FI90667B - Menetelmä valmistaa uutta ihmisen tyypin I interferoniproteiinia - Google Patents

Description

i v 9 0 667

Menetelmä valmistaa uutta ihmisen tyypin I interferoniproteii-nia - Pörfarande för framställning av nytt interferonprotein av human typ I

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat uudet tyypin I interferonit sekä rekombinantti-DNA-menetelmät valmistaa näitä peptidejä ja tuotteet, joita tarvitaan näissä menetelmissä, esimerkiksi geenisekvenssit, rekombinantti-DNA-molekyylit, ekspres-siovehikkelit ja organismit.

Interferoni on käsite, joka on muodostettu kuvaamaan joukkoa proteiineja, jotka ovat ihmissoluille endogeenisiä ja joille on tunnusomaista, että niillä on osittain päällekkäiset ja osittain erilaiset biologiset aktiivisuudet. Nämä proteiinit modifioivat kehon omaa immunovastetta, ja niiden uskotaan osaltaan antavan tehokkaan suojan virussairauksia vastaan. Interferonit on jaettu esimerkiksi kolmeen luokkaan, nimittäin o-, fl- ja γ-interferoniin.

Ihmisorganismissa tunnetaan β- ja γ-interferonista kummastakin vain yksi alatyyppi (esim. S. Ohno et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 28, 5305-5309 (1981); Gray et ai.. Nature 295. 503-508 (1982); Taya et ai., EMBO Journal 1/8., 953-958 (1982)). Sitä vastoin α-interferoni 11 e on kuvattu erilaisia alatyyppejä (esim. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 299. 7-28 (1982)). Valmiit α-interferonit eroavat tällöin toisistaan enintään 23 % diver-genssillä ja ne ovat noin 166 aminohapon pituisia. Huomionarvoinen on edelleen se tieto α-interferonista, että sillä on yllättävän suuri molekyylipaino (26 000, määritettynä SDS-polyakryyliamidi/geelielektroforeesin avulla) (Goren, P. et. ai. Virology 130, 273-280 (1983)). Tästä interferonista käytetään nimitystä IFN-α 26K. Siitä on todettu, että sillä on tähän mennessä korkein spesifinen antiviraalinen ja anti-sellulaarinen aktiivisuus.

Tunnetut interferonit näyttävät olevan tehokkaita erilaisissa sairauksissa, mutta niillä on kuitenkin vähäinen vaikutus 2 90667 useissa muissa sairauksissa tai ei lainkaan vaikutusta (esim. Powledge, Bio/Technology, March 1984, 215-228 "Interferon On Trial”). Interferoneilla on lisäksi sivuvaikutuksia. Esimerkiksi tutkittaessa rekombinantti-a-interferonin Anticancer-vaikutusta todettiin, että noin 50 miljoonan yksikön suuruiset annokset, joita tutkimusten ensimmäisen vaiheen tulosten perusteella pidettiin varmoina, aiheuttivat akuutteja sekavuustiloja, jopa työkyvyttömyyteen johtavia nivelkipuja, erittäin voimakasta väsymystä, ruokahalun vähenemistä, orien-toitumiskyvyn pienenemistä, epileptisiä kohtauksia ja maksa-toksisuutta. 1982 kielsi Ranskan hallitus IFN-a:lla tehtävät tutkimukset, sen jälkeen, kun sillä käsitellyt syöpäpotilaat olivat saaneet kuolettavia sydänkohtauksia. Amerikassa lyhytaikaisesti suoritetuissa tutkimuksissa on myös kerrottu vähintään kahdesta kardiaalisesta kuolemantapauksesta. Yhä selvemmäksi on tullut, että ainakin osa sivuvaikutuksista, kuten kuume ja pahoinvointi, ovat välittömässä yhteydessä itse interferonimolekyyliin eivätkä johdettavissa epäpuhtauksista.

Interferonin herättäminen suurten toiveiden, joita on lisännyt halu löytää uusia interferonin kaltaisia molekyylejä, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia, vuoksi esillä olevan keksinnön tavoitteena on löytää ja valmistaa tällaisia uusia aineita.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat sen vuoksi määrätyt tyypin I uudet interferonit, jotka voivat sisältää johto-peptidin, ja niiden N-glykolysoidut johdannaiset (joita kutsutaan tässä omega-interferoneiksi tai IFN-omegoiksi), jotka sisältävät 168 - 174, parhaiten 172 aminohappoa ja joilla on tähän mennessä tunnettuihin α-interferonin alatyyppeihin . . verrattuna 30 - 50 %:n, parhaiten 40 - 48 %:n divergenssi ja joilla toisaalta on α-interferonin kaltaisia vaikutuksia ja : joilla toisaalta ei ole näiden tunnettujen aineiden monia terapeuttisia haittoja.

Keksinnön kohteena ovat siten uudet interferonit täysin puhtaassa muodossa, niiden ei-glykosyloidut ja glykosyloidut II.

3 90667 muodot, näitä koodaavat geenisekvenssit sekä rekombinanttimo-lekyylit, jotka sisältävät näitä sekvenssejä. Keksinnön kohteena ovat edelleen ekspressiovehikkelit, kuten plasmidit, jotka sisältävät mainittuja geenisekvenssejä, sekä erilaiset isäntäorganismit, kuten mikro-organismit tai kudosviljelmät, jotka mahdollistavat uuden interferonin valmistamisen fermen-toimalla tai kudosvi1jelmämenetelmi11ä.

Keksinnön eräänä hyvänä pidettynä kohteena ovat omega-interferonit sekä seuraavan kaavan mukaiset vastaavat geenisekvenssit : 4 90667 5 10 15

Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu

TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG

20 25 30

Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Leu Cys Leu

GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC

35 40 45

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly

AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG

50 55 60

Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met

AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT^ GAG ATG

65 70 75

Leu Gin Gin lie Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala

CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC AC A GAG CGC TCC TCT GCT

80 85 90

Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His

GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT

95 100 105

Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Gly

CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA

110 115 120

Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala lie Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu

GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG

125 130 135

Arg Arg Tyr Phe Gin Gly lie Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys

.r AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA

140 145 150

Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu lie Met Lys

TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA

155 160 165

Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys

TCC TTG TTC TTA TCA AC A AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA

170 .: Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser

-..: GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT

II

5 90667

Paikassa 111 voi sekvenssi GGG (koodaa Gly-aminohappoa) olla korvattu sekvenssillä GAG (koodaa Glu-aminohappoa). Parhaina pidettyihin molekyy1eihin kuuluvat myös johdannaiset, jotka ovat N-glykosyloituja aminohappokohdassa 78.

Molemmat edellä mainitut omega-interferonit voivat esimerkiksi sisältää johto-peptidin, jolla on kaava

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Vai Met Thr Ser Tyr Ser Pro Vai Gly Ser Leu Gly

Selitykset piirustuksiin:

Kuvio 1: Kloonin E76E9 restriktiokartta

Kuvio 2: Kloonin P9A2 restriktiokartta

Kuvio 3: Kloonin P9A2 DNA-sekvenssi

Kuvio 4: Kloonin E76E9 DNA-sekvenssi

Kuvio 5: Genominen Southern Blot-analyysi käyttämällä koetti mena kloonin P9A2 DNA:ta

Kuvio 6: Ekspressiokloonin pRHW12 rakentaminen

Kuvio 7: Aminohappo- ja nukleotidierot tyypin I interferonien välillä

Kuvio 8a: Luettelo IFN-aA-geenin yksittäisistä nukleotidipai-koista

Kuvio 8b: Luettelo IFN-omegal-geenin yksittäisistä nukleotidi-paikoista 6 90667

Kuvio 8c: Luettelo IFN-aD-geenin yksittäisistä nukelotidipai-koista

Kuvio 9: Kaaviollinen esitys interferonin alatyypille spesi fisten koettimien synteesistä

Kuvio 10: Interferonin alatyypille spesifisen mRNA:n osoittaminen

Kuvio 11: IFN-omegal-geenin DNA-sekvenssi

Kuvio 12: IFN-pseudo-omega2-geenin DNA-sekvenssi

Kuvio 13: IFR-pseudo-omega3-geenin DNA-sekvenssi

Kuvio 14: IFN-pseudo-omega4-geenin DNA-sekvenssi

Kuvio 15: Korjattu luettelo IFN-omega-geenin sekvensseistä

Kuvio 16: Signaalisekvenssin homologia

Kuvio 17: "Valmiiden" proteiinisekvenssien homologia

Kuvio 18: 4 DNA-sekvenssin keskinäinen homologia

Keksinnön mukaisesti saadaan uudet omega-interferonit ja näitä koodaavat DNA-sekvenssit seuraavasti:

Ihmisen B-lymfooma-solulinja, esimerkiksi Namalwa-solut (kts.

G. Klein et ai., Int. J. Cancer 10., 44 (1982), voidaan aktivoida tuottamaan samanaikaisesti a- ja β-interferoni käsittelemällä viruksella, esimerkiksi Sendai-viruksella. Jos tällöin eristetään stimuloiduista Namalwa-soluista muodostunut mRNA, niin tämä voi toimita cDNA-synteesin mal1ialustana. Jotta kloonauksessa voitaisiin parantaa interferoni-spesifisten it 7 90667 sekvenssin saantoa, erotetaan mRNA-valmiste sokeritiheysgra-dientissa yksittäisten mRNA-molekyy1ien eri pituuksien perusteella. Edullisesti kootaan mRNA:t, joiden pituus on noin 125 (mRNA:n pituus noin 800 - 1000 emästä). Tällä alueella sedi-mentoituvat a- ja β-interferonei11 e spesifiset mRNA:t. Tästä gradienttialueesta saadut mRNA:t väkevöidään saostamalla ja liuottamalla veteen.

cDNA-kirjasto valmistetaan oleellisesti kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (kts. esim. E. Dworkin-Rastl, M.B. Dworkin ja P. Swetly, Journal of Interferon Research 2/4. 575-585 (1982)). mRNA alustaan oiigo-dT-1isäyksen avulla.

Tämän jälkeen cDNA syntetisoidaan vastaavasti puskuroidussa liuoksessa 1 tunti 45°C:ssa lisäämällä neljä desoksi-nukleosi-ditrifosfaattia (dATP, dGT, dCTP, dTTP) ja käänteis-transkrip-taasi-entsyymiä. cDNA/mRNA-hybridi puhdistetaan uuttamalla kloroformilla ja kromatografoimalla geelipylväässä, esimerkiksi Sephadex G50® -pyiväässä. RNA hydrolysoidaan aikaiikäsitte-lyllä (0,3 moolia NaOH 50°C:ssa, 1 tunti) ja cDNA seostetaan etanolilla happamalla natriumasetaattiliuoksella tapahtuneen neutraloinnin jälkeen. Sen jälkeen, kun vastaavaan liuokseen on lisätty neljä desoksinukleosiditrifosfaattia ja E.coli DNA-polymeraasia I, suoritetaan kaksoissäikeen synteesi, jolloin cDNA toimii samanaikaisesti mal1ialustana ja primeerina muodostamalla hiusneularakenteen 3'-päässään (6 tuntia 15°C:ssa) (kts. A. Eftratiadis et ai.. Cell 7., 279 (1976)), Fenoliuuton, Sephadex G50 ®kromatografiän ja etanolisaostuksen jälkeen käsitellään DNA sopivassa liuoksessa yhdelle säikeelle spesifisellä endonukleaasi11 a SI. Tällöin hiusneularakenne sekä kaksoissäikeeksi reagoimaton cDNA hajoavat. Kloroformiuuton ja etanolilla saostamisen jälkeen erotetaan kaksisäikeinen DNA (dsDNA) suuruuden perusteella sokeritiheysgradientissa. Seu-raavassa kloonausvaihetta varten käytetään parhaiten vain dsDNA:ta, jonka suuruus on 600 bp tai yli, jotta saataisiin suuremmalla todennäköisyydellä vain klooneja, jotka sisältävät uutta interferonia täydellisesti koodaavan sekvenssin. dsDNA, 8 90667 jonka pituus on yli 600 bp, väkevöidään gradientista seostamalla etanolilla ja liuottamalla veteen.

Saatujen dsDNA-molekyylien lisäämiseksi nämä on laitettava seuraavaksi vastaavaan vektoriin ja sen jälkeen E.coli-bak-teeriin. Käytetty vektori ön parhaiten plasmidi pBR322 (F. Bolivar et ai., Gene 2., 95 (1977)). Tämä plasmidi muodostuu oleellisesti replikonista ja kahdesta seiektiomarkkerista. Nämä antavat isännälle resistenttisyyden ampisilliini- ja tetrasykliini-antibiootteja vastaan (Apr, Tcr). B-laktamaasi (Apr)-geeni sisältää restriktioendonukleaasin PstI tunnista-missekvenssin. pBR322 voidaan pilkkoa Pstl-entsyymillä. Eri-pitkät 3'-päät pidennetään terminaalisella desoksinukleotidi-transferaasi (Tdt)-entsyymi 1lä lisäämällä ensin vastaavasti puskuroituun liuokseen dGTP:tä. Samanakaisesti pidennetään myös dsDNA 3'-päissä Tdt-entsyymi1lä käyttämällä cCTP:tä. Plasmidin ja dsDNA:n homopolymeeripäät ovat kömpiementtisia ja hybridisoituvat, kun plasmidi-DNA:ta ja dsDNA:ta sekoitetaan vastaavassa konsentraatiosuhteessa ja sopivissa suola-, puskuri- ja lämpötilaolosuhteissa (T. Nelson et ai., Methods in Enzymology 68., 41-50 (1980)).

E.coli-kanta HB 101 (genotyyppi F-, hsdS20 (r-8, m-B) recA13, ara-14, proA2, LacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-1, sup 44, lambda-) esivalmistetaan rekombinanttivektori-dsDNA-molekyylin vastaanottamista varten pesemällä CaCl2~1iuoksel1 a. Komponentteja E.coli HB 101-soluja sekoitetaan DNA:n kanssa ja 0°C:ssa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen transformoidaan näin saatu plasmidi-DNA lämpöshokin avulla 42°C:ssa 2 minuutin aikana (M. Dagert et ai., Gene 6., 23-28 (1979)). Sen jälkeen maljataan transformoidut bakteerit tetrasykliinipitoisi 11 e agar-mal joi 11 e (10 ]ig/ml) . Tällä agarilla voi kasvaa ainoastaan E.coli HB 101, joka on ottanut vektori- tai rekombinant-ti-vektorimolekyylin (Tcr). Rekombinantti-vektori-dsDNA-mole-kyylit antavat isännälle genotyypin ApsTcr, sillä informaatio ;· β-1aktamaasista on tuhoutunut, kun dsDNA on tuotu fl-lakta- maasigeeniin. Kloonit siirretään agarlevyille, jotka sisältä- li 9 90667 vät 50 ug/ml ampisilliinia. Tällöin kasvaa vain 3 %, mikä merkitsee sitä, että klooneista 97 % sisältää dsDNA-molekyy1i-insertin. Kun lähdetään 0,5 ug:sta dsDNA:ta, saadaan yli 30.000 kloonia. Näistä siirretään 28.600 kloonia yksitellen mikrotiitterilevyjen kalvoihin, jotka sisältävät ravintoalustaa, 10 yg/ml tetrasykliiniä ja glyseriiniä. Sen jälkeen, kun kloonit ovat kasvaneet näissä, pidetään maljoja säilyttämistä varten -70°C:ssa (cDNA-kirjasto).

Uuden interferonin geenin sisältävien kloonien etsimiseksi cDNA-kirjastosta siirretään kloonit sulattamisen jälkeen nitroselluloosasuodattimille. Nämä suodattimet ovat tetrasyk-1iinipitoisessa ravintoagarissa. Bakteeripesäkkeiden kasvun jälkeen kiinnitetään bakteereiden DNA suodattimelle.

Koettimena käytetään edullisesti kloonin pER33 inserttiä (E. Rasti el ai., Gene 2JL, 237-248 (1983) - kts. myös EP-A-0.115.613), joka sisältää INF-a2-Arg-geenin. Nick-trans-laation avulla tämä DNA-pala leimataan radioaktiivisesti, jolloin käytetään DNA-polymeraasia I, dATP:a, dGTP:a, dTTP:a ja a-32p_(jcpp : a . Nitrosel lul oosasuodattimet esikäsitel 1 ään ensin sopivissa, ei-stringenteissä hybridisointiolosuhteissa lisäämättä radioaktiivista koetinta ja sen jälkeen hybridisoi-daan noin 16 tuntia lisäämällä radioaktiivista koetinta. Tämän jälkeen suodattimet pestään myös ei-stringenteissä olosuhteissa. Hybridisoinnin ja pesun alhaisen stringenttisyyden vuoksi saadaan interferoni-a2-Arg-pitoisten kloonien lisäksi myös muita interferonipitoisia klooneja, joiden sekvenssit voivat poiketa tähän mennessä tunnettujen interferoni-α:jen sekvensseistä. Kuivauksen jälkeen suodattimet valutetaan röntgenkal-volla. Tummeneminen, joka on selvästi suurempi kuin taustan taso, osoittaa, että mukana on klooni, jossa on interferonille spesifisiä sekvenssejä.

Koska radioaktiivisuussignaalit ovat laadultaan erilaisia, kasvatetaan positiivisia klooneja tai positiivisiksi epäiltyjä klooneja pienessä mitassa. Plasmidi-DNA-molekyylit eristetään, 10 90667 käsitellään restriktioendonukleaasi1 la PstI ja erotetaan suuruuden perusteella elektroforeettisesti agaroosigeeli11ä (Birnoboim et ai., Nucl . , Acid. Res. Ί_, 1513 (1979)). Aga-roosigeelin DNA siirretään Southern'in menetelmällä (E.M. Southern, J. Mol. hioi . 98., 503-517 (1975)) nitrosellu-1oosasuodattimel1 e. Tämän suodattimen DNA hybridisoidaan radioaktiivisen, IFN-geeni-pitoisen, denaturoidun koettimen kanssa. Positiivisena kontrollina käytetään plasmidia 1F7 (talletettu DSM-kokoelmaan DSM-numerolla 2362), joka sisältää interferoni-a2-Arg-geenin. Autoradiogrammin perusteella on selvää, että kloonit E76E9 ja P9A2 sisältävät sekvenssin, joka hybridisoituu ei-stringenteissä olosuhteissa interferoni-ot2-Arg-geenin kanssa. Kloonien E76E9 ja P9A2 dsDNA-inserttien lähempää karakterisointia varten valmistetaan näiden kloonien plasmideja suuremmassa mitassa. DNA käsitellään erilaisilla restriktioendonukleaasei11 a, kuten esimerkiksi endonukleaa-seilla AluI, Sau3A, Bglll, Hinfl, PstI ja Haelll. Vastaavat palat erotetaan agaroosigeelissä. Palojen suuruudet määritetään vertaamalla vastaavien kokomarkkereiden kanssa, esimerkiksi paljojen kanssa, jotka saadaan käsittelemällä pBR322-plasmidi restriktioendonukleaasei11 a Hinfl tai Haelll.

Smith'in ja Brinsteil’in kartoitusmenetelmällä (H.O. Smith et ai. Nucl. Acid. Res. 3_, 3287-2398 ( 1967 )) määritetään näiden palojen järjestys. Näin saaduista restriktioentsyymikartoissa (kuviot 1 ja 2) voidaan yllättäen päätellä, että kloonien E76E9 ja P9A2 insertit ovat tähän mennessä tuntemattomia interferonigeenejä, nimittäin kummassakin tapauksessa omega-interferoni- geenejä.

Tätä tietoa omega-interferonista käytetään hyödyksi cDNA-insertin käsittelyssä sopivilla restriktioendonukleaasei11 a. Vastaavat palat ligatoidaan bakteeritaagin M13 mp9 dsDNA-muotoon (repiikatiivinen muoto) (J. Messing et ai., Gene 1_9, 269-276 (1982)) ja sekvenssoidaan Sanger'in dideoksi-menetelmällä (F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 5463-5467 (1977 )). Rekombinantti faagien yksisäikeinen DNA eristetään. Synteettisen oligomeerin sitomisen jälkeen li n 90667 suoritetaan neljässä erillisessä erässä kaksoissäikeiden synteesi käyttämällä l. coli'sta saatuja DN A-po1ymera asin I suuria paloja (Klenou-pala). Jokaiseen näihin neljään osareaktioon lisätään yhtä neljästä didesoksinukleosidi-trifosfaatista (ddAlP, ddGTP, ddCTP. ddTTP). Tämä johtaa tilastollisesti jakautuneeseen ketjun katkeamiseen niissä kohdissa, joissa mallialustan DNA:ssa on kulloinkin käytetyn didesoksinuk1eosiditrifo s faatin kanssa komplementtinen emäs. Lisäksi käytetään vielä radioaktiivisesti leimattua dATP. Synteesireaktion loppumisen jälkeen tuotteet denaturoidaan ja yksisäikeiset DNA-palat erotetaan koon perusteella denaturoidussa polyakryyliamidigeelissä (F. Sanger et ai., FEBS Letters 87_, 107-111 (1978 )). Tämän jälkeen geeli valotetaan röntgenkalvolla. Autoradiogrammista voidaan lukea rekombinantti M13-faagin DNA-sekvenssi. Erilaisten rekombinanttifaagien insertin sekvenssit käsitellään sopivien tietokoneohjelmien avulla (R. Staden, Nucl. Acid. Res.

10, 4731-4751 (1982)).

Sekve.nssointistrategia on esitetty kuvioissa 1 ja 2. Kuviossa 3 on esitetty kloonin P9A2 insertin DNA-sekvenssi ja kuviossa A kloonin E76E9 vastaava sekvenssi. Koodaamaton DNA-säie ':: on osoitettu suunnassa 5'- >3' yhdessä siitä johdetun f ;'- aminohapposekvenssin kanssa.

; Kloonin E76E9 eristetty sDNA omega (G lu ) - i nt e r f e ron i 1 le : on 858 emäsparia pitkä ja siinä on 3 '-ei-1ransla toitunut alue. Alue, joka koodaa valmista omega (Glu )-interferonia, • ·' ulottuu nukleotidista 9 nukleotidiin 524 asti. Kloonin P9A2 eristetty cDNA omega(G ly)-inter feroni 1le on 877 emäsparia ·.**· pitkä, jolloin valmista omega-interferonia koodaava sekvenssi : ulottuu nukleotidista 8 nukleotidiin 523. P9A2 kloonien tapauksessa 3'-ei-translatoitu alue ulottuu poly-A-leik-kauskohtaan asti,

Valmista omega-interferonia koodaavat DNA-sekvenssit ovat 12 90667 klooneissa E76E9 ja P9A2 komplementteja. Ne alkavat N-ter-minaalisessa päässä aminohapoilla kysteiini-asparagiinihappo-leusiini. Yllättäen ovat molemmat valmiit omega-interferonit 172 aminohappoa pitkiä, mikä poikkeaa selvästi tähän mennessä tunnettujen interferonien pituudesta, esimerkiksi a-interfero-neissa on 166 (tai 165) aminohappoa. Yllättäen on molemmilla omega-interferoneilla potentiaalinen N-glykolysoitumiskohta aminohappopaikassa 78 (asparagiini-metioniini-treoniini).

Kloonien E76E9 ja P9A2 vertaaminen tuo esiin erään eron. Aminohappoa 111 koodaava tripletti kloonissa E76E9 on GAG koodaten glutamiinihappoa, kun taas tämä tripletti kloonissa P9A2 on GGG ja koodaa glysiiniä. Kummatkin omega-interferoni -proteiinit eroavat siten yhden aminohapon suhteen ja niitä kutsutaan omega(Glu)-interferoniksi (E76E9) ja omega(Gly)-interveroniksi (P9A2).

Kun kumpaakin omega-interferonia verrataan tähän mennessä tunnettuihin ihmisen α-interferonin alatyyppeihin saadaan seuraava kuva: omega alfa f : Proteiinin pituus aminohapoissa 172 166^+) . ·: Potentiaalinen N-glykosylointikohta 78 - (++) +) Interferoni alfa A sisältää vain 165 aminohappoa ++) Interferoni alfa H sisältää yhden potentiaalisen N-gly-kosylointikohdan paikassa 75 (D. Goeddel et ai.. Nature 290. 20-26 (1981)).

E.coli HB 101, jossa on plasmidi E76E9 ja E.coli 101, jossa on plasmidi P9A2, on talletettu 03.07.1984 DSM-kokoelmaan li 13 90667 (Deutschen Sammlung för Mikroorgariismen, Gottingen) numerolla DMS 3003 vastaavasti DSM 3004.

Osoitukseksi siitä, että uudet löydetyt kloonit tuottavat interferonin tapaista aktiivisuutta, viljellään esimerkiksi kloonia E76E9 ja bakteerin lysaatti tutkitaan kasvun jälkeen plakkitestissä (Plaque-Reduktions-Test). Odotuksenmukaisesta bakteeri tuotti interferonin kaltaista aktiivisuutta (kts. esimerkki 3).

Sen osoittamiseksi, että kumpikin juuri löydetty interferoni on uuden interferoniperheen jäsen, eristettiin edelleen Namalva-soluista koottu DNA ja käsiteltiin erilaisilla restriktioendonukleaaseilla.

Tällä tavalla voidaan arvioida niiden geenien lukumäärä, joita koodaavat kloonin P9A2 ja E76E9 CDN:t. Tätä varten erotetaan saadut DNA-palat agaroosigeelillä Southern'in menetelmällä (E.M. Southern et ai., J. Mol. Uiol. 98, 503-517 (1975)), viedään nitroselluloosasuodattimien päälle ja hybridisoidaan suhteellisen voimakkaissa olosuhteissa kloonin P9A2 radioaktjivieesti leimatun spesifisen DNA:n : * kanssa.

Kuviossa 5a on esitetty tulokset, jotka on saatu hybridi-- soitaessa plasmidista P9A2 ja pER33 saadun DNA:n kanssa:

Yksittäiset jäljet on tällöin merkitty kirjaimilla, jotka viittaavat eri käsiteltyihin DNA-koettimiin (E = EcoRI, H = H ind III, B = BamHl, S = SpHI , PsPstI, CsClal). Suodattimen ·.·' vasen puoli hybridisoitiin interferoni-a-geeni-koettimen ("A") kanssa ja oikea puoli kloonin P9A2 cDNA-insertin . kanssa ("0")· Nauharyhmä, joka hybridisoituu joko a-inter- feroni-geeni-koettimen kanssa tai uuden interferoni-qeeni-koettimen kanssa, on erilainen. Näillä kahdella erilaisella koettimella ei voitu todeta mitään ristihybridisoitumista, 1* 90667 kun arvioitiin vastaavia jälkiä.

Kuviossa 5b on kuvattu kloonin P9A2 cDNA ja hybridisoinnissa hyödynnetty pala. Yksittäisten restriktioentsyymien pilkkomis-kohdat on annettu (P=PstIf S=Sau3A, AsAluI). Koetin käsittää vain kaksi Pstl-palaa kolmesta mahdollisesta. Hybridisoitumis-kuvio osoittaa vain yhden hybridisoituvan palan, jonka pituus on noin 1300 emäsparia (bp) ja joka kuuluu homologiseen geeniin. Pienempi 120 bp pitkä pala oli kulkenut ulos geelistä. Geenin 5'-osaan kuuluvaa nauhaa ei voida havaita, koska koetin ei sisällä tätä aluetta. Tässä Pst I-jäljes sä voidaan havaita vähintään kuusi erilaista nauhaa. Tämä merkitsee sitä, että ihmisen genomissa on oltava joitakin muita geenejä, jotka ovat lähisukuisia uusien sekvenssien kanssa. Jos näissä geeneissä on yksi tai useampi Pstl-leikkauskohta, niin voidaan odottaa, että vielä voidaan eristää vähintään kolme muuta geeniä.

Nämä geenit eristetään parhaiten hybrid isoima1la ihmisgeenin kirjastosta, jossa ne ovat plasmidi-vektorisssa, faagi-vektbrissa tai kosmidi-vektorissa (kts. esimerkki 4e).

Tässä kohdassa mainittakoon, että keksinnön mukaisista : : omega-interferoneista puhuttaessa kysymys ei ole vain kahdesta valmiista interferonista, jotka on kuvattu yksitellen, : vaan myös näiden po i y pep t id ien jokaisesta modifikaatiosta, jossa ei ole vaikutettu IFN-omega-aktiivisuuteen. Näihin modifikaatioihin sisältyy esimerkiksi molekyylin lyhentäminen N- tai C-terminaalisessa päässä, aminohappojen vaihtaminen toisiin ryhmiin, jolloin aktiivisuus ei oleellisesti muutu, - molekyylin kemiallinen tai biokemiallinen sitominen muihin molekyy1 eihin, jotka ovat inerttejä tai aktiivisia. Viimeksi mainituissa modifikaatioissa voi olla kysymys esimerkiksi -··, hybridimolekyy leistä, jotka on muodostettu yhdestä tai useammasta omega-interferonista ja/tai tunnetusta a- tai β-interferonista .

15 90667

Jotta uusien interferonien, erityisesti omega(Glu)- ja ornega (Gly )-interferonin aminohappo- ja nukleot id isek venssien eroja voitaisiin verrata jo a-i n t e r f e r one i 1 le ja β-mterfe-ronille julkaistuihin aminohappo- ja nukleotidisekvensseihin (C. Weissrnann et ai., Phil. Trans. R. Soc . London 299 , 7-28 ( 1982 ); A. Ullrich et ai., J. Molec. Biol. 156., 467-486 (1982); T. Taniguchi et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. 77. 4003-4006 (1980); K. Tokodoro et ai., EMBO J. 3, 669-670 (1984)), järjestetään vastaavat sekvenssit parittain ja lasketaan erot yksittäisissä paikoissa.

Kuviossa 7 esitetyistä tuloksista käy ilmi, että kloonien P9A2 ja E76E9 DNA-sekvenssit ovat lähisukuisia tyypin I interferonin (esimerkiksi a- ja β-interferoni) sekvensseille. Toisaalta käy ilmi, että aminohapposekvenssien erot yksittäisten α-interferonien ja uusien sekvenssien välillä ovat suurempia kuin 41,6 % ja pienempiä kuin 47,0 %> Erot uusien sekvenssien sekä yksittäisten «-interferonien ja β-interferonin sekvenssien välillä ovat suuruusluokkaa noin 70 ?». Kun otetaan huomioon esimerkin 4 tulokset, jossa esimerkissä osoitettiin lähisukuisten geenien kokonaisen ryhmän olemassaolo, ja interferoneille ehdotettu nimitystäpä (J. Vilceck et ai., J. Gen. Virol. 65, 669-670 (1984)), : uskotaan kloonien P9A2 ja E76E9 cDNA-inserttien koodaavan ·.· : uutta luokkaa tyypin I interferoneja, joita kutsutaan • omega-interferoneiksi.

Lisäksi osoitetaan, että omega-interferoni-geenin ekspressio tapahtuu analogisesti tyypin I interferoni-geenin ekspression - . kanssa. Tätä varten tutkitaan Sl-Mapping-mentelmään (A.J.

Berk et ai., Cell 1£, 721 (1977)) perustuen a- ja omega-interferonien monigeenisten perheiden yksittäisten jäsenten : : : transkriptiota (kts. esimerkki 7) ja osoitetaan, että omega-l-mRNA:n ekspressio voidaan indusoida viruksilla.

. Koska tällaisen qeeniperheen transkriptit eroavat vain ; muutaman emäksen, vain noin 1000 emäksen suhteen, hybridi- 16 90667 soituminen ei yksinään ole riittävän herkkä tunnusmerkki, jolla voidaan erottaa erilaiset IFN-mRNA:t.

Tätä varten valmistetaan 9 α-interferonista, omega-1-interferonista ja 8-interferonista mRNA-sekvenssit. Suurilla kirjaimilla on tällöin merkitty ne emäkset, jotka ovat spesifisiä ylimmälle sekvenssille. Tällaiset spesifiset paikat voidaan helposti löytää yksinkertaisen tietokoneohjelman avulla. Hybrid iso intikoetin, joka lähtee spesifisestä kohdasta, voi tällöin hybridisoitua täydellisesti määrätyn alatyypin mRNA:n kanssa. Mitkään muut mRNA:t eivät voi hybridisoitua alatyypin spesifissä kohdissa. Kun hybri-disointikoetin on leimattu radioaktiivisesta spesifisessä 5'-päässään, vain ne radioaktiiviset leimaukset on suojattu yksittäissäikeelle spesifisen nukleaasin (parhaiten Sl-nukleaasi) vastaisesti, jotka ovat hybridisoituneet sen interferoni-alatyyppi-mRNA:n kanssa, jolle koetin oli konstruoitu.

Tämä periaate ei rajoitu interferoniin, vaan sitä voidaan pikemminkin käyttää jokaiseen ryhmään tunnettuja sekvenssejä, joissa on kuviossa 8 kuvatut spesifiset kohdat.

··' · Alatyypin edellä mainitut spesifiset kohdat eivät useimmissa ‘ tapauksissa ole mitään re s t r ik t ioko h t ia , jolloin cDNA;n pilkkominen restriktioendonukleaaseilla ei sovi alatyyp-: : : pispesifisten hybridisointikoettimien valmistamiseen.

;Y; Tässä esimerkissä käytetyt koettimet on sen vuoksi valmistettu jatkamalla 5'-päässä radioaktiivisesti leimattua oligonukleo-; tidiä, joka on komp lemen 11 inen omega 1-in t er f e ronin mRNA:n ... kanssa spesifisen kohdan yläpuolella.

: Kuviosta 10 käy ilmi, että odotusten mukaisesti omega-l-mRNA

: on indusoituva Namalu/a- ja NC37-soluissa.

Keksinnön kohteena eivät sen vuoksi ole vain geenisekvenssit, jotka koodaavat spesifisesti annettuja omega-interferoneja, li 17 90667 vaan myös modifikaatiot, jotka voidaan helposti ja rutiininomaisesti saada mutatoimalla, hajottamalla, transposition kautta tai addition kautta. Keksintöön sisältyy jokainen sekvenssi, joka koodaa kuvattuja ihmisen omega-interferoneja (so. jolla on tässä kuvattu biologinen aktiivisuuskirjo ) ja joka on näiden suhteen degeneroitunut; tämän alan ammattimiehet kykenevät degeneroimaan koodaavien alueiden DN A-sekvenssejä. Keksintöön sisältyy myös jokainen sekvenssi, joka koodaa IFN-omegan aktiivisuuskirjon omaavaa polypeptidiä ja joka hybridisoituu näiden sekvenssien (tai niiden osien) kanssa stringenteissä olosuhteissa (esimerkiksi olosuhteissa, jotka selektoivat yli 85 S, parhaiten yli 90 % homologiaan).

Hybridisoinnit suoritetaan 6 x SSC/5 x Denhardt'in liuos/0,1 % SDS-seoksessa 65°C:ssa. Stringenttisyys määrätään kasvuvaiheessa. ΠΝΑ-sekvenssien, joiden homologia on noin 85 ?ί tai enemmän, selektoimiseen sopii siten olosuhteiksi 0,2 x SSC/0,01 %, 5DS/65°C ja DNA-sekvenssien, joissa homologia on noin 90 % tai enemmän, selektoimiseen sopivat olosuhteiksi 0,1 x SSC/0,01 % SDS/65°C.

Tutkimalla kosmidi-kirjasto näissä olosuhteissa (0,2 x SSC) -: · saadaan muutama IFN-omegal-koettimen kanssa hybridisoituva : kosmidi. Näistä eristettyjen restriktioentsyymipalojen : sekvenssianalyysi antaa autenttisen IFN-omegal-geenin : ·.: (kts. kuvio 11) sekä kolme muuta sen kanssa lähisukuista geeniä, joille annetaan nimet I F N-p s eu do - omega 2 , IFN-pseudo-omega3 ja IFN-pseudo-omega4 (kts. kuviot 12-14). Myös nämä ovat esillä olevan keksinnön kohteena sekä niiden . . koodaamat peptidit. Nämä kohteet on esitetty pa ten11ivaati-;_ · muksissa 43 - 52.

DNA-vertailu antaa pseudogeeneille noin 85 % homologia IFN-omegal-geenin (interferoni-omega-yksi-geeni ) suhteen. 1 · IFN-omegal-geeni osoittaa lisäksi, että transkriptiossa ib 90667 sisältää mRNA informaation funktionaalisesta interferonipro-teiinista, so. koodaa 23 aminohappoa pitkän signaa1ipeptid in, jonka kaava on

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Vai Met Thr Ser Tyr Ser Pro Vai Gly Ser Leu Gly ja jota seuraa valmis 172 aminohappoa pitkä IFN-omega1.

Interferoni-omega-geenit voidaan viedä tietyissä olosuhteissa jokaiseen organismiin, joka antaa korkeita saantoja. Alan ammattimies tuntee parhaiten sopivat isännät ja vektorit; esimerkkejä on annettu patenttijulkaisussa EP-A-0.093.619.

Ekspressoitumista varten pidetään erityisen hyvänä prokaryoot-teja. Sopiva on esimerkiksi E. coli K 12, kanta 294 (ATCC n:o 31 466). Muita sopivia kantoja on E. coli X1776-bakteerissa (ATCC n:o 31.537). Edellä mainittujen kantojen lisäksi voidaan käyttää myös E. coli W 3110-bakteeria (F”, lambda”, prototrofi, ATCC n:o 27325), basilleja, kuten Bacillus subtilis-bakteeria, ja muita enterobakteereita, kuten Salmonella typhimurium tai Serratia marcenses-. bakteereita, ja erilaisia peeudomonaksia.

Näiden isäntien kanssa voidaan yleensä käyttää plasmidi-. vektoreita, replikoneja ja kont rol lisek vensse j ä , jotka • · ovat peräisin isäntäsolujen kanssa yhteensopivista lajeista.

- : Replikaatiokohdan lisäksi vektorissa on tavallisesti tunnista- missekvensse jä, jotka mahdollistavat transformoitujen solujen fenotyyppisen selektoinnin. Esimerkiksi E. coli : ·.: transformoidaan tavallisesti pBR 322-plasmidilla, joka :on peräisin E. co 1 i - la j eis t a (Bolivar, et ai., Gene 2_, 95 (1977)). pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetra-sykliim-resistenttisyydelle ja sen avulla on sen vuoksi -··1 mahdollista identifioida transformoidut solut yksinkertaisella ·**.: tavalla. pBR322-plasmidin tai myös muiden plasmidien on ;1·1 lisäksi sisällettävä promoottoreita tai ne on tätä varten li I’ 90667 modifioitava niin, että ne sisältävät promoottoreita, joita mikrobiorganismit voivat käyttää omien proteiiniensa ekspressoimiseen. Rekombinantti-DNA:n valmistuksessa useimmiten käytettyihin promoottoreihin kuuluvat beta-laktamaasi-(penisi 11inaasi) ja laktoosi-promoottori-järjestelmät (Chang et ai., Naure 275, 615 (1978); Itakura et ai.,

Science 198 , 1056 (1977 ); Goeddel et ai., Nature 281, 544 (1979)) ja tryptofaani (trp)-promoottorijärjestelmä (Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. £, 4057 (1980); EP-A-0.036.776 ) . Vaikkakin edellä mainitut ovat tavallisimpia promoottoreita, niiden lisäksi on myös kehitetty ja käytetty muitakin mikrobipromoottoreita. IFN-omegan geenisekvenssiä voidaan esimerkiksi käyttää lambda-bakteerifaagin Leftuard-promoottorin (P^) kontrollin alaisena. Tämä promoottori, jota voidaan ohjata, on eräs erityisen hyvin tunnetuista promoottoreista. Ohjaaminen on mahdollista lambda-repressorin avulla, josta tunnetaan vierekkäisiä restriktioleikkauskohtia.

Tämän repressori-geenin lämpötilaherkkä alleeli voidaan liittää vektoriin, joka sisältää täydellisen IFN-omega-sekvenssin. Jos lämpötila nostetaan 42°C:een, repressori inaktivoituu ja promoottori eksprimoituu maksimaaliseen ' - : konsentraatioonsa. Näissä olosuhteissa tuotetun mRNA:n : ; : summan tulee olla niin suuri, että saadaan solu, jonka : : uusista synteettisistä ribonukleiini ha poista noin 10 °ί on peräisin P -promoottorista. Tällä tavoin on mahdollista ; kehittää kloonipankki, jossa funktionaalinen IFN-omeqa-.. sekvenssi on sijoittunut ribosomin sitoutumiskohdan lähei-‘ ‘ syyteen vaihte 1 evi1le etäisyyksille lambda-P -promoo11or ista. Nämä kloonit voidaan sen jälkeen tutkia ja selektoida · mitä korkeimmilla saannoilla.

. .·. IFN-omega-sekvenssin ekspressio ja translaatio voi tapahtua ·· myös sellaisten muiden säätelyjärjestelmien kontrollin alaisuudessa, jotka voivat olla transformoimattomassa muodossaan "homologisia" organismin kanssa. Siten sisältää esimerkiksi laktoosista riippuvan E. coli:n kromosomaalinen 20 90667 DNA laktoosi- eli lac-operonin, beta-galaktosidaasientsyymin muodostamisen kautta mahdollistaa laktoosin hajottamisen.

Lac-kontrollielementit voidaan saada lambda-plac5 baktee-rifaagista, joka infektoi E. coli:a. Faagin lac-operoni voidaan saada transduktoimalla samasta bakteerilajista. Säätelyjärjestelmät, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä, voidaan saada organismille ominaisesta plasmidi-DNA:sta. Lac-promoottori-operaattori-järjestelmä voidaan indusoida IPTG:11ä.

Yhtä hyvin voidaan käyttää muita promoottori-operaattori-järjestelmiä tai niiden osia: esimerkiksi arabinoosi-operaattori, kolisiini E^-operaattori, galaktoosi-operaattori, alkalinen fosfataasi-operaattori, trp-operaattori, ksyloosi-A-operaattori, tac-promoottori jne.

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää myös eukaryoottisia mikro-organismeja, kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae on useimmiten käytetty eukaryoottinen mikro-organismi, vaikkakin yleisesti on saatavissa joukko muitakin lajeja. Ekspres soitumista varten Saccharomyces-hiivassa : käytetään tavallisesti esimerkiksi plasmidia YRp7 (Stinchcomb f et ai. Natur 282, 39 ( 1979); Kingsman et ai., Gene 1_, 141 (1979 ); Tschumper et ai., Gene 1£, 157 (1980)) ja plasmidia YEp 13 (Bu/ach et ai., Gene 8_, 121-133 (1979)). Plasmidi YRp7 sisältää TRP1 -geenin, joka voi toimia selek-. · tiomarkkerina hiivamutantille, joka ei kykene kasvamaan tryptofaanipitoisessa alustassa; esimerkiksi ATCC n:o 44076.

.* ‘ TRPl-vaurion mukanaolo hiivaisännän genomin tunnusmerkkinä - voi olla tehokas apukeino transformaation osoittamisessa ·. viljeltäessä ilman tryptofaania. Asianlaita on täysin samoin plasmidin YLpll tapauksessa, joka sisältää hiiva-geenin *: LEU 2, jota voidaan käyttää LLU-2-minus-mutant m täydentä- • miseen. Hiivavektorei1le sopiviin promoottorisekvensseihin li 21 90667 kuuluvat ADH I:n geenin 5'-suoja-alue (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-Phosphoglycerate-Kinase (Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255 , 2073 ( 1980)) tai muut glyko1yyttiset entsyymit (Kawasaki ja Eraenkel, E3BRC 106 , 1107-1112 (1982 )), kuten enolaasi, qlyseraldehydi-3-fosfaatti, dehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaatti, dekar-boksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-iso-meraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja -glukokinaasi. Sopivia ekspressioplasmideja käytettäessä voidaan näiden qeenien kanssa assosioituvia päätesekvenssejä käyttää myös ekspres-sio-vektorissa eksprimoituvan sekvenssin 3 '-puoleisessa päässä mRNA:n polyadenylointiin ja päättämiseen.

Muita promoottoreita, joilla lisäksi on etuna kasvuolosuhteiden kontrolloima transkriptio, ovat alkoho1i-dehydroge-naasi-2:n geenin, isosytokromi C:n, hapanta fosfataasia hajottavien entsyymien, jotka kytkeytyvät typpimetaboliaan, edellä mainitun glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasin ja maltoosin ja galaktoosin käytöstä vastaavien entsyymien promoottori-alueet. Promoottoreita, joiden säätely tapahtuu hiivan Mating Typ Locus-kohdan avulla, esimerkiksi qeenien BAR1 , MFctl, STE2, STE3, STE5 promoottoreita voidaan käyttää lämpötilasäädellyissä järjestelmissä käyttämällä lämpötilasta : riippumattomia siv-mutaatioita. (Rhine PH.0., väitöskirja,

University of Oregon, Eugene,. Oregon (1979), Herskowitz ja Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, ; osa 1, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory).

Nämä mutaatiot vaikuttavat hiivan lepäävien Mating Typ-kasettien ekspressoitumiseen ja siten epäsuorasti Mating Typ-riippuvuussuhteisiin promoottoreista. Yleensä sopivia ovat kuitenkin kaikki plasmidivektorit , jotka sisältävät *. " hiivan kanssa sopivan promoottorin, alkuperäiset replikaatio-: ja terminaatiosekvenssit .

Mikro-organismien lisäksi sopivia isäntäorganismeja ovat '· myös monisoluisten organismien viljelmät. Periaatteessa voidaan käyttää jokaista tällaista viljelmää riippumatta 22 90667 siitä, onko se selkärankaisen eläimen tai selkärangattoman eläimen viljelmä. Suurin mielenkiinto kohdistuu kuitenkin selkärankaisten soluihin, ja viime vuosina selkärankaisten soluja on kasvatettu viljelmässä (kudosviljelmä) rutiini-menetelmällä (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse ja Patterson, toim. (1973)). Esimerkkejä tällaisista hyödyllisistä isäntäsolulinjoista ovat VERO- ja HeLa-solut, kulta-hamsterin munasarja (CHO)-solut ja W138, BHK, COS-7 ja MDCK-solulinjat. Näiden solujen ekspressiovektorit sisältävät tavallisesti (tarvittaessa) rep 1ikaatiokohdan, promoottorin, joka sijaitsee ennen eksprimoitavaa geeniä, yndessä jokaisen tarvittavan ribosomien sitoutumiskohdan kanssa, RNA-Splicing-kohdan, polyadenylisointikohdan ja transkriptio-naaliset terminaatio-sekvenssit.

Käytettäessä imettäväisten soluja useimmiten virusmateriaali pitää huolen ekspressiovektoriin kohdistuvasta kontrollifunktiosta. Tavallisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin Polyoma Adenovirus 2-viruksesta ja erityisen usein Simian Virus 40 (SV 40)-viruksesta. Erityisen hyödyllisiä ovat SV 40-viruksen aikaiset ja myöhäiset loppupro-moottorit, koska kumpikin voidaan saada helposti viruksesta palana, joka vielä sisältää SV 40-viruksen replikaatiokohdat " (Fiers et ai., Nature 273 , 113 (1978 )). Myös pienempiä : : : ja suurempia SV 40-viruksen paloja voidaan käyttää edel- : lyttäen, että ne sisältävät noin 250 bp pitkän sekvenssin, : joka ulottuu Hindlll-leikkauskohdasta Bql 1-leikkauskohtaan v i rus-r ep 1 ik aa t iok ohda ssa . Lisäksi on myös mahdollista ja usein suositeltavaa käyttää promoottori- tai kontrolli-. . sekvenssejä, jotka tavallisesti ovat liittyneet haluttuihin - - geenisekvensseihin edellyttäen, että nämä kontrollisekvenssit sopivat yhteen isäntäsolun järjestelmien kanssa.

Replikaatiokohta voidaan muodostaa joko vastaavan vektori-. konstruktion avulla muodostamalla eksogeeninen kohta, * " esimerkiksi SV 40-viruksesta tai muista viruslähteistä (esim. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, jne.) tai se voidaan 11 23 90667 muodostaa isäntäsolujen kromosomaalisten replikaatiomekanis-mien avulla. Jos vektori integroidaan isäntäsolun kromosomin kanssa, viimeksi mainittu toimenpide on useimmiten riittävä.

Geenit voidaan kuitenkin ilmentää parhaiten ekspressio-plasmidissa pER103 (E. Rastl-Dvi/orkin et ai., Gene 21, 237-248 (1983) ja EP-A-Q.115-613-tallennettu DSM-kokoelmaan numerolla DSM 2773 20. joulukuuta 1983), koska tämä vektori sisältää kaikki säätelyelementit, jotka johtavat kloonatun geenin suureen ekspressoitumiseen. Keksinnön mukaisesti korvataan siten plasmidissa pBR322 plasmidille ominainen lyhyt EcoRI/BamHI-pala DNA-sekvenssillä, jonka kaava on

EcoRI Sau3A

gaattcacgct GATC GC TAAAAC ATTGTGC AAAAAGAGGG TTGAC TTTGCC TTCGCGA 59 ^mRNA- alku Met ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116 RBS Hindlll

Cys Asp TGT GAT C--IFN-omega-geeni->

Sau3A 1 - · Keksinnön mukaisen tavoitteen saavuttamiseksi toimitaan kuvion 6 mukaisesti siten esimerkiksi seuraavasti: I. Tarvittavien yksittäisten DNA-palojen valmistaminen:

Pala a

Palan a) valmistamiseksi käsitellään restriktioendonuk-: leaasilla Avail plaemidi, joka sisältää IFN-omegan geenin,

esimerkiksi plasmidi P9A2. Kromatografoinnin ja saadun cDNA-insertin puhdistamisen jälkeen tämä käsitellään vielä ’· kaksi kertaa r es t r ik t ioendonuk 1 eaa se i 11 a Ncol ja AluI

ja sen jälkeen eristetään kromatografian ja elektroeluoinnin 24 90667 avulla. Tämä pala sisältää suurimman osan vastaavasta omega-interferoni-geenistä. Siten on esimerkiksi kloonin P9A2 omega (Gly )-interferoni-geenillä seuraava rakenne: 5 10 15

His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu c|CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 |

Ncol 20 25 30

Vai Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 35 40 45

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Vai Lys Gly AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 50 55 60

Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Vai Met Ser Vai Leu His Glu Met AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 65 70 75

Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 208 80 85 90 .-Ala "rp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His *,:®CC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 95 100 105 -'· Sln Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Vai Vai Gly • .-CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 110 115 120

Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 125 130 135

Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Vai Tyr Leu Lys Glu Lys Lys - 1 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 li:: 25 90667 140 145 150

Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Vai Val Arg Met Glu lie Met Lys TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 155 160 165

Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 170

Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATAC TATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGfct 802

Alul

Pala b :

Palan b) valmistamiseksi käsitellään plasmidi P9A2 restrik-tioendonukleaasi1la Avail. Saadun cDNA-insertin kromato-qrafoinnin ja puhdistamisen jälkeen tämä käsitellään uudelleen restriktioendonukleaasilla Sau3A ja haluttu 189bp pitkä pala eristetään kromatografiän ja elektroeluoinnin avulla.

; Tällä on seuraava rakenne: Z6 90667 5 10 15

Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu

IgAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 42

Sau3A| Ncol 20 25 30

Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Leu Cys Leu GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 87 35 40 45

Lys Asp Arg Arg Asp phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 132 50 55 60

Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Vai Met Ser Vai Leu His Glu Met ACG CAG TTG CAG AAG GGC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 177

Leu Gin Gin Ile CTG CAG CA|g a te 189

Sau3A| ' : : Pala c : - ; Palan c) valmistamiseksi käsitellään plasmidi pER33 (kts.

E. Rastl-Dworkin et ai., Gene 2_1, 237-248 (1983) ja EP-A-Q.115.613) kaksi kertaa re striktioentsyymei11ä EcoRI ja PvuII. Agaroosigee 1i-fraktioinnin ja puhdistamisen jälkeen saatu 389bp pitkä pala, joka sisältää Trp-promoottorin, ribosomaa1isen sitoutumiskohdan ja aloitus-kodonin, käsitellään sen jälkeen Sau3A-entsyymillä. Haluttu . 108bp pitkä pala saadaan agaroosigee1i-elektro for ees in, .!! elektroeluoinnin ja Elutip-pylväspuhdistamisen jälkeen.

'' Tällä on seuraa va rakenne: li 27 90667

EcoRI |Sau3A

gaa t tcac gc tEATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGAC TTTGCCTTCGCGA 59 ^jtiRNA- alku Met ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116 RES Hindlll

Cys Asp TGT gat c 123

Sau3A

Palojen b j a c liqitointi:

Palat b ja c ligatoidaan T4-ligaasilla ja entsyymin tuhoamisen jälkeen leikataan Hiridlll-entsyymillä. Tällä ligitoidulla palalla on seuraauu rakenne:

Hindin Sau3A Ncol ajAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 :·. CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAkqct t ; Sau3A Hind IIil Tämä plasmidin pRHWIO valmistamiseen tarvittava DNA-pala Λ*! voidaan vaihtoehtoisesti muodostaa myös käyttämällä kahta \ synteettisesti valmistettua oiigonuk1eotid ia : 28 90667

Oligonukleotidi, jonka kaava on 5’-AGCTTAAAGATGTGT-3' säilyy 5'-päässään de fosforyloitumatta.

Oligonukleotidi, jonka kaava on 5’-GATCACACATCTTTA-3’ kinaasikäsitellään 5'-paässä -po1ynuk1eotidikinaasin ja ATP:n avulla.

Kun molemmat oiigonukleotidit hybrid isoidaan, saadaan seuraava lyhyt DNA-pala: 5'-AGCTTAAAGATGTGT 3' 3'- ATTTCTACACACTAGp 5' Näin saadaan toiseen päähän HindHI entsyymille tyypillinen 5'-jatke ja toiseen päähän S au 3A-entsyymi 1le tyypillinen ,*; 5 1 - jatke .

' Pala b) de fos fory1 oidaan käyttämällä vasikansuolen fos-'.*·; fataasia. Pala b) ja edellä kuvattu pala viedään yhteen : : ja liitetään keskenään T^-ligaasin avulla.

Koska ligaasi tarvitsee vähintään ytiden 5 ' - f os f aa 11 ip i t oi sen : pään., voidaan liittää vain synteettinen DNA-pala palan b) kanssa tai myös kaksi synteettistä palaa Sau3A-päissään. Koska kummankin saadun palan pituudet, ovat erilaiset, : ne voidaan erot taa selektiivisellä isopropano 1 isaostuksella .

: : Näin puhdistettu pala fosforyloidaan f^-polynuk1eotidi - ; kinaasilla ja MP:llä.

li 29 90667 II. Ekspressioplasmidin valmistaminen a) Plasmidin pRHWIO valmistaminen:

Ekspressioplasmidi pERl03 (E. Rastl-Dworkin et al.f Gene 21, 237-284 (1983) ja EP-A-0.115.613-tallennettu ΟςΜ-kokoelmaan DSM-numerolla 2773) linearisoidaan Hindlll-entsyymillä ja käsitellään sen jälkeen vasikansuolen fosfa-taasilla. Näin saadun DNA:n eristämisen ja puhdistamisen jälkeen tämä defosforyloidaan ja sen jälkeen ligitoidaan ligitoitujen palojen b ja c kanssa (niiden Hindlll-käsittelyn jälkeen). Tämän jälkeen E. coli HB 101 transformoidaan saadulla ligaatioseoksella ja viljellään LB-agarilla, jossa on 30 ug/ml ampisi11iinia . Halutun rakenteen omaavalle plasmidille annetaan merkinnäksi pRHW 10 (kts. kuvio fa).

Sen replikoinnin jälkeen sitä käytetään välituotteena muiden plasmidien valmistuksessa.

b) Plasmidin pRHW12 valmistaminen:

BamHI-entsyymillä leikattuun plasmidin pRHWIO lisätään DNA-polymeraasin I Klenow-pala ja neljää deoksinukleo-. " siditrifosfaattia. Inkuboinnin jälkeen saatu linearisoitu, ;;/ tylpillä päillä varustettu plasmidi puhdistetaan ja leikataan '·' ’ sen jälkeen Neo I-en t syy mi 1 la . Suurempi pala, joka saadaan '· ag ar oos igee 1 i-e lek t ro f orees in , elek t roel uoinnin ja Elutip- " puhdistamisen jälkeen, ligatoidaan palan a kanssa. Tämän : : jälkeen ligaatioseos transformoidaan E. coli HB 101 bakteerin kanssa ja viljellään LB-aqarilla, jossa 50 ug/ml ampisil-: liinia. Halutun rakenteen omaavalle plasmidille annetaan nimeksi pRHW12 (kts. kuvio 6), joka ilmentää halutun omega(G ly)-interferonin. 1 1 näin saatua bakteeri viljelmää (optinen tiheys: 0,6, : 600 nm) sisältää esimerkiksi I x 10^ kansainvälistä mter- ____: feroniyksikköä.

3D 90667 c) Plasmidin pKIIWli valmistuminen:

BamHT-entsyymillä leikattuun plasmidiin prHWIO lisätään DNA-polymeraasin I Klenow-pala ja 4 desoksinukleosiditri-fosfaattia. Inkuboinnin jälkeen saatu linearisoitu, suorilla päillä varustettu plasmidi puhdistetaan ja leikataan sen jälkeen Ncol-entsyymillä. Suurempi pala, joka saadaan agaroosigeeli-elektroforeesin, elektroeluoinnin ja Elutip-pundistamisen jälkeen, ligitoidaan plasmidista E79E9 analogisesti saadun palan a kanssa, jossa vain 111. aminohap-poa(Gly) koodaava GGG-kodoni on korvattu GAG-kodonilla (Glu). Sen jälkeen saatu ligaatioseos transformoidaan f. coli HB 101 bakteerin kanssa ja viljellään LB-aqarilla. Halutun rakenteen omaavalle plasmidille annetaan nimeksi pRHWll (kts. analogisesti kuvion 6 kanssa), joka eksprimoi halutun omega(G1u)-interferonin.

Solujen transformointl vehlkke 1 ei11ä voidaan saada aikaan monella menetelmällä. Se voi tapahtua esimerkiksi kalsiumin avulla, jolloin joko solut pestään magnesiumissa ja DNA lisätään kalsiumiin suspendoituihin soluihin tai solut käsitellään DNA:n ja kalsiumfosfaatin ko-sakalla. Seuraavassa geenin ekspressiossa siirretään solut alustoille, jotka -· · selektoivat transformoidut solut.

Kun isäntä on transformoitu, geeni ekspressoitu tai fer-; : mentoitu tai viljelty soluja olosuhteissa, joissa IFN-omega ;; ekspressoituu, voidaan tuote tavallisesti uuttaa tunnetuilla kromatograaf isi1la erotusmenetelmillä, jolloin näin saadaan : materiaalia, joka sisältää omega-interferonia, jossa on --. Leader- ja Tailing-sekvenssejä tai näitä ei ole. IFN-omega voidaan eksprimoida Leader-sekvenssi11ä N-päässä (Pre-IFN-omega) , joka voidaan poistaa joistakin isäntäso-: luista. Jos näin dj voi tehdä, tarvitaan valmiin IFN-omegan .·. : saamiseen Leader-poiypeptidin (kun se on mukana) lohkaiseminen ____. pois. Vaihtoehtoisesti voidaan IFN-omega-klooni modifioida li

Ji 90667 siten, että mikro-organismissa muodostuu suoraan valmista proteiinia Pre-IFN-omegan asemesta. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää hiivan Mating-Pheromon-MF-a 1 fa-1:n prekur-sori-sekvenssiä, jolla mahdollistetaan fuusioituneen proteiinin oikea "valmistuminen11 ja tuotteen eroaminen kasvualustaan tai veriplasmiseen tilaan. Funktionaalisen tai valmiin IFN-omegan DNA-sekvenssi voi olla liitetty MF-alfa-1:11a oletettuun katepsiinin tapaiseen leikkauskohtaan (Lys-Arg-aminohappojen jälkeen) aloituskodonista ATG lähtien paikassa 256 (Kurjan, Herskowitz, Cell 3_0, 933-943 (1982)).

Biologisen vaikutuskirjonsa perusteella voidaan uusia keksinnön mukaisia interferoneja käyttää kaikenlaisissa hoidoissa, joissa käytetään myös tunnettuja interferoneja. Näihin kuuluvat esimerkiksi herpes, rinovirus, sopivat AID5-infektiot, erilaiset syöpälajit ja vastaavat. Uusia interferoneja voidaan käyttää yksinään tai yhdistelmänä muiden tunnettujen interferonien tai biologisesti aktiivisten tuotteiden, esimerkiksi IFN-alfa:n, IL-2:n, muiden immuno-modu1 aattoreiden ja vastaavien kanssa.

IFN-omegaa voidaan antaa parenteraalisesti tapauksissa, joissa tarvitaan tuumorien tai virusten vastaista hoitoa, : ja tapauksissa, joissa on kyse immunosupressiivisista : : . ominaisuuksista. Annostus ja annostelumäärät voivat olla samoja kuin tähän mennessä IFN-a-materiaalien kliinisissä : tukimuksissa , esimerkiksi noin (1-10) x 10^ yksikköä päivässä ja preparaateilla, joiden puhtaus on yli 1 %, esimerkiksi 5 x 10^ yksikköä päivässä asti.

•Kun on kysymys oleellisesti homogeenisesta, bakteereiden **' tuottamasta IFN-omegasta, voidaan tarkoituksenmukaistaa annostusmuotoa varten esimerkiksi liuottaa parenteraalisessa käytössä 3 mg IlN-omegaa 25 ml : aan 5-p rosen 11 is t a ihmisen see rum ialbumiin m. lama liuos johdetaan sen jälkeen bakterio-- · logisen suodattimen läpi ja suodatettu liuos täytetään 32 90667 aseptisesti 100 pikkupulloon, joista jokainen sisältää 6 x 10^ yksikköä parenteraaliseen appiikointiin sopivaa puhdasta IFN-omegaa. Ennen käyttöä pulloja säilytetään parhaiten kylmässä (-20°C). Keksinnön mukaiset aineet voidaan formuloida tunnetulla tavalla niin, että saadaan farmaseuttisesti käyttökelpoisia aineita. Keksinnön mukainen polypeptidi sekoitetaan tällöin farmaseuttisen, hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa. Tavallisia kantajia ja niiden formulointeja on kuvannut E.W. Martin kirjassa: Remingtom's Pharmaceutical Sciences, joka tässä mainitaan viitteenä. Omega-interferonin kanssa sekoitetaan mitattu määrä kantajaa niin, että saadaan sopivia farmaseuttisia aineita, joita vastaanottaja (potilas) voi tehokkaasti käyttää. Parhaana pidetään parenteraalista anta-mistapaa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä yksityiskohtaisesti. Esimerkki 1 IFN-sekvenssille spesifisten kloonien löytäminen a) cDNA-kiriaston valmistaminen

Sendai-viruksi1 la stimuloiduista soluista saatua mRNA:ta käytetään lähtöaineena valmistettaessa cDNA-kirjasto kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (E. Dworkin-Rast1 et ai., Journal of Interferon Research Voi 274, 575-585 (1982)).

Saadut 30.000 kloonia siirretään yksitellen mikrotiitterilevy-jen kaivoihin. Pesäkkäiden kasvuun ja pakastamiseen käytetään seuraavaa alustaa: n ” 90667 10 g Tryptoni 5 g Hiivauute 5 g NaC 1

0,51 g Na-sitraatti x 2 H^O

7,5 g K2HP04 x 2 f^O 1,8 g KH2P04 0,09 g MgS04 x 7 ^0 0,9 g (NH4)2504 44 g glyseriini 0,01 g Tetrasykliini x HC1 ad 1 1 H20

Yksittäisiä klooneja sisältäviä mikrotii11eri1 evyjä inkuboidaan yön yli 37°C:ssa ja sen jälkeen säilytetään -70°C:ssa.

b ) Hybridisointikoetin

Hybridisointikoettimen lähtöaineena toimii rekombinantti-plasmidi pER33 (E. Duforkin-Rastl et ai., Gene 2_1, 237-248 (1983)). Tämä plasmidi sisältää alueen, joka koodaa valmista interferoni lFN-a2arg ja 190 3'-ei-translatoidun alueen • emästä. 20 ug plasmidia pER33 ja 30 yksikköä Hindlll- restriktioendonukleaasia inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 200 ul:ssa reaktioliuosta (10 mM Tris-HCl pH-7,5, 10 mM Mg Cl « ·. 4 . 1 mM ditiotreitoli (OTT), 50 mM NAC1. Reaktio lopetetaan " lisäämällä 1/25 voi. 0,5 M ety1eenidinitrilotetraetikkehappoa (EDTA) ja kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa. Lisätään 1/4 voi. 5 x puskuria (80 ?ό glyseriini, 40 mM tris-etikkahappo pH = 7,8, 50 mM EDTA, 0,05 % natriumdodekyy1isu1 faa11i (5DS), 0,1 % bromi fenolisininen) ja muodostuneet palat erotetaan · -' : suuruuden perusteella elektroforeettisesti 1-prosenttisessa agaroosigeelissä /Geeli- ja ajopuskuri (TBE): 10,8 g/1 -trishydroksimetyyliaminometaani ( tris-enäs ) , 5,5 q/1 tris- hydroksimetyyliaminometaani (tris-emäs), 5,5 g/1 boorinappo, 0,93 g/1 EDTA/. Geeliä inkuboidaan 0,5 ^ug/ml etidiumbro-midiliuoksessa, minkä jälkeen DNA-vyöhykkeet tehdään UV-valossa näkyviksi ja IFN-geeni-pitoisen DNA-palan (noin 800 bp 34 90667 pitkä) sisältävä geelialue leikataan irti. Jännitettä käyttämällä elektroeluoidaan DNA 1/10 x IBL-puskuriin. DNA-liuos uutetaan kerran fenolilla ja neljä kertaa eetterillä ja DNA seostetaan vesiliuoksesta -20°C:ssa lisäämällä 1/10 vo. 3 M natriumasetaattia (NaAc) pH-5,8 ja 2,5 voi. etanolia. Sentrifugoima1 ia tapahtuneen erottamisen jälkeen DNA pestään kerran 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan 5 minuuttia tyhjössä. DNA otetaan 50 ul:an vettä (noin 50 Lig//Ul). Tämä DNA leimataan radio a kti ι vise sti N ie k-tra n s latoima11 a (τ· Maniatis'in et ai., menetelmän modifikaatio, Molecular Cloning, toim. CSH). 50 /ui inkubaatio 1iuosta sisältää: 50 mM Tris pH=7,8, 5 mM MgCl^, 10 mM merkaptoetnao1i, 100 ng pER33:n inertti-DNA, 16 pg DNasel, 25 ^uMol dATP, 25 yjMol dGTP, 25 ^Mol dllP, 20 jjCi a32P-dCTP (> 3000 Ci/mMol) sekä 3 yksikköä DN A-po1ymera a si 1 ( E . c o 1 i ) . Inkubointi suoritettiin 140 C : s s a 45 minuutin aikana. Reaktio lopetetaan lisäämällä 1 voi. 50 mM EDTA, 2 % SDS, 10 mM Tris pH = 7,6-liuosta ja kuumentamalla 70°C;ssa 10 minuuttia. DNA erotetaan sitoutumattomasta radioaktiivisuudesta kromatograafisesti Sephadex G-100 pylväässä TE-puskurissa (10 mM Tris pHr8,0, 1 mM EDTA). Radioaktiivisesti leimatun koettimen spesifinen aktiivisuus on noin 4 x 10^ cpm/jug.

c) IFN-qeeni-pitoisen insertin seulominen klooneista ' M ik r o t i i 11 e r i le v y i ss ä pakastetut ba k t eer i v i 1 j e lmät sulatetaan : ·'; (a). LB-aqarin (LB-Agar: 10 g/1 tryptoni, 5 g/1 hiivauute, . 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Bacto-agar, 20 mg/1 te t rasy k 1 i i ni-HC 1) päälle laitetaan vastaavan kokoinen nitro se 11u1oosasuodatinpala . . (Schleicher und Seniili, BA 85, huokoskoko 45 um). Mikro- t i i 11 er l le v y lh i n sopivan leimasimen avulla siirretään yksittäiset kloonit n11rose1luloosasuoda11ime 1 le. Bakteerit : kasvavat yön aikana 37°C:ssa halkaisijaltaan noin 5 mm : suuruisiksi pesäkkeiksi. Bakteereiden tuhoamiseksi ja DNA:n . denaturoitumiseksi asetetaan nitroselluloosasuodattimet leimasimen päälle seuraavilla liuoksilla kostutetun Whatman li 35 90667 3MM suodattimen kanssa: 1) 8 minuuttia 0,5 M NaOH:lla, 2) 2 minuuttia 1 M Tris pH = 7,4, 3) 2 minuuttia 1 M Tris pH = 7,4 ja 4) 4 minuuttia 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris pH = 7,4. Suodattimet kuivataan ilmassa ja sen jälkeen pidetään 2 tuntia 80°C:ssa. Suodattimien esikäsittely tapahtui 4 tunnin aikana 65°C:ssa hybridisointiliuoksessa, jonka koostumus oli: 6 x SSC (1 x SSC vastaa 0,15 M NaCl; 0,015 M trinatriumsit-raatti; pH = 7,0), 5 x Denhardt'in liuos ( 1 x Denhardt'in liuos vastaa 0,02 % PVP (polyvinyylipyrrolidoni); 0,02 %

Picoll (mp.: 40.000 D); 0,02 % BSM (Bovine Serum Albumine) ja 0,1 % SDS (natriumdodekyylisulfaatti). Noin 1 x 106 cpm/suoda-tin kohdassa b) valmistetussa koettimessa denaturoidaan keittämällä ja lisätään hybridisointi1iuosta. Hybridisointi tapahtuu 16 tunnin aikana 65°C:ssa. Suodatin pestään 65°C:ssa 4 kertaa tunnin ajan 3 x SSC/0,1 5 SDS-liuoksella. Suodattimet kuivataan ilmassa, peitetään Saran Wrap-peitteel1ä ja valotetaan Kodak X-OmatS-fiImi 11ä.

Esimerkki 2

Southern-hvbridisaatio IFN-oeeni-pj toisten rekombinantti-plasmidien toteamiseksi

Positiivisista tai positiivisesti uskotuista pesäkkeistä ' kasvatetaan 5 ml viljelmiä L-liemessä (10 g/1 tryptoni, :/.[ 5 g/1 hiivauute, 5 g/1 NaCl, 20 mg/1 tetrasykliini x HCl) : ·"; yön yli 37°C:ssa. Plasmidi-DNA modifioidaan Briboim'in ja

Doly'n menetelmällä (Nucl. Acid Res. 7., 1513 (1979)) ja eristetään. Solut sentrifugoidaan erilleen 1,5 ml:sta suspensiota (Eppendorf-sentrifuugi) ja suspendoidaan 0°C:ssa uudelleen ;- 100 ul:aan lysotsyymiliuosta, jonka koostumus on: 50 mM glu- koosi, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH = 8,0 ja 4 mg/ml lysot-syymi. Inkuboidaan 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen lisätään 2 tilavuusosaa jääkylmää 0,2 M NaOH, 1 % SDS-liuosta ja inkuboidaan vielä 5 minuuttia. Tämän jälkeen - lisätään 150 μΐ jääkylmää kaiiumasetaatti 1 iuosta pH = 4,8 ja inkuboidaan 5 minuuttia. Saostuneet solun ainesosat 56 9 0 6 6 7 erotetaan sentri f uyoiinalia. DNA-liuos uutetaan 1 lilavuusosaila feno 1i/kloro form ia (1:1) ja DNA seostetaan lisäämällä 2 tilavuus osaa etanolia. Sentrifuyoimullu tapailtu noen erottamisensa jälkeen pelletti pestään kerran 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan 5 minuuttia tyhjössä. DNA liuotetaan 50 jj Iraan ( TL)-puskuria. Iästä 10 pl:n suuruinen erä käsitellään 1 tunnin ajan 37°C:ssa 10 yksiköllä Pstl-restrik-tioendonukleaasia 50 ^ilrssa reak t i o 1 i uos t a (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM MqCl2, 50 mM NaCl, 1 mM OTT). Lisätään 1/25 tilavuusosaa 0,5 H LDTA ja 1/4 tilavuusosaa 5 x puskuria (kts. esimerkki Ib)) ja sen jälkeen kuumennetaan 10 minuuttia 70°C:ssa ja tämän jälkeen DNA erotetaan e 1ektro foree11isesti 1-prose n11isessa agarosigeelissä (TBE-puskuri ) . Agaroosigee1 in DNA siirretään Southern'in menetelmällä (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 9J3_, 5U3-517 (1975)) n itrose 1 lu 1 oos asu oda 11 ime 1 le . Geelin DNA denaturoidaan inkuboimalla geeliä 1 tunti yhdessä 1,5 M NaCl/0,5 M Na0H-l iuoksen kanssa, laman jälkeen liuos neutraloidaan yhden tunnin aikana 1 M Tris x Hai pH = 8/1,5 M NaC 1-1iuokse1la. DNA siirretään 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M natriumsitraatti, pH=7,0) liuoksen kanssa nitrosellu-1 o osasuoda11ime 11 e. Täydellisen siirtymisen tapahduttua (noin 16 tuntia) suodatin huuhdellaan hetken aikaa 6 x SSC-puskurissa, sen jälkeen kuivataan ilmassa ja lopuksi paistetaan : 2 tuntia 80°C:ssa. Suodatin es ik äs i te 1 lään neljän tunnin • : - ajan 6 x 5SC/5 x Denhardt’in liuos/0,1 % SDS (kts. esimerkki : ·.: le )-1 iuoksel la 65°C:ssa. Noin 2 x 10^ cpm hybridisointikoet- : timesta (kts. esimerkki Ib) denaturoidaan kuumentamalla .·.·. 100°C:ssa ja sen jälkeen lisätään hy bridisoint i 1 i uokseen .

Hybridisointiaika on 16 tuntia 65°C:ssa. Sen jälkeen suodatin . . pestään 4 x 1 tunnin ajan 65°C:ssa 3 x SSC/0,1 % S D S - liuoksella. Ilmassa kuivaamisen jälkeen suodatin peitetään • ’ Saran Wrap-peitteellä ja valotetaan Kodak X-0matS-fllmillä.

Esimerkki 3 ‘ Interferoniaktilvisuuden osoittaminen kloonissa E76E9 li 3, 90667 100 ml kloonin E76D9 viljelmää kasvatetaan L-liemessä (10 g/1 tryptoni, 5 g/1 hiivauute, 5 g/1 NaCl, 5 g/1 glukoosi, 20 mg tetrasykliini x HCl pro 1) 37°C:ssa optiseen tiheyteen Agoo = 0,8 asti. Bakteerit erotetaan sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 7000 kierr./min., pestään kerran 10 mM Tris x HCl pH = 8,0, 30 mM NaCl-1iuoksella ja suspendoidaan uudelleen 1,5 ml:aan kasvuliuosta. Inkuboidaan 0°C:ssa puoli tuntia 1 mg/ml lysotsyymin kanssa, minkä jälkeen bakteeri-suspensio pakastetaan ja sulatetaan viisi kertaa. Solujään-nökset pelletoidaan sentrifugoimalla tunnin ajan nopeudella 40.000 kierr./min. Supernatantti sterii1isuodatetaan ja siitä tutkitaan interferoniaktiivisuus. Testinä käytetään plakkites-tiä V3-soluilla ja Vesicular Stomatitis-viruksi 11 a (G.R. Adolf et ai., Arch. Virol. 72., 169-178 (1982)). Klooni tuottaa yllättäen jopa 9000 IU interferonia/1itra 1ähtövi1jelmää.

Esimerkki 4

Genominen Southern Blot-testi uusia sekvenssejä sisältävi_en geenien lukumäärän määrittämiseksi a) DNA:n eristäminen Namalwa-soluista : 400 ml Namalwa-soluvi 1 jelmää sentrifugoidaan solujen pelletoi- miseksi JA21-sentrif uugissa nopeudella 1000 kierr. /min. Saadut : pelletit pestään varovasti suspendoimal 1 a nämä uudelleen NP40-puskuriin (NP40-puskuri: 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris/Cl pH = 7,4) ja pelletoidaan uudelleen nopeudella 1000 kierr./min. Saadut pelletit suspendoidaan uudelleen 20 ml:aan NP40-puskuria ja soluseinämät hajotetaan lisäämällä 1 ml 10-prosenttista NP40-liuosta. Seisotetaan 5 minuuttia jäähauteessa, minkä jälkeen ehjät solutumat pelletoidaan : : : sentrifugoimalla nopeudella 1000 kierr./min. ja supernatantti heitetän pois. Solutumat suspendoidaan uudelleen 10 ml:aan * _ liuosta, jonka koostumus on: 50 mM Tris/Cl pH = 8,0, 10 mM *.**: EDTA ja 200 mM NaCl, ja sen jälkeen lisätään proteiinien 38 90667 poistamiseksi 1 ml 2U-prosenltistu SD5- 11 uoota . Saatu viskoo-sinen liuos uutetaan kaksi kertaa yhtä suurella määrällä fenolia (kyllästetty 10 mM Tris/Cl pH = 8,0-puskuri11 a) ja kaksi kertaa kloroformilla. DNA saostetaan lisäämällä etanolia, erotetaan sentrifugoimalla ja sen jälkeen saatu DNA-pelletti pestään kerran 70-prosenttisella etanolilla. Kuivataan tyhjössä 5 minuuttia ja liuotetaan 6 ml:aan TE-puskuria (TE-puskuri: 10 mM Tris/Cl pH=8,0, 1 mM EDTA). DNA:n kon-sentraatio on 0,8 mg/ml.

b) Namalwa-soluista saadun DNA:n restriktio-endonukleaasi-käsittely

Restriktio-endonukleaasi-käsittelyt suoritetaan kulloinkin valmistajan (New England Biolabs) antamissa olosuhteissa.

1 pg DNA:ta käsitellään 2 yksiköllä sopivaa restriktio-endonuk 1 eaasla 10 jjl:n tilavuudessa 37°C:ssa 2 tunnin tai pidemmän ajan kuluessa. Restriktio-endonukleaaseina käytetään EcoRl, Hindlll, BamHl, Sphl, PstI ja Clal entsyymejä. Jokaisessa käsittelyssä käytetään 20 jjg DNArta. Käsittelyn täydellisyyden toteamiseksi erotetaan aina reaktion alussa • ·'. 10 ^j1 (tasaosa) ja lisätään 0,4 ^ig lambda-f aagi-DNA: ta .

. .·. 2 tunnin inkuboinnin jälkeen nämä tasaosat kontrolloidaan agaroosi-geeli-elektroforeesin avulla ja käsittelyn täydel-, lisyys arvioidaan värjättyjen lambda-faagi-DNA-palojen * kuvion avulla.

: Tämän kontrollin suorittamisen jälkeen pysäytetään reaktiot lisäämällä EDTArta 20 mM loppukonsentraatioon ja kuumentamalla liuosta 10 minuuttia 70°C:ssa. DNA saostetaan lisäämällä 0,3 M NaAc pH = 5,6 ja 2,5 tilavuusosaa etanolia. Inkuboidaan 30 minuuttia -70°C:ssa, minkä jälkeen DNA pelletoidaan ··' Epppendorf-sentrifuugissa, pestään kerran 70-prosenttisella ·-·’ etanolilla ja kuivataan. Saatu DNA otetaan 30 Risaan TE-: puskuria.

li 39 90667 c) Geelielektroforesi ja Southern-siirto Käsitellyt DNA-koettimet fraktioidaan kokonsa perusteella 0,8-prosenttisessa agaroosi-geelissä TBE-puskurissa (10,8 g/1 Tris-emäs, 5,5 g/1 boorihappo, 0,93 o/l EDTA). Tätä varten 15 pi kanssa DNA-koetinta sekoitetaan 4 ^il kuormitus-puskuria (0,02 % 5D5, 5 x TBE-puskuri, 50 mM EDTA, 50 % glyseriini, 0,1 % bromifenolisininen) , kuumennetaan hetki 70°C:ssa ja laitetaan varattuihin geelialtaisiin. Vastaavaan altaaseen laitetaan EcoRI ja HindllI-entsyymeillä leikattua lambda-DNA;ta, jolloin se toimii DNA:n suuruuden markkerina. Geelielektroforeesi suoritetaan 24 tunnin aikana noin 1 V/cm jännitteellä. Tämän jälkeen DNA siirretään Southern'in menetelmällä nitrose 1luloosasuoda11imelle (Schleicher und Schuell BA85), jolloin siirtopuskurina käytetään 10 x SSC (1 x ^SC: 150 mM trinatirumsitraatti , 15 mM NaCl, pH=7,0)-puskuria. Suodatin kuivataan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen tätä kuumennetaan 2 tuntia 80°C:ssa DNAsn sitomiseksi suodattimeen.

d) Hybridisointikoetin

20 yq plasmidia P9A2 leikataan Avall-entsyymillä, jolloin ' vapautuu noin 1100 bp pitkä pala, joka sisältää koko cDNA-insertin. Tämä DNA-pala leikataan uudelleen entsyymillä Sau3A ja AluI ja suurin DNA-pala eristetään aqaroosi-geeli-elektroforeesin (kts. kuvio 5b) jälkeen elektroeluoinnin : : ja Elutip-py 1 väskromatogra f iän avulla. Näin saatu DNA

(1,5 yjg) liuotetaan 15 ^iltaan vettä.

20 ug plasmidia pER33 leikataan Hindll I-entsyymillä, jolloin tämä IFN-a2-Arg:n ekspressioplasmidi (E. Rasti.-Dworkin et ai. Gene 2_1, 237-248 (1983)) leikkautuu kaksi kertaa. Pienempi DNA-pala sisältää interferoni-a2-Args n geenin : ja eristetään samalla tavoin plasmidin P9A2 tapauksessa.

Molemmat DMA:t Nick-translatoidaan P.W.J. Rigby'n et ai.

40 9 0 6 6 7 ehdottamalla menetelmällä (J. Mol. Biol. 113, 237-251 (1977)). Nick-translaatίο suoritetaan kulloinkin käyttämällä 0,2 )jg DNA:ta 50 ultssa liuoeta, jonka koostumus on: 1 x Nick-puskuri (1 x Nick-puskuri: 50 mM Iris/Cl p H = 7,2 , 10 mM MgSO^, 0,1 mM DTT, 30 pg/ml BSA), kulloinkin 100 uMol dATP, dGTP ja d Γ T P , 150 uCi a-^P-dCTP (Arnersham, 3000 Ci/mMol) ja 5 yksikköä DNA-polymeraasi I (Boehringer-Mannheim, Nick-tra Is aatio-1 aatu). Kun reaktioseosta on pidetty 2 tuntia lA°C:ssa, pysäytetään reaktio lisäämällä yhtä suuri määrä EDtA-liuosta (AO mMol) ja reagoimaton radioaktiivinen aines erotetaan G 50-py1väskromatografiän avulla TE-puskunssa . Jäljelle jäänyt spesifinen radioaktiivisuus on noin 100 x 10 ^ cpm/jjg DNA.

e ) Hybridisointi ,ja au torad ioq ra f ia N it rose 1luloosasuodatin leikataan kahteen puoliskoon. Jokainen puolisko sisältää identtisen jälkiryhmän, jossa on Namalvi/a-DNA: ta , joka, kuten esimerkissä Aa on mainittu, on käsitelty restriktio-entsyymi 11ä. Suodattimet esihybri-disoidaan 2 tunnin ajan 65°C:ssa liuoksessa, jonka koostumus on: 6 x SBC, 5 x Denhardt'in liuos (1 x Dernhardt'in liuos: 0,02 S naudanseerumi-albumiini (BSA), 0,02 % poly-:: vinyylipyrrolidorii (PVP), 0,02 % Ficoll A00), 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml denaturoitu vasikant ymus-DNA ja 10 mM EDTA.

: Hybridisointi suoritetaan liuoksessa, jonka koostumus on: 6 x SBC, 5 x Denhardt'in liuos, 10 mM EDTA, 0,5 % SD9 ja noin 10 x 10u cpm nick-translatoitu DNA, 16 tunnin aikana 65°C:ssa. Puolet suodattimesta hybndisoidaan inter-feroni-u2-Arg-DNm: L1 a ja toinen puoli interferoni-DNA:11 a, joka on eristetty plasmidista P 9 A 2 . Hybridisoinnin jälkeen : molemmat suodattimet pestään huoneen lämpötilassa neljä kertaa liuoksella, jonka koostumus on 2 x S S C ja 0,1 ?ό ·- SDS, ja sen jälkeen kaksi kertaa A5 minuutin aikana 65°C;ssa liuoksella, jonka koostumus on 0,2 x SSC ja 0,01 % SDS.

Tämän jälkeen suodattimet kuivataan ja valotetaan Kodak X-0mat S-kalvollu.

41 90667

Esimerkki 5

Ekspressioplasmidien pRHW 12 ja pRHW II valmistaminen Esihuomautus:

Ekspressioplasmidien valmistaminen on esitetty kuviossa 6 (mittakaava ei oikea). Kaikki restriktioentsyymikäsi11e lyt suoritetaan entsyymin valmistajan tietojen mukaisesti.

a) Plasmidin pRHW 10 valmistaminen 100 pg plasmidia P9A2 käsitellään 100 yksiköllä restriktio-endonukleaasia Avail (New Englands Biolabs). Käsittelyn jälkeen entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 70°C:een ja saadut palat fraktioidaan koon perusteella 1,4-pro-senttisessa agaroosigeelissä TBE-puskurilla (TBE-puskuri: 10,8 g/1 Tris-emäs, 5,5 o/l boorihappo, 0,93 q/1 EDTA).

Koko cDNA-insertin sisältävä vyöhyke elektroeluoidaan ja puhdistetaan E lutip-py1väässä (Schleicher 4 Chuell). Qaadusta 20 pg:sta käsitellään 6 ^ig suuruinen erä uudelleen restriktio-endonukle aa si11 a Sau3a (20 yksikköä yhteensä 100 pl:lla liuosta). Palat erotetaan 2-prosen11ise11 a agaroos igee 111 la TBE-puskurissa . Etidiumbromidilla (EtBr) suoritetun värjäämisen jälkeen elektroeluoidaan 189 bp ‘ pitkä DNA-pala ja puhdistetaan edellä kuvatulla tavalla .* (= pala b kuviossa 6).

Jotta interferonigeeniin voitaisiin liittää promoottori, ribosomaa 1inen sitoutumiskohta ja aloituskodoni, eristetään . vastaava DNA-pala ekspressioplasmidista pER 33 (E. Rasti-Oworkin et ai., Gene 21_, 237-248 (1983)). Tätä varten käsitellään 50 jug pER 33-plasmidia kaksi kertaa restriktio-entsyymeillä EcoRI ja PvuII ja saadut palat fraktioidaan :**: koon perusteella 1-4,-prose n Etisessä ugaroosi-geelissä - . TBE-puskurissa. 389 bp pitkä DNA-pala, joka sisältää Trp-) promoottorin, ribosomaalisen sitoutumiskohdan ja aloitus- 42 9 0 6 6 7 kodonin, elektroeluoidaan ja puhdistetaan Eiutip-py1väässä. Mäin saatu pala käsitellään sen jälkeen Sau3A-entsyymi11ä ja haluttu 108 bp pitkä pala saadaan agaroosi-qee1ι-elektroforeesin, elektro-eluoinnin ja Elutip-pylväs-puhdistamisen jälkeen noin 100 ng saannolla (= pala c kuviossa 6).

20 ng palaa b ja 20 ng palaa c ligatoidaan 18 tunnin aikana 14°C:ssa AO pl:n tilavuudessa käyttämällä 10 yksikköä T4-ligaasia liuoksessa, jonka koostumus on: 50 mM Tris/Cl pH=7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT ja 1 mM ATP. Tämän jälkeen entsyymi tuhotaan kuumentamalla 7Q°C:een ja saatu DNA leikataan Hind 111-entsyymillä 50 pl:n kokonaistilavuudessa.

10 pig ekspressioplasmidia pER 103 (E. RAst l-Dwork in et ai., Gene 2_1, 237-248 ( 1983)) linearisoidaan Hindlll-entsyymillä 100 pi:n kokonaistilavuudessa. Seosta pidetään 2 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen lisätään 1 tilavuus 2 x fosfataa slpuskuria (20 mM Tris/Cl pH=9,2, 0,2 mM FDTA) yhden yksikön kanssa vasikansuolen fosfataasia (C1P).

Pidetään 30 minuuttia 45°C:ssa, minkä jälkeen lisätään vielä yksi yksikkö CIP-fosfataasia ja inkuboidaan vielä 30 minuuttia. Näin saatu DNA puhdistetaan uuttamalla kaksi - kertaa fenolilla, kerran kloroformilla ja saostamalla lisäämällä 0,3 M natriumasetaattia (pH=5,5) ja 2,5 voi. etanolia. Sen jälkeen de fosfory1 oidaan, jotta estettäisiin seuraavassa 1igat nintivaiheessa vektorin uudelleen ligätoi-tuminen.

100 ng li nearisoitua pER 103-plasmidia ja ligatoituja paloja b ja c ( H ind 111-käsi t tely n jälkeen) lisätään 100 piiraan liuosta, joka sisäätää ligaasipuskuria, ja ligatoidaan \ T^-DNA-1igaasilla 18 tuntia 14°C:ssa.

;·’ Sekoitetaan 200 ^j1 kompetentteja E. coli HB 101-bakteereita li m . 90667 (E. Dworkin el ai., Dev. Biol. 7£, 435-448 (1980)) ja 20 ^il ligatoint iseosla ja inkuboidaan 45 minuuttia jäillä. Tämän jälkeen 0NA:n siirtyminen saatetaan loppuun lämpöshokin avulla (2 minuuttia 42°C:ssa). Solususpensiota inkuboidaan vielä 10 minuuttia jäillä ja sen jälkeen suspensio levitetään LB-agarille (10 q/1 tryptoni, 5 g/1 hiivauute, 5 g/1 waCl, 1,5 % agar), joka sisältää 50 mgl ampisi11iinia. Saatujen 24 pesäkkeen sisältämät plasmidit eristetään Birnboim'in ja Doly'n (kts. Nuc. Acid. Res. 7_* 1513-1523 (1979)) menetelmällä. Eri restriktioentsyymeillä suoritetun käsittelyn jälkeen plasmidilla on haluttu rakenne. Tälle annetaan nimeksi pRHW 10 (kts. kuvio 6).

b) Plasmidin pRHW 12 valmistaminen

Noin 10 yjg plasmidia pRHW 10 leikataan BamHI-entsyymi 11 ä . Tämän jälkeen lisätään DNA-polymeraasin I Kleno\i/-pala ja 4 deoksinuk1eosldi-trifosfaattia ja inkuboidaan 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Saatu linearisoitu ja suorilla päilla varustettu plasmidi puhdistetaan uuttamalla fenolilla ja seostamalla ja sen jälkeen leikataan restriktio-endonukleaasil la Ncol 100 yul:n tilavuudessa. Suurempi : : pala otetaan talteen agaroosigeeli-elektroforeesin, elektro- eluoinnin ja Elutip-puhdistamisen avulla. Pala a) (kts. kuvio 6) saadaan Ncol- ja AluI-käsittelemällä 4 ug Avall-palaa, joka sisältää P9A2-cDNA-insertin (kts. edellä).

. . Näin saadaan noin 2 /jg palaa a).

- - Viimeisessä ligatointivaiheessa ligatoidaan pala a) ja tähän lisätty, kahdesti BamHI/NcoI-käsite Ity pRHW 10 10 ^il tilavuudessa, jolloin kulloinkin käytetään DNAsta 10 V - ng. BamHI-leikkauskohta saadaan jälleen ligatoimalla täytetty . BamHI-leikkauskohta AluI-entsyymillä leikatussa DNAjssa.

Saatu ligato intiseos transformoidaan edellä kuvatulla tavalla kompetenteilla t.coli HB 101-bakteereil la. Saaduista 40 pesäkkeestä valitaan yksi, jolle annetaan nimeksi pRHW

«4 90667 12 .

Plasmidi eristetään ja EcoK1/BamHl-inserttl sekvenssoidaan Sanger'in menetelmällä (F. Sanger et ai., Proc. Nat. Acad.

Sei _74, 5463-5467 ( 1979)). Tällä on odotettu sekvenssi.

c) Plasmidin pRHW 11 valmistaminen Tämä tapahtuu analogisesti esimerkin 5b kanssa. 1 μ g plasmidia pRHW 10 käsitellään Bamh 1-entsyymi11ä. Saadun DNA:n tarttuvat ( sticky)-päät tasoitetaan DNA-po1ymeraas in I Klenow-palan ja 4 deoksinukleosidi-trifosfaatin avulla, minkä jälkeen linearisoitu DNA katkaistaan NeoI-entsyymilla. Suurempi pala otetaan talteen agaroosi-geeli-elektroforeesin, elektro-eluoinnin ja E1utip-pv1väskromatogra f iän avulla.

Neo I-AluI-pala eristetään kloonista E76E9 esimerkin 5b mukaisesti. Sen jälkeen ligatoidaan 10 ng vektorin osaa ja 10 ng cDNA-osaa 10 pl:n tilavuudessa sopivissa olosuhteissa ja käyttämällä yksi yksikkö T4-ligaasia. Saatu DNA-seos transformoidaan E.coli HB 101-bakteereihin ja selektoidaan saadut 45 pesäkettä amp isi11iini a sisältävillä LB-ma1joi 1la, minkä jälkeen valitaan yksi klooni, jolle annetaan nimeksi pRHW 11. Vastaavan kloonin kasvattamisen jälkeen eristetään plasmidi-DNA. Tämän rakenne osoitetaan useiden spesifisten restriktio-endonukleaasi-leikkauskohtien (Alul , EcoRl, r : Hindlll, Ncol, PstI) avulla.

d) Interferoni-aktiivisuuden ekspressio E. coli HB 101 bakteereissa, .jotka sisältävät plasmidin pRHW 12 100 ml bakteeriviljelmää inkuboidaan optiseen tiheyteen 0,6 asti (600 nm) M9 minimiälustassa, joka sisältää trypto-faania lukuunottamatta kaikkia aminohappoja (20 yug/ml - - per aminohappo), 1 /jg/ml tiamiinia, 0,2 % glukoosia ja I 20 ^ug/ml indoli-(3)-akryylihappoa (IAA), joka sisältää tryptofaani-operonin induktorin. Sen jälkeen pelletoidaan

II

« 90667 bakteerit sentrifugoima1la (10 minuuttia, 7000 kierr./min.), pestään kerran 50 mM Tris/Cl pH = 8, 30 mM NaCl-liuoksella ja sen jälkeen suspendoidaan 1,5 mlraan samaa puskuria.

Tämän jälkeen inkuboidaan 30 minuuttia 1 mg/ml lysotsyymin kanssa, minkä jälkeen bakteerit pakastetaan ja sulatetaan viisi kertaa. Solu jäännökset poistetaan sent r.i f ugo ima 1 la 1 tunti 40 000 kierr./min. Supernatantti steriilisuodatetaan ja siitä tutkitaan plakkitestissä interferoniaktiivisuus käyttämällä ihmisen A549-soluja ja enke fa 1o-myokarditis-viruksia.

Tulos: 1 1 valmistettua bakteeriviljelmää sisältää 1 x 10^ kansainvälistä yksikköä interferonia (A. Billiau, Antiviral Res. 4, 75-98 (1984)).

Esimerkki 6

Yhteenveto tyypin I interferonien aminohappo- ja nukleotidi-sekvenssien eroista a) Aminohapposekvenssien vertaaminen

Aminohapposekvenssiä verrataan parittain listaamalla valmiin a-interferonin ensimmäinen kysteiini-ryhmä aminohapposek-venssien, joita koodaavat plasmidin P9A2 ja E76E9 c D N A -·.· - insertit, ensimmäisen kysteiiniryhmän kanssa. Kummatkin '/·' sekvenssit on esitetty kuviossa 7 IFN-omegana, koska saatujen arvojen perusteella ei voitu havaita mitää eroja P9A2-tai E76E9-kloonien spesifisten sekvenssien välillä. Ainoa suoritettu korjaus oli välin laittaminen aA-interferonin .* - paikkaan 45, jota pidettiin virhepaikkana. Kun vertailukohtana ... oli omega-interferonin sekvenssi, vertailu suoritettiin ottamalla huomioon muut 166 aminohappoa. Tämä arvo on . esitetty kuviossa 7 yhdessä 6 muun aminohapon kanssa, joita kloonit P9A2 ja E76E9 koodaavat. Prosentuaaliset . . erot saadaan jakamalla saadut erot luvulla 1,66. Yksi aminohappo lisää merkitsee siten prosenteissa lukua 0,6. IFN-omegan 6 lisäaminohapolle saadaan 3,6 %, jotka jo 46 90667 sisältyvät prosenttilukuun.

Vertailu g-interferonin kanssa suoritetaan listaamalla valmiin β-interferonin 3. aminohappo valmiin α-interferonin ensimmäisen aminohapon tai ensimmäisen aminohapon kanssa, jota koodaa plasmidi P9A2 ja E76E9. α-interferonin pisin vertailurakenne g - i nt e r fe ron in kanssa ulottuu siten yli 162 aminohapon, jolloin saadaan 2 1isäaminohappoa sekä a-interferoni1le että g-interferoni11 e. Näitä pidetään virhepaikkoina ja ne on esitetty erillään kuviossa 7, mutta kuitenkin prosenttilukuun sisältyen, g-interferonin listaaminen kloonien P9A2 tai E76E9 aminohapposekvenssien kanssa suoritetaan samalla tavoin. Tällöin saadaan kuitenkin yhteensä 10 lisäaminohappoa.

b) Nukleotidi-sekvenssien vertaaminen

Listaaminen vertai1 use kvensseihin tapahtuu esimerkin 6b mukaisesti. Valmiin α-interferonin DNA:n ensimmäinen nukleotidi on valmiin u-interferonin kysteiiniä koodaavan tripletin ensimmäinen nukleotidi. Plasmidien P9A2 tai E76E9 DNA:n ensimmäinen nukleotidi on samoin kysteiini-1:n kodonin : : ensimmäinen nukleotidi, g-interferonin DNA:n ensimmäinen : : nukleotidi on 3. tripletin ensimmäinen nukleotidi. Vertailu - tapahtuu yhteensä yli 498 nukleotidin, kun verrataan a-inter- feronin yksittäisiä DNA:ta β-interferonin DNA:n kanssa, • ja yli 516 nukleotidin, kun verrataan yksittäisten a-inter- feronien tai g-interferonien DNA-sekvenssejä plasmideihin P9A2 ja E76E9. Virhepaikkojen absoluuttinen lukumäärä on annettu kuvion 7 taulukon vasemmassa osassa ja sen - jälkeen suluissa vastaavat prosenttiluvut.

. Esimerkki 7

Viruksilla indusoituva omega-1-mRNA:n ja NC37-soluien - ekspressio li : *' 90667 a ) Omega-inter feron.ille spesifisen hybrid isointikoett imen synteesi .10 pikomoolia oiigonukleotidia d( TGCAGGGC TGCTAA ) ja 12 pikomoolia gamma- P-ATP:tä (spesifinen aktiivisuus: > 5000 Ci/mMol) ja 10 yksikköä po1ynukleotidi-kinaasia sekoitetaan 10 pl:n kokonaistilavuudessa (70 mM Tris/Cl pH = 7,6, 10 mM MgCl^, 50 mM DT Γ) ja annetaan seistä yksi tunti 37°C:ssa. Sen jälkeen reaktio pysäytetään kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa. Saatu radioaktiivisesti leimattu oiigonukleotidi ja 5 pikomoolia M13pRHW 12 ssDNA:ta (kts. kuvio 9) hybridisoidaan seisottamalla yksi tunti 50°C:ssa 36 ^jl:n kokonaistilavuudessa (100 mM NaCl).

Huoneen lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen lisätään Nick-translaatio-puskuria, 4 deoksinukleosidi-trifosfaattia ja 10 yksikköä Klenow-polymeraasia 50 ^il:n kokonaistilavuuteen asti (50 mMTris/Cl pH = 7,2, 10 mM MgCl^, 50 ^ug/ml BSA, 1 mM per nukleotidi). Polymerointi suoritetaan seisottamalla yksi tunti huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen reaktio pysäytetään kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa.

Reaktiossa saadaan osittain kaksisäikeistä kehän muotoista - - - DNA:ta. Tämä käsitellään sen jälkeen 25 yksiköllä Avall- entsyymiä 500 Hl:n kokonaistilavuudessa, jolloin käytetään ; valmistajan kuvaamaa puskuria. Kaksisäikeiset alueet leikkaan-. . tuvat tällöin yhtä suuriksi paloiksi. Sen jälkeen reaktio ; pysäytetään kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa.

b) RNA:n valmistaminen viruksilla infektoiduista soluista * : 100 x 106 solua (0,5 x 10^/ml) käsitellään 48 - 72 tuntia 100 jjmol:lla deksametason ia - kontrolli ei sisällä deksa-II metasonia. Interferonin indusr ,uia varten ekspressiosoluja suspendoidaan seerumittomaan alustaan 5 x 106/ml ja in-fektoidaan 210yksikkö/ml ^endai-viruksilla. Soluviljelmien supernatanttien tasaosat tutkitaan IFN-aktiivisuuden suhteen *8 90667 p 1 akkite stissä (esimerkki 5). 6 tunnin kuluttua viruksilla infektoimisesta kerätään solut sentrifugoimalla (1000 g, 10 minuuttia), pestään 50 ml:ssa NP40-puskuria (esimerkki 4a), suspendoidaan uudelleen 9,5 ml:aan jääkylmää NP4Q-puskuria ja lyysataan lisäämällä 0,5 ml 10-prcsenttista NP40-puskuria 5 minuuttia jäillä. Tumat poistetaan sentri-fugoimalla (1000 x q, 10 minuuttia), minkä jälkeen super-natantti säädetään pH-arvoon 8 50 m M fris/Cl, 0,5 % sarko-siini-liuoksella 5 m M EDTA:lla ja säilytetään -2Q°C;ssa.

Koko RNAtn eristämiseksi supernatantista uutetaan kerran fenolilla, kerran fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla ja kerran kloroformi/isoamyylialkoholi 11a. Vesifaasi säädetään 4 ml:ksi 5,7-mo la arlse 11 a CsC1-Po 1 ster-1iuokse 1la ja sentri-fugoidaan SW40-roottorissa (35 kierr./min., 20 tuntia) DNA:n ja jäljelle jääneiden proteiinien poistamiseksi uutteesta. Saatu RNA-pelletti suspendoidaan uudelleen 2 mlsaan TE pH=8,D puskuria ja säestetään etanolilla.

Saostunut DNA liuotetaan sen jälkeen veteen 5 mg/ml konsentraa-t i os sa.

c) Interferoni-omeqa-mRNA:n osoittaminen esimerkin 7b mukaisesti valmistettua hybridisointi-: koetinta ja 20-50 yug esimerkin 7c mukaisesti valmistettua RNA:ta saostetaan yhdessä lisäämällä etanolia. Kontrolli-kokeessa lisätään se 11 u la arisen RNA:n asemesta tRNA:ta . . (transfer RNA) tai RNA:ta, j oka on peräisin plasmidilla - - pRHW 12 (esimerkki 5) transformoidusta E.coli'sta.

Saadut pelletit pestään suolattomiksi 70-prosenttisella etanolilla, kuivataan ja liuotet aan 25 yu 1: a a n 80-prosenttista ' : : formamidia (100 mM PIPES pH = 6,8, 400 mM w a C1 , 10 mM EDTA).

Sen jälkeen koettimia kuumennetaan 5 minuuttia 100°C:ssa hybridisointikoettimen denaturoimiseksi, säädetään välittömästi 52°C:een ja inkuboidaan tässä lämpötilassa 24 tuntia. Hybridisoinnin jälkeen koettimet viedään jäihin ·’.··; ja lisätään 475 yjl Sl-reaktioseosta (4 mM Zn(Ac)2, 30 li 49 90667 mM NaAc, 250 mM MaEl, 5 % glyseriini, 20 pg ss vas ikan t ymus-DNA, 100 yksikköä Sl-nukleaasi ) . Käsitellään yksi tunti 37 C:ssa, minkä jälkeen reaktio pysäytetään seostamalla etanolilla.

Pelletit liuotetaan 6 pl:aan formamidi-puskuria ja erotetaan oleellisesti kuten koettimet DN A -sek v/en sso in 11 r eak t io i s La 6-prosenttisella akryylia in idillä, joka sisältää 8 M ureaa (F. ^nger et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. 74^ 5463-5467 (1979 ) ) .

AutoradiograFiaa varten kuivattu geeli valotetaan DuPont Cronex X-ray-kalvolla käyttämällä Kodak Lanex Regular intensivaattoreita -70°C:ssa.

Selitykset kuvioon 10 Jäljet A - C esittävät kontrolleja.

Jälki A: 20 μς tRNA

Jälki B: 10 ^jg RNA pER 33:sta (p. coli-ekspressio- kanta interferoni -a 2-Arg:lle) Jälki C: 1 ng RNA pRHW 12:sta (E. coli-ekpressio- *·’ ’ kanta interferoni-omega l:lle) : Jälki D: 50 pg RNA käsittelemättömistä Namalwa- : : : soluista : Jälki E: 50 μ g RNA viruksilla infektoiduista

Namalu/a-soluista Jälki F: 50 ^ig RNA deksame t a son i 1 la esikäsi tel ly ist ä ·...* ja viruksilla infektoiduista Namalvi/a- : soluista 5u 90667 Jälki G: 20 p q RNA käsittelemättömistä NC 37-soluista Jälki H: 20 |jy RNA viruksilla in f ek t o idu is t a NL' 37-soluista Jälki I: 20 ^ig RNA deksametasonil la es ik äs i te 11 y ist ä ja viruksilla infektoiduista NC 37-soluista Jälki M: Ruuruusmitta (pBR 322 leikattu H IN f I — entsyymillä).

Jäljet B ja C osoittavat, että odotettu signaali voidaan osoittaa vain silloin, kun RNA-molekyyleissä on omegal-spesifinen RNA. Edelleen osoittautuu, että suurikaan ylimäärä väärää RNA:ta ei aiheuta mitään taustasignaalia (kts. jälki B). Myöskään hybridisointikomponenttina käytetty tRNA ei aiheuta signaalia (kts. jälki A).

Jäljet G - I osoittavat omegal-spesifisen RNA:n induktion viruksilla in fektoiduissa NC 37-soluissa. Esikäsittely deksametasonilla vahvistaa tällöin tätä vaikutusta.

j ‘ Jäljet D - F antavat periaatteessa samat tulokset kuin . : mitä saadaan Nama1wa - so 1ui1la. Induktio omega 1-spesifise 11ä RNA;lla ei ole kuitenkaan niin voimakas kuin NC 37-soluissa. Tämä tulos sopii yhteen interfero ni-tii11ereiden kanssa, jotka mitattiin kaikista solujen supernatanteista.

' Tämä interfero ni-omega 1-geenin ekspressio käyttäytyy siten, kuten oli odotettavissa tyypin I interferonin geenin perus- ’: te e 1 la .

- -'. Esimerkki 8

Geenin, joka koodaa omega 1 - i n t e r f e ron ia , tai lähisukuisten . ·: geenien eristäminen: I!.: si 90667 a) Kosmidin seulonta

Humaani-kosmidipankista (ihmisen DNA (mielien) kloonattu kosmidivektorissa pcos2 EMBL (A. Ponstka, H.-R. Rocku/itz, A.-M. Fnschauf, B. Hohn, H. Lehrach Proc. Natl. Avad.

Sei. £1, 4129-4133 ( 1984)), jonka kompleksisuus 2 x 10^) tutkittiin IFN-omega- tai lähisukuiset geenit. Isäntänä käytettiin E. coli DH1 (r^-, Π)κ + > rec.A; gyrA96, sup.E)-kantaa. Ensin valmistettiin MG++-solut (= "plating bacteria"). E. coli DH1 kasvaa yön aikana L-liemessä (10 g/1 tryptoni, 3 g/1 hiivauute, 5 g/1 NaCl), joka on supplementoitu 0,2 %:lla maltoosia. Bakteerit erotetaan sentrifugoimalla ja otetaan 10 mM MqSO^-liuokseen tiheyteen OD^^ = 2. 5 ml tätä solu-suspensiota ja 12,5 x 106 colony forming-yksikköä pakattua kosmidia inkuboidaan 20 minuuttia 37°C:ssa. Tämän jälkeen lisätään 10 voi. LB-liuosta ja suspensiota pidetään 1 tunti 37°C:ssa kostu idin välittämän kanainysiiniresistenttiyden ekspressoimiseksi. Tämän jälkeen bakteerit erotetaan sentrifugoimalla, suspendoidaan uudelleen 5 mitään LB-liuosta ja sivellään 200 pl:n tasaosissa nitroselluloosasuodattimille (BA85, Scti le ie her und Schöll, halkaisija 132 mm), jotka ovat LB-aqann (1,5 % agar L-liemessä), jossa 20 ^ig/ml • : : kanamysiiniä, päällä. Suodatinta kohti kasvaa noin 10.000 - • : : 20.000 pesäkettä. Pesäkkeet rep 1ika-ma1ja taan uusille nitroselluloosasuodattimille, joita säilytetään 4°C:ssa.

Joukko pesäkesuodattimia käsitellään esimerkissä le) kuvatulla ' tavalla, so. bakteerit denaturoidaan ja yksisäikeinen - · DNA kiinnitetään nitroselluloosaan. Suodattimia esipestään 4 tuntia 65°C:ssa 50 mM Tris/HCl, pH=8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS-liuoksessa. Sen jälkeen suodattimia ·: inkuboidaan 2 tuntia 65°C:ssa 5 x Denhardt’in liuos (kts.

’. esimerkki le), 6 x 5SC, 0,1 % c;DS-liuoksessa ja hybridisoidaan ;;; 2 tuntia 65°C:ssa samassa liuoksessa käyttämällä noin 50 x 10^ cpm nick-translatoitua, denaturoitua IFN-omegal-: DNA:ta (kloonin pRHW12 Hind-III-BamHI-insertti, kts. kuvio ;··; 6). H y b r i d i so i nn i n jälkeen suodattimet pestään ensin 2 x 10 « 90667 minuuttia huoneen lämpötilassa 2 x SSC, 0,01 % SQS-1iuoksessa ja sen jälkeen 3 x 45 minuuttia 65°C:ssa 0,2 x SSC, 0,01 % SDS-1iuoksessa. Suodattimet kuivataan ja valotetaan Kodak X-0mat 5-kalvoila käyttämällä vahvis tuska 1voa -70°C:ssa. Positiivisesti reayoivat pesäkkeet paikallistetaan replika-suoda11 i mi11 a, irroitetaan ja suspendoidaan uudelleen L-liemeen, jossa on kanamysiiniä (30 jjy/ml). Iästä suspensiosta maljataan muutama ml LB-agarille, joka sisältää 30 jjg/ml kanamysiiniä. Saadut pesäkkeet rep 1 i ka-ma 1 j a t aan nitroselluloosasuodattimille. Nämä suodattimet hybridisoidaan edellä kuvatulla tavalla P-leimatun lFN-omegal-DNA:n kanssa. Kulloinkin hybridisoituneista pesäkkeistä eristettiin kosmidi Birnboim'in & Doly'n kuvaamalla menetelmällä (Nucl. Acids Res. 1513 ^1979)). Näillä kosmid i-DN A - v a lm is t e i 1 la transformoitiin t. coli DH1 ja trans formant it selektoitiin LB-agarilla, joka sisälsi 30 ^ig/ml kanamysiiniä. Transfor-manteista tutkittiin positiivisesti reagoivat kloonit jälleen cP-radioakLi ι visesti leimatulla IFN-omegal-DNA:11a. Alkuperäisestä eristeestä valitaan kulloinkin yksi klooni ja tämän kosmidia valmistetaan suuremmassa mitassa (Clewell, D.B. und Helinski, L). ^. , Biochemistry 9_, 4428 (1970)).

Kolmella eristetyllä kosmidilla on nimet cos9, coslO ja |; c o s B .

b) Hybridisoituvien palojen subkloonaus PUC8:ssa

Valmistajan (New England Biolabs) suosittelemissa olosuhteissa leikattiin kulloinkin 1 yug kosmideja cos9, coslO ja cosB Hind 111 -entsyymi 11ä. Palat erotetaan elektro foree11isesti 1-prosenttisilla acjaroosigeeleillä TBE-puskurissa ja transformoidaan Southern'in menetelmällä nitroselluloosasuodattimille (esimerkki 4c). Molemmat suodattimet hybridi-soidaan esimerkissä 4d) kuvatulla tavalla nick-translatoidulla omegal-DNA; 11a, pestään ja valotetaan. Noin 20 jig kutakin kosmidia leikataan Hind111-entsyymi 11ä ja saadut palat erotetaan gee 1ie lektro fore e11is esti. Esikokeessa omegal-DNA:n kanssa hybridisoituvat palat eiektroeluoidaan ja puhdistetaan 55 90667

Elutip-pylväissä (Schleicher + Schull). Nämä palat ligitoidaan Hind111-1inearisoidun, de fosforyloidun pUC8:n kanssa (Messing, J., Vieira, J.f Gene 19_, 269-276 ( 1982 )). E. coll JM101 (supE, thi, (Iac-proAB), F', traD36, pro AB, lac q 1 M15/ (esim. P.L. Biochemica1 s ) transformoidaan 1igaasirea ktio-liuoksella. Bakteerit sivellään LB-agarille, joka sisältää 50 yug/ml ampisi 11 i inia , 250 ^ig/ml 5-bromi-4-kloori-3-indo-lyy1i-β-D-qala ktopyranosid ia (BCIG, Sigma) ja 250 pg/ml isopropyyli-B-D-tiogalakto-pyranosidia (IPTG, Sigma). Muodostuneiden pesäkkeiden värjääntyminen siniseksi osoittaa insertin puuttumisen pUC8:ssa. Muutamasta valkoisesta kloonista eristetään plasmidin DNA:ta pienessä mitassa, leikataan Hind111-entsyymi11ä ja erotetaan 1-prosenttisella agaroosi-geelillä. DNA-palat siirretään nitroselluloosasuodattimille ja hybridisoidaan edellä kuvatulla tavalla P-omega1-DNA:n kanssa. Kun lähdetään kosmideista cos9 ja coslO, valitaan kulloinkin yksi sub-eli aliklooni, jolle annetaan niinet pRHW22 ja pRH57. KosmidisLu cosB a 1ik 1oonataan kaksi omegal-koettimen kanssa hyvin hybrιdisoituvaa DNA-palaa ja näille annetaan nimet pRH51 ja pRH52.

c) Sekvenssianalyysi . - pUC8:aan insertoitu DNA erotetaan vektonosasta leikkaamalla Hind 111-entsy ymi 11 ä ja sen j äIkeise 1 lä geelielektroforeesilla .

; Noin 10 ^jg tätä DNA:ta 50 ^il:ssa reak t io 1 iuosta käyttämällä T^-DNA-ligaasia, tilavuus säädetään 250 piiksi nick-translaatiopuskurilla (esimerkki 4d) ja sen jälkeen hajotetaan ultraäänen avulla jäissä jäähdyttäen (MSE 100 Watt Ultrasonic Disintegrator), max. teho 20 kHz:ssa, viisi kertaa 30 sekuntia.

;*- Tämän jälkeen murtopalojen päät korjataan lisäämällä 1/100 voi. kutakin seuraavaa: 0,5 mM dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, sekä 10 yksikköä DNA-polymeraasin I Klenou-palaa 2 tunnin ‘ · aikana 14°C:ssa. Saadut DNA-palat, joilla on suorat päät, erotetaan koon perusteella 1-prosenttisella agaroosigeelillä. Palat, joiden koko on välillä 500 ja 1000 bp, eristetään ja subkloonataan Smal-entsyymillä leikattuun, defosforyloituun 5 4 90667 faagivektoriin MlimpO. Rekombinuntti-faagin yksisäikeinen DMA eristetään ja sekvensaoidaun Sanger'in kehittämällä menetelmällä (Sanger, F. et ai., Proc, Natl. Acad. Sei 74, 5463-5467 (1976)). Yksittäissäikeiden kokoaminen koko sekvenssiksi tapahtuu tietokoneen avulla ($taden, R,, Nucl. Acid Res. 10, 4731-4751 (1982)).

d) Alikloonin pRH57 sekvenssi (iFN-omeqal) cekvenssi on annettu kuviossa 11. Tämä 1933 bp pitkä pala sisältää interferom-omega1:n geenin. Proteiinia koodaava alue käsittää nukleotidit 576 - 1163. Sekvenssi on täysin identtinen cDNA-kloonin P9A2 sekvenssin kanssa. Nukleotidipala 576 - 674 koodaa 23 aminohappoa pitkää signaa1ipeptidiä. TATA-Box sijaitsee tyypin I interferoni-geeni11 e tunnusomaisen etäisyyden päässä ennen aloituskudonia ATG (paikat 476-482). Geenillä on joitakin siynaa 1ise kve n s s ejä polyadeny.loini, iin transkriptiossa (ΑΠΑΑΑ paikoissa 1497-1502 tai 1764-1796; AATAAA paikoissa 1729-1734 tai 1798-1803), joista ensimmäistä käytettiin kloonissa P9A2.

e) Alikloonin pRHW22 sekvenssi (lFN-pseudo-omeqa2) : Kuviossa 12 on uudelleen annettu omega1-DNA-koettimen kanssa . hybridisoituvan Hindlll-palan 2132 bp pitkä sekvenssi kosmi- dista cos9. Avoin lukukehys sijaitsee nukleotidista 905 nukleotidiin 1366. Tästä johdettava aminohapposekvenssi on annettu uudelleen. Fnsimmäiset 23 aminohappoa ovat samanlaiset kuin tyypillisen tyypin I interferonin signaa1ipeptid in aminohapot. Seuraavat 131 aminohappoa aminohappoon 65 asti ovat samankaltaiset kuin omegal-interferonissa, jolloin valmiin proteiinin ensimmäisen aminohapon havaitaan olevan tyrosiini.

Aminohappokohdan 66 jälkeen tulee potentiaalisen N-glySolysoi-- tumiskohdan sekvenssi (Asn-Phe-Ser ) . Iästä kohdasta lähtien aminohapposekvenssi on erilainen kuin tyypin 1 interferonin.

li 90667

Kuitenkin voidaan osoittaa, että sopivien inserttien avulla ja niistä johtuvan proteiinin lukukehyksen siirtymisen vuoksi saadaan samankaltaisuus IFN-omegal:n kanssa (kts. esimerkki 9). Tyypin I interferonin kannalta eristetty geeni on siten pseudogeeni: IFN-pseudo-omega 2.

f) Alikloonin pRH51 sekvenssi (IFN-pseudo-omeqa3)

Kosmidista B peräisin oleva, noin 3.500 bp pitkä omeoal-koettimen kanssa hybridisoituva Hindlll-pala sekvessoitiin osittain (kuvio 13). Avoin lukukehys ulottuu nukleotidipaikasta 92 paikkaan 394. Ensimmäisillä 23 aminohapolla on signaali-peptidin tunnusmerkit. Sen jälkeen seuraava sekvenssi alkaa tryptofäänillä ja on IFN-omegal:n kanssa samankaltainen aminohappoon 42 asti. Tämän jälkeen seuraava sekvenssi on erilainen kuin IFN-omegal ja päättyy aminohapon 78 jälkeen. Sekvenssiä voidaan muuttaa inserttioiden avulla siten, että sillä on sen jälkeen voimakas homologia IFN-omegal:n kanssa (esimerkki 9). Geenille annetaan nimeksi IFN-pseudo-omega3.

q) pRH52 insertin sekvenssi (IFN-pseudo-omeqa4) : Kuviossa 14 on esitetty 3659 pitkä, kosmidista B eristetty, ja omega 1-DNA : n kanssa hybridisoituva Hindi 11-palan sekvenssi.

I Avoin lukukehys, jonka translaatiotuotteella on osittainen homologia lFN-omegal:n kanssa, on nukleotidipaikkojen 2951 ja 3250 välillä. 23 aminohappoa pitkän signaalipeptidin jälkeen alkaa seuraava aminohapposekvenssi fenyy lialaniinilla. Homologia IFN-lsn kanssa loppuu jo 16. aminohapon jälkeen, - jatkuu 22. aminohaposta ja päättyy 41. aminohappoon. Mahdol- : : : linen translaatio olisi mahdollinen aminohappoon 77 asti.

Esimerkin 8f) ja 8g) kanssa analogisesti voidaan myös nyt saada aikaan hyvä homologia IFN-omegal:n kanssa liittämällä inserttejä (esimerkki 9). Eristettyä pseudogeenia kutsutaan 56 90667 nimellä IFN-pseudo-omeya4.

Esimerkki 9 IFN-omeqa-perheen 4 .jäsenen geenien arviointi

Kuviossa 15 on omegal-interferonin - pseudo-omega4-interferonin geenit luetteloitu allekkain yhdessä aminohappokoostumuksen kanssa. Yhteensopivuuden parantamiseksi yksittäisiin geeneihin liitetään välit, jotka on esitetty pisteillä. Yhtään emästä ei jätetä pois. Välit on otettu mukaan emästen numerointiin. IFN-omegal:n aminohappokäännös on pidetty mukana (esimerkiksi paikat 352-355: "C.AC" koodaa His-aminohappoa) . Pseudogeeneillä on käännös aminohapoksi mukana vain silloin, kun tämä on yksiselitteisesti mahdollista. Tämän listauksen perusteella voidaan heti havaita, että nämä neljä eristettyä geeniä ovat keskenään lähisukuisia. Siten on esimerkiksi kaikille neljälle geenille saatu potentiaaliset N-glykolysoitumiskohdat (nukleotidipaikat 301 - 309).

Lukuunottamatta IFN-pseudo-omega4 on myös nuk 1 eotidipaikoissa 611-614 tripletti, joka esittää pysäytyskodonia ja joka omega 1-interferoni11 a päättää valmiin, 172 aminohappoa pitkän proteiinin. Tosin tässä järjestelyssä IFN-pseudo-omega2:lla (nukleotidipaikat 497-499) ja IFN-pseudo-omega4:llä (nukleotidipaikat 512-514) pysäytyskodonit sijaitsevat : alka isemmin .

Geenien tai aminohappotranslaatioiden välinen suku1 aisuusaste voidaan laskea kuviossa 15 esitetystä järjestelystä. Kuviossa ; 16 on uudelleen annettu IFN-omega-perheenjäsenten väliset DNA-homologiat. Parittain verrattaessa ei tällöin lasketa mukaan niitä paikkoja, joissa toisessa komponentissa tai molemmissa ori välit. Vertailu antaa IFN-omegal-DNA:n ja pseudogeenien sekvenssien väliseksi ho filologiaksi noin 8 5 %.

. : IF N-p seudo - omega 2 - DN A on IFN-pseudo-oinega3 : n tai IFN-pseudo- omega4:n DNA: n kanssa noin 82-prosenttisesti homologinen.

li 57 90667

Kuviossa 17 on anneltu siynualisekvonssien vertailun tulokset ja kuviossa 18 "valmiiden" proteiinien vertailun tulokset. Jälkimmäiset ovat välillä 72 ja 88 %. Tämä homologia on kuitenkin oleellisesti suurempi kuin IFN-omegal:n ja a-mterferonien ja ^-interferonin välinen homologia (esimerkki 6). Se seikka, että IFN-omega-perheen yksittäiset jäsenet ovat toisistaan etäisempiä kuin IFN-α-perheenjäsenet keskenään, voidaan selittää sillä, että neljästä eristetystä IFN-omega-geenistä kolme on pseudogeenejä ja eivät ilmeisesti ole enempää selektiopaineen alaisia kuin funktionaaliset geenit.

Esimerkki 10 F ermentaatio

Kannan saaminen:

Kannan HBl01/pRHW14 yksittäispesäke LB-aqarilla (jossa 25 mg/ml ampisilliinia) siirroste taan tryptoni-suoja-1iemeen (OXDID CM129), jossa on 25 mg/ml ampisilliinia, ja ravistellaan 250 kierr./min. (U/min.) 37°C:ssa, kunne optiseksi tiheydeksi (546 nm) saadaan noin 5 (logaritminen kasvuvaihe). Sen ;'· jälkeen lisätään 10 painoprosenttia steriiliä glyseriiniä, viljelmä täytetään 1,5 ml:n erinä steriileihin ampulleihin ja pakastetaan -70°C:ssa.

Esivil.jely:

Viljelyalustan koostumus on: 15 g/1 Na^FIPO^ x 12 H ^ 0; 0,5 g/1 NaCl; 1,0 q/1 NH^Cl; 3,0 o/l KH^O^; 0,25 g/1 MqSO^ x 7H20; ‘.j 0,011 a/1 CaCl2; 5 g/1 kaseiinihydrolysaatti (Merck 2238 ); : 6,6 o/l qlukoosi-monohydraatti, 0,1 g/1 ampisilliini ; 20 mg/1 kysteiini ja 1 mg/1 tiamiini-hydrok1 or idi. 4 x 200 ml tätä alustaa kukin 1000 ml:n Lrlenmeyer-pullossa siirros-tetaan kulloinkin 1 ml:lla HB 101/pRHW14-kantovi1jelmää :’· ' ja ravistellaan 16 - 18 tuntia 37°C:ssa ja 250 kierr./min.

se 90667 Pääviljely :

Fermentaation alustan koostumus on: ID g/1 4,6 q/1 K2HP04 x 3H20; 0,5 o/l MaCl; 0,25 g/1 MgSO^ χ 7H20; 0,011 g/1 CaCl2; 11 a/1 glukoosi-monohydraatti ; 21 g/1 kaseiinihydrolysaaLLi (Merck 2238); 20 mg/1 kysteiini, 1 mg/1 tiamiini-hydrokloridi ja 20 mg/1 3-(3-indolakry ylihappo.

8 litraa steriiliä alustaa siirrostetaan 800 mlrlla esivil-jelmää fermenttorissa, jonka kokonaistilavuus on 14 litraa (kor.keus:säde = 3:1).

Fermentaatio tapahtuu 28°C:ssa 1000 U/min. (E ffigas-turbiini), ilmastusnopeuden ollessa 1 vvm (tilavuus/tilavuus/minuutti) ja alku-pH 6,9. Fermentaation aikana pH-arvo laskee ja pidetään sen jälkeen vakiona arvossa 6,0 3N natriumhyd-roksidilla. Kun optiseksi tiheydeksi (546 nm) saavutetaan 18 - 20 (tavallisesti 8,5 - 9,5 tunnin fermentaatioajän jälkeen), jäähdytetään muutoin samoissa olosuhteissa 20°C:een ja sen jälkeen säädetään pH arvoon 2,2 6N rikkihapolla (ilmastamatta) ja sekoitetaan yksi tunti 20°C:ssa ja nopeudella 800 U/min. (ilman ilmastusta). Tällä tavoin inaktivoitu biomassa erotetaan sen jälkeen sentrifugoima 11a CEPA-labo-ratoriosentrifuugissa (tyyppi GLE) nopeudella 30 000 U/min.

' ja pakastetaan -20°C:ssa ja säilytetään.

- : Esimerkki 11 ··- · I nt e r f e ron i-ome ga - G ly : n puhdistuminen a) Osittainen puhdistaminen ' : : Kaikki vaiheet suoritetaan 4°C:ssa.

; ; 140 g biomassaa (E.coli HB 101 transformoitu ekspressiokloonilla pRHW 12 ) suspendo idaan uudelleen 1150 mitään 1-prosent t ista et ikkahappoa ( es i j iiitluly Le l t y 4uL’:een) ja sekoitetaan 30

II

59 90667 minuuttia. Suspensio säädetään 5 M natriumhydroksid illa pH-arvoon 10,0 ja sekoitetaan viulu 2 tuntia. Säädetään 5 M suolahapolla pH-arvoon 7,5 ja sen jälkeen sekoitetaan vielä 15 minuuttia ja tämän jälkeen sentrifugoidaan (4°C, 1 tunti 10.000 U/min. J21 sentrifuugi (Beckman), JA10-roottori) .

Kirkas pääliliuos viedään 150 ml:an CPG (controlled pore glass )-pvlvääseen (CPG 10-350, Mesh Size 120/200) nopeudella 50 ml/h, jälkipestään 1000 ml:lla 25 mM Tris/1M NaCl, pH 7,5, puskurilla ja eluoidaan 25 mM Tris/lM KCNS/50SJ etyleeni-glykolilla, pH = 7,5 (50 ml/h).

Interferoniaktiivisuutta sisältävä proteiinipiikki otetaan talteen, dialysoidaan yön aikana 0,1 M Na-fosfaattia vasten, pH = 6,0 ja 10 % polyetyleeniglykoli 40.000, ja saatu sakka erotetaan sentrifugoimalla (4°C, 1 tunti, 10.000 U/min., J21-sentrifuugi, JA20-roottori (kts. taulukko 1).

b) Jatkopuhdistaminen

Dialysoitu ja väkevöity CPG-eluaatti laimennetaan puskurilla A (0,1 M Na-fosfaatti pH = 6,25/25 ?ί 1,2-propyleeniglykoli) ; 1:5 ja viedään "Super loop "-in j isoi nt i la i t teen (Pharmacia) kautta nopeudella 0,5 ml/min. puskurilla A tasapainoitettuun MonoS 5/5 (Pharmacia, kationivaihdin)-pvlvääseen. Eluoinnissa f käytetään 20 ml lineaarista aradienttia 0:sta 1 M NaCl:an puskurissa A myös virtausnopeudella 0,5 ml/min. Läpivirtaama ja 1 ml:n jakeet kerätään ja testataan interferoniaktiivisuuden suhteen CP E-reduktiotestin avulla. Aktiiviset jakeet yhdistetään.

r~ -------------- 60 90667

Taulukko 1

Tilavuus Biologinen testi Proteiini Yhteensä U/mg Saanto (ml) U/ml+ U yhteensä (mg/ml) (mg) %

Puhdista- maton 1150 15000 17,3xl06 3,6 4140 4180 100 DL 2200 600 l,3xl06 0,74 1628 600 5

Eluaatti 124,3 170000 21,0xl06 16,8 2088 10000 121

Dialyysin , jälkeen 41 300000 12,3xl06 12,6 516,6 23800 71 + CPE-reduk*· iofesti : A549-solut, EMC-virus U: Yksikköä, kun standardina käytetään interferoni- 2 (kts. esimerkki 2 julkaisussa EP-A-0.115.613 : E. Coli HB101 transformoitu ekspressioklooni1 la pER 33) DL: Läpivirtaama

Esimerkki 12 : : Hu IF N-omega 1:n karakterisointi A. Antiviraalinen aktiivisuus ihmissolujen suhteen B. Antiviraalinen aktiivisuus apinasolujen cuhteen C. Lisääntymistä estävä aktiivisuus ihmisen Burkitt'in lymfoomasoluja vastaan (solulinja Daudi) : : D. Lisääntymistä estävä aktiivisuus ihmisen cervix-karsi- noomasoluja vastaan (solulinja HeLa) E. Happostabiilisuus 61 90667 F. Serologinen karakterisointi A. Antiviraalinen aktiivisuus ihmissoluja vastaan

Solulinja: Ihmisen keuhkokarsinooma-solulinja A549 (ATCC CCL 185)

Virus: Hiiren enkefalomyokardit is-virus (EMCV)

Testaus järjestelmiä : Sytopaattisen vaikutuksen estäminen (kaikki titraukset suoritettiin neljään kertaan)

Osittain puhdistettu Hu IFN-omega1-preparaatti, jonka proteiinipitoisuus oli 9,4 mg/ml, tiirattiin sopivassa laimennuksessa mainitussa testaus järjestelmässä. Preparaatilla oli antivi-raalinen vaikutus spefisen aktiivisuuden ollessa 8300 Ie/mg laskettuna vertailustandardista Go-23-901-527.

B. Antiviraalinen aktiivisuus apinasolujen suhteen

Solulinja: GL-V3 apinan munuaissolut (Chirstofinis G.J., J. Med. Microbiol. .3, 251-258, 1970) . Virus: Vesikulaarinen Stomatitis-virus (VSV)

Testa usjärjeste lmä: Plakkien vähenemistesti (kaikki " titraukset neljään kertaan) ·:: Esimerkissä 12A kuvatulla preparaatilla oli mainitussa testausjärjestelmässä spesifinen antiviraalinen aktiivisuus : 580 E/mg.

C. Lisääntymistä estävä aktiivisuus ihmisen Burkitt'in - - lymfooma-soluissa (solulinja Daudi) : Ihmisen Burkitt'in lymfoma-solulinja Daudi kasvatettiin ....· eri HuIFN-omegal-kunsentraatioiden läsnäollessa. Solutiheydet määritettiin kahden, neljän ja kuuden päivän inkuboinnin 62 90667 jälkeen 37°C:ssa; kontrolleina käytettiin käsittelemättömiä viljelmiä. Kaikkia viljelmiä oli kolme rinnakkain. Seuraavasta kuviosta ilmenee, että UN-omega selvästi estää solujen lisääntymistä, kun konsentraatio on 100 antiviraa 1 ista yksikköä (IE, kts. esimerkki 12A) ml:ssa; 10 IE/ml konsentraatiossa oli havaittavissa osittainen, ohimenevä estyminen (seuraajassa kuviossa käytetään seuraavia symboleja: O kontrolli, · 1 It/ml, Q10 IE/ml, ^ 100 IE/ml): i ·' j · f * : · ; | ' II j ? : : ! Ϊ i .

' X· I ’ i V·! CO i , „ I , O ' | · H ; : -Mi i l !' · · · ' ·'j':' H ; ,r; : r~ ~r ··:;· o . ) i a 4 . e : · ! * * ! ! · v : : ' . ! HÄIVÄÄ

II

63 90667 D, Lisääntymistä estävä aktiivisuus ihmisen cervix-karsi-no omaso 1 u.j en (solutin,ja HeLa) suhteen

Ihmisen cerix-k a rsinooma-solulinjaa HeLa kasvatettiin seuraajien proteiinien tai proteiiniseosten läsnäollessa:

Hu IF N-omega 1 (kts. esimerkki 12A) 100 IE/ml HuIFN-gamma (kts. esimerkki 12A) 100 IE/ml Ihmisen tuumori-nekroosi-faktori (HuIFN), puhtaus i 98 8, valmistaja Genentech Inc., San Fanzisco, USA (kts. Pennica D. et ai., Nature 312, 724-729; 1984) 100 ng/ml

Mainittujen proteiinikonsentraatioiden kaikkia binäärisiä kombinaatioita käytettiin kuten edellä kahta viljelmää kohti 3 cm muovisissa kudosviljelymaljoissa (50 000 solua/malja) ja inkuboitiin kuusi päivää 37°C:ssa; sen jälkeen määritettiin solutiheys. Solujen käsittelemisellä HuIFN-omegal:llä tai HuIFN-gamma11a oli vain vähäinen vaikutus solukasvuun, kun taas HuIFN-gamma11a saatiin selvä sytostaattinen vaikutus. IFN-gamman ja IFN-omegal:n yhdistelmällä oli synergistisiä sytostaattisia/sytotoksisiä vaikutuksia.

Kokeen tulos on esitetty seuraajassa kuviossa: 64 90667 ..... I I TTTrrrr—" i—i—πτπη- . ill1 {its i-SHi··:·»* *?·:?*·ΜίiH-h»' Ι;=ί;!^ Ι!ϊ·Τ·Μι f! η:r‘n-rptn^ih^fTnnimT[ :1 ^^ψΠΊι^^ίΤΤΓi.is s ΤμΓη riiill MCE iH m i; uiiiipu Miifpte Ίί'Μά iiiiiiliHgii ’:!! -ΓΡιΊ: ?:ji ,ιΊΤΤ il;):! :Ρ^Π^ΜϊΤπΐΙτΓΤ ίΠΤί · ΜΓΠΐϊ;. i rtJI; rl?

ΑμΙ&3 ffcvi* Hi; jj:i;?::M?!ΙίΙφΤίΤIVH

.ΔΧΧi1 !Tir!;i!-'-'T:i:!iff Tl: a lii»i ύ ^isiiit: i r*.t vTnTtTKFTrfrLim

iM’"'i “ j/i' I 1 ^ .1:¾} λbfcj ::\r fp 4K ·ftlifÄf'-kl-iT

'Am MMMimSMtmFfeteKfifgfcHg mSI?TOT iffffc ψΐΓίΐ fel C«^4?h‘jgp Ά tjäfl? .CTmPt^ ΚΓ7.Η!ΠψΠ^ΤΓι7Μ :rU-t«T«f.

n.’-finr-mzyzτ:χϊ. fi*ΚαΤ^ΛκΙ®·*,: ίο &sff f .«-r · .ISTiyr ~τρ+γϊ~ τπ*η*ττττΎ -τΗγϊγρ^τ -TT^uiyd: bl μΡλ·γ -I-iTfaipas l^TT;1· i ί-ii i:'ΪΤ-iaii.lr,.~ I. .· . -.:1 ^ΓΠΤΤ

' 'F:",·'Γ!"("; -i-'ί ,m:' ·ΓΙ Μ·Γ·:ϋ' cia·!;:!:: ; ί.]t-Ίλ!:i_.L_tU.JT

1 ^^ΤΤ-ί-Γ'ΠΤΤί .1Wit ItU-^J

3 g 10 30 60 100

10_<* * SOLUA/MALJA

Edellä olevassa kuviossa käytetään seuraavia symboleja: ·.: C käsittelmätön kontrolli, T HuTNF, O HuIFN-omegal, G HuIFN-gamma.

F , Happostabiilisuus • - HyIF N-omega 1:n happostabiilisuuden tutkimista varten sää dettiin esimerkissä 12A mainitun preparaatin laimennus soluviljelymediumissa (U/min.I 1640, jossa 10 % vasikan-sikiöseerumia) pH-arvoon 2 suolahapon avulla, inkuboitiin . 24 tuntia 4°C:ssa ja sen jälkeen neutraloitiin natriumhyd- • * roksidilla. Tämä näyte titrattiin antiviraalisessa testissä a 6b 90667 (kts. esimerkki 12A); sillä oli 75 % neutraalissa pH-arvossa inkuboidun kontrollin biologisesta aktiivisuudesta. IFN-omegal on siten pidettävä happostabiilina.

F. Serologinen karakterisointi

HuIFN-omegal:n ja HuIFN-a2:n serologisten ominaisuuksien vertaamiseksi esi-inkuboitiin näytteitä (laimennettu aktiivisuuteen 100 IE/ml) yhtä suurien tilavuuksien kanssa monoklonaalisten vasta-aineiden tai polyklonaalisten anti-seerumien liuosten kanssa 90 minuuttia 37°C:ssa; sen jälkeen määritettiin näytteiden antiviraalinen aktiivisuus. Seuraava taulukko osoittaa, että HuIFN-omegal voidaan neutraloida vain leukosyy11i-interferoni n vastaisella antiseerumilla suhteellisen korkeassa konsentraatiossa, mutta ei vasta-aineilla, jo ka ovat suuntautuneet HuIFN-a2:ta tai HuIFN-betaa vastaan. HuIFN-omegal ei ole siten serologisesti lähisukuinen HuIFN-^2:n eikä HuIFN-betan kanssa: 66 90667

Antiseerumi Laimennus HuIFN-a2:n Hu IFN-omega 1:n monokl. vasta-aine ^ig/ml neutraloituminen EBI-11) 1 + 10 +++ 100 +++ 1000 - 0 EBI-3X) 1 +++ 10 +++ 100 +++ 1000 +++ 0 L3B72^ 100 +++ 0 1000 +++ 0

Lammas-ant i- leukosy y 11 i -1 FN'5 ^ 1:50.000 ++ + 1: 5 000 +++ 0 1: 500 +++ + 1:50 - +++

Kaniini-anti- • HuIFN a2 1:1 000 ++ + : 1 : 100 +++ 0 1: 10 0

Lammas-anti-

HuIFN-g4) l: 50 - 0 .·. - = k t s . EP-A-0.119.476 : 7 ) ' = A. Berthold et ai. Arzneimittel forschung 3F5> 364-369 (1985) ^ = Research Reference Reagent katalogi n:o G-026-502-568 : ^ = Research Reference Reagent katalogi n:o G-028-501-568 ; Research Resources Branch, National Institute of

Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, USA.

Il·: 67 90 667

Symbolit: - ei testattu, 0 ei neutraloitusmista, + osittainen neutraloituminen, +++ täydellinen neutraloituminen.

Claims (35)

6β 90667

1. Menetelmä valmistaa rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka koodaavat uutta ihmisen tyypin I interferoniproteiinia, joka sisältää 168 - 174 aminohappoa, interferoni-pseudo-omegaa2 (kuva 12), interferoni-pseudo-omegaa3 (kuva 13) tai inteferoni-pseudo-omegaa4 (kuva 14), tunnettu siitä, että B-lymfosolulinjän cDNA:sta vaativissa olosuhteissa, jotka mahdollistavat yli 85 % homologian, hybridisoimalla inserttien kanssa a) plasmidin E76E9 E.coli HB 101-bakteerissa, talletettu DSM-kokoelmaan numerolla DSM 3003 tai b) plasmidin P9A2 E.coli HB 101-bakteerissa, talletettu DSM-kokoelmaan numerolla 3004, Pst-l-leikkauskohdassa erotetaan ja lopuksi replikoidaan toivottu DNA-molekyyli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaativissa olosuhteissa saadaan homologiaksi yli 90 %.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koodaava sekvenssi DNA-molekyylissä on inserttinä a) plasmidin E76E9 E.coli HB 101-bakteerissa, talle- - tettu DMS-kokoelmaan numerolla DMS 3003 tai b) plasmidin P9A2 E.coli HB 101-bakteerissa, talletettu DSM-kokoelmaan numerolla DSM 3004, Pst-l-leikkauskohdassa tai näiden inserttien degeneroiduissa variaatioissa.

4. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että DNA-molekyyli sisältää sekvenssin II ^ 90667 TGT GAT C'l'G CCT C AG Λ AC CAT GGC CTA C'i'T AGO AG'', ACC TTG -11. GTG CTT CTG CAC CAA ATG AG G AGA ATC TG’C CCT TIC i'ci TGT CTC ·»<) A AG GAG AGA AGA GAC TTC AGG TTC LCC GAG '..,AG AIG ,- a aaA (, < -,, I it AGC CAG TTG CAG MG GCC CAT GTC ATG TGT G'i’C C'i’C JA Γ CAC ATG I HO CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAC GCG C'C TGT CCT .: 2 t GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GCA CTT CAT .’7 0 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAC ACC TGC TTG CTG CAG C TA GTG GGA ·· i ‘» GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA G-'G ACC TTG i<.0 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG ΑΛΑ 40 G TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATG ATG AAA -in’) TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA ATG AT A AGT AAA · o ' GAT AGA GAC ATG GGC TCA TCT Go

5. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-molekyyli sisältää paikassa 332 nukleotidin G asemesta nukleotidin A.

6. Patenttivaatimuksen l tai 5 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että DNA-molekyyli sisältää lisäksi johto-peptidiä koodaavan DNA-sekvenssin, enkä kaava an : . ATG GCC CTC C’l’G TTC C(”1’ CTA CTG GCA GCC CTA GTG ATG ACC AGC TAT AGC CCT GTT GGA TCT CTC, GGC

7. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu ·.· : siitä, että koodaava DNA-molekyyli on IFN-omegal-geen 1, jonka kaava on • * 70 90667 GATCTGGTAAACCTGAA 17 GCAAATATAGAAACCTATAGGGCCTGACTTCCTACATAAAGTAAGGAGGGTAAAAATGG 76 AGGCTAGAATAAGGGTTAAAATTTTGCTTCTAGAAC AGAGAAAATG ATTTTTTTC AT AT 135 ATATATG AATATATATTATATATAC ACATATATACATATATTCACTATAGTGTGT ATAC 194 ATAAATATATAATATATATATTGTTAGTGTAGTGTGTGTCTGATTATTTACATGCATAT 2 5 3 AGTATATACACTTATGACTTTAGTACCCAGACGTTTTTCATTTGATTAAGCATTCATTT 312 GTATTGACACAGCTGAAGTTTACTGGAGTTTAGCTGAAGTCTAATGCAAAATTAATAGA 371 TTGTTGTCATCCTCTTAAGGTCATAGGGAGAACACAC AAATG AAAAC AGTAAAAGAAAC 430 TG AAAGTACAG AG AAATGTTC AG AAAATG AAAACCATGTGTTTCCTATTAAAAGCCATG 489 CATAC AAGCAATGTCTTC AGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATATCCC AGCTCAG 54 8 TAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCA ATG GCC CTC CTG TTC CCT CTA CTG 5 99 GCA GCC CTA GTG ATG ACC AGC TAT AGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC 64 4 TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 6 89 GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 734 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 779 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 82 4 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 869 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 914 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 959 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 1004 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 1045 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 109 4 .'TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 1139 ; GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGA AATGATTCTCATTGATTAATTTGCCAT 1190 ÄTAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCA 1249 CAGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTT 13 08 ÄAAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATC AGTCCCTAAG ATGTTATTTATTTTTACTCATTTA 1367 TTTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGC 1426 CTTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGCTTTCCATTTGGTTAAATATTGTA 1485 TTTTGTTATTTATTAAATTATTTTCAAACAAAACTTCTTGAAGTTATTTATTCGAAAAC 1544 CAAAATCCAAACACTAGTTTTCTGAACCAAATCAAGGAATGGACGGTAATATACACTTA 1603 . .CCTATTCATTCATTCCATTTACATAATATGTATAAAGTGAGTATCAAAGTGGCATATTT 1662 TGGAATTGATGTCAAGCAATGCAGGTGTACTCATTGCATGACTGTATCAAAATATCTCA 1721 TGTAACCAATAAATATATACACTTACTATGTATCCCACAAAAATTAAAAAGTTATTTTA 1780 AAAAAGAAATACAGGTGAATAAACACAGTTTCTTTCCGTGTTGAAGAGCTTTCATTCTT 1839 ACAGGAAAAGAAACAGTAAAGATGTACCAATTTCGCTTATATGAAACACTACAAAGATA 1898 AGTAAAAGAAAATGATGTTCTCATACTAGAAGCTT 1933 11 7i 90667

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koodaava DNA-molekyyli on IFN-pseudo-omega2-geeni, jonka kaava on AAGCTTGAGCCCCCAGGGAAGCATAACCACATGAACCTGAATFAATATATT 51 CTAGAAGGAGGGAAGCACCAGAGAAGTTCTTTCACTAATAACCATCAACGTCTTCTGTG 110 AATCAAATATCAAACAAAGATAGTCCTAAAAAGTTTAATTTCCAGAGATAGGTAATTTC 169 CTAACTGAATACAGAAACCCATAGGGCCCAGGGATCCTGATTTCCTATGCAAAATGGAG 228 GGTAAAACTGGAGGCTAGGATCTGGGCTAAAAGTATATACTTCTAACAGTAGCACAAAG 287 ATGTTTCTCATCTGATTGATCAATATTCATTTGGATTGATATATCTTAAGTTTACTGGG 346 AATATTGAACATCCATTGCAAAAATCAAGAGTGTAGAGTGATGACCTCCTTTTAGGTCA 405 TATAGAACAAGGTTTTTCAACCCCCATCCATGGACCGGGGTACTGGTCCTGGCCTGGTA 464 GGAACAGGGCCGCACAGCAGGAGGCAAGCAGGCCAACCAACAAGCATTAACGCCTGAGC 523 TCTGCCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTGGATTCTCAAAAGAGCAGGAACCCTATTG 582 TGAAGTGCAGATGCGAAGGATCTAGGTTGTGGTCTCCTAATGAGAATCTAATGCCTCTG 641 AAAGCATTCCCTCCCTGACCCCATTTTTCGTGGAAAAATTATCTTCCACCAAACTGGTG 700 GCCAAAAGGTTGTGGATGCTGATATAGAAGACATGTAAATGAAAACAATAAATGGAATT 759 AAAAATTTAGAGAAATGCTCAGAAAAATGAAAACTATTTGTGCTCCATTAAAGCCATGC 818 ATAGATAGAATGTCTTCATAGAACCTAGGATCCAAGGTTCTATGAAGACCTCAGCTCAA 877 CCAGGCCAAAAGCATCCTGATTTCTCA ATG GCC CTC CTC TTC CCT CTA CTG 928 GCA GCC CTA GAG GTG TGC ACG TGT GGC TCT TCT GGA TCT CTA GGA 973 TAT AAC CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTG CTA GGC AGG AAC ACC TTG 1018 GTG CTT TTG GGC CAA ATG AGG AGA ATC TCT CCC TTC TTG TGT CTA 1063 : AAG GAC AGA AGT GAC TTC AGA TTC CCC CAG GAG AAG GTG GAA GTC 1108 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAG GCT ATG TCT TTC CTC TAT GAT GTG 1153 TTA CAG CAG GTC TTC AAC TTC TCA CAC AAA GCG CTC CTC TGC TGC 1198 ATG GAA CAT GAC CTT CCT GGA CCA ACT CCA CAC TTT ACG TCA TCA 1243 GCA GCT GGA ACA CCT GGA GAC CTG CTT GGT GCA GGA GAT GGG AGA 1288 AGG AGA AGC TGG GGG CAG TGG GTG ATT GAG GGC TCT ACA CTG GCC 1333 TTG AGG AGG TAT TTC CAG GAA TCC ATC TCT AGG TGA AAGAGAAGAAA 1380 . TAAAGATTGTGCCTGGGAAGTTGTCAGAGTGGAAATCATGAGATCCTTTTCATCCACAA 1439 GTTTGCAAGAAAGATTGAGAAGTAAGGATGAAGACCTGGGCTCATCATGAAATGATTCT 1498 CATTGACTAATCTGCCATATCACACTTGTACATGTGACTTTGGATATTCAAAAAGCTCA 1557 TTTCTGTTTCATCAGAAATTATTGAATTAGTTTTAGCAAATACTTTATTAATAGCATAA 1619 AGCAAGTTTATGTCAAAAACATTCAGCTCCTGGGGCATCCGTAACTCAGAGATAACTGC 1675 CCTGATGCTGTTTATTTATCTTCCTTCTTTTTTTTCATGCCTTGTATTTATGATATTTA 1734 72 90667 TATATTTTATATTTTCATCTTCACATCGTATTAAAATTTATAAAAC ATTC ACTTTTTCA 17 9 3 TATTAAGTTTGCATTTTGTTTTATTAAATTCATATC AAAGAAAACTCTGTAAATGTTTC 18 5 2 TATTCTAAAAACAATGTCTACTTTCTCTTTTTGTAAACCAAATTGAAAATATGGTAAAA 1911 TGTATTAACTCATTCATTTCATTCCTATTATATGTATAAATTGAGTAAATGGCAAACTG 197 0 TGGGGTTTTCTTAAAGAAATACAGGTGAATAAAGCAAACACAGTTTCTCTCAGTCTAAG 202 9 AGGGAAAGAGACGTAAAAACAGGACAAATATTTATATTATTTCAATTATGTTAAATGCT 2088 ACAAAGAGAAGTAAAGAAAAGTGATGTTCTCACATCAGAAGCTT 2132

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koodaava DNA-molekyyli on IFN-pseudo-omega3-geeni, jonka kaava on CCATG 5 CATAGCAGGAATGCCTTCAGAG AACCTGAAGTCCAAGGTTCATCC AGACCCCAGCTC AG 6 4 CTAGGCCAGCAGCACCCTCGTTTCCCA ATG GTC CTC CTG CTT CCT CTA CTC 115 GTG GCC CTG CCG CTT TGC CAC TGT GGC CCT GTT GGA TCT CTG AGC 160 TGG G AC CTG CCT CAG AAG CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAG ACC TTG 205 GCA CTT CTG GGC CAA ATG TGC AGA ATC TCC ACT TTC TTG TGT CTC 250 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CTG GAG ATG TGG ATG GCA 295 GTC AGT TGC AGA AGG CCC CGG CCC TGT CTG TCC TCC ATG AGA TGC 340 TTC AGC AGA TCT TCA GCC TCT TCC CCA CAG AGT GCT CCT CTG CTG 385 CCT GGA AC A TGA CCCTCCTGGACCAACTCCACACTGGACTTCATCTGCAGCTGGA 440 ATGCCTGGATGCTTGCTTAGGGCAGACAAAAAGAGAGGAAGAATCTGTGGGGGTGATTG 4 99 GGGCCCTACACTGGCCTTGAGGACGTACTTTCAGGGAATGCATGGGAATCCAGGG AATC 5 5 8 TACCTGGAGGAG AAG AAATACAGTGACTGTGCTTGGGAGGTTGTCAG AGTGG AATCGTG 617 - AAATCCTTCTCTTC ATCATCAACAAACTTGC AAG AAGG ACTG AG AAGT AAGG ATG AAG A 6 76 CCTGGGTTCATCCTGAAATTATTCTCATTGATTAATCTGCCATATC ACACTTGCACATG 7 3 5 TGTCTTTGGTCATTTCAATAGGTTCTTATTTCTGCAG 772

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-molekyyli on IFN-pseudo-omega4-geeni, jonka kaava on It 73 90667 AAGCTTTGGGCATGACCTAGTAGGTGACTCTT 3 2 AGTTGGAGTGGTCAGTTGTAAGGCTCTTGCTCAGTCACGTGGCTCCCCTGTATTTCCCC 91 ACGTTTGCAGCCGTGCTCCTTCTCAATGCTATGAAAGTGTGGGCTCCTCTCCCACTGGA 150 GTGCTGACTGTAGCTTGTATCTTGGCACTCCCAGGCTGTACATAACAGCTCTG AGGTG A 209 TCTC AGGGTTAATGTTTTCTCCCCGACTTGGAGGCCATTG AAGG AAGGG ACCTT AGTAG 26 8 TAGTTGTAACTGAGGGTCTTTTGCTTGTCTCCTGGGGGCTCCACCCCAG AGATGCAGGT 3 27 G AGC AATC ACTCAGTGCATTCAGCTTGGG ATGGGGGTGTCTGTGCTGTGGGCCC AAG AC 386 AGGGGTTCCCTGCCTGGTGATGTGAGGGGTGGGTGGTTG ACCAATGGC AG ACAG ACTGG 445 CCTCCTCTCTTGGGTTG ACAGCAGCTTGTTGGAGGTATGCATAAGGCACTTGGGGTCTT 504 GCTCCTTCATTAGTTCCAAGGTAGCTGGGGTAGTACC ACTGCAG AGGC AGTGTTAGACA 56 3 GGCTTTCTGTT ACCCCTGGGGTCTCCACCTCCTAGAAATGTGAAGTC ATGTTAATGGG A 622 GTGTTTAGCCAGAGGAGTGGGGTGGCTGCATGCTGGTGTAAGTATGGG ACTTCACTTCT 6 81 TGGG AAACAGGGAGGTGGAATCTTACCAGCAGG AGACTGTTCTCCTCACG ATGTGT AAC 7 40 CTGCAGTGTGCTGGAAGTTTAGGTGACTGTGGCATGATGTTAGCTTGTAAACAAAGAGC 799 TTC AG ACTCTTTGTCTCTTCCCCAGACCCAAGGCAGCAAGGATAAAAGCTGCTGCTGTG 85 8 GCAGTGGCAGAGGTAGGATGGTTGTGGGAGCCTCTCCCCAGGGAAACTCTAGTCAACTA 917 CAAGTGGATATGCTCAGCCATGGGTAGGGTGACTGTTCTGCAGTCATGGGCAGGGGGCC 976 TGCTCCTGAAG AATAGGGACAGGGATTCTCAGGG AAG AGGGGCTGGACTCCTCTTC ATA 10 35 TAGTGGCGATGATGTGCTGGAGGTGCCAGTGTAGTGAATAGGCCTTTGTTCCTTCCCC A 1094 GCCAG AGGGCTGCTGGGGCTGTCCCACTGCAACGGTCATGGTGGATGGGTTATGGGTTG 115 3 ACTGTGGGATTTCTTTCTTGG AGAAATGCTGGACTGCCTG ATTGAGGAG ACG AGGCAAG 1212 . GG AAGAATGCCTGTGCTGGAGTCTCTGGTCAGGTGGCTGTGCCACAGAGG AG AGGTG AC 1271 CACCAGGAACTGCGTGGAGAACAGTGTAGCCACTCTTCTGTGAGGCAGTTGCTCTGTTT 13 30 TGGGGATCTGGAGCAGCCGCTATTCCTTACAGATTCCCAGAGCCTGGAG ACAGCAAGGG 13 8 9 CAAGAGCTGTGAGAAAGCAAAGATAGCAACCCäCCCTTCTCACTGGGAGCTCTGTTCCA 144 8 GGGAGATGCAGAGCTGCCATTGCTCAATAGCCCCAGCTGGTAGCTGCAGACCCAGGCCT 1507 GGCAGACCCACCCAGTGAGCAGATAGGGGATTAGGGACCCACATAACACACAGTCTGGC 1566 CACTTTTCCATAGGGCTGCTGAATATGCTGGGGGTCCAATCCAGACCATAGTCACCTCA 1625 CATTTTTCAGTACCTGAAGATATCCACAGTGAAGGCTATGAAACAGTGAAGATGGGGAC 1684 CTGCCCCTGCCTCTGGACCTCTGTTCCAGAGAGGTACAACCTGTTGCCTCCGACATACA 1743 TGCAGGAGGTGGCTGGAGACCCGGTGGATATCCCTCCCACTGAGGAGAAGCAGCATCAG 1802 GGAATCAGGTGAAGAAACAGTCTGGCCACTTTTTGGTAGAGCAGCTGTGCTTGCTGGGG 1861 GTCTGCTACCACCCCCAGCAAAAAGAATGGCATTTGCAAGAATGGCTAAGGCTGCTAAA 1920 74 90667 CAGCAACAATGGCAACCTACCATTCCCTTTGGAGCGCCATCCCAGGGATATTCG AAACT 197 9 GCTGTCCACTAGAAAACAGTGGTGGAGGTGACTGGAGACCCCAGTGGAGAGTTTCACCT 20 38 GGTGAAAAGAAACAGGATTTGGGATCGACATGAATAACCAATCTGACTGCTTCCCCGTA 20 9 7 GAGCTGCTGGACTGTGCTGGGTGGCTGCTCCAGTCCCTAGCTGCCTTGGACTCCCGAGA 219 6 ACCCAAAGGCTCCAATAGCTAAGATTGTGAAAGAGCAAAGATGGCAGCCCACCCCCTGC 2 215 CACAGGGACGTCCATGTCAGGGAGGTATGCGGCTGCTACCAGTGTCTGGCTGGATTCCC 2274 AAGTCGAGTGGGTCTTACCCTGAGACAGGCCATGGAAGGTGGGCCTGTCATTGTCACTG 23 3 3 CCC AGCGCCCTGGATGAAACCCCTTTCCTAGGGGTATGTATAGGGGTCTAGCGTCCTGC 2 392 TTGGCTGGAGTTATAGCTTCTTTTGTGGGGAGGCCTGGGTATCTAAGGCTCCAGGGTAC 2451 CCATGCATGCGAGAGCGGCTGCTCTGCTGAACCCTACGTAGCCCTGCATGTCAGACTAA 2510 ATGCCCTGGTAGAGTGGGTTCACTAGGAGATCTCCTGACCTGAGGATTGCAAAGATCTG 2569 TGGGAGAAGCGTGGGTCCCCAGGGCTGCTCACTTACTCACCACTTCCCTGGGCAGGAGA 2628 GGCTCCCCTGGCTCTGTGTCATCCTGGGGGGGCAGTTGTCCTGCCTTACTTTGCTTTAT 2687 TCTCCATGGGTCAAGTTGTTTTCTTGAGTCTCAATGTGTGCACCTGGTTTTTTCAGTTG 2746 AAGGTGCTGTATTTACTTGCCCCTTCCATTTCTCTCCATGAGAGTGGCACACACTAGCA 2805 GGTTCCAGTCGGCCATCTTGCAACCCCTGAAAACTATTTGTTTCCAGCTATAAGCCATT 286 4 G AG AG AACCTGG AGTGGCATAAAAAG AATGCCTCGGGGTTCATCCCGACCCC AGCTC AG 2923 CTAGGCCAGCAGCACCCTCGTTTCCCA ATG GTC CTA CTG CTT GTT CTA CTG 2974 GTG GCC CTG CTG CTT TGC CAA TGT GGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC 3019 TTT GAC CTG CCT CAG AAC CGT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 3064 GCA TTC TGG GCC AAA TGC AGA ATC TCC ACT TTC TTG TGT CTC AAG 3109 GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CTG GAG ATG TGG ATG GCA GTC 3154 ATT TGC AGA AGG CCC AGG CTG TGT CTG TCC TCC ATG AGA TGC TTC 3199 AGC AGA TCT TCA GCC TCT TCC CCA CAG AGC GCT CCT CTG CTG CCT 3 244 GGA ACA TGA CCCTCCTGGACCAGCTCCACACTGGATTTCATCAGCAGCTCGAATAG 3300 CCTGGAGTCTTGCTTAGGGCAGGCAACAGGAGAGGAAGAATCTGTGGGGGTGATTGGGA 335 9 •CCCTACACTGGCCTTGAGGAGGTACTTCCAGGGAATCCATGGGAATCCAGAGAATCTAC 3 418 CTGAAAGAGAAGAAATACAGTGACTGTGCTTAGGAGGTTGTCAGAATGGAATCATGAAA 347 7 TCCTTCTCTTCATCAACAGACTTGCAAGGACTGAGAAGTAAGGATGAAGACCTGGGGTC 35 36 TGCTTTACTCTTTCTTATTTTCTTCCTCTTCCTTACTATGTGTTTATTTCTTCTTTTTC 35 95 TAGTTCCTTAACTTGTAAGTAGTTCACTTGGTTTGAGGTCTTTCTTCTTTTTTAATATA 3654 AGCTT 3659 ii 75 90667

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rekombinantti-DNA-molekyyli replisoidaan vehikkelissä, joka kykenee replikoitumaan prokaryooteissa tai eukaryooteissa.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vehikkelinä käytetään plasmidia tai ekspres-siovehikkeliä, joka kykenee replikoitumaan mikro-organismeissa tai nisäkkäiden soluissa.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vehikkelinä käytetään a) plasmidia E76E9 E.coli HB 101-bakteerissa, talletettu DSM-kokoelmaan numerolla DSM 3003 tai b) plasmidia P9A2 E.coli HB 101-bakteerissa, talletettu DSM-kokoelmaan numerolla DSM 3004.

14. Menetelmä valmistaa uutta ihmisen tyypin I interferonia, jolloin valmiiden interferonien divergenssi ihmisen a-inter-feroneihin verrattuna on 30 - 50 %, ja niiden N-glykosyloituja johdannaisia, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen rekombinantti-DNA-molekyylin sisältämä geneettinen informaatio eksprimoidaan ja toivottu interferoni eristetään.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiin interferonin divergenssi lisäksi β-interfe-roniin nähden on noin 70 %.

16. Patenttivaatimuksen 14 ja 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiin interferonin divergenssi ihmisen a-interferoneihin nähden on 40 - 48 %.

17. Patenttivaatimuksen 14 - 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiit interferonit sisältävät johto-peptidin. 76 90667

18. Patenttivaatimuksen 14 - 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiit interferonit sisältävät 172 aminohappoa.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmis interferoni sisältää aminohapposekvenssin 5 10 15 Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu 20 25 30 Vai Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu 35 40 45 Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Vai Lys Gly 50 55 60 Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Vai Met Ser Vai Leu His Glu Met 65 70 75 Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala 80 85 90 Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His 95 100 105 Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Vai Vai Gly 110 115 120 Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu 125 130 135 Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Vai Tyr Leu Lys Glu Lys Lys 140 145 150 Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Met Glu Ile Met Lys 155 160 165 Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys 170 Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser It: 77 90667 ja sen aminohappopaikassa 78 N-glykosyloituja johdannaisia.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan patenttivaatimuksen 19 mukainen interferoni, joka sisältää paikassa 111 Glu-aminohapon Gly-aminohapon asemesta, ja sen aminohappopaikassa 78 N-glykosy-loituja johdannaisia.

21. Jonkin patenttivaatimuksen 14 - 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan interferoneja, jotka sisältävät johtopeptidin jonka kaava on Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Lou Ala Ala Leu Vai Met Thr Ser Tyr Ser Pro Vai Gly Ser Leu Gly

22. Menetelmä prokaryootin tai eukaryootin valmistamiseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen geneettisen informaation, tunnettu siitä, että vehikkeli, joka sisältää patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen rekombinantti-DNA-molekyylin, transformoidaan prokaryootin tai eukaryootin kanssa.

23. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vehikkeli sisältää lisäksi ekspressioon tarvittavat replikointi- ja kontrollisekvenssit.

24. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prokaryoottina tai eukaryoottina käytetään nisäkässolulinjaa tai E.colia.

25. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prokaryoottina käytetään E.colia, jonka DSM numero on 3003, tai E.coli, jonka DSM numero on 3004. 78 90667

26. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään plasmidin pER103 (DSM nro 2773, kuva 6) ekspressioon tarvittavat replikointi- ja kontrollisekvenssit.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että IFN-omegal ekspressioplasmidina käytetään plasmidia pBR322, jossa plasmidille ominaisen lyhyen EcoRI/BamHI-palan asemesta sisältää DNA-sekvenssin, jonka kaava on EcoRI Sau3A q aa t tcacq c tGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA 5 9 nRNA-alku Met ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116 RBS Hindlll Cys Asp TGT GAT C - IFN-omega-geeni — > Sau3A

28. Patenttivaatimuksen 26 ja 27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prokaryoottina käytetään E.coli HB 101-bakteeria ja vehikkelinä plasmidia pRWHll ja pRWHl2.

29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vehikkelinä käytetään ekspressioplasmidia pRHWll, jossa IRN-omega-geenillä on DNA-sekvenssi, jonka kaava on TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 Ncol GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 7 3 AAG G AC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT G AG ATG 16 3 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC AC A GAG CGC TCC TCT GCT 208 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 25 3 CAG CAA CTG CAA CAC CTG G AG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 II 79 90667 GAA GGA GAA TCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AA A G AG AAG AAA 3 88 TAC AGC CAG TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 43 3 TCC TTG TTC TT A TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 5 30 TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 5 8 9 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 6 4 8 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 7 0 7 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 7 66 TTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802 AluI

30. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vehikkelinä käytetään ekspresioplasmidia pRHW12, jossa IRN-omega-geenillä on DNA-sekvenssi, jonka kaava on TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CT A CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 Ncol GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 7 3 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 16 3 - CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 208 . GCC TGG AAC ATG ACC CTC CT A GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 25 3 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 29 8 GAA GGA GAA TCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 34 3 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 .. . TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 43 3 : TCC TTG TTC TT A TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 47 8 ' GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 5 30 TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 5 89 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 70 7 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802 AluI so 90667

31. Plasmidin pRHWIO valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että plasmidiin pER103 (DSM nro 2773, kts. kuva 6) liitetään HindiII-kohtaan ligaasireaktion avulla DNA-pala, jonka kaava on Hindlll Sau3A Ncol aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAaqct t Sau3A Hindlll ja replikointia varten näin saatu plasmidi transformoidaan E.coli HB 101-bakteerissa ja viljellään.

32. Ekspressioplasmidin pRHW12 valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että plasmidin pRHWIO suurempi pala, joka on saatu restriktioendonukleaasikäsittelemällä BamHI-entsyymillä, : täyttämällä leikkauskohdat DNA-polymeraasin Klenow-palan ja : 4 deoksinukleosiditrifosfaatin avulla sekä sen jälkeen leikkaamalla Ncol-entsyymillä ja joka sisältää plasmidin pER103-Hindlll-leikkauskohdassa (DSM 2773, kuva 6) DNA-palan, jonka kaava on Hindlll Sau3A Ncol aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAaqct t Sau3A Hindlll II e1 90667 liitetään ligaasireaktion avulla palaan, joka on saatu käsittelemällä kloonin P9A2 (DSM nro 3004) Avall-pala Ncol- ja Alul-entsyymillä ja jonka kaava on c CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 Ncol GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 7 3 AAG G AC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 16 3 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC AC A GAG CGC TCC TCT GCT 20 8 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 25 3 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 2 98 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 34 3 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 3 88 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 43 3 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 47 8 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 5 89 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 6 4 8 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 7 0 7 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 76 6 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802 AluI ja replikointia varten näin saatu plasmidi transformoidaan E.coli HB 101-bakteerissa ja viljellään.

33. Ekspressioplasmidin pHWRll valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että plasmidin pHRWIO suurempi pala, joka on saatu restriktioendonukleaasikäsittelemällä BamHI-entsyymillä, täyttämällä leikkauskohdat DNA-polymeraasin I Klenow-palan ja 4 deoksinukleosiditrifosfaatin avulla ja sen jälkeen leikkaamalla Ncol-entsyymillä ja joka sisältää plasmidin pER103 (DSM 2773, kuva 6) HindiII-kohdassa DNA-palan, jonka kaava on 82 90667 Hindlll Sau3A Ncol aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAaqct t Sau3A Hindlll liitetään ligaasireaktion avulla palaan, joka on saatu käsittelemällä kloonin E76E9 (DSM 3003) Avall-pala Ncol- ja AluI-entsyymeillä ja jonka kaava on c CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 Ncol GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 208 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 ' TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 5 89 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802 AluI 84 li 83 90 667 ja replikointia varten näin saatu plasmidi transformoidaan E. coli HB 101-bakteerissa ja viljellään.

34. Plasmidin E76E9 ja P9A6 valmistus, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 4 ja 5 mukainen IFN-omegal koodaava sekvenssi cDNA:n, joka on saatu Sendai-viruksella indusoiduista Namalwa- tai NC37-soluista, hybridisoinnilla plasmidin pER34, joka koodaa IFN-a2(Arg), insertin, eristetään ja lopuksi replikoidaan plasmidiin pPR322.

35. Menetelmä patenttivaatimuksen 19 ja 20 mukaisen Met-johdan-naisen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään plasmidilla pHRWll tai pRHW12 transformoitua E. coli HB 101 ja että in situ muodostettu Met-johdannainen eristetään. 84 90667