NO177863B - Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant humant IFN-type I, IFN1, IFN-pseudo-2, -3, og -4, samt ekspresjonsvektorer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler som koder for nye menneske-interferoner av type I IFNiol (figur 1), som inneholder

168 til 174 aminosyrer, for interferon-pseudo-u>2 (figur 12) ,

for interferon-pseudo-o)3 (figur 13) eller for interferon-pseudo-o)4 (figur 14) ; et ekspresjonsplasmid for IFN-ul, som

er et derivat av plasmidet PBR322; og en fremgangsmåte for fremstilling av nye menneskeinterferoner av typen I, hvorunder de ferdige interferoner har en divergens på 30 tii'50% i forhold til menneske-a-interferonene, og av deres N-glykosylerte derivater.

Interferon er et begrep som er fremkommet for å beskrive

et utvalg av proteiner som er endogene til menneskeceller og er karakterisert ved at de har delvis overlappende og delvis divergerende biologiske aktiviteter. Disse proteiner modifi-serer den legemsspesifikke immunreaksjon, og man antar at de bidrar til en virkningsfull beskyttelse mot virussykdommer. Interferonene ble f.eks. inndelt i tre klasser, nemlig a-,

/3- og t-interferon.

Av jS- og 7-interferon er bare én undertype kjent i den menneskelige organismen (f.eks. S. Ohno et al., Proe. Nati.

Acad. Sei. 78, 5305-5309 (1981); Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982); Taya et al., EMBO Journal 1(8, 953-958 (1982)). Derimot er det beskrevet forskjellige subtyper av a-interferon (f.eks. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 299, 7-28 (1982)). De ferdige a-interferoner adskiller seg derunder seg imellom ved maksimalt 23% divergens og er ca. 166 aminosyrer lange.

Videre er en rapport over et a-interferon bemerkelsesverdig,

som har en overraskende høy molekylvekt (26 000 bestemt med SDS polyakrylamid/gelelektroforese) (Goren, P. et al., Virol-

ogy 130, 273-280 (1983)). Dette interferonet kalles IFN-a 26K. Man har funnet at dette har den hittil høyeste spesi-

fikke antivirus og anticellulære aktivitet.

De kjente interferoner synes å virke på forskjellige sykdommer, men viser liten eller overhodet ingen virkning ved mange andre sykdommer (f.eks. Powledge, Bio/Technology, Mars 1984, 215-228 "Interferon On Trial"). Interferoner gir dertil bivirkninger. For eksempel fant man ved undersøkelser av antikreftvirkningen av rekombinant a-interferon at doser på ca. 50 millioner enheter, som etter resultatene fra fase I-undersøkelser gjaldt som sikre, frembragte akutte forvirrings-tilstander, leddsmerter som førte til arbeidsudyktighet, sterk utmattelse, appetittmangel, tap av orienteringsevne, epilept-iske anfall og levertoksisitet. I 1982 forbød den franske regjering undersøkelser med IFN-a etter at kreftpasienter som var blitt behandlet med dette fikk dødelige hjerteantall. Det er rapportert minst to kardiale dødsfall også ved nylig utfør-te undersøkelser i Amerika. Dertil er det blitt tydelig at i det minste en del av bivirkningene, såsom feber og utilpass-het, står i umiddelbar sammenheng med selve interferon-molekylet og ikke kan tilbakeføres til forurensninger.

På grunn av de store forhåpninger som interferonet hadde vekket, og stimulert av ønsket om å finne nye interferonlignende molekyler med reduserte bivirkninger, var oppgaven for foreliggende oppfinnelse å finne frem til og fremstille slike nye forbindelser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye interferoner av type I, som kan inneholde et Leader-peptid, og deres N-glykosylerte derivater (her kalt omega-interferon eller IFN-u)) , som inneholder 168-174, fortrinnsvis 172 aminosyrer, og som har en divergens på 30 til 50%, fortrinnsvis 40-48% i forhold til de hittil kjente undertyper av a-interferon, og en divergens på ca. 70% i forhold til /3-interferon, og på den ene side viser lignende virkninger som a-interferonet, men på den annen side ikke har de mange terapeutiske ulemper hos kjente forbindelser.

Gjenstand for oppfinnelsen er således fremstilling av nye interferoner i fullstendig ren form, deres ikke-glykosylerte og glykosylerte former, videre ekspresjonsplasmider som inneholder de tilsvarende gensekvenser.

I henhold til oppfinnelsen fremstilles de innledningsvis nevnte rekombinante DNA-molekyler ved at cDNA fra en B-lymfo-cyttcellelinje hybrideres med, under stringente betingelser som gir en homologi som er større enn 85%, IFN-ul innskuddet eller en degenerert variant derav, i Pstl-setet i

a) plasmidet E76E9 med dep. nr. DSM 3003

b) plasmidet P9A2 med dep. nr. DSM 3004

og settes inn i en ekspresjonsvektor pRWHIO (fig. 6), pRWHll

eller pRWH12 (fig. 6) med påfølgende transformasjon av E. coli.

Ekspresjonsplasmidet for IFN-ol er kjennetegnet ved at ekspresjonsplasmidet for IFN-ul er et pBR322-plasmid, som istedet for det plasmid-egne, kortere EcoRI-BamHI-fragmentet, inneholder DNA-sekvensen med formelen:

Fremgangsmåten for fremstilling av de nye menneske-interferoner av typen I er særpreget ved at en egnet vertsorganisme transformeres med et ekspresjonsplasmid ifølge krav 10 med den genetiske informasjon som et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 til 6 inneholder, uttrykkes, og det således produserte interferonpeptid isoleres fra denne vertsorganismen.

En foretrukket gjenstand for oppfinnelsen er fremstilling av co-interferoner med etterfølgende formel, som har de tilsvarende gensekvenser:

I stilling 111 kan sekvensen GGG (som koder for Gly) erstattes med GAG (som koder for Glu). De foretrukne molekyler inneholder likeledes derivater som er N-glykosylert på aminosyreposisjon 78.

For eksempel kan de to forannevnte o>-interferoner inneholde lederpeptidet med formel

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly. Kommentar til tegningene:

Fig. 1. restriksjonskart av klon E76E9

Fig. 2. restriksjonskart av klon P9A2

Fig. 3. DNA-sekvens av klon P9A2

Fig. 4. DNA-sekvens av klon E76E9

Fig. 5. genomisk Southern Blot-analyse under anvendelse

av DNA fra klon P9A2 som probe

Fig. 6. konstruksjon av ekspresjonsklon pRHW12

Fig. 7. aminosyre og nukleotidforskjeller mellom type I-interferoner

Fig. 8a. nukleotidsammensetning for IFN-aA-genet

Fig. 8b. nukleotidsammensetning for IFN-col-genet

Fig. 8c. nukleotidsammensetning for IFN-aD-genet

Fig. 9. skjematisk fremstilling av syntese av interferon- subtype-spesifikke prober Fig. 10. påvisning av interferon-subtype spesifikke mRNA'er

Fig. 11. DNA-sekvens for IFN-col-genet

Fig. 12. DNA-sekvens for IFN-pseudo-w2-genet

Fig. 13. DNA-sekvens for IFN-pseudo-co3-genet

Fig. 14. DNA-sekvens for IFN-pseudo-u)4-genet

Fig. 15. korrigert oppstilling av IFN-co-gensekvenser

Fig. 16. homologi av signalsekvenser

Fig. 17. homologi a "modne" proteinsekvenser

Fig. 18. homologi av 4 DNA-sekvenser til hverandre.

Ifølge oppfinnelsen får man de nye cj-interferoner og DNA-sekvensene som koder for disse som følger: En human B-limfom-cellelinje, f.eks. Namalwa-celler (se G. Klein et al., Int. j. Cancer 10, 44 (1972)), kan aktiveres ved behandling med en virus, f.eks. Sendai-virus til å samti dig produsere a- og /J-interferon. Isoleres det dannede mRNA fra stimulerte Namalwa-celler, kan disse tjene som mal for cDNA-syntese. For å øke utbyttet av interferonspesifikke sekvenser ved kloningnsprosessen, spalter mRNA-preparatet tilsvarende etter forskjellig lengde av de enkelte mRNA-molekyler gjennom en sukkerdensistets-gradient. Med fordel samles mRNA'en i området rundt 12S (ca. 800 til 1000 basers lengde av mRNA). I dette området sedimenteter de spesifikke mRNA'er for a- og /9-interferoner. mRNA'ene fra dette gradientområdet

konsentreres ved utfelling og oppløsning i vann.

Fremstillingen av et cDNA-bibliotek følger i det vesentlige metoder som er kjent fra litteraturen (se f.eks. E. Dworkin-Rastl, M.B. Dworking og P. Swetley, Journal of Interferon Research 2/4, 575-585 (1982)). mRNA'ene primes ved tilsetning av oligo-dT. Deretter syntetiseres ved tilsetning av de fire deoksynukleosidtrifosfater (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) og enzymet reverstranskriptase i en tilsvarende bufret løsning cDNA 1 time ved 45"C. Ved kloroformekstraksjon og kromatografi gjennom en gelsøyle, f.eks. gjennom Sephadex G50, renses cDNA/mRNA-hybridet. RNA'et hydrolyseres ved alkalibehandling (0,3 mol NaOH ved 50°C i 1 time), og cDNA'et utfelles etter nøytralisering med sur natriumacetatløsing med etanol. Etter tilsetning av de fire deoksynukleosidtrifosfater og E. coli DNA-polymerase I i tilsvarende løsning, utføres dobbeltkjede-syntesen, hvorunder cDNA samtidig fungerer som mal og som primer ved hårnålstrukturdannelse på sin 3'-ende (6 timer ved 15°C) (se A. Eftratiadis et al., Cell 7, 279 (1976)). Etter fenolekstraksjon, Sephadex G50 kromatografi og etanolutfelling, behandles DNA'et i egnet løsning med den enkeltkjede-spesifikke endonuklease Sl. Derved nedbygges hårnålstruk-turen, samt cDNA som ikke er omsatt til dobbelkjede. Etter kloroformekstraksjon og utfelling med etanol, skilles dobbeltkjedet DNA (dsDNA) etter størrelse på en sukkergradient. For de følgende kloningstrinn anvendes fortrinnsvis bare dsDNA med størrelse 600 bp og mer for å øke sannsynligheten for bare å få kloner som inneholder den komplette kodende sekvensen for de nye interferoner. dsDNA med mer enn 600 bp lengde konsentreres fra gradienten ved utfelling med etanol og oppløsning i vann.

For å formere dsDNA-molekylene, må disse først bringes inn i en tilsvarende bærer og deretter føres inn i bakterien E. coli. Den anvendte bærer er fortrinnsvis plasmid pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). Dette plasmidet består i det vesentlige av et replikon og to seleksjons-markører. Disse gir verten resistens overfor antibiotikaene Ampicillin og Tetracyklin (AP<1>, Tcr) . Genet for /3-lactamasen (Ap<r>) inneholder gjenkjennelsessekvensen for restriksjonsendonukleasen Pstl. pBR322 kan kuttes med Pstl. De utstikk-ende 3'-endene forlenges med enzymet terminal deoksynukleo-tid-transferase (TdT) når dGTP foreligger i tilsvarende bufret løsning. Samtidig forlenges dsDNA'et likeledes med enzymet TdT under anvendelse av dCTP på 3'-endene. Homopolymerendene av plasmidet og dsDNA er komplementære og hybridiserer for plasmid-DNA og dsDNA blandes i tilsvarende konsentrasjons-forhold og under egnede salt-, buffer- og temperaturbetingel-ser (T. Nelson et al., Methods in Enzymology 68, 41-50

(1980)).

E. coli av stammen HB 101 (Genotype F-, hsdS20 (r-B, m-B) recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mt-1-1, supE44, lambda-) forberedes til opptak av de rekombinante bærer-dsDNA-molekyler ved vasking med en CaCl2-løsning. Kompetente E. coli HB 101 blandes med DNA'et, og etter inkubasjon ved 0°C, transformeres det således erholdte plasmid-DNA ved varmesjokk ved 42°C i 2 minutter (M. Dagert et al., Gene 6, 23-28 (1979)). Deretter pletteres de transformerte bakteriene på tetracyklinholdige agarplater (10 /ig/ml) . På denne agaren kan bare E. coli HB 101 vokse som har opptatt et bærer-eller rekombinant bærermolekyl (Tcr) . Rekombinante bærer-dsDNA-molekyler tilfører verten genotypen Ap<s>Tc<r>, da informasjonen for /3-lactamasen ødelegges ved innføringen av dsDNA'et i /9-lactamasegenet. Klonene overføres på agarplater som inneholder 50 /ig/ml Ampicillin. Bare ca. 3% vokste opp, hvilket betyr at 97% av klonene inneholdt innsatt et dsDNA-molekyl. Ut fra 0,5 fig dsDNA, fikk man mer enn 30 000 kloner. 28 600 koner derav ble overført enkeltvis i skålene av mikrotiterplater som inneholdt næringsmedium, 10 /xg/ml tetracyklin og glycerol. Etter at klonene var vokst deri, holdes platene oppbevart ved -70°C (cDNA-bibliotek).

Ved gjennomsøkning av cDNA-biblioteket etter nye inter-ferongenholdige kloner, overføres klonene etter opptining på nitrocellulosefilter. Dette filteret ligger på tetracyklin-holdig næringsagar. Etter oppvekst av bakteriekolonier, fikseres DNA til bakteriene på filteret.

Som probe tjener med fordel innsatsen fra klonet pER33 (E. Rasti et al., Gene 21, 237-248 (1983 - se også EP-A-0.115.613) , som inneholder genet for IFN-a2-arg. Ved nick-translasjon merkes dette stykket DNA radioaktivt, hvorunder DNA-polymerasel, dATP, dGTP, dTTP og a-32P-dCTP anvendes. Nitro-cellulosefilteret forbehandles først under egnede, ikke-stringente hybridiseringsbetingelser uten tilsetning av radioaktiv probe, og deretter ca. 16 timer under tilsetning av radioaktiv probe. Deretter vaskes filteret likeledes under ikke-stringente betingelser. Gjennom den lave hybridiserings-stringens og vasking oppfanges ikke bare interferon-a2-arg-holdige kloner, men også andre interferonholdige kloner, hvis sekvenser kan avvike betraktelig fra det hittil kjente interferon-a. Etter tørking, eksponeres filteret på en røntgenfilm. En sverting som ligger tydelig over bakgrunns-nivået viser tilstedeværelsen av et klon med interferon-spesifikke sekvenser.

Da radioaktivitetssignalene er av forskjellig kvalitet, dyrkes de positive kloner, henholdsvis klonene som mistenkes for å reagere positivt, i liten målestokk. Plasmid-DNA-molekylene isoleres, spaltes med restriksjonsendonuklease Pstl og oppspaltes elektroforetisk på en agarosegel etter størrelsen (Birnboim et al., Nucl. Acid. Res. 7, 1513 (1979)). DNA'et i agarosegelen overføres etter metoden til Southern (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) på et nitro-cellu-losef ilter. Dette filterets DNA hybridiseres med den radioaktive, IFN-gen-holdige, denaturerte probe. Plasmidet 1F7 tjener som kontroll (deponert hos DSM under DSM-nummer 23 62), som inneholder genet for interferon-a2-arg. Autoradiogrammet viser tydelig at klonet E76E9 og klonet P9A2 inneholder en sekvens som under ikke-stringente betingelser hybridiserer med genet for interferon-a2-arg. For å karakterisere dsDNA innsatsen av klonet E76E9 og E9A2 nærmere, fremstilles plasmidene til dette klonet i større målestokk. DNA'et spaltes med forskjellige restriksjonsendonukleaser, således f.eks. med Alul, Sau3A, Bglll, Hinfl, Pstl og Haelll. De dannede fragmenter oppspaltes i en agarosegel. Ved sammenligning med tilsvarende størrelsesmarkører, således f.eks. fragmentene som dannes ved spaltning av pBR322 med restriksjonsendonuklease Hinfl og henholdsvis Haelll, bestemmes fragmentenes størrelser. Ved kart-legging ifølge Smith og Birnstiel (H.O. Smith et al., Nucl. Acid. Res. 3, 2387-2398 (1967)), bestemmes rekkefølgen til disse fragmentene. Fra de således oppstilte restriksjons-enzymkart (fig. 1 og 2), finner man overraskende at innsatsene til klonen E76E9 og P9A2 hittil er ukjente interferongener, nemlig sådanne for co-inter f er oner.

Denne informasjon om co-inter f er onen brukes til å spalte cDNA-innsatsen med egnede restriksjonsendonukleaser. De dannede fragmenter ligeres i dsDNA-formen (replikativ form) av bakteriogfagen M13mp9 (J. Messing et al., Gene 19, 269-276

(1982)), og sekvenseres med den sanger'ske dideoksymetode

(F. Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 5463-5467

(1977)). Den enkeltkjedede DNA fra rekombinante fager isoleres. Etter binding av en syntetisk oligomer, utføres i fire atskilte satser to kjedesynteser under anvendelse av store fragmenter av DNA-polymerase I fra E. coli (Klenow-fragment). Til hver av de fire delreaksjoner settes ett av de fire dideoksynukleosid-trifosfater (ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP). Det fører til statistisk fordelte kjedebrudd på de steder hvor den komplementære base til det enkelte dideoksynukleosid-trifosfat befinner seg i mal-DNA'et. Dertil anvendes radioaktivt merket dATP. Etter avsluttede syntesereaksjoner, denatureres produktene,og de enkeltkjedede DNA-fragmenter adskilles etter størrelse i en denaturerende polyakrylamidgel

(F. Sanger et al., FEBS Letters 87, 107-111 (1978)). Deretter eksponeres en røntgenfilm på gelen. Fra autoradiogrammet kan DNA-sekvensen til de rekombinante M13 fager avleses. Sekvensene til innsatsen av de forskjellige rekombinante fager behandles ved hjelp av egnede computer-programmer (R. Staden, Nucl. Acid, Res. 10, 4731-4751 (1982)).

Fig. 1 og 2 viser strategien for sekventeringen. Fig. 3 viser DNA-sekvensen til klonets P9A2-innsats, fig. 4 for klonet E76E9. Den ikke-kodende DNA-kjeden er vist i 5'-> 3'-retningen sammen med aminosyresekvensen som utledes derav.

De isolerte cDNA fra klonet E76E9 for co- (Glu-) interferon er 858 basepar lang og har et 3'-ikke-translatert område. Dette området som koder for ferdig co-(Glu-) interferon, går fra nukleotid 9 til nukleotid 524. De isolerte cDNA fra klonet P9A2 for co-(Glu-) interferon er 877 basepar lang, hvorunder sekvensen som koder for ferdig co-interferon rekker fra nukleotid 8 til nukleotid 523. Det 3'-ikke-translaterte området rekker i tilfellet P9A2 til poly-A-avsnittet.

DNA-sekvensene som koder for ferdig co-interferon foreligger fullstendig i klonen E76E9 og P9A2. De begynner på den N-terminale ende med aminosyrene cystein-asparaginsyreleucin. Overraskende er de to ferdige co-interferoner 172 aminosyrer lange, hvilket tydelig avviker fra lengden til de hittil kjente interferoner, f.eks. 166 (henholdsvis 165) aminosyrer ved a-interferoner. Overraskende har de to co-interferoner et potensielt N-glykosyleringssted på aminosyreposisjon 78 (asparagin-metionin-treonin).

En sammenligning av DNA fra klonet E76E9 og P9A2 viser en forskjell. Tripletten i klonet E76E9 som koder for aminosyren 111 er GAG og koder for glutaminsyre, mens denne tripletten i klonet P9A2 er GGG og koder for glycin. De to co-inter f er on - proteiner adskiller seg derfor i én aminosyre og betegnes med co-(Glu-) interferon (E76E9) og co-(Gly-) interferon (P9A2) .

Sammenligningen av de to co-interferoner med de tidligere kjente humane a-interferon-subtyper gir følgende bilde:

E. coli HB 101 med plasmidet E76E9 og E. coli 101 med plasmidet P9A2 er deponert hos Deutschen Sammlung fur Mikroor-ganismen (DSM Gottingen) under nummeret DSM 3003 henholdsvis DSM 3004 3. juli 1984.

For å underbygge at de nye funnede kloner produserer

en interferonlignende aktivitet, dyrkes f.eks. klonen E76E9

og lysatet til bakterien etter veksten prøves i et plaque-reaksjonsforsøk. Bakterien produserte som forventet interferonlignende aktivitet (se eksempel 3).

Videre ble som understøttelse for at de to nye funnede interferoner var medlemmer av en ny interferonfamilie isolert totalt DNA fra Namalwa-celler og spaltet med forskjellige restr iksjonsendonukleaser.

Herved kan antallet av gener som koder gjennom cDNA'ene til klonene P9A2 og E76E9 bestemmes. I denne hensikt spaltes de erholdte DNA-fragmenter på agarosegel etter metoden til Southern (E.M. Southern et al., J. Mol. Biol. 98, 503 - 517

(1975)), settes på nitrocellulosefilter og hybridiseres under relativt strenge betingelser med radioaktivt merket spesifikt DNA fra klonet P9A2. Resultatet man får etter hybridisering med DNA'er fra plasmidet P9A2 og pER33 er vist i fig. 5a: Herunder er de enkelte spor karakterisert ved bokstaver som viser de forskjellige spaltede DNA-prober (E = EcoRI, H=HindIII, B=BamHI, S=SphI, P=PstI, C=ClaI). Den venstre halvpart av filteret ble hybridisert med interferon-<X-gen-proben ("A") og den høyre halvpart med cDNA-innsatsen fra klonet P9A2

("0"). Båndsatsen som enten hybridiserer med a-interferon-gen-proben eller med den nye interferon-gen-probe er forskjellig. Ved de to forskjellige prober kunne ingen krysshybridi- " sering konstateres når man vurderer de tilsvarende spor.

I fig. 5b er cDNA'et fra klonet P9A2 og fragmentet som brukes for hybridiseringen avbildet. Avskjæringsstedene til noen restriksjonsenzymer er vist (P=PstI, S=Sau3A, A=AluI). Proben omfatter bare to av de tre mulige Pstl-fragmenter. Hybridiseringsmønsteret viser bare et hybridiserende fragment med ca. 1300 basepar (bp), som tilhører det homologe genet.

Det mindre 120 bp lange fragment var løpt ut av gelen. Båndet som tilhører 5'-delen av genet kan ikke oppdages, da proben ikke inneholder dette området. Minst 6 forskjellige bånd kan oppdages i PstI-sporet. Dette betyr at et annet gen som er beslektet med de nye sekvenser må være tilstede i det humane genom. Skal ett eller flere Pstl avskjæringssteder foreligge i disse gener, kan det ventes at enda minst tre ytterligere gener kunne isoleres.

Disse gener kunne fortrinnsvis isoleres ved hjelp av hybridisering fra et humant gen-bibliotek som foreligger i en plasmidbærer, fagbærer eler kosmidbærer (se eksempel 4e).

Det skal her nevnes at det ved co-interferonet fremstilt ifølge oppfinnelsen ikke bare dreier seg om to ferdige interferoner som er detaljert beskrevet, men likeledes om enhver modifikasjon av disse polypeptider som ikke påvirker IFN-co-aktiviteten. Disse modifikasjoner innbefatter f.eks. for-kortelse av molekylet på den N- eller C-terminale ende, ut-skifting av aminosyrer med andre rester, hvorved aktiviteten ikke forandres vesentlig, kjemiske eller biokjemiske bindinger av molekylet til andre molekyler som er inerte eller aktive. Ved de sistnevnte modifikasjoner kan det f.eks. dreie seg om hybridmolekyler av ett eller flere co-interferoner og/eller kjente a- eller /3-interferoner.

For å kunne sammenligne forskjellene av aminosyre- og nukleotidsekvensene til de nye interferoner, spesielt co(Glu)-og co (Gly) -interf eronet i sammenligning med de publiserte aminosyrenukleotidsekvenser for a-interferonet og for /3-interferonet (C. Weissmann et al., Phil. Trans. R. Soc. London 299, 7-28 (1982); A. Ullrich et al., J. Molec. Biol. 156, 467-486

(1982); T. Taniguchi et al., Proe. Nat, Acad. Sei. 77, 4003-4006 (1980); K. Tokodoro et al., EMBO J. 3, 669-670 (1984)) anordnes de tilsvarende sekvenser parvis og forskjellene telles på de enkelte posisjoner.

Av resultatene som er vist på fig. 7 fremgår at DNA-sekvensene til klonet P9A2 og E76E9 er beslektet med sekvensene til type I-interferonet (f .eks. a- og /3-inter feronet) . På den annen side vises at forskjellene i aminosyresekvenser mellom de enkelte interferoner av de nye sekvenser er større enn 41,6% og mindre enn 47,0%. Forskjellene mellom de nye sekvenser og sådanne for de enkelte interferoner og for /3-interferoner ligger i størrelsesorden ca. 70%. Ut fra resultatene i eksempel 4, hvori eksistensen til et helt sett beslektede gener dokumenteres, og under hensyn til den foreslåt-te nomen-klatur for interferonene (J. Vilceck et al., J. Gen. Virol. 65, 669-670 (1984)) antas at cDNA-innsatsene av klonene P9A2 og E76E9 koder for en ny klasse av type I-interferon som angis som interf eron-co.

Videre underbygges at co-interferon-genekspresjon finner sted analogt med for et interferon-typel-gen. Dertil under-søkes transkripsjonen for de enkelte medlemmer av multigen-familien a- og co-interferoner på basis av Sl-kartleggings-metoden (A.J. Berk et al., Cell 12, 721 (1977)) (se eksempel 7) , og det vises at ekspresjonen co-l-mRNA er virus induserbar. Da transkriptene til en slik genfamilie bare adskiller seg ved noen baser av ca. 1000, er hybridiseringen alene ikke noe tilstrekkelig ømfintlig forskjellstrekk til å adskille de forskjellige IFN mRNA'er.

Til dette fremstilles mRNA-sekvensene av 9 a-interferoner, av interferon-co-1 og av /3-inter f er on. De baser er her angitt méd store bokstaver som er spesifikke for den øverste sekvensen. Slike spesifikke steder kan lett finnes ved et trivielt computerprogram. En hybridiseringsprobe som går ut fra et spesifikt punkt kan bare hybridisere perfekt med mRNA'et til en bestemt subtype. Alle andre mRNA'er kan ikke hybridisere til det spesifikke punktet av subtypen. Når hybridiseringsprøven er radioaktivt markert på sin spesifikke 5'-ende, er bare de radioaktive markeringer beskyttet mot spaltninger med en enkeltkjede-spesifikk nuklease (fortrinnsvis Sl-nuklease) som har hybridisert med interferon-subtype-mRNA som proben var konstruert for.

Dette prinsipp er ikke begrenset til interferon, men kan tvert imot anvendes på enhver type kjente sekvenser som har de spesifikke punkter som er beskrevet i fig. 8.

De ovenfor nevnte spesifikke punkter for subtyper er i de fleste tilfeller ingen restriksjonspunkter, slik at kappingen av cDNA'er med restriksjonsendonukleaser ikke er egnet til å fremstille subtype-spesifikke hybridiseringsprober. Probene som benyttes i dette eksempel er derfor fremstilt ved utvidel-se av et 5'-ende radioaktivt merket oligonukleotid som er komplementært til mRNA'et for interferon-col ovenfor det spesifikke punkt.

Fra fig. 10 fremgår at som ventet, er col-mRNA induserbart i Namalwa- og NC37-celler.

Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er derfor ikke bare fremstilling av gensekvenser som koder spesifikt for de angitte co-interferoner, men likeledes modifikasjoner som lett og rutinemessig kan erholdes ved mutasjon, nedbygning, trans-posisjon eller addisjon. Enhver sekvens som koder for de beskrevne humane co-interferoner (dvs. som har det biologiske aktivitetsspektrum som her er beskrevet) og er degenerert i sammenligning med det viste, kan fremstilles på tilsvarende måte, og en fagmann på dette området er istand til å degenere-re DNA-sekvensene til de kodende områder. Likeledes kan enhver sekvens som koder for et polypeptid med aktivitets-spekteret til IFN-co, og som hybridiserer med de viste sekvenser (eller deler derav) under stringente betingelser (f.eks. betingelser som selekterer for mer enn 85%, fortrinnsvis mer enn 90% homologi), fremstiles.

Hybridiseringen utføres i 6 x SSC/5 x Denhardfs Løs-ning/0,1% SDS ved 65°C. Stringensgraden bestemmes i hvert vasketrinn. Således er betingelsene 0,2 x SSC/0,01%, SDS/65°G egnet for en seleksjonering på DNA-sekvenser med ca. 85% eller mer homologi og for en seleksjonering på DNA-sekvens med mer enn 90% eller mer homologi er betingelsene 0,1 x SSC/0,01% SDS/65°C egnet.

Ved gjennomsøking av et kosmid-bibliotek under disse betingelser (0,2 x SSC), får man noen kosmider som hybridiserer med en IFN-col-probe. Sekvensanalysen av restriksj ons-enzymfragmenter isolert fra disse gir det autentiske IFN-iol-gen (se fig. 11) samt tre ytterligere beslektede gener som kalles IFN-pseudo-co2, IFN-pseudo-o)3 og IFN-pseudo-o)4 (se fig. 12-14) .

DNA-sammenligningene viser en rundt 85% homologi a pseudo-genet til IFN-col-genet (interferon-col-gen) .

Videre viser IFN-tol-genet at ved transkripsjon inneholder mRNA'et informasjonen for et funksjonelt interferonprotein, dvs. det koder for et 23 aminosyrer langt signalpeptid med formel

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly

som etterfølges av det ferdige 172 aminosyrer lange IFN-col.

Interferon-io-gener kan innføres under betingelser i enhver organisme som fører til høye utbytter. Egnede verter og bærere er velkjente for fagmannen, og som eksempel vises til EP-A- 0.093.619.

Spesielt er prokaryoter foretrukne for ekspresjonen. Som eksempel er E. coli K 12, stamme 294 (ATCC nr. 31 446) egnet. Andre stammer som er egnet er E. coli X1776 (ATCC nr. 31.537). I likhet med de foran nevnte stammer, kan også E. coli W3110 (F", Lambda", Prototroph, ATCC nr. 27325), basiller såsom Bacillus subtilis og andre Enterobacteriaceae såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcenses og forskjellige Pseudo-monader anvendes.

Generelt kan plasmidbærere som inneholder replikon og kontrollsekvenser som stammer fra arter som er kompatible med vertcellene anvendes i forbindelse med disse vertene. Bæreren inneholder normalt ved siden av et replikasjonspunkt, gjen-kjennelsessekvenser som gjør det mulig å selektere de transformerte cellene genotypisk. For eksempel transformeres E. coli normalt med pBR322, et plasmid som stammer fra E. coli-arter (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 inneholder gener for Ampicillin- og Tetracyklin-resistens og gir derved enkle midler til å identifisere transformerte celler. pBR322-plasmidet eller også andre plasmider, må dertil i seg selv inneholde promotorer eller må være således tilstrekkelig modifisert at de inneholder promotor som kan anvendes fra den mikrobielle organisme til ekspresjon av dens egne proteiner. Prmotorene som oftest anvendes for fremstilling av rekombinant DNA, inneholder beta-lactamase (Penicillinase) og laktose-promotor-systemer (Chang et al., Nature, 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) og Tryptofan (trp) promotorsystemer (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0.036.776). Skjønt de nevnte er de vanligste promotorer, er det også utviklet og benyttet andre mikrobielle promotorer. Gen-sekvensen for IFN-io kan f.eks. anvendes under kontroll av Leftward-promotoren til bakteriofagen Lambda (PL) . Denne promotoren er en promotor som er kjent for å være spesielt sterk og kontrollerbar. Kontrollen muliggjøres med Lambda-repressoren hos hvilken naborestriksjonsavskjæringssteder er kj ente.

Et temperaturømfintlig allel for dette repressor-gen kan innsettes i en vektor, som inneholder en fullstendig IFN-w-sekvens. Økes temperaturen til 42°C, inaktiveres repressoren, og promotoren eksprimeres til sin maksimale konsentrasjon. Summen av mRNA som produseres under disse betingelser skulle være tilstrekkelig til å oppnå en celle som blant sine nye syntetiske ribonukleinsyrer inneholder ca. 10% som stammer fra PL-promotoren. På denne måte er det mulig å etablere en klonebank, hvori det er plassert en funksjonell IFM-co-sekvens i naboskap til et ribosombindingspunkt i varierende avstander fra Lambda-PL-promotoren. Disse klonene kan så granskes, og det med det høyeste utbytte selekteres.

Ekspresjon og translasjon av IFN-co-sekvens kan også foregå under kontroll av andre reguleringssystemer som gjelder for "homologe" til organismen i sin ikke-transformerte form. Således inneholder f.eks. kromosomalt DNA fra en laktoseav-hengig E. coli et laktose eller lac-operon, som muliggjør laktosenedbrytning ved utskillelse av enzymet Ø-galaktosidase.

Lac-kontrollelementene kan erholdes fra batakeriofagen lambda-plac<5> som kan infisere E. coli. Lac-operonet til fagen kan ved transduksjon stamme fra den samme bakterieart. Regu-leringssystemet som finner anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan stamme fra plasmid-DNA som er egenartet for organismen. Lac-promotor-operatorsystemet kan induseres ved

IPTG.

Andre promotor-operatorsystemer eller deler derav kan like godt anvendes: f.eks. arabinose-operator, Colicine Ex-operator, galaktoseoperator, alkalisk fosfataseoperator, trp-operator, xylose-A-operator, tac-promotor og andre.

I tillegg til prokaryoter kan også eukaryote mikro-organismer såsom gjærkulturer anvendes. Saccharomyces cerevisiae er den mest anvendte av de eukaryote mikroorganismer, skjønt flere andre arter er generelt tilgjengelige. For ekspresjon i Saccharomyces anvendes f.eks. plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al. Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141

(1979); Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) og plasmidet YEpl3 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)) normalt. Plasmidet YRp7 inneholder TRPl-genet, som er en seleksjonerings-merking for en gjærmutant som ikke er istand til å vokse i tryptofanholdig medium; f.eks. ATCC nr. 44076.

Tilstedeværelsen av TRP1 Schadens som karakteristikum for gjærverts-genomet utgjør da et effektivt hjelpemiddel til å påvise transformasjonen, idet man dyrker uten tryptofan. Lignende forholder det seg med plasmidet YEpl3, som inneholder gjærgenet LEU 2, som kan anvendes for komplettering av en LEU 2-minus-mutant. Egnede promotor-sekvenser for gjærbærere inneholder det 5'-flankerende området til genet av ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-fosfoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255,2073 (1980)) eller andre glykolytiske enzymer (Kawaski og Fraenkel, BBRC 1008, 1107-1112 (1982)) såsom enolase, glycer-aldehyd-3-fosfat, dehydrogenase, heksokinase, pyruvat, dekar-boksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og -glukokinase. Ved konsentrering av egnede ekspresjonsplasmider, kan avslutningssekvensen i forbindelse med disse gener likeledes anvendes i ekspresjons-vektoren på 3'-enden til sekvensen som skal eksprimeres for å frembringe polyadenylering og avslutning av mRNA'et.

Andre promotorer som dertil også har fordelen av transkripsjon kontrollert med vekstbetingelser, er promotorområdene til genet for alkohol-dehydrogenase-2, isocytochrom C, syre-fosfatase nedbrytende enzymer som er forbundet med nitrogen-metabolismen, de ovenfor nevnte glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase og enzymer som er ansvarlig for reaksjonene til maltose og galaktose. Promotorer som reguleres med gjær-matingstype-lokus, f.eks. promotorer for genene BARI, MFal, STE2, STE3, STE5 kan anvendes ved temperaturregulerende syste-mer gjennom anvendelsen av temperaturavhengige siv-mutasjoner.

(Rhine PH.D. i Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon

(1979), Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces, del I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Disse mutasjonene påvirker ekspresjonen av hvilende matingtype-kassetter av gjær og derved indirekte matingtype-avhengige promotorer. Generelt er imidlertid enhver plasmidbærer som inneholder en gjærfordragelig promotor, opprinnelig replikasjons- og termineringssekvenser egnet. I tillegg til mikroorganismer er kulturer av fler-cellede organismer likeledes egnede vertsorganismer. Prinsippielt kan enhver av disse kulturer anvendes, både av virveldyr eller virvelløse dyrekulturer. Størst interesse består imidlertid i virveldyrceller, slik at formeringen av virveldyrceller i kultur (vevskultur) i de siste år er blitt en rutinemessig metode (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, utgivere (1973)). Eksempler på slike nyttige verts-cellelinjer er VERO- og HeLa-celler, gullhamster-egg-stokk (CHO)-celler og W138, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinjer. Ekspre-sjonsbærer for disse celler inneholder normalt (om nødvendig) et replikasjonssted, en promotor som befinner seg foran genet som skal eksprimeres, sammen med et nødvendig ribosombindings-sted, RNA-spleising-sted, polyadenyleringssted og transkrip-sjonelle termineringssekvenser.

Ved anvendelse av pattedyrceller benyttes det for kon-trollfunksjoner på ekspresjonsbærerne ofte virusmateriale. For eksempel stammer de normalt anvendte promotorer fra polyoma Adenovirus 2, og særlig ofte fra Simian Virus 40 (SV 40). De tidlige og sene sluttpromotorer fra SV 40 er likeledes nyttige, da begge er lette å oppnå fra virusen som fragment, hvilken også inneholder virusreplikasjonsstedet til SV 40. (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Også mindre eller større fragmenter av SV 40 kan anvendes forutsatt at de inneholder den tilnærmet 250 bp lange sekvens som går fra Hindlll-skjæringsstedet til Bgl 1-skjæringsstedet i det virale replikasjonsstedet. Dertil er det likeledes mulig og ofte anbefalelsesverdig å anvende promotor eller kontrollsekvenser som normalt er knyttet sammen med de ønskede gensekvenser, forutsatt at disse kontrollsekvenser er forenlige med vert-cellesysternene.

Et replikasjonssted kan enten frembringes ved tilsvarende bærerkonstruksjon for å innbygge et eksogent sted, f.eks. av SV 40 eller fra andre viruskilder (f.eks. polyoma, adeno, VSV, PVB osv.) eller kan tilveiebringes ved kromosomreplikasjons-mekanismer fra vertcellen. Integreres bæreren i vertcelle-kromosomet, er den sistnevnte fremgangsmåte som regel tilstrekkelig.

Genet kan likevel fortrinnsvis uttrykkes i et ekspresjonsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248

(1983) og EP-A-0.115.613 - deponert hos DSM under nummeret DSM 2773 den 20. desember 1983), da denne bæreren inneholder alle regulatorelementer som fører til en høy ekspresjonsgrad av det klonede gen. Ifølge oppfinnelsen ble altså i plasmidet pBR322 det plasmid-egne kortere EcoRI/BamHI-fragment erstattet med DNA-sekvensen med formel For å oppnå målet med oppfinnelsen går man frem som f.eks. vist på fig. 6: I. Fremstilling av de her nødvendige enkelte DNA-fragmenter:

Fragment a)

For fremstilling av fragment a) spaltes et plasmid som inneholder et gen for IFN-omega, f.eks. plasmidet P9A2 med restriksjonsendonukleasen Avall. Etter kromatografi og rensning av den erholdte cDNA-innsats spaltes videre dette med restriksjonsendonukleasen Ncol og Alul to ganger, og isoleres så ved hjelp av kromatografi og elektroeluering. Dette fragment inneholder den største delen av det tilsvarende omega-interferon-gen. Således har f.eks. omega(Gly)-interferon-genet av klonet P9A2 følgende struktur :

Fragment b)

For fremstilling av fragment b) spaltes plasmidet P9A2 med restriksjonsendonukleasen Avall. Etter kromatografi og rensing av det erholdte cDNA-innskudd spaltes dette videre med restriksjonsendonukleasen Sau3A og det ønskede 189bp lange fragment isoleres ved hjelp av kromatografi og elektroeluering. Dette er den følgende struktur:

Fragment c)

For fremstilling av fragment c) spaltes plasmidet pER33 (se E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237 - 248 (1983) og EP-A-0.115.613) med restriksjonsenzymene EcoRI og PvuII to ganger. Det 389bp lange fragment man får etter agarosegelfrak-sjonering og rensning, som inneholder Trp-promotoren, det ribosomale bindingspunkt og startkodonet, spaltes deretter med Sau3A. Det ønskede 108bp lange fragment får man ved agarosegel-elektroforese, elektroeluering og Elutip-søylerensning. Dette har følgende struktur:

Ligering av fragmentene b) og c)

Fragmentene b) og c) ligeres med T4-ligase og avskjæres etter destruksjon av enzymet med Hindlll. Dette ligerte fragment har følgende struktur:

Alternativt kan dette DNA-fragment som er nødvendig for fremstillingen av plasmidet pRHWI0 også fremstilles ved anvendelse av to syntetisk fremstilte oligonukleotider:

Oligonukleotidet med formel

forblir defosforylert på sin 5'-ende.

Oligonukleotidet med formel

kinasebehandles ved hjelp av T4~polynukleotidkinase og ATP på 5'-enden.

Ved hybridisering av de to oligonukleotider får man føl-gende korte DNA-fragment:

Derved dannes på én ende 5'-overhenget som er typisk for Hindlll og på den andre ende 5 *-overhenget som er typisk for Sau3A.

Fragmentet b) defosforyleres under anvendelse av kalvetarmfosfatase. Fragment b) og det ovenfor beskrevne fragment bringes sammen og forbindes med hverandre ved hjelp av T^-ligase.

Da ligasen krever minst én 5'-fosfatholdig ende, kan

bare det syntetiske DNA-stykke med fragment b), eller 2 syntetiske fragmenter på sine Sau3A-ender knyttes sammen. Da de to resulterende fragmenter har forskjellig lengde, kan de adskilles ved selektiv isopropanolfelling. Således rensede fragment fosforyleres ved hjelp av T4~polynukleotidkinase og ATP.

II. Fremstilling av ekspresjonsplasmidene

a) Fremstilling av plasmidet pRHW 10

Man lineæriserer ekspresjonsplasmidet pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237 - 384 (1983) og EP-A-0.115.613 - som er innsendt til DSM under DSM-nummeret 2773) med Hindlll og behandler deretter med kalvetarmfosfatase. Etter isolering og rensing av det således erholdte DNA defosforyleres dette og ligeres deretter med ligerte fragmenter b) og c) (etter spaltning av dem med Hindlll). Deretter transformeres E. coli HB 101 med den erholdte ligeringsblanding og dyrkes på LB-agar pluss 50 [ ig/ ml Ampicillin. Plasmidet med den ønskede struktur får betegnelsen pRHWI0 (se fig. 6), som etter sin replikasjon tjente som mellomprodukt for fremstilling av ytterligere plasmider .

b) Fremstilling av plasmidet pRHWI2

Til plasmidet pRHWIO som var kuttet med BamHI setter man

Klenow-fragment av DNA-polymerase I og de fire deoksynukleo-sidtrifosfåtene. Plasmidet som oppnås lineærisert etter inkubasjon og med stumpe ender renses og avskjæres så med Ncol. Det større fragment, som oppnås ved hjelp av agarosegelelektro-forese, elektroeluering og elutip-rensning, ligeres med fragmentet a). Deretter transformeres ligeringsblandingen med E. coli HB101 og dyrkes på LB-agar pluss 50 |ag/ml Ampicillin. Plasmidet med den ønskede struktur får betegnelsen pRHW12 (se fig. 6), som eksprimerer det ønskede omega/Gly Jointerferon.

For eksempelvis inneholder 1 1 av den således erholdte bakteriekultur (optisk tetthet: 0,6 ved 600 nm) 1 x 10<6> internasjonale enheter interferon.

c) Fremstilling av plasmidet pRHWI1

Til plasmidet pRHWIO som er avskåret med BamHI setter

man Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og de fire deoksynukleosidtrifosfater. Plasmidet som erholdes lineærisert etter inkubasjon med rette ender renses og avskjæres så med Ncol.

Det større fragment, som oppnås ved hjelp av agarosegelelektro-forese, elektroeluering og elutip-rensning, ligeres med fragment a) som er analogt fremstilt fra plasmid E79E9, hvori bare GGG-kodonet som koder for den 111. aminosyren (Gly) er erstattet med GAG-kodonet (Glu). Deretter transformeres E. coli HB 101 med den erholdte ligeringsblanding og dyrkes på LB-agar. Plasmidet som har den ønskeae struktur får betegnelsen pRHWI1 (se analogt fig. 6) som eksprimerer det ønskede omega(Glu)-interferon.

Transformsjon av cellene med bærerne kan oppnås gjennom flere fremgangsmåter. For eksempel kan den skje med kalsium, hvorunder enten cellene vaskes i magnesium og DNA'et settes til cellene som er oppslemmet i kalsium, eller cellene utsettes for et kopresipitat av DNA og kalsiumfosfat. Ved etter-følgende gen-ekspresjon overføres cellene til medier som selekterer for de transformerte celler.

Etter gjennomført transformasjon av verten, ekspresjon av genet og fermentering eller celledyrking under betingelser hvorunder IFN-omega eksprimeres, kan produktet normalt ekstraheres ved kjente kromatografiske adskillelsesmetoder for således å oppnå et materiale som inneholder IFN-omega med eller uten leder og halesekvenser. IFN-omega kan eksprimeres med en ledersekvens på N-enden (Pre-IFN-omega), som kan fjernes fra noen vertceller. Hvis ikke er en avspaltning av leder-polypeptidet (om slikt foreligger) nødvendig for å oppnå fullstendig IFN-omega. Alternativt kan IFN-omega-klonet modifise-res slik at det ferdige protein produseres direkte i mikroorga-nismen i stedet for pre-IFN-omega. I dette tilfelle kan forsta-diesekvensen av gjærmodningsferomonet MF-alfa-1 anvendes for å oppnå en korrekt "modning" av de fusjonerte proteiner og utskillelse av produktene i vekstmediet eller i det periplas-miske rom. DNA-sekvensen for funksjonelt eller ferdig IFN-omega kan forbindes med MF-alfa-1 på den antatte katepsinlig-nende avskjæringspunkt (etter Lys-Arg) i stilling 256 ut fra påbegynnelseskodonet ATG (Kurjan,_ Herskowitz, Cell 30, 933 - 943 (1982)).

På basis av sitt biologiske virkningsspektrum er de nye interferoner anvendelige for enhver type behandling som også de kjente interferoner er egnet for. Dette omfatter f.eks. herpes, rhinovirus, opportunistiske AIDS-infeksjoner, forskjellige krefttyper og lignende. De nye interferoner kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre kjente interferoner eller biologisk aktive produkter, f.eks. med IFN-a, IL-2, andre immun-modulatorer og lignende.

eller antivirusbehandling er nødvendig, og i tilfeller hvor det vises immunoundertrykkende egenskaper. Dosering og dose-ringshastighet kan være lignende som det som for tiden gjelder for kliniske undersøkelser av IFN-o(-materialer, f.eks. ca.

(1-10) x IO<6> enheter daglig, og ved preparater som er enn 1%

rene, opptil f.eks. 5 x 10<7> enheter daglig.

For eksempel kan 3 mg IFN-omega oppløses i 25 ml 5% human-serumalbumin for en hensiktsmessig doseringsform ved en i det vesentlige homogen, bakterielt produsert IFN-omega ved parenteral anvendelse. Denne løsning sendes så gjennom et bakterio-logisk filter, og den filtrerte løsning fordeles aseptisk på 100 flasker, hvorav hver inneholder 6 x 106 enheter rent IFN-omega egnet for parenteral anvendelse. Glassene oppbevares.

før anvendelse fortrinnsvis kaldt (-20°C). Substansen kan formuleres på kjent måte til farmasøytisk anvendelige midler, hvorunder det fremstilte polypeptid blandes med en farmasøy-tisk akseptabel bærersubstans. Brukbare bærestoffer og for-muleringen av disse er beskrevet av E.W. Martin i Remington's Pharmaceutical Sciences. IFNto- blandes med en tilmålt mengde av bærerstoffet for å gi egnede farmasøytiske midler som er egnet for en effektiv anvendelse hos mottageren (pasienten). Fortrinnsvis foretas en parenteral applikasjon.

De følgende eksempler beskriver oppfinnelsen i detalj.

EKSEMPEL 1

Utplukking av IFN- sekvens- spesifikke kloner

a) Fremstilling av cDNA-biblioteket

mRNA fra Sendai-virus-stimulerte celler anvendes som

utgangsmateriale for fremstilling av et cDNA-bibliotek etter metoder kjent fra litteraturen (E. Dworkin-Rastl et al., Journal of Interferon Research Vol 2/4, 575 - 585 (1982)). De dannede 30 000 kloner overføres enkeltvis i skålene til mikrotiterplater.

Følgende medium anvendes for vekst og nedfrysing av kolonier:

10 g Trypton

5 g Gjærekstrakt

5 g NaCl 0,51 g Na-sitrat x 2 H20

7,5 g K2HP04 x 2 H20

1,8 g KH2P04

0,09 g MgS04 x 7 H20

0,9 g (NH4)2S04

44 g Glycerol

0,01 g Tetracyklin x HC1

ad 1 1 H20

Mikrotiterplatene inkuberes med de individuelle kloner natten over ved 37°C og oppbevares deretter ved -70°C.

b) Hybridiseringsprobe

Det rekombinante plasmid pER33 (E. Dworkin-Rastl et al.,

Gene 21, 237 - 248 (1983)) tjener som utgangsmateriale for hybridiseringsproben. Dette plasmid inneholder det kodende område for det ferdige interferon IFN-0(2arg pluss 190 baser av det 3'-ikke-translaterte område. 20 ug pER33 inkuberes med 30 enheter Hindlll restriksjonsendonuklease i 200 \ il reaksjons-løsning (10 rtiM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 50 mM NaCl) 1 time ved 37°C. Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av 1/25 volum 0,5 M etylendinitrotetraeddiksyre (EDTA) og oppvarmning til 70°C i 10 minutter. Etter tilsetning av 1/4 volum 5 x buffer (80% glycerol, 40 mM tris-eddiksyre pH = 7,8, 50 mM EDTA, 0,05% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% bromfenylblått) adskilles de dannede fragmenter elektroforetisk etter størrelse i en 1 % agarosegel (gel- og vandringsbuffer

(TBE): 10,8 g/l trishydroksymetylaminometan (TrisBase), 5,5 g/l borsyre, 0,9 3 g/l EDTA). Etter inkubering av gelen i en 0,5 ug/ml etidiumbromidløsning synliggjøres DNA-båndene i UV-lys, og det gelområde som inneholder det IFN-gen-holdige DNA-stykket (ca. 800 bp lang) skjæres ut. Ved å legge på en spen-ning elektroelueres DNA'et i 1/10 x TBE-buffer. DNA-løsningen ekstraheres én gang med fenol og fire ganger med eter, og DNA'et utfelles ved tilsetning av 1/10 volum 3M natriumacetat (NaAc)

pH = 5,8 og 2,5 volumer EtOH fra den vandige løsning ved -20°C. Etter frasentrifugering vaskes DNA'et én gang med 70% etanol

og tørkes 5 minutter i vakuum. DNA'et tas opp i 50 (il vann (ca. 50ug/ul). Dette DNA merkes radioaktivt ved nick-translasjon (modifisert ifølge T. Maniatis et al., MOlecular Cloning, ed. CSH). 50ul inkubasjonsløsning inneholder: 50 mM Tris pH = 7,8, 5 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetanol, 100 ng innsats-DNA av pER33, 16 pg DNasel, 25 uMol dATP, 25 uMol dGTP, 25 uMOl dTTP, 20 uCicX 32P-dCTP O3000 Ci/mMol) samt 3 enheter DNA-polymerase I (E. coli). Inkuberingen fant sted ved 14°C i 45 minutter. Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av 1 volum 50 mM EDTA;

2% SDS, 10 mM Tris pH = 7,6-løsning og oppvarmning til 70°C

i 10 minutter. DNA'et adskilles ved kromatografi gjennom Sephadex G-100 i TE-buffer (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA) fra ikke innebygget radioaktivitet. Den radioaktivt markerte probe har en spesifikk aktivitet på ca. 4 x 10' cpm/ng.

c) Utplukking av klonene méd IFN-gen-innhold

Bakteriekulturen som var frosset inn i mikrotiterplater

tines opp (a). Ett stykke nitrocellulosefilter av tilsvarende størrelse (Schleicher og Schiill, BA 85, 0,45 um porestørrelse) legges på LB-agar (LB-agar: 10 g/l Trypton, 5 g/l gjær-ekstrakt, 5 g/l NaCl, 15 g/l Bacto-agar, 20 mg/l Tetracyklin-HCl. Med et stempel tilpasset mikrotiterplatene overføres de enkelte kloner til nitrocellulosefilteret. Bakteriene vokser natten over ved 37°C til kolonier med ca. 5 mm diameter. For å ødelegge bakteriene og denaturere DNA'et legges nitrocellulosefiltrene 1 rekkefølge på en stabel med Whatman 3MM filteret gjennomtruk-ket med følgende løsninger: 1) 8 minutter på 0,5 M NaOH, 2)

2 minutter 1 M Tris pH = 7,4, 3) 2 minutter 1 M Tris pH = 7,4

og 4) 4 minutter 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris pH = 7,4. Filtrene

lufttørkes og holdes så 2 timer på 80°C. Forbehandlingen av filteret fant sted 4 timer ved 65°C i hybridiseringsløsningen bestående av 6 x SSC (1 x SSC tilsvarer 0,15 M NaCl; 0,015 M trinatriumsitrat; pH = 7,0), 5 x Denhardt<1>s løsning (1 x Denhardfs løsning tilsvarer 0,02% PVP (polyvinylpyrrolidon); 0,02% Ficoll (MG: 40 000 D); 0,02% BSM (Bovin serumalbumin)

og 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat). Ca. 1 x 10 cpm pr. filter av den i b) fremstilte probe denatureres ved koking og settes til hybridiseringsløsningen. Hybridisering finner sted i 16 timer ved 65°C. Vaskingen av filteret finner sted ved 65°C 4 x 1 time med 3 x SSC/0,1% SDS. Filterne lufttørkes, dekkes med Såran Wrap og eksponeres på Kodaks X-OmatS-film.

EKSEMPEL 2

Southern Transfer for bekreftelse av IFN- gen- holdige rekombinante plasmider

Fra koloniene som reagerer positivt eller mistenkes for

å reagere positivt dyrkes 5 ml kulturer i L-medium (10 g/l Trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 5 g/l NaCl, 20 mg/l tetracyklin x HCl) natten over ved 37°C. Plasmid-DNA'et behandles ifølge Birnboim og Doly (Nucl. Acid Res. 7, 1513, (1979)) og isoleres. Cellene fra 1,5 ml suspensjon sentrifugeres fra (Eppendorf-sentrifuge) og oppslemmes på nytt ved 0°C i 100 ul lysozym-løsning bestående av 50 mM glukose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-

HCl pH = 8,0 og 4 mg/ml lysozym. Etter 5 minutters inkubering ved romtemperatur tilsettes 2 volumdeler iskald 0,2 M NaOH,

1% SDS-løsning og inkuberes ytterligere 5 minutter. Så tilsettes 150 ul iskald natriumacetatløsning pH = 4,8 og inkuberes 5 minutter. De utfelte cellebestanddeler sentrifugeres fra. DNA-løsningen ekstraheres med 1 volumdel fenol/CHCl^ (1:1)

og DNA'et utfelles ved tilsetnina av 2 volumdeler etanol. Etter fra sentr i fuger ingen vaskes pelleten én gang med 70%.- etanol og tørkes 5 minutter i vakuum. DNA'et oppløses i 50 ul (TE)-buffer. 10 ul av dette spaltes i 50 ul reaksjonsløsning (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT) med 10 enheter Pstl-restriksjonsendonuklease i 1 time ved 37°C. Etter tilsetning av 1/25 volumdeler 0,5 M EDTA samt 1/4 volumdeler

5 x buffer (se eksempel 1b)) oppvarmes 10 minutter ved 70°C,

og DNA'et adskilles deretter elektroforetisk i en 1% agarosegel

(TBE-buffer). DNA'et i agarose-gelen overføres på et nitro-cellulosef ilter etter metoden til Southern (E.M. Southern,

J. Mol. Biol. 98, 503 - 517 (197 5)). DNA'et i gelen denatureres ved én times inkubasjon av gelen med en 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH løsning. Deretter nøytraliseres 1 time med en 1 M Tris

x HC1 pH = 8/1,5 M NaCl-løsning. DNA'et overføres med 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M natriumsitrat, pH = 7,0) på nitrocel-lulosef ilteret . Etter avsluttet overføring (ca. 16 timer) skylles filteret kort i 6 x SSC-buffer, lufttørkes så og varmes så 2 timer ved 80°C. Filteret forbehandles 4 timer med en 6 x SSC/5 x Denhardfs løsning/0,1% SDS (se eksempel 1c) ved 65°o C. Ca. 2 x 10 6 cpm av hybridiseringsproben (se eksempel lb) denatureres ved oppvarmning til 100°C og innføres så i hybridiseringsløsningen. Hybridiseringens varighet er 16 timer ved 65°C. Deretter vaskes filteret 4 x 1 time ved 65°C med en 3 x SSC/0,1% SDS-løsning. Etter lufttørking dekkes filteret med Såran Wrap og eksponeres på Kodak X-OmatS-film.

EKSEMPEL 3

Påvisning av interferonaktivitet i klon E76E9

En 100 ml kultur av klonet E76E9 dyrkes i L-medium (10 g/l Trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 5 g/l NaCl, 5 g/l glukose, 20 mg tetracyklin x HC1 pr. 1) ved 37°C inntil optisk tetthet Ag00 = 0,8. Bakteriene sentrifugeres fra 10 minutter ved 7000 opm, vaskes én gang med 50 mM Tris x HC1 pH = 8,0, 30 mM NaCl-løsning og oppslemmes i 1,5 ml vaskeløsning. Etter inkubasjon med 1 mg/ml lysozym ved 0°C i en halv time, fryses og tines bakte-riesuspensjonen fem ganger. Cellerestene sentrifugeres fra ved 40 000 opm i én time. Supernatantens sterilfiltreres og undersøkes med hensyn til interferonaktivitet. Som undersøkelse anvender man plaque-reduksjonsundersøkelsen m©6 V3-celler og Vesiculær stomatitt-virus (G.R. Adolf et al., Arch. Virol.

72, 169 - 178 (1982)). Overraskende produserer klonet opptil 9 000 IU interferon pr. liter utgangskultur.

EKSEMPEL 4

Genomisk Southern Blot for bestemmelse av antall gener som

er tilordnet de nye sekvenser

a) Isolering av DNA'et fra Namalwa-celler

400 ml av en Namalwa-cellekultur sentrifugeres ved 1000

opm i en JA21-sentrifuge for å pelletere cellene. De erholdte pelletene vaskes forsiktig, idet disse gjenoppslemmes i NP40-buffer (NP40-buffer: 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris/Cl pH = 7,4) og pelleteres på nytt ved 1000 opm. De erholdte klumper oppslemmes på nytt i 20 ml NP40-buffer og blandes med 1 ml av en 10% NP40-løsning for å ødelegge celleveggene.

Etter 5 minutters henstand i et isbad, pelleteres de intakte cellekjerner ved sentrifugering ved 1000 opm, og supernatanten kastes. Cellekjernene oppslemmes på nytt i 10 ml av en løs-ning bestående av 40 mM Tris/HCl pH = 8,0, 10 mM EDTA og 200 mM NaCl, oppslemmes på nytt og blandes så med 20 ml 20% SDS for å fjerne proteinene. Den dannene viskøse løsning ekstraheres 2 ganger med samme mengde fenol (mettet med 10 mM Tris/HCl pH = 8,0) og to ganger med kloroform. DNA<*>et utfelles ved tilsetning av etanol, skilles fra ved sentrifugering, deretter vaskes den erholdte DNA-klumpen én gang med 70% etanol, tørkes 5 minutter i vakuum og oppløses i 6 ml TE-buffer (TE-buffer: 10 mM Tris/Cl pH = 8,0, 1 mM EDTA). Konsentrasjonen av DNA er 0,8 mg/ml.

b) Restriksjonsendonuklease-spaltning av DNA'et fra Namalwa-celler

Restriksjonsendonuklease-spaltningen utføres alltid ifølge betingelsene som er angitt av produsenten.

1 ug DNA spaltes 1 time med 2 enheter av den egnede restriksjonsendonuklease i et volum på 10 ul ved 37°C i 2 timer eller lenger. EcoRI, Hindlll, BamHI, SphI, Pstl og Clal anvendes som restriksjonsendonukleaser. 20 ug DNA anvendes ved hver spaltning. For å kontrollere fullstendigheten av spaltningen adskilles alltid ved starten av reaksjonen 10 ul (alikvote deler) og blandes med 0,4 ug lambda fag-DNA. Etter 2 timers inkubasjon kontrolleres disse alikvote deler ved hjelp av aga-rosegelelektroforese og fullstendigheten av spaltningen bedøm-mes ved hjelp av et mønster av fargede lambda-fag-DNA-fragmenter.

Etter gjennomføring av disse kontroller stoppes reaksjonene ved tilsetning av EDTA inntil en sluttkonsentrasjon på 20 mM og 10 minutters opvarming av løsningen ved 70°C. DNA'et felles ved tilsetning av 0,3 M NaAc pH = 5,6 og 2,5 volumdeler etanol. Etter 30 minutters inkubasjon ved -70°C, pelleteres DNA'et i en Eppendorf -sentrifuge,vaskes én gang med 70% etanol og tørkes. Det erholdte DNA tas opp i 30 /xl TE-buffer.

c) Gel-elektroforese og Southern overføring

De spaltede DNA-prober fraksjoneres etter størrelse i

en 0,8% agarosegel i TBE-buffer (10,8 g/l Tris-base, 5,5 g/l borsyre, 0,93 g/l EDTA). For dette blandes 15 ul av DNA-proben med 4 ul belastningsbuf f er 0,02% SDS, 5 x TBE-buffer , 50 mM EDTA, 50% glycerol, 0,1% bromfenolblått), oppvarmes kort til 70°C og settes i gelene i de foreliggende trau. Lambda-DNA, som er avskåret med EcoRI og Hindlll settes i et tilsvarende trau og tjener til merking for størrelsen av DNA'et. Gelelektroforesen utføres 24 timer ved ca. 1 V/cm. Deretter bringes DNA'et ifølge Southerns metode på et nitrocellulosefilter (Schleicher og Schuell, BA85), og herunder anvendes som overføringsbuffer 10 x SSC (1 x SSC: 150 mM trinatriumsitrat, 15 mM NaCl, pH = 7,0). Etter tørking av filteret ved romtemperatur, oppvarmes dette 2 timer ved 80°C for å binde DNA'et til dette.

d) Hybridiseringsprobe

20 ug av plasmidet P9A2 avskjæres med Avall, hvorunder

et ca. 1100 bp langt fragment frigjøres, som inneholder hele cDNA-innsatsen. Dette DNA-stykket kappes på nytt med Sau3A

og Alul og det største DNA-stykket etter agarose-gel-elektroforese (se fig. 5b) isoleres ved hjelp av elektroeluering og elutip-søylekromatografi. Det således erholdte DNA (1,5 ug) oppløses i 15 (il vann.

20 ug av plasmidet pER33 kappes med Hindlll, hvorunder dette ekspresjonsplasmidet for IFN-ofé-Arg (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237 - 248 (1983)) kappes to ganger. Det mindre DNA-f ragment inneholder genet for interf eron-0C2-Ai;g og

isoleres på samme måte som ved plasmidet P9A2.

Begge DNA'er nick-translateres ifølge metoden som er foreslått av P.W.J. Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113, 237 -

251 (1977)). Nick-translasjonen utføres med 0,2 ug DNA i en løsning av 50 ul bestående av 1 x Nick-buffer (1 x Nick-buffer: 50 mM Tris/Cl pH = 7,2, 10 mM MgS04, 0,1 mM DTT, 50 ug/ml BSA), hver 100 JiMOl dATP, dGTP og dTTP, 150 uCi d-32P-dCTP

3 000 Ci/mMol) og 5 enheter DNA-polymerase I

( Nick-translasjonskvalitet). Etter 2 timer ved 14°C avbrytes reaksjonen ved tilsetning av den samme mengde av en EDTA-løsning (40 mMol) og det ikke omsatte radioaktive materiale skilles fra ved hjelp av G50-søylekromatografi i TE-buffer. Den gjenværende spesifikke radioaktivitet er ca. 100 x 10 cpm/ug DNA:

e) Hybridisering og autoradiografi

Cellulosefilteret skjæres i to halvdeler. Hver halvdel

inneholder en identisk sats av spor med Namalwa-DNA som er behandlet med restriksjonsenzymet som er omtalt i eksempel 4a. Filteret forhybridiseres i en løsning inneholdende 6 x SSC, 5 x Denhardfs (1 x Denhardt' s: 0,02% storfeserum-albumin (BSA), 0,02% polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,02% Ficoll 400), 0,5% SDS; 0,1 mg/ml denaturert kalvetymus-DNA og 10 mM EDTA 2 timer ved 65°C. Hybridiseringen utføres i en løsning inneholdende 6 x SSC, 5 x Denhardfs, 10 mM EDTA; 0,5% SDS

og ca. 10 x 106 cpm nick-translatert DNA i 16 timer ved 65°C. Den ene halvdelen av filteret hybridiseres med interferon- 2-Arg-DNA og den andre halvdelen med interferon-DNA som ble isolert fra plasmidet P9A2. Etter hybridisering vaskes begge filtrene ved romtemperatur 4 ganger med en løsning bestående av 2 x SSC og 0,1% SDS og deretter to ganger ved 65°C i 45 minutter med en løsning bestående av 0,2 x SSC og 0,01% SDS. Deretter tørkes filtrene og en Kodak X-OmatS-film eksponeres.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av ekspresjonsplasmidene pRHW 12 og pRHW 11

Forbemerkning:

Fremstillingen av ekspresjonsplasmidene vises _L fig.

6 (ikke målestokktro), videre utføres alle restriksjonsenzym-

spaltninger ifølge enzymfremstillerens forskrifter.

<a>) Fremstillin<g> av plasmidet pRHW 10

100 ug av plasmidet P9A2 spaltes med 100 enheter av restr iks jonsendonukleasen Avall. Etter spaltningen inaktiveres enzymet ved oppvarming til 70°C, de erholdte fragmenter fraksjoneres på 1,4% agarosegel med TBE-buffer (TBE-buffer: 10.8

g/l Tris-Base, 5,5g/l borsyre, 0,93 g/l EDTA) etter størrel-sen. Båndene som inneholder hele cDNA-innsatsen elektro-

elueres og renses på en elutip-søyle. Av de erholdte 20 iiq spaltes 6 /tg med restr iks jonsendonukleasen Sau3A (20 enheter i tilsammen 100 /il løsning) videre. Fragmentene adskiller man ved hjelp av 2% agarosegel i TBE-buffer. Etter farging med etidiumbromid (EtBr) elektroelueres det 189 bp lange DNA-stykket og renses som ovenfor beskrevet (= fragment b i fig-6).

For å knytte interferongenet til en promotor, et riboso-malt bindingssted og et startkodon, isoleres det tilsvarende DNA-stykke fra ekspresjonsplasmidet pER33 (E. Rastl-Dworkin

et al., Gene 21, 237 - 248 (1983)). I denne hensikt spaltes 50 ug pER33 med restriksjonsenzymet Ecol og PvuII to ganger og de erholdte fragmenter fraksjoneres etter størrelsen på

1,4% agarose-gel i TBE-buffer. 389 bp lange DNA-stykker som .inneholder Trp-promotor, det ribosomale bindingssted og startkodonet, elektroelueres og renses over en elutip-søyle. Det således erholdte fragment spaltes med Sau3A, og det ønskede 108 bp lange fragment får man ved hjelp av agarose-gel-elektroforese, elektroeluering og elutip-søylerensning i et utbytte på ca. 100 ng (= fragment c i fig. 6).

20 ng av fragment b ligeres med 20 ng av fragment c i

et volum på 40 ul under anvendelse av 10 enheter T4-ligase i en løsning som inneholder 50 mM Tris/Cl pH = 7,5, 10 mM

MgCl2, 1 mM DTT og 1 mM ATP ved 14°C i 18 timer. Deretter ødelegges enzymet ved oppvarming til 70°C, og det erholdte DNA kappes med Hindlll i et tallvolum på 50ul.

10 ug av ekspresjonsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin

et al., Gene 21, 237 - 248 (1983)) lineæriserer man med Hindlll i et totalvolum på 100 ul. Etter 2 timer ved 37°C tilsettes et volum 2 x fosfatasebuffer (20 mM Tris/Cl pH = 9,2, 0,2 mM

EDTA) sammen med én enhet kalvetarmfosfatase (CIP). Etter

30 minutter ved 45°C tilsetter man en ytterligere enhet CIP

og inkuberer igjen i 30 minutter. Det derved erholdte DNA renses ved 2 gangers fenolekstraksjon, en gang kloroformeks-traks jon og ved felling ved hjelp av tilsetning av 0,3 M natriumacetat (pH = 5,5) og 2,5 volumer etanol. Deretter defosforyleres for å forhindre deligeringen av bæreren ved neste ligeringstrinn.

100 ng av det lineære pER103 og de ligerte fragmenter

b og c (etter HindiII-spaltningen) innføres en løsning på 100 ul som inneholder ligase-buffer og ligeres ved 14°C i 18 timer med T^-DNA-ligase.

200 ul kompetent E. coli HB 101 (E. Dworkin et al., Dev. Biol. 76, 435 - 448 (1980)) blandes med 20 ul ligeringsblanding og inkuberes 4 5 minutter på is. Deretter avsluttes DNA-opptaket med et varmesjokk på 2 minutter ved 42°C. Cellesuspensjonen inkuberes ytterligere 10 minutter på is og bringes til slutt på LB-agar som inneholder 50 mg/l ampicillin. Plasmidene som foreligger i de 24 erholdte kolonier isoleres etter metoden til Birnboim og Doly (se Nucl. Acid Res. 7, 1513 - 1523 (1979)). Etter spaltningen med de forskjellige restriksjonsenzymer har et plasmid den ønskede struktur. Dette fikk betegnelsen pRHW 10 (se fig. 6 ) .

b) Fremstilling av plasmidet pRHW 12

Ca. 10 ug av plasmidet pRHW 10 kappes med Barn HI. Deretter tilsettes Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og de fire deoksynukleosid-trifosfater og inkuberes 20 minutter ved romtemperatur. Plasmidet med rette ender som er lineærisert renses ved fenolekstraksjon og felling og kappes deretter med restriksjonsendonukleasen Ncol i et volum på 100 ul. Det største fragmentet isoleres ved hjelp av agarosegel-elektroforese, elektroeluering og elektrotip-rensing. Fragmentet a) (se fig. 6) får man ved spaltning av 4 ug AvaII-fragment, som inneholder P9A2-cDNA-innsatsen (se ovenfor) med Ncol og Alul, hvorunder man får ca. 2 (ag av fragment a).

I det siste ligeringstrinn ligeres fragment a) og det tilsatte pRHW 10 som er spaltet to ganger med BamHI/NcoI i et volum på 10 ul, hvorunder det av hvert DNA anvendes 10 ng. Ligeringen av et utfylt BamHI-skjæringssted på et DNA kappet med Alul gir igjen et BamHI-skjæringssted.

Den erholdte ligeringsblanding transformeres som ovenfor beskrevet med kompetente E. coli HB 101. Fra de erholdte 40 kolonier velger man ut én, og denne får betegnelsen pRHW 12.

Plasmidet isoleres og EcoRI/BamHI-innsatsen sekvenseres etter metoden til Sanger (F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 74, 5463-5467 (1979)). Dette har den ventede sekvens.

c) Fremstilling av plasmidet pRHW 11

Denne finner sted analogt eksempel 5b. 1ug av plasmid

pRHW 10 spaltes med BamHI. De overhengende (sticky) ender av det erholdte DNA gjøres stumpe ved hjelp av Klemow-fragmentet av DNA-polymerase I og de fire doeksynukleosidtrifosfater, og deretter kappes det lineæriserte DNA med Ncol. Det største fragmentet isoleres ved hjelp av agarosegel-elektroforese, elektroeluering eller elutip-søylekromatografi.

NcoI-AluI-fragmentet isolerer man fra klonet E76E9 analogt eksempel 5b. Deretter ligerer man 10 ng av vektordelen med 10 ng av cDNA-delen i et volum på 10 ul under egnede betingelser og under anvendelse av 1 enhet T^-ligase. Etter transformasjon av den erholdte DNA-blanding i E. coli HB 101 og seleksjon av de erholdte 45 kolonier på ampicillinholdig LB-plater utvelges et klon som får betegnelsen pRHW 11. Etter dyrking av det tilsvarende klon, isolerer man plasmid-DNA. Dettes struktur underbygges ved nærvær av flere spesifikke restriksjonsendonuklase-skjæringssteder (Alul, EcoRI, Hindlll, Ncol, Pstl).

d) Ekspresjon av interferonaktivitet med E. coli HB 101

som inneholder plasmidet pRHW 12

100 ml av bakteriekulturen inkuberes inntil en optisk tetthet på 0,6 ved 600 nm i M9 minimal-medium, som inneholder alle aminosyrer unntatt tryptofan (20 ug/ml pr. aminosyre),

1 ug/ml tiamin, 0,2% glukose og 20 ug/ml indol-(3)-akrylsyre (IAA), induktoren til tryptofan-operonet. Så klumpes bakteriene ved sentrifugering (10 minutter ved 7000 opm), vaskes én gang med 50 mM Tris/Cl pH = 8, 30mM NaCl og oppslemmes til-slutt i 1,5 ml av den samme buffer. Etter 30 minutters inkubering med 1 mg/ml lysozym på is, fryses og tines bakteriene fem ganger. Celleresten fjerner man ved 1 times sentrifugering ved 40 000 opm. Supernatanten sterilfiltreres og prøves med hensyn til interferonaktivitet i plaque-reduksjonsmålingen under anvendelse av A549 celler fra mennesker og Encophalo-myocardit-virus.

Resultat: 1 1 av den fremstilte bakteriekultur inneholder

1 x 10<6> internasjonale enheter interferon (A. Bil-liau, Antiviral Res. 4, 75 - 98 (1984)).

EKSEMPEL 6

SAMMENSTILLING AV FORSKJELLENE TIL AMINOSYRE- OG NUKLEOTID-SEKVENSER FRA TYPI- INTERFERONER

a) Sammenligning av aminosyresekvensene

Den parvise sammenligning av aminosyresekvensene får

man ved oppstilling av den første cystein-resten av det ferdige (/-interferon med den første cystein-resten til aminosyresekvensene som kodes gjennom cDNA-innsetningene i plasmidene P9A2

og E76E9. Begge sekvenser vises i fig. 7 som i IFN-omega, da man ikke kunne finne noen forskjeller mellom de spesifikke sekvenser for P9A2- eller E76E9-kloner ved de målte verdier. Den eneste utførte korrektur var en innføring av et tomrom

ved posisjon 45 av interf eron- c( k, som ble talt feilsted. Når sekvensen til omega-interferonet er en partner, ble sammenligningen utført under hensyntagen til de øvrige 166 aminosyrer. Denne verdi vises i fig. 7 sammen med de ytterligere 6 aminosyrer som kodes gjennom klonene P9A2 og E76E9. De prosentvise forskjeller oppnås ved divisjon av de målte forskjeller med tallet 1,66. En ytterligere aminosyre utgjør således prosent-tallet 0,6. Det gir 3,6% for de seks ytterligere aminosyrer av IFN-omega, som allerede foreligger i prosentsatstallet.

Sammenligningene med Æ-interferonet utførs ved opplisting av den tredje aminosyre til det ferdige /i-interf eron med den første aminosyre til det ferdige oC-interferon eller den første aminosyre som kodes gjennom plasmidene P9A2 og E76E9. Den lengste sammenligningsstruktur av et <X-interf eron med ^-interferon går således over 162 aminosyrer, hvilket gir to ytterligere aminosyrer for <<>*-interferonet og $-interferonet. Disse telles som feilsteder og vises adskilt i fig. 7, men inngår i prosentsatstallet. Opplistingen av co-inter f eronet med aminosyresekvensene til klonene P9A2 eller E76E9, utføres på samme måte. Dette gir imidlertid tilsammen 10 ytterligere aminosyrer.

b) Sammenligning av nukleotid- sekvenser

Opplistingen av sekvensene som skal sammenlignes foregår

analogt eksempel 6a. Det første nukleotidet fra DNA'et til det ferdige a-interferon er det første nukleotidet til tripletten som koder for cystein i det ferdige a-interferon. Det første nukleotidet fra DNA'et til plasmidene P9A2 eller E76E9

er likeledes det første nukleotidet til kodonet for cystein-1. Det første nukleotidet fra DNA'et til / 3- inter f eronet er det første nukleotidet til den tredje triplett. Sammenligningen skjer over tilsammen 498 nukleotider når de enkelte DNA'er av a-interferonene sammenlignes med DNA'et til /3-inter f eronet, og over 516 nukleotider når DNA-sekvensene til de enkelte a-interferoner eller /3-interferoner sammenlignes med sådanne for plasmidene P9A2 eller E76E9. Det absolutte tallet for feilsteder angis i venstre del av tabellen på fig. 7 og deretter i parenteser de tilsvarende prosentangivelser.

VIRUSINDUSERBAR EKSPRESJON AV OMEGA- 1- mRNA OG NC3 7- CELLER

a) Syntese av en omega- interferon spesifikk hybridiseringsprobe

10 pMOl av oligonukleotidet d(TGCAGGGCTGCTAA) blandes

med 12 pMol gamma- 32-P-ATP (spesifikk aktivitet: > 5 000 Ci/mMol) og 10 enheter polynukleotid-kinase i et totalvolum på 10 ul

(70 mM Tris/Cl pH = 7,6, 10 mM MgCl2, 50 mM DTT) og får stå

1 time ved 37°C. Deretter avbrytes omsetningen ved 10 minutters oppvarming ved 70°C. Det erholdte radioaktivt merkede oligonukleotidet hybridiseres med 5 pMol M13pRHW 12 ssDNA (se fig. 9) i et totalvolum på 35 ul (100 mM NaCl) ved 1 times henstand ved 50°C.

Etter avkjøling til romtemperatur tilsettes nick-trans-las jonsbuffer, de fire deoksynukleosid-trifosfater og 10 enheter Klenow-polymerase til et totalvolum på 50ul (50 mM Tris/Cl pH = 7,2, 1<0> mM <MgCl>2, 5u ug/ml BSA; 1 mM pr. nukleotid). Polymeriseringen utføres ved 1 times henstand ved romtemperatur, deretter stoppes omsetningen ved 5 minutters oppvarming ved 70°C.

Ved omsetningen får man et delvis dobbeltkjedet sirku-lært DNA. Dette kappes deretter i et totalvolum på 500 ul

med 25 enheter Avall, hvorunder man anvender bufferen fremstil-leren har beskrevet. Herunder kappes de dobbeltkjedede områder til enhetlige størrelser. Så avbrytes omsetningen ved 5 minutters oppvarming ved 70°C.

b) Fremstilling av RNA fra celler infisert med virus

100 x 10<6> celler (0,5 x 10<6>/ml) behandles 48-72 timer med

100 jiMol deksametason (16a-metyl-9a-fluor-A'-hydrocortison) - kontrollene inneholder ikke noe deksametason. For interferon-induksjon oppslemmes ekspresjonscellene i serumfritt medium i en konsentrasjon på 5 x 10<6>/ml og infiseres med 2<10> enheter/ml Sendai-virus. Alikvote deler av cellekultur-supernatantene prøves med hensyn til IFN-aktivitet ved plaque-reduksjonsmål-ing (se eksempel 5b). Cellene høstes 6 timer etter virus-infeksjon ved hjelp av sentrifugering (1000 g, 10 minutter), vaskes i 50 ml NP40-buffer (eksempel 4a), gjenoppslemmes i 9,5 ml iskald NP4 0-buffer og lyses ved tilsetning av 0,5 ml 10% NP40 i 5 minutter på is. Etter ferning av kjernene ved sentrifugering, (1000 x g, 10 minutter), innstilles supernatanten med 50 mM Tris/Cl, 0,5% Sarkosin og 5 mM EDTA på pH = 8 og oppbevares ved -20°C. For å isolere alt RNA fra supernatanten, ekstraheres én gang med fenol, én gang med fenol/- kloroform/isoamylalkohol og én gang med kloroform/isoamyl-alkohol. Den vandige fasen plasseres på en 4 ml 5,7 molar CsCl-pute og sentrifugeres i en SW40-rotor (35 opm, 20 timer) for å befri ekstraktet for DNA og gjenværende proteiner. Den erholdte RNA-pellet gjenoppslemmes i 2 ml TE pH=8,0, og utfelles med etanol. Det utfelte RNA oppløses så i vann med en konsentrasjon på 5 mg/ml.

c) Påvisning av interferon- omega mRNA

0,2 ul av hybridiseringsprøven fremstilt ifølge eksempel

7b, utfelles sammen med 20 - 50 ug av RNA"et fremstilt ifølge 7c ved tilsetning av etanol. I kontrolleksperimentet tilsettes i stedet for det cellulære RNA overførings-RNA (tRNA) eller RNA, som stammer fra E. coli transformert med plasmidet pRHW 12

(eksempel 5). De erholdte pelletene vaskes saltfrie med 70% etanol, tørkes og oppløses i 25 /il 80% formamid (100 mM PIPES

pH = 6,8, 400 mM NaCl , .10 mM EDTA). Så oppvarmes proben 5 minutter ved 100°C for å denaturere hybridiseringsprobene, innstilles umiddelbart på 52°C og inkuberes 24 timer ved denne temperaturen. Etter hybridiseringen stilles probene på is og 475 ul S1-reaksjonsblanding (4 mM Zn(Ac)2, 30 mM NaAc, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 20 ug ss kalvetymus-DNA, 100 enheter S1-nuklease) tilsettes. Etter 1 times spaltning ved 37°C avbrytes omsetningen med etanolutfelling.

Pelletene oppløses i 6 /il formamid-buffer og oppspaltes

i det vesentlige lik som probene fra DNA-sekvenserings-reaksjonene på en 6% akrylamidgel som inneholder 8 M urea, (F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 74, 5463 - 5467 (1979)).

For autoradiografi utsettes den tørkede gel for en DuPont Cronex røntgenfilm under anvendelse av Kodak Lanex Regulær intensivatorer ved -70°C.

Tekst til fig. 10

Sporene A til C er kontroller.

Spor A: 20 ug tRNA

Spor B: 10 ug RNA fra pER 33 (E. coli-ekspresjonsstamme

for interferon-d2-Arg)

Spor C: 1 ng RNA fra pRHW 12 (E. coli-ekspresjonsstamme

for interferon-omega 1)

Spor D: 50 ug RNA fra ubehandlede Namalwa-celler

Spor E: 50 ug RNA fra Namalwa-celler infisert med virus Spor F: 50 ug RNA fra Namalwa-celler forbehandlet med deksametason og infisert med virus

Spor G: 20 ug RNA fra ubehandlede NC 37-celler

Spor H: 20 ug RNA fra NC 37-celler infisert med virus

Spor I: 20 ug RNA fra NC 37-celler forbehandlet med deksametason og infisert med virus

Spor M: størrelsesmerking (pBR 322 kappet med Hinfl)

Sporene B og C viser at det ventede signal bare kan påvi-ses når et omega 1-spesifikt RNA befinner seg blant RNA-molekylene. Videre vises at selv et stort overskudd av det falske RNA ikke frembringer noe bakgrunnssignal (se spor B). Videre gir også tRNA som anvendes som hybridiseringspartner ikke noe signal (se spor A).

Sporene G til I viser induksjon av det omega 1-spesifikke RNA i NC 37-celler infisert med virus. Forbehandlingen med deksametason forsterker herunder denne virkning.

Sporene D til F viser prinsippielt det samme resultat

som oppnås med Namalwa-celler. Induksjonen med omega1-spesifikt RNA er imidlertid ikke så sterkt som ved NC 37-cellene. Dette resultat er parallelt med interferonkonsentrasjonene

som ble målt i den enkelte supernatant.

Disse forholdene til interferon-omega1-gen-ekspresjon

er også slik det var å vente for et interferon type I-gen.

EKSEMPEL 8

ISOLERING AV GENET SOM KODER FOR IFN- OMEGA1 HENHOLDSVIS DERTIL BESLEKTEDE GENER:

a) Kosmidsortering

En human kosmidbank (humant DNA (fra menn) klonet i

Kosmid pcos2 EMBL (A. Ponstka, H.R. Rockwitz, A.M. Frischauf, B. Hohn, H. Lehrach Proe. Nati. Acad. Sel. 81, 4129 - 4133

(1984)) med en kompleksitet på 2 x 10^) ble undersøkt med hensyn til IFN-omega- henholdsvis dermed beslektede gener. E. coli DH1 (r„-, m„+, rec.A; gyrA96, sup.E) ble anvendt som vert. Man fremstilte først Mg -celler (lik "pletteringsbakterier"). E. coli DH1 vokser over natten i L-medium (10 g/l trypton, 5 g/l gjaerekstrakt, 5 g/l NaCl) tilsatt 0,2% maltose. Bakteriene sentrifugeres vekk^g tas opp i en 10 mM MgSO^-løsning til en ODgQQ =2. 5 ml av denne cellesuspensjonen inkuberes med 12,5 x 10^ kolonidannende enheter forpakkede kosmider i 20 minutter ved 37°C. Deretter tilsettes 10 vol LB og suspensjonen holdes 1 time for ekspresjon av kanamycinresistensen som formidles ved kosmidet på 37°C. Så sentrifugeres bakteriene vekk, oppslemmes igjen i 5 ml LB og strykes i 200 ul alikvoter på nitrocellulosefilteret (BA85, 132 mm diameter), som ligger på LB-agar (1,5% agar i L-medium) pluss 30 ug/ml kanamycin. Pr. filter vokser ca. 10 000 til 20 000 kolonier opp. Koloniene replika-plates på ytterligere nitro-cellulosef iltere som oppbevares ved 4°C.

En sats kolonifiltere behandles som beskrevet i eksempel

lc), dvs. dsDNA denatureres, og det enkeltkjedede DNA

fikseres på nitrocellulose. Filtrene forvaskes 4 timer ved 65°C i en 50 mM Tris/HCl, pH = 8,0, IM NaCl, 1 mM EDTA; 0,1% SDS-løsning. Deretter inkuberes filtrene i en 5 x Denhardfs (se eksempel 1c), 6 x SSC, 0,1% SDS-løsning i 2 timer ved 65°C og hybridiseres med ca. 50 x 10<6> cpm nicktranslaterte, denaturert IFN-omega 1 -DNA (Hind III-BamHI innsats av klone pRHWl2,

se fig. 6) 24 timer ved 65°C i den .samme løsning. Etter utført hybridisering vaskes filtrene først 3 x 10 minutter ved romtemperatur i en 2 x SSC, 0,01% SDS-løsning og deretter 3 x 45 minutter ved 65°C i en 0,2 x SSC, 0,01% SDS-løsning. Filtrene tørkes og eksponeres på Kodak X-OmatS film under anvendelse av en forsterkerfolie ved -70°C. Positivt reagerende kolonier lokaliseres på replika-filtrene, skrapes av og gjenoppslemm.es i L-medium + kanamycin (30 ug/ml). Fra denne suspensjonen ut-pletteres noen ul på LB-agar + 30 ug/ml kanamycin. De resulterende kolonier replika-pletteres på nitrocellulosefilter. Disse

32

filtrene hybridiseres som ovenfor beskrevet med P-merket IFN-omega1-DNA. Fra en hybridiserende koloni ble kosmidet isolert ved hjelp av metoden som er beskrevet av Birnboim & Doly (Nucl. Acids Res. 7, 1513 (1979)). Med dette kosmid-DNA-preparatet transformertes E. coli DH1 og transformantene ble selektert på LB-agar + 30 ug/ml kanamycin. Transformantene

32

ble igjen prøvet med P-radioaktivt merket IFN-omega1-DNA etter positivt reagerende kloner. Ett klon utvelges fra det opprinnelige isolat og dets kosmid ble fremstilt i større målestokk (Clewell, D.B. og Helinski, D.R., Biochemistry 9, 4428 ( 1970)). Tre av de isolerte kosmider har navnene cos9, cos 10 og cosB.

b) Subklonina av hybridiserte fra<g>menter i PUC8

1 jug av kosmidene cos9, coslO og cosB ble kuttet med

Hindlll. Fragmentene adskilles elektroforetisk på 1% agarose-geler i TBE-buffer og overføres ifølge Southern til nitro-cellulosef ilteret (se eksempel 4c). Begge filtrene hybridiseres med nick-translatert ul-DNA som beskrevet eksempel 4d, vaskes og eksponeres. Ca. 20 rø av hvert kosmid kuttes med Hindlll, og de dannede fragmenter adskilles gel-elektroforetisk. Fragmentene som er hybridisert med tol-DNA i det innle-dende forsøket, elektroelueres og renses over elutip-søyler. Disse fragmentene ligeres med Hindlll-lineærisert, defos-forylisert pUC8 (Messing, J., Vieira, J., Gene 19, 269-276

(1982)). E. coli JM101 (supE, thi, (lac-proAB), (F', traD36, pro AB, lac q Z Ml 5) (f.eks. Fa. P.L. Biochemicals) transformeres med ligasereaksjonsløsning. Bakteriene strykes ut på LB-agar som inneholder 50 ug/ml ampicillin, 250 ug/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-0_D-galaktopyranosid (BCIG) , og 250 /ig/ml isopropyl-Ø-D-tiogalakto-pyranosid (IPTG). En blåfar- ging av de oppvokste kolonier viser at det mangler en innsetning i pUC8. Fra noen hvite kloner isolertes plasmid-DNA'er i liten målestokk, ble kuttet med Hindlll og adskilt på 1% agarosegel. DNA-fragmentene ble overført på nitrocellulose-filtere og hybridisert som ovenfor med <32>P-omega1-DNA. Ut fra cos9 og cos 10 valgte man et subklon og betegnet det med pRHW22 henholdsvis pRH57. Fra cosB ble to DNA-fragmenter som hybridiserte godt med omega1-proben subklonet og betegnet med pRH51 henholdsvis pRH52.

c) Sekvensanalyse

DNA'et som er innsatt i pUC8 adskilles ved kutting med

Hindlll og etterfølgende gel-elektroforese fra bærerdelen. Dette DNA, ca. 10 ug, ligeres under anvendelse av T4~DNA-ligase i 50 ul reaksjonsløsning, volumet bringes på 250 ul med nick-translas jonsbuf f er (eksempel 4d) og brytes deretter under is-kjøling ved hjelp av ultralyd (MSE 100 Watt Ultrasonic Disinte-grator, maks. avgivelse ved 20 kHz, 5 x 30 sekunder). Deretter repareres endene av bruddstykkene ved tilsetning av ^100 volum av 0,5 mM dATP; dGTP, dCTP og dTTP samt 10 enheter Klenow-fragment av DNA-polymerase I i 2 timer ved 14°C. De resulterende DNA-fragmenter med rette ender adskilles etter størrelse på

en 1% agarosegel. Fragmenter med størrelser mellom 500 og

1000 bp ble isolert og subklonet i den med Smal kuttede, defos-forylerte fagbærer M13 mp8. Rekombinantfagene med enkeltkjedet DNA isoleres og sekventeres etter metoden som er utviklet av Sanger (Sanger, F. et al., Proe. Nati. Acad. Sei 74, 5463 - 5467 (1976)). Sammensetningen av enkeltsekvensene i forhold til totalsekvensen finner sted ved hjelp av Computer (Staden,

R., Nucl. Acids Res. 10, 4731 - 4751 (1982)).

d) Sekvens av subklonet pRH57 ( IFN- omega1)

Sekvensen er gjengitt i fig. 11. Dette 1933 bp lange

fragment inneholder genet for interferon-omega1. Området som koder for protein omfatter nukleotidene 576 til 1163. Sekvensen er fullstendig identisk med den frå cDNA-klonet P9A2. Nu-kleotidavsnittet 576 til 574 koder for ett 23 aminosyrelangt signalpeptid. TATA-boksen ligger i en avstand som er karakte-ristisk for interferon type I-gen foran startkodonet ATG (posisjoner 476 - 482). Genet har noen signalsekvenser for polyadenyleringen ved transskripsjonen på (ATTAAA på posisjo-nene 1497 - 1502, henholdsvis 1764 - 1796; AATAAA på posisjo-nene 1729 - 1734, henholdsvis 1798 - 1803), hvis første ble anvendt i klonet P9A2.

e) Sekvens av subklonet pRHW22 ( IFN- pseudo- omega2)

I fig. 2 er det 2132 bp lange sekvens av det med omega1-DNA-proben hybridiserende Hindlll fragment fra kosmid cos9 vist. Det dannes en åpen leseramme fra nukleotid 905 til nukleotid 1366. Aminosyresekvensen som kan utledes derav er gjengitt. De første 23 aminosyrer ligner på de fra signalpeptidet til et typisk type I interferon. De etterfølgende 31 aminosyrer viser inntil aminosyre 65 likhet med omega1-interferon, hvorunder tyrosin er bemerkelsesverdig som første aminosyre i det ferdige protein.

Etter aminosyreposisjon 66 følger sekvensen til et potensielt N-glykosyleringssted (Asn-Phe-Ser). På dette sted er aminosyresekvensen forskjellig fra et type I-interferon. Det lar seg imidlertid påvise at ved egnet innsetning og derav resulterende forskyvning av proteinleserammen kan man få likhet med IFN-omega1 (eksempel 9). Det dreier seg derfor ved det isolerte gen sett fra synspunktet type I-interferonet om et pseudogen: IFN-pseudo-omega2.

f) Sekvens av subklonet pRH51 ( IFN- pseudo- omega3)

Det ene ca. 3 500 bp lange og med omega1-probe hybridisert

HindIII-fragment som stammer fra cosmid B ble delvis sekvensert (fig. 13). Det foreligger en åpen leseramme fra nukleotidposi-sjon 92 til 94. De første 23 aminosyrene viser trekkene til et signalpeptid. Den deretter følgende sekvens begynner med tryptofan og viser likhet med IFN-omega1 inntil aminosyre 42. Deretter blir den avledede sekvens forskjellig fra IFN-omega1

og ender etter aminosyre 98. Sekvensen lar seg forandre slik ved innsetninger at den da har stor homologi ved IFN-omega1 (eksempel 9). Genet betegnes med IFN-pseudo-omega3.

g) Sekvens av innsatsen fra pRH52 ( IFN- pseudo- omega4 )

Den 3659 bp lange sekvensen av HindIII-fragmentet som

er isolert fra kosmid B og hybridiserer med omega1-DNA'et,

er vist i fig. 14. En åpen leseramme,hvis translasjonsprodukt delvis viser homologi med IFN-omega1, befinner seg mellom nukle-otidposisjon 2951 og 3250. Etter det 23 aminosyre lange signalpeptid begynner den videre aminosyresekvensen med fenylalanin. Homologien med IFN-1 er allerede avbrutt etter den 16. aminosyre, fortsetter ved den 22. aminosyre og ender med den 41. aminosyre. En eventuell translasjon vil være mulig frem til aminosyre 77. Analogt med eksempel 8f og 8g kan man også her få en god homo-r logi med IFN-omega1 ved innføring av innsetninger (eksempel 9). Det her isolerte pseudogen betegnes som IFN-pseudo-omega4.

EKSEMPEL 9

VURDERING AV GENET FOR 4 MEDLEMMER AV IFN- OMEGA- FAMILIEN

På fig. 15 er genene for IFN-omega1 til IFN-pseudo-omega4 oppstilt sammen med aminosyre-oversettelsen. For å få bedre overensstemmelse innføres huller i de enkelte gener som er vist ved punkter. Ingen baser utelates. Basenummereringen innbefatter hullene. Aminosyre-oversettelsen av IFN-omega1 bibeholdes (f.eks. posisjon 352 - 355: "C.AC" koder for His). Ved pseudogenene finner oversettelsen i en aminosyre bare sted der hvor den er entydig mulig. På grunn av denne oppstillingen ser man straks at de fire isolerte genene er beslektet med hverandre. Således får man f.eks. det potensielle N-glykosyle-ringsstedet (nukleotidposisjonene 301 til 309) i alle fire gener.

Likeledes befinner det seg en triplett som er et stopp-kodon foruten ved IFN-pseudo-omega4 på nukleotidposisjonene

611 - 614, og som ved IFN-omega1 avslutter et ferdig protein

med lengde på 172 aminosyrer. Imidlertid foreligger det i

denne anordningen hos IFN-pseudo-omega2 (nukleotidposisjoner 497 til 499) og ved IFN-pseudo-omega4 (nukleotidposisjoner 512 - 514) tidligere stoppkodoner.

Slektskapsgraden mellom genene henholdsvis aminosyretrans-lasjonene lar seg beregne ut fra anordningen som er truffet i fig. 15. Fig. 16 gjengir DNA-homologien mellom medlemmene av IFN-omega-familien. Derunder telles de posisjoner ikke med ved parvis sammenligning hvor én av de to parter eller begge har et hull. Sammenligningen gir en homologi på rundt 85% mellom IFN-omega1-DNA og sekvensene til pseudogenene. IFN-pseudo-omega2-DNA er homologt med DNA'ene fra IFN-pseudo-omega3 henholdsvis IFN-pseudo-omega4 i omtrent 82%. Fig. 17 viser sammenligningsresultatene for signalsekvenser og fig. 18 sammenligningene av "ferdige" proteiner. De sistnevnte ligger mellom 72 og 88%. Denne homologien er likevel vesentlig større enn mellom IFN-omega 1 og IFN-oCenet og IFN-0> (eksempel 6). Det forhold at de enkelte medlemmer av IFN-omega-familien ligger fjernere fra hverandre enn for IFN-a-familien seg imellom,

lar seg forklare ved at tre av de fire isolerte IFN-omega-gener er pseudogener og åpenbart ikke lenger er utsatt for det samme seleksjonstrykk som funksjonelle gener.

EKSEMPEL 10

FERMENTERING

Stammehold:

En enkeltkoloni av stammen HB101/pRHW12 på LB-agar (med 25 mg/ml ampicillin) podes over i trypton-soya-medium (OXDID CM129) med 25 mg/ml ampicillin og rystes med 250 omdreininger pr. minutt (U/min) og 37°C inntil en optisk tetthet (546 nm)

på ca. 5 erholdt (logaritmisk vekstfase). Deretter tilsettes 10 vektprosent sterilt glycerol, kulturen fylles i 1,5 ml por-sjoner i sterile ampuller og fryses inn ved -70°C:

Forkultur:

Kulturmediet inneholder 15 g/l Na2HP04 x 12H20; 0,5 g/l NaCl; 1,0 g/l NH4C1; 3,0 g/l KH2P04; 0,25 g/l MgS04 x 7H20; 0,011 g/l CaCl2; 5 g/l kaseinhydrolysat (merck 2238); 6,6 g/l glukose-monohydrat; 0,1 g/l ampicillin; 20 mg/l cystein og

1 mg/l tiamin-hydroklorid. 4 x 200 ml av dette mediet i hver sin 1000 ml Erlenmeyerkolbe podes hver med 1 ml av en stam-kultur av HB101/pRHW14 og rystes 16 - 18 timer ved 37°C og 250 omdreininger pr. minutt.

Hovedkultur:

Mediet for fermenteringen inneholder 10 g/l.,.(NH4 ) 2HP04 ; 4,6 g/l K2HP04 x 3H20; 0,5 g/l NaCl; 0,25 g/l MgS04 x 7H20; 0,011 g/l CaCl2; 11 g/l glukose-monohydrat; 21 g/l kaseinhydrolysat (merck 2238); 20 mg/l cystein, 1 mg/l tiamin-hydroklorid og 20 mg/l 3-/?-indolakrylsyre. 8 liter sterilt medium i en fermentator med 14 liters totalvolum (høyde:radius = 3:1) inok-uleres med 800 ml av forkulturen. Fermenteringen finner sted ved 28°C; 1000 O/min. (Effigas-Turbine), en luftgjennomblås-ningshastighet på 1vvm (volum/volum/minutt) og en start-pH

på 6,9. Under fermenteringen synker pH-verdien og holdes så konstant på 6,0 med 3N NaOH. Er en optisk tetthet (546 nm) på 18 til 20 nådd (normalt etter 8,5 til 9,5 timers fermenterings-tid), avkjøles under forøvrig like betingelser til 20°C og deretter innstiller man pH på 2,2 med 6N H2S04 (uten luftgjen-nomblåsning) og rører 1 time ved 10°C og 800 O/min. (uten luft-gjennomblåsning). Den biologiske masse som er inaktivert på denne måten sentrifugeres deretter fra i en CEPA-laboratorie-sentrifuge type GLE ved 30 000 O/min. og nedfryses og oppbevares ved -20°C.

EKSEMPEL 11

RENSING AV INTERFERON- OMEGA- Gly

a) Delvis rensing

Alle trinn utføres ved 4°C.

140 g biomasse (E. coli HB101 transformert med ekspresjonsklonet pRHWl2) gjenoppslemmes i 1150 ml 1% eddiksyre (for-kjølt til 4°C) og røres 30 minutter. Suspensjonen innstilles på pH 10,0 med 5 M NaOH og røres videre i 2 timer. Etter inn-stillingen med 5 M HC1 på pH = 7,5 rører man videre i 15 minutter og sentrifugerer så (4°C, 1 time med 10 000 O/min, J21-sentrifuge (Beckman), JAlO-rotor).

Den klare supernatanten settes på en 150 ml CPG (kontrol-lert poreglass)-søyle (CPG 10-350, mesh størrelse 120/200) med 50 ml/time, ettervaskes med 1000 ml 25 mM Tris/1M NaCl, pH 7,5 og elueres med 25 mM Tris/1M KCNS/50% etylenglykol, pH = 7,5 (50 ml/time).

Proteintoppen som inneholder interferonaktivitet ble oppsamlet, dialysert mot 0,1 M Na-fosfat, pH = 6,0 og 10% poly-etylenglykol 40 000 natten over, og den dannede felling ble sentrifugert fra (4°C, 1 time, 10 000 O/min, J21-sentrifuge, JA20-rotor) (se tabell 1).

b) Videre rensing

Det dialyserte og konsentrerte CPG-eluat fortynnes med

buffer A (0,1 M Na-fosfat pH = 6,25/25% 1,2-propylenglykol)

1:5 og føres gjennom et "superloop"-injeksjonsapparat (Pharmacia) med 0,5 ml/min på den buffer A ekvilibrerte MonoS 5/5 (Pharmacia, kationbytter)-søyle. Elueringen finner sted med 20 ml av en lineær gradient av 0 til 1 M NaCl i buffer A, likeledes ved en gjennomstrømningshastighet på 0,5 ml/min. Gjennom-løpet og 1 ml-fraksjonene ble samlet og undersøkt ved hjelp av en CPE-reduksjonsprøve med hensyn til interferonaktivitet.

De aktive fraksjoner ble samlet.

U:enheter i forhold til interferon-d2 (se eksempel 2 i EP-A-0.115.613: E. Coli HB101 transformert med ekspresjonsklonet pER 33) som standard

DL: gjennomløp

EKSEMPEL 12

KARAKTERISERING AV HuIFN- OMEGAI

A. Antivirusaktivitet på humanceller

B. Antivirusaktivitet på apeceller

C. Antiformeringsaktivitet på humane Burkitfs lymfocytter (cellelinje Daudi) D. Antiformeringsaktivitet på humane cervixcarcinomceller

(cellelinje HeLa)

E. Syrestabilitet

F. Serologisk karakterisering.

A. Antivirusaktivitet på menneskeceller

Cellelinje: Human lungekarcinom-cellelinje (A549)

(ATCC CCL 185)

Virus: Muse-encefalomyocarditis-virus (EMCV) Prøvesystem: Hemning av cytopatisk virkning (alle styrke-bestemmelser ble utført fire ganger)

Et partielt renset preparat fra HuIFN-omegal med et protein-innhold på 9,4 mg/ml ble titrert gjennom egnet fortynning i det nevnte prøvesystem. Preparatet viste en antivirusvirk-ning med en spesifikk aktivitet på 8300 IE/mg i forhold til referansestandarden Go-23-901-527.

B. Antivirusaktivitet på apeceller

Cellelinje: GL-V3 apenyreceller (Christofinis G.J., J.

Med. Microbiol. 3, 251 - 258, 1970)

Virus: Vesikulær stomatitt-virus (VSV)

Prøvesystem: Plaque-reduksjons-prøve (alle titreringer fire ganger)

Preparatet som er beskrevet i eksempel 12A viste en spesifikk antivirusaktivitet på 580 E/mg i nevnte prøvesystem.

C. Antiformeringsaktivitet på humane Burkitts' s lymfom- celler

( cellelinje Daudi)

Den humane Burkitfs lymofom-cellelinje Daudi ble dyrket

i nærvær av forskjellige konsentrasjoner HuIFN-omegal. Etter 2, 4 og 6 dagers inkubasjon ved 37°C ble celletettheten bestemt, ubehandlede kulturer tjente som kontroller. Alle kulturer

ble ansatt tre ganger parallelt. Fra den etterfølgende figur fremgår at IFN-omega viser en utpreget hemning av celleforme-ringen ved en konsentrasjon på 100 antivirus-enheter (IE, se eksempel 12A) pr. ml; ved en konsentrasjon på 10 IE/ml obser-verte man en partiell, transient hemning (følgende symboler anvendes i den følgende figur: 0 kontroll, ° 1 IE/ml, □ 10 IE/ml, ▼ 1 00 IÉ/ml):

D. Antiformeringsaktivitet på humane cervixcarcinomceller ( cellelinje HeLa)

Den humane cervixcarcinom-cellelinje HeLa ble dyrket

i nærvær av følgende proteiner henholdsvis proteinblandinger:

HuIFN-omegal (se eksempel 12A) 100 IE/ml

HuIFN-gamma (se eksempel 12A) 100 IE/ml

Human tumor-nekrose-faktor (HuIFN), >_ 98% ren, fremstilt av Genentech Inc., San Fransisco, USA (se Pennica D.

et al., Nature 312, 724 - 729; 1984) 100 ng/ml

Alle binære kombinasjoner av de nevnte proteinkonsentra-sjoner som ovenfor 2 kulturer ble startet i hver av 3 cm plast vevskultur-skåler (50 000 celler/skål) og inkubert 6 dager ved 37°C, og deretter ble celletettheten bestemt. Behandlingen av cellene med HuIFN-omegal eller HuIFN-gamma hadde bare liten innflytelse-på celleveksten, mens HuIFN-gamma viste en tydelig cytostatisk virking. Kombinasjoner av IFN-gamma med IFN-omega1 viste syner-gistisk cytostatisk/cytotoksisk virkning.

Den etterfølgende figur viser resultatet av forsøket:

Følgende symboler anvendes i figuren ovenfor: C ubehandlede kontroller, T HuTNF, 0 HuIFN-omega, G HuIFN-gamma.

E. Syrestabilitet

For å undersøke syrestabiliteten til HuIFN-omegal innstilles en fortynning av preparat som er omtalt i eksempel 12A i cellekulturmedium (E/min.I 1640 med 10% føtalt kalve-serum) ved hjelp av HCl på pH 2, inkuberes 24 timer ved 4°C og nøytraliseres deretter med NaOH. Denne proben ble titrert i antivirusprøven (eksempel 12A), og den viste 75% av den biologiske aktiviteten til en kontroll inkubert ved nøytral pH. IFN-omega1 må dermed betegnes som syrestabil.

F. Seroloqisk karakterisering

For å bestemme de serologiske egenskapene til HuIFN-col

i sammenligning med HuIFN-a2, ble prober (fortynnet til 100 IE/ml) for-inkubert med samme volum av løsninger av monoklonale antistoffer eller polyklonale antisera 90 minutter ved 37°C,

og deretter ble probenes antivirusaktivitet bestemt. Den et-terfølgende tabell viser at HuIFN-omegal bare kan nøytraliseres med et antiserum mot leukocyttinterferon i relativt høy konsentrasjon, men ikke med antistoffer som er rettet mot HuIFN-a2 eller HuIFN-/3. HuIFN-col er derfor hverken serologisk beslektet med HuIFN-a2 eller HuIFN-Ø:

Symboler: - ikke undersøkt; 0 ingen nøytralisering; + partiell-nøytralisering; +++ fullstendig nøytralisering.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler som koder for nye menneske-interferoner av type I IFNtol-(figur 1), som inneholder 168 til 174 aminosyrer, for interferon-pseudo-co2 ( figur 12), for interferon-pseudo-o>3 (figur 13) eller for interferon-pseudo-a>4 (figur 14), karakterisert ved at cDNA fra en B-lymfo-cyttcellelinje hybrideres med, under stringente betingelser som gir en homologi som er større enn 85%, IFN-tol innskuddet eller en degenerert variant derav, i Pstl-setet i a) plasmidet E76E9 med dep. nr. DSM 3003 b) plasmidet P9A2 med dep. nr. DSM 3004 og settes inn i en ekspresjonsvektor pRWHIO (fig. 6), pRWHll eller pRWH12 (fig. 6) med påfølgende transformasjon av E. coli.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de stringente betingelser bare kan påvise en homologi på mer enn 90%.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2, karakterisert ved at det rekombinante DNA-molekylet IFN-col inneholder sekvensen:

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at det rekombinante DNA-molekylet IFN-col ifølge krav 3 istedet for nukleotidet G i posisjon 332 inneholder nukleotidet A.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 4, karakterisert ved at de rekombinante DNA-molekyléne i tillegg inneholder en DNA-sekvens som koder for et lederpeptid med sekvensen:

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante DNA-molekyl er et interferon-col-gen med formelen:

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante DNA-molekyl er et interferon-pseudo-to2-gen med formelen:

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante DNA-molekylet er et interferon-pseudo-co3-gen med formelen:

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante DNA-molekyl er et interferon-pseudo-w4-gen med formelen:

10. Ekspresjonsplasmid for IFN-tol, som er et derivat av plasmidet PBR322, karakterisert ved at ekspresjonsplasmidet for IFN-Ql er et pBR322-plasmid, som istedet for det plasmid-egne, kortere EcoRI-BamHI-fragmentet, inneholder DNA-sekvensen med formelen:

11. Fremgangsmåte for fremstilling av nye menneske-interferoner av typen I, hvorunder de ferdige interferoner har en divergens på 30 til 50% i forhold til menneske-a-interferonene, og av deres N-glykosylerte derivater, karakterisert ved at en egnet vertsorganisme transformeres med et ekspresj onsplasmid ifølge krav 10 med den genetiske informasjon som et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 til 6 inneholder, uttrykkes, og det således produserte interferonpeptid isoleres fra denne vertsorganismen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1-9, karakterisert ved at de ferdige interferoner i tillegg har en divergens på omtrent 70% i forhold til 0-interferon.

13. Fremgangsmåte ifølge kravene 11 og 12, karakterisert ved at de ferdige interferoner har en divergens på 40 til 48% i forhold til menneske-a-interferonene.

14. Fremgangsmåte ifølge kravene 11 til 13, karakterisert ved at interferonene inneholder et leder-peptid med formel Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly.

15. Fremgangsmåte ifølge kravene 11 til 14, karakterisert ved at de ferdige interferoner inneholder 172 aminosyrer. *

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at det ferdige interferon inneholder aminosyresekvensen og deres i aminosyrestilling 78 N-glykosylerte derivater.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at det ferdige interferon ifølge krav 16 i stilling 111 inneholder aminosyren Glu istedet for Gly, og dets i aminosyrestilling 78 N-glykosylerte derivater.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av Met-derivatet ifølge kravene 16 og 17, karakterisert ved at E. coli HB 101 transformert med plasmidet pHRWll eller pRHW12 dyrkes, og det in situ dannede Met-derivat isoleres.