kautta
Suodatinhybridi- Nukleiinihappojen hybridioinsti, jolloin sointi: toinen komponentti on sidottu suodattimeen (d)G: (Deoksi) guanosiini
Geeni: DNA-pala, joka sisältää informaation tietystä transkriptistä (RNA-molekyy1i), joka myöhemmin voidaan kääntää proteiiniksi
Geeniperhe: Geenien, jotka koodaavat lähisukuisia tuot teita (alatyyppejä), muodostama perhe
Geentituote: RNA(transkripti), proteiini (translaatio- tuote)
Gradientti: Kts. sakkaroosigradientti
Homologia (DNA- DNA-sekvenssien välinen lähisukuisuus, mikä sekvenssien): ilmenee samankaltaisena nuk1eotidi järjes tyksenä
Hybridi: Kahden, keskenään ainakin osittain komple mentaarisen DNA-sftikeen stabiili kompleksi
Hybridisointi Keskenään komplementaaristen yksittäisten (nukleiinihap- DNA- tai RNA-säikeiden välisten stabiilien pojen): kompleksien muodostaminen 22 82072
Hybridi so inti- Radioaktiivisesti leimattu nukleiinihappo, koetin: jota käytetään sen kanssa komplementaaris ten sekvenssien löytämiseen
Hybridiplasmidi: Plasmidi, joka sisältää vieraasta organis mista peräisin olevan DNA-palan I : Inosi ini IFN-α: Leukosyytti - interferoni IFN-S: Fibroblasti-interferoni IFN-)^: Immuuni - interferoni
In vitro: Reaktioastiassa
Indusointi (intei— Interferonisynteesiä varten suoritettu feroni tuoton): solujen kiihottaminen käsittelemällä induk- toreilla (viruksilla, kaks isäikeisi1lä RNA-molekyylei1lä, mitogeenei11 a)
Aloituskodoni: mRNA-molekyy1 in AUQ-sekvenssi, joka antaa signaalin translaation aloittamisesta
Aloituskompleksi: Käänteistranskriptaasin yhdiste mRNA- molekyy 1 in ja primeerin kanssa, joka mahdollistaa cDNA-synteesin alkamisen
Insertti, cDNA- Vieraan DNA:n (esim. cDNA:n) pala, joka on insertti: hybridiplasmidissa
Klooni: Bakteeripesäke, joka lähtee yhdestä bakteer i sta
Kloonipankki, Bakteerikloonien, jotka kaikki sisältävät cDNA-kloonipankki: hybridiplasmidin, jossa on cDNA-insertti, kokoelma
Kloonata: Kloonien valmistaminen; useimmiten ymmär retään sellaisten kloonien valmistamista, jotka sisältävät hybridiplasmidin
Pesäkehybridi- Hybridisointi suodattimeen sidottujen sointi: denaturoitujen bakteeripesäkkäiden kanssa
Komplementaarinen: Toisiinsa sopiva (nukleotidi DNA-molekyy- lissä: A on komplementaarinen T:n kanssa, G on komp1ementaarinen C:n kanssa)
II
23 82072
Ristihybridi- Ei-identtisten, mutta homologisten DNA- sointi: sekvenssien välinen hybridisointi
Ligatoida: DNA-sekvenssien kovalentti yhdistäminen 1igaasi-entsyymin avulla
Mikrotiitterilevy: Levy, jossa on 96 syvennystä, jotka on
karakterisoitu koordinaateilla 1 - 12 ja A-Z
Mitogeeni: Aine, joka kiihottaa solut mitoosiin (solun jakaantumiseen)
Kloonata moleku- laarisesti: Kts. kloonata
mRNA: Lähetti-RNA eli proteiinia koodaava RNA
Neutralointi: Antigeenin inaktivointi vasta-aineen avulla dNTPs: 4 nukleotidin, so. dATP, dTTP, dCTG, dGTP, seos
Nukleotidi: DNA:n tai RNA:n peruskivi; (d)A, (d)C,
(d)G, (d)T
01igonukleotidi: Pienet, keskenään fosfodiesterei1lä yhdistetyt nukleotidit
Oligo(C): C-ryhmien, jotka on liitetty fosfodi- esterIyhdistei1lä, oligomeeri
Oligo(dT): dT-ryhm1en, jotka on liitetty fosfodi- esteriyhdistei1lä, oligomeeri
Oligo(dT)- Selluloosaan sidotut oiigo(dT)-ryhmät; selluloosa: käytetään poly(A)+RNA-molekyy1 ien kromato- grafoimiseksi P|pES: Piperatsi ini-Ν,Ν’-bis(2-etaanisu1fonihappo)
Plasmidi: Ympyrän muotoinen, ekstrakromosomaalinen bakteeri-DNA, joka replikoituu itsenäisesti
Poly(A) tai (dA): A- tai dA-ryhmien, jotka on liitetty fosfodiesteriyhdistei1lä, polymeeri
Poly(A)+RNA: mRNA, jossa nukleiinihapposekvenssin 3'- päässä on homopolymeerinen poly(A)-alue 24 82072
Poly(C) tai (dc): C- tai dC-ryhmien, jotka on liitetty fosfodiesteriyhdistei1lä, polymeeri
Po ly(I): l-ryhmien, jotka on liitetty fosfodi- esteriyhdistei1lä, polymeeri
Po 1y(I):po1y(C): Kaksisäikeinen nukleiinihappo, jonka säikeet ovat poly(|) ja poly(C)
Poly(U): U-ryhmien, jotka on liitetty fosfodi- esteriyhdistei1ä, polymeeri
Primeeri: 01igonukleotidi, joka on komplementaarinen sen RNA-molekyylin osan kanssa, josta lähtien tapahtuu cDNA-synteesi
Koetin: Kts. hybridisointikoetin
Promoottori: DNA-sekvenssi, johon RNA-po1ymeeri sitoutuu RBS: Kts. ribosomien sitoutumissekvenssi
Rekombinantti“DNA: DNA~sekvenssi, joka muodostuu alkuperältään erilaisista DNA-paloista, jotka on liitetty toisiinsa in vitro
Rep 1i ko i nt i (DNA:n): DNA-mo1ekyy1in kahdentuminen
Restriktio- DNA-molekyy1 in kartoittaminen restriktio- analyysi: endonukleaasien katkaisukohtien suhteen
Restriktioendo- Entsyymi, joka katkaisee DNA-kaksoissäikeen nukleaasi: määrätyn DNA-sekvenssin kohdalla
Restr ikt iokar- toitus: Kts. restriktioanalyysi Käänteistrans- cDNA-kopion valmistaminen, jossa matriisina kriptio: on RNA-molekyyli ja primeerinä oligonukleo- t i d i
Ribosomien sitoutumissekvenssi: mRNA:n se osa, johon ribosomi voi sitoutua RNA: Ribonukleiinihappo RNA-polymeraasi: Entsyymi, joka voi syntetisoida DNA:n kanssa komplementaarisen RNA-säikeen 25 8 2 0 7 2
Sakkaroosi- Keino, jolla (RNA-)molekyy1 ien seos ero- gradientti: tetaan koon perusteella SOS: Natriumdodekyy1isulfaatti
Seulonta: Etsiminen tietyn ominaisuuden suhteen
Sekvenssin TietyssÄ DNA-määrässä olevien laadulli- kompleksisuus: sesti erilaisten DNA-sekvenssien lukumäärää ilmoittava arvo
Alatyyppi: Kts. geeniperhe (d)T: (Deoksi) tymidiini
Transformantti: Bakteeri, johon transformoimalla on lisätty vierasta DNA:a
Transformaatio: Vieraan DNA:n sulkeminen bakteereihin
Transkriptio: mRNA:n kopiointi sen kanssa kömpiementaari- sestä DNA-sekvenssistä
Translaatio: Informaation siirtäminen mRNA:sta poly- peptidiin (translaatiotuote)
Tridekanukleotidi: 01igonukleotidi, jossa on 13 nukleotidi- komponenttia
Tridekanukleotidi- positiivinen: Hybridisoitua tridekanukleotidin kanssa
Tr is: Trishydrokslmetyy1iaminometaani U: Uridiini
Vektori: Välittäjä, jolla vieras DNA suljetaan bakteereihin, useimmiten plasmidi
Vektorihybridi: Kts. hybridiplasmidi 26 82072
Kuvat lyhyesti Kuvio 1: esittää kaavioi 1isesti cDNA-k 1oonipankin valmistamista.
Kuvio 2: esittää kaavio 11isesti hybridisointikoettimena käytettävän cDNA:n valmistamista, joka on rikastettu IFN-a- ja IFN-B-spesifisten DNA-sekvenssiensä määrän suhteen käyttämällä spesifisiä tridekanukleotidi-primeeriä.
Kuvio 3: esittää tuloksen, joka on saatu pesäkehybridisoima11 a klooni-pankki Nama1wa-so 1uista saadun tridekanuk1eotidi-insertin cDNA:n kanssa. Kuvassa on autoradiografia nitrose11u1oosa-suodattimesta, jossa on 1536 eri kloonia. Nuolella on esitetty eräs esimerkki tridekanu1eotidi-positiivisesta kloonista.
Kuvio 4 : esittää autoradiograf iaa, jossa indusoiduista ja indusoimat-tomista Nama1wa-so1uista saatu poly(A)+RNA on suodatinhybridi-soitu useiden plasm idin kanssa. Virusi nduso idut po1y(A)+RNA ("i" kunkin parin vasempana osana) ja po1y(A)♦RNA molekyylit, jotka oli saatu indusoimattomista Namalwa-so1uista ("n" kunkin parin oikeana osana), erotettiin mo 1ekyy1ikoon perusteella e 1ektroforesoima11 a ennen siirtämistä nitrose11u1oosasuodat-timelle, minkä jälkeen suodatin hybridisoitiin radioaktiivi-sesti leimatun p1asmidi-DNA:n kanssa ja tämän jälkeen auto-rad i ografo iti in.
Kuvio 5: esittää kaavio11isesti neljän DNA-insertin , jotka on saatu tämän keksinnön mukaisista rekombinantti-DNA-mo1ekyy1 eistä, 27 82072 restriktiokarttojen vertailua. Plasmidien P1F12 ja P2H10 DNA-insertei11ä esiintyy tällöin homologiaa IFN-S-DNA-restrik-tiokuvion kanssa ja plasmidien P1A6 ja 1F7 DNA-insertei11ä esiintyy homologiaa IFN-a-DNA:n kahden erilaisen alatyypin kanssa .
Kuvio 6: esittää kahden insertin (kloonit P1A6 ja 1F/)f jotka ovat IFN-α-DNA-sepsifisiä, 3’- ja 5’-terminaalisten segmenttien nukleo-tidisekvenssejä. Alleviivattu sekvenssi AGT on translaation a lo i tuskodon i.
Claims (5)
- 2s 82072
- 1. IFN-q2(Arg):a koodaava po1ydeoksiribonuk1eotidi, tunnettu siitä, että tämä po1ydeoksiribonuk1eotidi on talletettu talletuslaitokseen "Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen" numerolla DSM 2362 plasmidin pBR322 (Pst) 1F7 Pstl-insertissä esiintyvänä sekvenssinä, joka IFN-a2(Arg):a koodaava sekvenssi sisältää osasekvenssin, jonka kaava on 120 C CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC 153 TGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAC GAG 195 TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC 237 CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG 279 GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CT A GAC AAA TTC 321 TA 323 2. pBR322-p1asmidi, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin Pst-insertissä, ja joka plasmidi on talletettu organismiin E.co1i HB101 talletuslaitoksessa "Deutschen Sammlung fiir M i kroorgan i smen" numerolla DSM-2362.
- 3. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 2 mukaisen plasmidin sisältävä bakteerik 1ooni, tunnettu siitä, että cDNA:sta, joka on syntetisoitu RNA:11a Sendai-viruksen indusoimista Nama1wa-so1uista, valmistetaan vastaava kloonipankki ja tästä k 1oonipankista a) hybridisoima11 a tridekanuk1eotidi, jonka kaava on 5'-dCCTTCTGGAACTG-3' saadaan klooni, joka sisältää tämän tridekanuk1eotidin ja joka koodaa LelFN-B:a, C, D, F tai G:a b) lopuksi valitaan IFN-a2(Arg):a koodaava klooni hybridisoi-ma11 a kohdan a) mukaan saadun kloonin cDNA-insertti. 29 82072
- 4. Menetelmä valmistaa IFN-<x2(Arg): a, tunnettu siitä, että viljellään IFN-c*2(Arg) :n geneettisen informaation sisältävää patenttivaatimuksen 2 mukaisella plasmidilla transformoitua E.coli-bakteeria ja erotetaan näin syntynyt IFN-<*2(Arg).
- 5. Menetelmä valmistaa bakteerista isäntää, kuten E.coli, joka plasmidissa sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista IFN_«*2(Arg):a koodaavan polydeoksiribonukleotidin, tunnettu siitä, että se transformoidaan patenttivaatimuksen 2 mukaisella plasmidilla. 30 82072
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3220116 | 1982-05-28 | ||
| DE19823220116 DE3220116A1 (de) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI831818A0 FI831818A0 (fi) | 1983-05-23 |
| FI831818L FI831818L (fi) | 1983-11-29 |
| FI82072B FI82072B (fi) | 1990-09-28 |
| FI82072C true FI82072C (fi) | 1991-01-10 |
Family
ID=6164725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI831818A FI82072C (fi) | 1982-05-28 | 1983-05-23 | Ifn-2(arg)-interferoner kodande polydeoxiribonukleotider, dessa interferoner kodande dna-sekvenser, denna genetiska information innehaollande mikro-organismer och deras framstaellningsfoerfarande. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4820638A (fi) |
| EP (1) | EP0095702B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0774238B2 (fi) |
| KR (1) | KR920006349B1 (fi) |
| AT (1) | ATE42114T1 (fi) |
| AU (1) | AU565479B2 (fi) |
| DD (1) | DD211359C4 (fi) |
| DE (2) | DE3220116A1 (fi) |
| DK (1) | DK164742C (fi) |
| ES (2) | ES8403522A1 (fi) |
| FI (1) | FI82072C (fi) |
| GR (1) | GR79236B (fi) |
| HK (1) | HK112893A (fi) |
| HU (1) | HU196452B (fi) |
| IL (1) | IL68790A (fi) |
| MX (1) | MX9202815A (fi) |
| NO (1) | NO168538C (fi) |
| NZ (1) | NZ204384A (fi) |
| SG (1) | SG38692G (fi) |
| SU (1) | SU1346048A3 (fi) |
| UA (1) | UA8037A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA833845B (fi) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| US4709324A (en) * | 1985-11-27 | 1987-11-24 | Motorola, Inc. | Data processor control unit having an interrupt service using instruction prefetch redirection |
| CA2025180A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts |
| US6685933B1 (en) | 1998-07-28 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Interferon α hybrids |
| BR0115392A (pt) * | 2000-11-03 | 2004-06-15 | Biomedicines Inc | Método para o tratamento de uma doença sensìvel a interferona em um animal de sangue quente, método para individualizar as dosagens de uma interferona no tratamento, método para a fabricação de um dispositivo de liberação de efeito terapêutico de longa duração de uma droga ao longo de um perìodo de tempo, e conjunto útil para a ministração de uma quantidade relativamente constante de uma droga |
| FR2817559B1 (fr) * | 2000-12-06 | 2003-12-12 | Genodyssee | Procede de determination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fontionnel(s) dans la sequence nucleique d'un gene "candidat" fonctionnel preselectionne et ses applications |
| FR2821625B1 (fr) * | 2001-03-01 | 2003-05-16 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques |
| FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
| US20030143197A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-07-31 | Moran S. Mark | Method for treating diseases with omega interferon |
| US20040063912A1 (en) * | 2002-03-15 | 2004-04-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Central airway administration for systemic delivery of therapeutics |
| WO2003099320A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| US8778880B2 (en) * | 2004-02-02 | 2014-07-15 | Ambrx, Inc. | Human growth hormone modified at position 35 |
| WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
| US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
| WO2007140416A2 (en) | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Two-piece, internal-channel osmotic delivery system flow modulator |
| PT2359808E (pt) | 2006-08-09 | 2013-08-28 | Intarcia Therapeutics Inc | Sistemas de entrega osmótica e montagens de pistão |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| ES2402172T3 (es) | 2007-04-23 | 2013-04-29 | Intarcia Therapeutics, Inc | Formulación en suspensión de péptidos insulinotrópicos y usos de los mismos |
| WO2009102467A2 (en) | 2008-02-13 | 2009-08-20 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
| EP3735944A1 (en) | 2009-09-28 | 2020-11-11 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Rapid establishment and/or termination of substantial steady-state drug delivery |
| US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
| WO2013024158A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection |
| WO2013024156A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection |
| WO2014033266A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection |
| US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
| KR102650751B1 (ko) | 2015-06-03 | 2024-03-22 | 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 | 임플란트 배치 및 제거 시스템들 |
| CN109310743A (zh) | 2016-05-16 | 2019-02-05 | 因塔西亚制药公司 | 胰高血糖素受体选择性多肽及其使用方法 |
| USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
| USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
| AU2018206539A1 (en) | 2017-01-03 | 2019-07-18 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Methods comprising continuous administration of a GLP-1 receptor agonist and co-administration of a drug |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2906160A1 (de) * | 1979-02-17 | 1980-09-04 | Thomae Gmbh Dr K | Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon |
| AU538665B2 (en) * | 1979-10-30 | 1984-08-23 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Human interferon dna |
| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| EP0032134B2 (en) * | 1980-01-08 | 1993-10-13 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-alpha like polypeptides |
| GB2068970B (en) * | 1980-02-06 | 1983-06-22 | Searle & Co | Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon |
| DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
| DE3005843A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
| ES506955A0 (es) * | 1980-11-10 | 1983-02-01 | Genentech Inc | Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral. |
| DE3106982A1 (de) * | 1981-02-25 | 1982-09-09 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | "neues tridecadeoxynukleotid, verfahren zu seiner herstellung und verwendung" |
| IL63327A (en) * | 1981-07-16 | 1985-11-29 | Yeda Res & Dev | Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria |
| GB2108510B (en) * | 1981-10-03 | 1984-12-12 | Ciba Geigy Ag | Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof |
-
1982
- 1982-05-28 DE DE19823220116 patent/DE3220116A1/de active Granted
-
1983
- 1983-05-19 US US06/495,944 patent/US4820638A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-05-23 FI FI831818A patent/FI82072C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-05-24 AT AT83105116T patent/ATE42114T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-24 DE DE8383105116T patent/DE3379591D1/de not_active Expired
- 1983-05-24 EP EP83105116A patent/EP0095702B1/de not_active Expired
- 1983-05-24 GR GR71447A patent/GR79236B/el unknown
- 1983-05-26 DD DD83251287A patent/DD211359C4/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-26 IL IL68790A patent/IL68790A/xx unknown
- 1983-05-27 HU HU831890A patent/HU196452B/hu not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 UA UA3598429A patent/UA8037A1/uk unknown
- 1983-05-27 DK DK239383A patent/DK164742C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 NO NO831903A patent/NO168538C/no unknown
- 1983-05-27 NZ NZ204384A patent/NZ204384A/en unknown
- 1983-05-27 SU SU833598429A patent/SU1346048A3/ru active
- 1983-05-27 ZA ZA833845A patent/ZA833845B/xx unknown
- 1983-05-27 AU AU15044/83A patent/AU565479B2/en not_active Ceased
- 1983-05-27 JP JP58093886A patent/JPH0774238B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-27 ES ES522762A patent/ES8403522A1/es not_active Expired
- 1983-05-28 KR KR1019830002362A patent/KR920006349B1/ko not_active Expired
-
1984
- 1984-02-01 ES ES529360A patent/ES8500321A1/es not_active Expired
-
1992
- 1992-04-07 SG SG386/92A patent/SG38692G/en unknown
- 1992-06-12 MX MX9202815A patent/MX9202815A/es unknown
-
1993
- 1993-03-22 JP JP5062065A patent/JP2558422B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-21 HK HK1128/93A patent/HK112893A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI82072C (fi) | Ifn-2(arg)-interferoner kodande polydeoxiribonukleotider, dessa interferoner kodande dna-sekvenser, denna genetiska information innehaollande mikro-organismer och deras framstaellningsfoerfarande. | |
| US4530901A (en) | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides | |
| FI88175C (fi) | Rekombinant-dna-molekyler och foerfaranden foer framstaellning av polypeptider liknande humant -interferon | |
| FI86558C (fi) | Dna- sekvenser, rekombinant-dna- molekyler och foerfaranden foer framstaellning av humant interferon av -typ och val av dna-sekvensen. | |
| EP0218825B1 (en) | Cysteine-depleted muteins of interferon-beta, their preparation, formulations containing them, and structural genes, vectors and organisms, and their production, suitable for use in the preparation of said muteins | |
| US5089400A (en) | Polypeptides and process for the production thereof | |
| US5004689A (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields | |
| EP0088540A2 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides | |
| FI90667B (fi) | Menetelmä valmistaa uutta ihmisen tyypin I interferoniproteiinia | |
| EP0062971B1 (en) | Genetically modified microorganisms | |
| JPS6156199A (ja) | 新規ヒトインタ−フエロンα類 | |
| US4716217A (en) | Hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons | |
| US4734491A (en) | DNA sequences encoding hybrid lymphoblastoid-leukocyte human interferons | |
| JPS60126299A (ja) | 新規インターフェロンγとその製造方法 | |
| KR890001828B1 (ko) | 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법 | |
| SU1572419A3 (ru) | Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК pRH W11 или pRH W12, кодирующей омега-интерферон |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: DR. KARL THOMAE GESELLSCHAFT MIT |