DK164108B - Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid - Google Patents
Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid Download PDFInfo
- Publication number
- DK164108B DK164108B DK314485A DK314485A DK164108B DK 164108 B DK164108 B DK 164108B DK 314485 A DK314485 A DK 314485A DK 314485 A DK314485 A DK 314485A DK 164108 B DK164108 B DK 164108B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- ifn
- dna
- cys
- ser
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 8
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 title 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 title 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 56
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 38
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 32
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 8
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 8
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 104
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 31
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 12
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 11
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 5
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 4
- 101000804764 Homo sapiens Lymphotactin Proteins 0.000 description 4
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 4
- 102100035304 Lymphotactin Human genes 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- NCGICGYLBXGBGN-UHFFFAOYSA-N 3-morpholin-4-yl-1-oxa-3-azonia-2-azanidacyclopent-3-en-5-imine;hydrochloride Chemical compound Cl.[N-]1OC(=N)C=[N+]1N1CCOCC1 NCGICGYLBXGBGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- PZHJLTWGMYERRJ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PZHJLTWGMYERRJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- -1 e.g. Chemical compound 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108700027921 interferon tau Proteins 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- IMVJCTWESJIARS-QWWZWVQMSA-N (2r,3r)-2,3-bis(sulfanyl)butane-1,4-diol Chemical compound OC[C@@H](S)[C@H](S)CO IMVJCTWESJIARS-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- NSHWGYPCYVZQOD-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=C)C(=O)O)=CC2=C1 NSHWGYPCYVZQOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VRTWYUYCJGNFES-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VRTWYUYCJGNFES-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100285688 Caenorhabditis elegans hrg-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSTWKJOBKSMVCV-UWVGGRQHSA-N Cys-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DSTWKJOBKSMVCV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VRJZMZGGAKVSIQ-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VRJZMZGGAKVSIQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-threitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101900234631 Escherichia coli DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- KLBVGHCGHUNHEA-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N KLBVGHCGHUNHEA-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- PPTAQBNUFKTJKA-BJDJZHNGSA-N Leu-Cys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PPTAQBNUFKTJKA-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- XBYKTPZCWQQSGB-IHRRRGAJSA-N Met-Cys-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBYKTPZCWQQSGB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N Ser-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N Tyr-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical group C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 101150077190 sinI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i
DK 164108 B
Opfindelsen angår et derivat af et humant interferon-r-polypeptid ifølge krav 1, der kodes af et rekombinant plasmid ifølge krav 1 og 2. Opfindelsen angår endvidere en mikroorganisme ifølge krav 3, der er transformeret med 5 et sådant rekombinant plasmid. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et derivat af humant interferon-r-polypeptid ifølge krav 4.
Interferoner (i det følgende betegnet I FN) kan så vidt 10 vides klassificeres i tre grupper, nemlig lFN-α, IFN-/5 og IFN-r. IFN-a dannes hovedsageligt ud fra leukocyter, IFN-β ud fra fibroblaster og IFN-r ud fra T-lymfocyter. Disse IFN'er er blevet beskrevet som biologisk aktive stoffer med antiviral aktivitet, aktiverende aktivitet på natur-15 lige killer-celler og makrofager, antitumoraktivitet og lignende.
Hvad angår IFN-r, er det rapporteret, at det har en stærkere celleinhiberende aktivitet end andre IFN'er, baseret 20 på det eksperiment, der gør brug af dyreceller [B.Y.
Rubin og S.L. Gupta: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 5928-5932 (1980)]. Endvidere er kloning af en IFN-r-cDNA og bestemmelse af dens basesekvens for nylig rapporteret [P.W. Gray, et al., Nature 295, 503 (1982); R. Devos, et 25 al., Nucleic Acids Research 10, 2487 (1982)].
Ved opfindelsen har man nu uafhængigt klonet en cDNA kodende for et hidtil ukendt IFN-r, hvori, som det fremgår af basesekvensen som vist i tabel 1, den 9. aminosyre 30 af det modne IFN- r rapporteret af Devos et al., lysin (Lys) (AAA), er erstattet med glutamin (Gin) (CAA). Endvidere blev IFN-r-cDNA'en inkorporeret i vektor pKYP-10, der har en tryptophanpromoter (japansk offentliggjort, u-undersøgt patentansøgning nr. 110600/83), og masseproduk-35 tion af IFN-r er opnået i Escherichia coli.
2
DK 164108 B
Derefter har opfinderne af den foreliggende opfindelse undersøgt dannelsen af derivater af IFN-r-polypeptid under anvendelse af den i tabel 1 viste IFN-r-cDNA som udgangsmateriale.
5
Det -blev rapporteret, at deletion af 11 aminosyrer fra den C-terminale ende af α-IFN nedsatte den specifikke aktivitet til 1/3 [A.E. Franke, et al., DNA 3L, 223-230 (1982)]:, hvorimod addition af 18 aminosyrer til den N-10 terminale ende af α-IFN ikke ændrede den specifikke aktivitet [R.M. King, et al., J. Gen. Virol. 64, 1815-1818 (1983)].
Opfinderne af den foreliggende opfindelse har fundet, at 15 deletion af 5 aminosyrer fra den N-terminale ende af
Hepatitis B virus nedsatte den specifikke aktivitet til ca. 1/100 [T. Nishi, et al., DNA 2, 265-273 (1983)], og addition af 7 aminosyrer til den N-terminale ende af Hepatitis B virus nedsatte den specifikke aktivitet til 20 ca. 1/10 [S. Itoh, et al., DNA 3, 157-165 (1984)].
I EP offentliggørelsesskrift nr. 95 350 beskrives et humant IFN-r-lignende polypeptid, hvis aminosyresekvens er angivet på side 2 i EP offentliggørelsesskrift nr.
25 9 5 3 50. Aminosyreresten på position 9 er en Lys-rest (derivaterne i nærværende opfindelse har en Gin-rest på position 9).
EP offentliggørelsesskrift nr. 146 944 (DK patentansøg-30 ning nr. 6108/84, tilhørende ansøgeren), der er et dokument under Art. 54(3) EPC, beskriver fem derivater af det humane IFN-r-polypeptid. Alle har de en carboxyl-terminus, der er identisk med det naturligt forekommende humane IFN-r. Disse derivater er derfor forskellige fra 35 derivaterne ifølge opfindelsen, der har en deletion af aminosyrepositionerne 138-146.
3
DK 164108 B
Opfinderne af den foreliggende opfindelse har konstrueret et derivat af IFN-r, hvori den 3. aminosyre i IFN-r som vist i tabel 1, cystein (Cys), var erstattet med tyrosin (Tyr) (i det følgende kaldt 3-Tyr-IFN-T), og fundet, at 5 den specifikke aktivitet var 2 til 4 gange så stærk som aktiviteten af moder-IFN-r . Endvidere konstruerede man de derivater, hvori Cys i stilling 1 var erstattet med serin (Ser) (1-Ser-IFN-r), Cys i stilling 3 var erstattet med Ser (3-Ser-IFN-r), Cys i stilling 1 og 3 var erstattet 10 med Ser (1,3-Ser-IFN-r), og N-terminale amiriosyrer i IFN-r vist i tabel 1 var deleteret. Ækvivalent eller større interferonaktivitet blev detekteret for alle derivaterne sammenlignet med udgangs-IFN-r.
15 Det har været kendt, at modent murint IFN-r består af 136 aminosyrer, hvilket antal er 10 mindre end antallet af aminosyrer i humant IFN-r, og det er mere varmestabilt end humant IFN-r. Murint IFN-r har Cys i position 136 såvel som i position 1 og 3, og disse Cys danner disulfid-20 bindinger i molekylet, hvilket betragtes som bidragende til stabilisering af IFN [D. Goeddel, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 80, 5842-5846 (1984)].
Opfinderne af den foreliggende opfindelse har fremstillet 25 molekylmodellen af IFN-r og antaget, at dannelsen af di-sulfidbinding i molekylet for humant IFN-r var mulig ved indføring af Cys mellem position 135 og 138 fra den N-terminale ende, foretrukkent i position 137. Adskillige derivater af IFN-r, hvori C-terminale aminosyrer var de-30 leteret og Met i position 137 erstattet med Cys, har vist sig at have forøget varmestabilitet og specifik aktivitet .____
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte deriva-35 ter af humant IFN-r-polypeptid, hvori visse aminosyrer fra humant IFN-r-polypeptid er fjernet, og visse aminosyrer, forskellige fra nævnte aminosyrer, er erstattet 4
DK 164108 B
med andre aminosyrer. De hidtil ukendte derivater har høj IFN-r-aktivitet og forventes at blive nyttige som lægemidler, såsom antivirale og antitumore midler.
5 På tegningen viser:
Fig. 1 et diagram for konstruktionen af plasmid pGVT137.
Som steder for Hinf I og Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
10
Fig. 2 er et diagram for konstruktionen af plasmid pGNC5.
Som steder for Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
15 Fig. 3 er et diagram for konstruktionen af plasmid pGNB4.
Som steder for Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
Fig. 4 er et diagram for konstruktionen af plasmid pGNA3.
20 Som steder for Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
Det tilsigtes med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et rekombinant plasmid, hvori inkorporeres en DNA 25 kodende for et hidtil ukendt derivat af humant IFN-r, en mikroorganisme indeholdende plasmidet, en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt derivat af humant IFN-r-polypeptid under anvendelse af mikroorganismen og derivatet af humant IFN-r-polypeptid som sådant.
30
Konstruktionen af det rekombinante plasmid udføres ved som udgangsmateriale at anvende cDNA opnået fra messenger-RNA kodende for IFN-r ved rekombinant DNA teknologi eller kromosomal DNA kodende for IFN-r.
I den foreliggende opfindelse kan en vilkårlig human IFN-r-cDNA anvendes, og pIFNr-G4 er særlig foretrukket.
35 5
DK 164108 B
Escherichia coli indeholdende pIFNr-G4 er blevet deponeret i American Type Culture Collection, USA under betegnelsen ATCC 39123.
5 DNA-sekvensen i IFN-r-DNA i pIFNr-G4 blev bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)] og er vist i tabel 1.
10 15 20 25 30 35 6
DK 164108 B
TABEL 1
CACATTGTTCTGATCATCTGAAGATCAGCTATTAGAAGAGAAAGATCAGTTAAGTCCTTTGGACCTGATCAGCTTGATACAAGAACTACTGATTT
-20 net lys tyr thr ser tyr ile leu ala phe gin leu cys ile val leu
CAACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCGGAAACG ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG
1 _ 10 20
gly ser leu gly. CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL GLN GLU ALA GLU ASK LEU LYS LYS TYR PHE ASK ALA
• GGT TCT CTT GGC'TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GT A CMl GAA GCA GAA AAC CTTAAG AAA TAT TTT AAT GCA
1 f 30 40
GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASK TRP LYS GLU GLU SER ASP
GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAG
50 60
ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASK PHE LYS ASP ASP GLN SER
AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC
70 80 90
ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASK VAL LYS PHE PHE ASK SER ASK LYS LYS LYS ARG
ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA
100 110
ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASK TYR SER VAL THR ASP LEU ASK VAL GLH ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU
GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC HG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC
120 130 140 ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU ΡΗΕΡΓΤ
ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA
(!) 146
GLY ARG ARG ALA SER GLN
GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA TGSTTGTCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATTTAACATTATTTA
TATGGGGAATATATTTTTAGACTCATCAATCAAATAAGTATTTATAATAGCAACTTTTGTGTAATGAAAATGAATATCTATTAATATATGTATTA
TTTATAATTCC7ATATCCTGTGACTGTCTCACTTAATCCTTTGTTTTCTGACTAATTAGGCAAGGCTATGTGATTACAAGGCTTTATCTCAGGGG
CCAACTAGGCAGCCAACCTAAGCAAGATCCCATGGGTTGTGTGTTTATTTCACTTGATGATACAATGAACACTTATAAGTGAAGTGATACTATCC
AGTTACTA CCCCCCC-^......
7
DK 164108 B
Sammenligning mellem den humane IFN-r-cDNA i pIFNr-G4 og den kendte IFN-r-cDNA [R. Devos, et al., Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)] viser følgende. Den første base af den triplet, der koder for den 9. aminosyre fra 5 den N-terminale ende i det modne humane IFN-r-polypeptid, lysin, er i den kendte cDNA adenin (A) [R. Davos, et al.. Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)]. På den anden side, da den tilsvarende base i plFNr-G4 cDNA er cytosin (C), er den 9. aminosyre fra den N-terminale ende af det 10 humane IFN-r-polypeptid, indkodet af pIFNr-^G4 cDNA, glu-tamin og ikke lysin. Det er derfor indlysende, at pIFNr-G4 koder for et hidtil ukendt humant IFN-r-polypeptid.
Derivater af IFN-r opnået ved deletion eller udskiftning 15 af aminosyrer i IFN-r vist i tabel 1 er også hidtil ukendte IFN-r-derivater.
Som det plasmid, der skal inkorporere en DNA kodende for IFN-r-derivat, kan et vilkårligt plasmid anvendes, så 20 længe det deri inkorporerede DNA kan udtrykkes i
Escherichia coli. Foretrukkent kan anvendes et plasmid, hvori en fremmed DNA kan indsættes nedstrøms for en egnet promoter, såsom tryptophan-promoter (Ptrp), lac-promoter eller PT-promoter af λ-fag, og længden mellem Shine-25 Dalgarno-sekvens (i det følgende benævnt SD-sekvens) og initieringscodon (ATG) indstilles, f.eks. til 6-18 basepar. Foretrukne eksempler er pKYPlO, pKYPll og pKYP12, som blev konstrueret af opfinderne til den foreliggende opfindelse (japansk offentliggjort uundersøgt patent-30 ansøgning nr. 110600/83).
Som vist på fig. 1 kløves pGBDl (referenceeksempel 1) med BamHI og Taql, og nedbrydningsproduktet renses ved poly-acrylamidgelelektroforese [A.M. Maxam, et al., Proc.
35 Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)] til opnåelse af et DNA-fragment på ca. 310 basepar (i det følgende benævnt bp).
8
DK 164108 B
Derpå kløves pGKA2 (referenceeksempel 2) med Hindlll og Hinf I, og et DNA-f ragment på ca. 400 bp indeholdende en stor del af IFN-r strukturgenet opnås ved polyacrylamid-gelelektroforese.
5 pKYPlO (japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83) kløves med Hindlll og BamHI til opnåelse af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende en tryptophan-promoter. For at opnå et IFN-r derivat, hvori amino- •5, ^ 10 syren i position 137 af det modne humane IFN-r-polypep-tid, Met, er erstattet med Cys, og aminosyrerne i positionerne 138-146 er deleteret, syntetiseres den i det følgende viste DNA-linker separat.
15
Hinfl 135 136 137 Bglll Tagl
Ser Gin Cys t*niuti«n 5' AGT CAGTGCTAA |G A T C T T 3' 3' GTCACGATTCTAGA AG cj 5' 20
De rensede DNA-fragmenter og den syntetiske DNA-linker ligeres med T4 DNA-ligase til opnåelse af det rekombi-nante plasmid pGVT137, der er vist på fig. 1. Plasmidet 25 koder for IFN-r-derivatet [137-Cys-IFN-r-(Al38-146)], der har Cys som aminosyren i position 137 og ikke har aminosyrerne i positionerne 138-146.
For at konstruere det rekombinante pGNC5, der koder for 30 derivatet [l-Ser-137-Cys-IFN-r-(Al38-146)], skæres pGVLlO derpå (referenceeksempel 4) med Hindlll og Taql, og et DNA-fragment på ca. 300 bp opnås. Separat skæres pGVT137 DNA opnået i eksempel 1 med Bglll og Taql henholdsvis Hindlll og Bglll til opnåelse af DNA-fragmenter på ca.
35 130 bp og ca. 4,6 kb. DNA-fragmenterne ligeres med T4 DNA
ligase til opnåelse af det rekombinante plasmid pGNCS, der er vist på fig. 2.
9
DK 164108 B
Det rekombinante plasmid pGNB4, der koder for 3-Ser-137-Cys-IFN-T-(Al38-146), og det rekombinante plasmid pGN3, der koder for 1,3 Ser-137-Cys-IFN-r-(Al38-146), konstrueres efter samme metode som beskrevet i det foregående 5 med den undtagelse, at plasmiderne pGVMIOl (fig. 3) og pGVKl3 (fig. 4) anvendes som kilde for DNA kodende for den N-terminale del af IFN-r.
De reaktionsbetingelser, der kræves for den rekombinante 10 DNA teknologi som beskrevet i det foregående, er almindeligvis som følger.
Nedbrydning af DNA med restriktionsenzymer udføres sædvanligvis ved omsætning af 0,1 til 20 ag DNA med 0,1 til 15 100 enheder, foretrukkent 1 til 3 enheder restriktions enzym pr. 1 ag DNA i en blanding af 2 til 200 mM, foretrukkent 10 til 40 mM Tris-HCl (pH 6,0-9,5, foretrukkent pH 7,0-8,0), 0 til 200 mM NaCl og 2 til 20 mM, foretrukkent 5 til 10 mM MgCl2 ved 20 til 70 °C (optimal tempera-20 tur afhænger af anvendte restriktionsenzymer) i 15 minutter til 24 timer. Reaktionen standses sædvanligvis ved opvarmning til 55-75 °C i 5-30 minutter eller også ved inaktivering af restriktionsenzymet med et reagens, såsom phenol eller diethylpyrocarbonat.
25
Rensning af DNA-fragmenterne dannet ved nedbrydning med restriktionsenzymer udføres ved agarosegelelektroforese under anvendelse af agarosegel, der gelerer ved lav temperatur [L. Wieslander, Analytical Biochemistry 98, 305 30 (1979), i det følgende benævnt LGT-metoden] eller poly- acrylamidgelelektroforese.
Ligering af DNA-fragmenterne udføres med 0,3-10 enheder T4 DNA-ligase i en blanding af 2-200 mM, foretrukkent 10-35 40 mM, Tris-HCl (pH 6,1-9,5, foretrukkent 7,0-8,0), 2-20 mM, foretrukkent 5-10 mM MgCl2, 0,1-10 mM, foretrukkent 0,5-2,0 mM ATP og 1-50 mM, foretrukkent 5-10 mM dithio- 10
DK 164108 B
threitol ved 1-37 °C, foretrukkent 3-20 °C i 15 minutter til 72 timer, foretrukkent 2-20 timer. Den rekombinante plasmid-DNA dannet ved ligeringsreaktionen indføres i Escherichia coli ved transformationsmetoden ifølge Cohen 5 et al. [S.N. Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, -2110 (1972)], om nødvendigt. Isolation af den rekombinante plasmid-DNA fra Escherichia coli indeholdende DNA’en udføres ved den metode, der er beskrevet i eksempel 1, eller metoden ifølge Birnboim, et al. [H.C.
10 Birnboim, et al., Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1979) ]. Plasmid-DNA nedbrydes med 1-10 typer restrik-tionsendonukleaser, og kløvningsstederne undersøges ved agarosegelelektroforese eller polyacrylamidgelelektro-forése. Om nødvendigt undersøges DNA-sekvensen af DNA'en 15 yderligere ved Maxam-Gilbert sekventeringsmetoden [Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)].
De rekombinante plasmider kan fremstilles under de i det foregående beskrevne betingelser.
20
Derivatet af IFN-τ-polypeptid ifølge opfindelsen fremstilles ved følgende metode.
Escherichia coli K-12 HB101 transformeres med et plasmid, 25 såsom pGVA4, og en Escherichia coli-stamme indeholdende pGVA4 udvælges fra de ampicillinresistente (i det føl-
R
gende benævnt Ap ) kolonier. Escherichia coli-stamme indeholdende pGVA4 dyrkes i et medium til fremstilling af et derivat af IFN-r-polypeptid i mediet.
30
Som medium kan der enten anvendes et syntetisk medium eller et naturligt medium, så længe det er egnet til dyrkning af Escherichia coli og produktionen af IFN-r-polypeptidderivatet.
Som carbonkilde kan der f.eks. anvendes glucose, fructose, lactose, glycerol, mannitol og sorbitol.
35 11
DK 164108 B
Som nitrogenkilde der kan der f.eks. anvendes NH^Cl, (NH^^SO^, casaminosyre, gærekstrakt, polypepton, kødekstrakt, "Bactotrypton" og majsstøbevæske.
5 Desuden kan der anvendes næringsstoffer, såsom K^HPO^, KJ^PO^, NaCl, MgSO^, vitamin B1 og MgCl2-
Dyrkningen udføres ved pH 5,5 til 8,5 og ved 18 til 40 °C med luftning og omrøring.
10
Efter dyrkning i 5-90 timer akkumuleres derivatet af humant IFN-r-polypeptid i dyrkede celler. De indsamlede celler behandles med lysozym, sønderdeles ved gentagen frysning og optøning og underkastes centrifugering. Den 15 således opnåede ovenliggende væske underkastes ekstraktion efter en konventionel metode til ekstraktion af polypeptider til udvinding af polypeptidet.
Bestemmelse af den humane IFN-r-aktivitet udføres efter 20 metoden ifølge Armstrong [J.A. Armstrong, et al., Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)].
Visse specifikke udførelsesformer for den foreliggende opfindelse forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgen- 25 de eksempler.
EKSEMPEL 1
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVT137 kodende for 30 137-Cys-IFN-r-(Al38-146) 10 ug pGBDl-DNA opnået i referenceeksempel 3 blev opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning bestående af 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 35 100 mM NaCl (i det følgende benævnt "Y-100 bufferopløs ning*' ). Derpå tilsættes 20 enheder restriktionsenzym BamHI (produkt fra Takara Shuzo Co., ligesom alle i det 12
DK 164108 B
følgende anvendte restriktionsenzymer er produkter fra Takara Shuzo Co. med mindre andet er angivet), og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Derefter blev der tilsat 20 enheder restriktionsenzym Taql, 5 og nedbrydningsreaktionen foregik ved 65 °C i 2 timer.
Ca. 0,5 ug af et DNA-fragment på ca. 310 bp - indeholdende 3'-non-translationalt område blev opnået fra reaktions-opløsningen ved polyacrylgelelektroforese.
10 Separat blev 10 ug pGKA2-DNA opnået i referénceeksempel 2 opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og Hinfl blev sat til opløsningen. Nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 15 3 timer. Et DNA-fragment på ca. 400 bp indeholdende en stor del af IFN-r-strukturgenet blev opnået fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese. 3 ug pKYPlO fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83 20 blev opløst i 40 ni (totalvolumen) af en opløsning indeholdende Y-100 pufferopløsning, og 6 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og BamHI blev sat til opløsningen. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. 1,8 ng af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indehol-25 dende en tryptophan-promoter (P^ ) blev opnået fra reak tionsopløsningen ved LGT-metoden. Separat blev følgende DNA-linker syntetiseret for at ændre den 137. aminosyre (Met) i det modne humane IFN-r-polypeptid til Cys og for at give en terminal codon (TAA), nødvendig til afslutnin-30 gen af udtrykkeisen, umiddelbart efter aminosyre nr. 137,
Cys.
Hinfl 135 136 137 Bglll Taql
Ser Gin Cys termination 35 5'| A G T C A G |t~ G Ci T A A [G A T C T T 3' 18-mer 3’ GTCACGATTCTAGAAGC5' 17-mer 13
DK 164108 B
To enkeltkædede DNA'er, en 18-mer og en 17-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode [R. Crea, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 5765 (1978)]. Derpå blev 2 ug af såvel den 18-mere som den 17-mere DNA opløst 5 i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase (produkt fra Takara Shuzu Co.) blev tilsat, og phospho-ryleringsreaktion blev udført ved 37 °C i 60 minutter.
10
Derpå blev 0,5 ag af Taql-BamHI-fragmentet på ca. 310 bp afledt fra pGBDl, 0,5 ag af Hindlll-HinfI-fragmentet på ca. 400 bp afledt fra pGKA2 og 1,0 ug af HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb af udtrykkel ses vektoren pKYPlO, 15 som opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-puf feropløsning. Ca. 0,1 ug af den i det foregående nævnte DNA-linker blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
20
Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af en AP koloni.
25 Plasmid pGVT137 vist på fig. 1 blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVT137 blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, Bglll og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved metoden ifølge [A.M. Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 30 USA, 74, 560 (1977)], at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql i plasmidet pGVT137 var som følger:
Hinfl 135 136 137 Bglll Taql
Ser Gin Cys ttniutiei 35 AGT CAGTGCTAA b A T C T T _ GTCACGATTCTAGAA GCj 14
DK 164108 B
Det humane IFN-r-polypeptidderivat, som pGVT137 koder for [derivatet kaldes 137-Cys-IFN-r(Δ138-146)], er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 137. aminosyre (Met) i det modne humane IFN-r er 5 erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale ende, aminosyre 138 (Leu) til 146 (Gin) er deleteret.
Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVT137 er blevet deponeret hos Fermentation Research Institute, 10 Agency of Industrial Science and Technology" (i det følgende benævnt FRI) som Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547).
EKSEMPEL 2 15
Konstruktion af rekombinant plasmid pGNC5 kodende for 1-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146): 10 ug pGVLIO DNA opnået i referenceeksempel 4 blev opløst 20 i 50 ul Y-100 pufferopløsning. 20 enheder restriktionsenzym HindiII blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev foretaget ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev der tilsat 20 enheder restriktionsenzym Taql, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,5 25 ug af et DNA-fragment på ca. 300 bp indeholdende det 5'-terminale område af IFN-r strukturgenet ud fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 10 ug pGVT137 opnået i eksempel 1 opløst i 30 50 ul Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder restriktions enzym Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder restriktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,4 ug af 35 et DNA-fragment på ca. 130 bp indeholdende det 3'-terminale område af IFN-r strukturgenet fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
15
DK 164108 B
Separat blev 5 ag plasmid pGVT137 DNA opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, og 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev foretaget ved 37 °C i 3 timer.
5
Ca. 2,0 ug af et DNA-fragment på ca. 4,6 kb indeholdende det 3'-non-translationale område og Ptrp blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
10 Derpå blev 0,4 ug af Hindlll-Taql fragmentet (ca. 300 bp) afledt fra pGVLlO, 0,5 ug af Bglll-Taql fragmentet (ca.
130 bp) afledt fra pGVT137 og 1,0 ug af Hindlll-BgIII fragmentet (ca. 4,6 kb) afledt fra det samme plasmid, som var opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-15 pufferopløsning. 6 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
Escherichia coli stamme HB101 blev transformeret med den
resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af R
20 en Ap koloni.
Plasmid pGNC5, der er vist på fig. 2, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGNC5 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, EcoRI, Blgll, 25 Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen omkring Hindlll-Sinl var som følger:
Sin! 30 . .
Hindlll Met Ser Tyr Cys Gin Asp
U G C T I ATGTCTTACTGCCAGGAC
J ‘“““l 35 og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger: 16
DK 164108 B
HinfI Bglll Taql 135 136 137 5 Ser Gin Cys termination
AGTCAGTGCTAAGATCTTCG
L-^-j I J
Det humane IFN-r-polypeptidderivat, som pGNC5 koder for 10 [derivatet kaldes l-Ser-137-Cys-IFN-r(Al36-146)], er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 1. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser, aminosyre 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale ende, 15 aminosyre 138 (Leu) til aminosyre 146 (Gin), er delete-ret. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGNC5 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) 20 EKSEMPEL 3
Konstruktion af rekombinant plasmid pGNB4 kodende for 3-
Ser-137-Cys-IFN-r(M38-146): 25 10 ug pGVMIOl DNA opnået i referenceeksempel 5 blev op løst i 50 ul Y-100 pufferopløsning. 20 enheder restriktionsenzym Hindlll blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev foretaget ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev der tilsat 20 enheder restriktionsenzym Taql, og nedbrydningsreak-30 tionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,5 ug af et DNA-fragment på ca. 300 bp indeholdende det 5'-terminale område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
35 Separat blev 10 ug pGVT137 opnået i eksempel 1 opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder restriktionsenzym Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev ud- 17
DK 164108 B
ført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder restriktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,4 ug af et DNA-fragment på ca. 130 bp indeholdende det 3'-termi-5 nåle område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 5 ug plasmid pGVT137 DNA opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, 10 enheder af hvert af restrik-10 tionsenzymerne Hindlll og Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev foretaget ved 37 °C i 3 timer.
Ca. 2,0 ug af et DNA-fragment på ca. 4,6 kb indeholdende det 3'-non-translationale område og blev opnået fra 15 reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
Derpå blev 0,4 ug af Hindlll-Taql fragmentet (ca. 300 bp) afledt fra pGVMIOl, 0,5 ug af Bglll-Taql fragmentet (ca.
130 bp) afledt fra pGVT137 og 1,0 ug af Hindlll-BgIII 20 fragmentet (ca. 4,6 kb) afledt fra det samme plasmid, som blev opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-pufferopløsning. 6 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 "C i 17 timer.
25 Escherichia coli stamme HB101 blev transformeret med den
resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af R
en Ap koloni.
Plasmid pGNB4, vist i fig. 3, blev isoleret fra dyrk-30 ningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGNB4 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, EcoRI, Blgll, Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen omkring Hindlll-SinI i pGNB4 var som følger: 35 18
DK 164108 B
Sinl
Hindlll Met Cys Tyr Ser Gin Asp k Iagcttatgtgctactctcaggac og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger: 10
Hinfl Bglll Taql 135 136 137
Ser Gin Cys f rad nation AGTCAGTGCTAA G A T C T T IC G 15 » I “
Det humane IFN-τ-polypeptidderivat, som p6NB4 koder for [derivatet kaldes 3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146)], er 20 klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 3. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser, aminosyre 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale ende, aminosyre 138 (Leu) til aminosyre 146 (Gin), er 25 deleteret. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGNB4 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549) EKSEMPEL 4 30
Konstruktion af rekombinant plasmid pGNA3 kodende for 1,3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146): 10 ug pGVK13 DNA opnået i referenceeksempel 6 blev opløst 35 i 50 ul Y-100 pufferopløsning. 20 enheder restriktionsenzym HindiII blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev foretaget ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder re- 19
DK 164108 B
striktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,5 ug af et DNA-fragment på ca. 300 bp indeholdende det 5'-terminale område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsop-5 løsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 10 Mg pGVT137 opnået i eksempel 1 opløst i 50 μΐ Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder restriktionsenzym Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev ud-10 ført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder restriktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,4 wg af et DNA-fragment på ca. 130 bp indeholdende det 3'-terminale område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsopløsnin-15 gen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 5 ug plasmid pGVT137 DNA opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og Bglll blev tilsat. Nedbryd-20 ningsreaktionen blev foretaget ved 37 °C i 3 timer.
Ca. 2,0 ug af et DNA-fragment på ca. 4,6 kb indeholdende det 3’-non-translationale område og Ptrp blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
25
Derpå blev 0,4 ug af HindiII-Taql fragmentet (ca. 300 bp) afledt fra pGVK13, 0,5 ug af Bglll-Taql fragmentet (oa.
130 bp) afledt fra pGVT137 og 1,0 ug af Hindlll-BgIII fragmentet (ca. 4,6 kb) afledt fra det samme plasmid, som 30 blev opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-pufferopløsning. 6 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
Escherichia coli stamme HB101 blev transformeret med den
35 resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af R
en Ap koloni.
20
DK 164108 B
Plasmid pGNA3, vist i fig. 4, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGNA3 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, EcoRI, Blgll, Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet 5 ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen omkring Hindlll-SinX i pGNA3 var som følger:
Sinl
Hindu I Met Ser Tyr Ser Gin Asp 10 i
AGCTTATGTCTTACTCTCAGGAC
og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger: 15
Hinfl Bglli Taql 135 136 137
Ser Gin Cys termination 20
AGTCAGTGCTAAGATCTTCG
L-Sj
Det humane IFN-r-polypeptidderivat, som pGNA3 koder for 25 [derivatet kaldes l,3-Ser-137-Cys-IFN-r(Al38-146)], er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 1. og den 3. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser, aminosyre 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale 30 ende, aminosyre 138 (Leu) til aminosyre 146 (Gin), er deleteret. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGNA3 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGNA3 (FERM BP-548).
35 EKSEMPEL 5
Produktion af IFN-r derivater med Escherichia coli stam- 21
DK 164108 B
mer indeholdende pGVT137, pGNC5, pGNB4 og pGNA3
Escherichia coli HBlOl-stammer indeholdende rekombinante plasmider pGVT137, pGNC5, pGNB4 og pGNA3 opnået i eksem-5 pel 1-4, som kaldes henholdsvis IGVT137, IGNC5, IGNB4 og IGNA3, blev dyrket ved 37 °C i 18 timer i LG-medium (10 g trypton, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl, 2 g glucose, 1 liter vand, indstillet til pH 7,0 med NaOH). 0,2 ml af dyrkningsbouillonen blev inokuleret i 10 ml MCG-medium (0,6% 10 Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5% NaCl, 0,1% NH4cr,~ 0,5% glucose, 0,5% casaminosyre, 1 mM MgS04, 4 ag/ml vitamin B^, pH 7,2) og dyrkning blev udført ved 30 °C i 4-8 timer. Derpå blev 10 ag/ml indolylacrylsyre (i det følgende benævnt IAA), som er en inducer for tryptophan, tilsat, og dyrk-15 ning blev fortsat i 2-12 timer. Dyrkningsbouillonen blev centrifugeret ved 8000 omdr./min. i 10 minutter, og de høstede celler blev vasket med en pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl (pH 7,5). Vaskede celler blev suspenderet i 1 ml af pufferopløsningen som 20 beskrevet i det foregående, og 5 al af en opløsning indeholdende 200 ag lysozym og 0,25 M EDTA (ethylendiamin-tetraeddikesyre) blev tilsat. Blandingen fik lov at henstå ved 0 °C i 30 minutter, og frysning og optøning blev gentaget 3 gange for at sønderdele cellerne. De sønder-25 delte celler blev centrifugeret ved 15000 omdr./min. i 30 minutter til opnåelse af en overliggende væske. Mængden af interferon i den overliggende væske blev bestemt efter metoden ifølge Armstrong [J.A. Armstrong, et al., Appl. Microbiol., 21, 723-725 (1971)], hvori Sindvis-virus blev 30 anvendt som virus, og FL-celler afledt fra humane amnion-celler blev anvendt som dyrecellerne. Resultaterne er vist i tabel 2.
35 TABEL 2 22
DK 164108 B
IFN-r
Produkt, som (enheder/ 5 Stamme Plasmid plasmidet koder for ml) IGVT137 PGVT137 137-Cys-IFN-r(Δ138-146) 8 x 104 IGNA3 pGNA3 l,3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 8 x 105 10 IGNB4 pGNB4 3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 1 x 106 IGNC5 pGNC5 l-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 5 x 105 IGKA2 pGKA2 IFN-r 2 x 104 15 -—- IGKA2 er en stamme indeholdende plasmid pGKA2, der koder for IFN-r.
20 EKSEMPEL 6
Eksperiment vedrørende varmestabilitet af IFN-r-derivater; 137-Cys-IFN-r(Δ138-146), 1-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146), 3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146) og 1,3-Ser-137-Cys-25 IFN-r(Δ138-146)
Escherichia coli HBlOl-stammer indeholdende rekombinante plasmider pGVT137, pGNC5, pGNB4 og pGNA3 opnået i eksempel 1-4, som kaldes henholdsvis IGVT137, IGNC5, IGNB4 og 30 IGNA3, blev dyrket ved 37 °C i 18 timer i LG-medium. 0,2 ml af dyrkningsbouillonen blev inokuleret i 10 ml MCG-me-dium, og der blev foretaget dyrkning ved 30 °C i 4-8 timer. Derpå blev 10 ug/ml I AA tilsat, og dyrkningen blev fortsat i 2-12 timer. Dyrkningsbouillonen blev centrifu-35 geret ved 8000 omdr./min. i 10 minutter, og de høstede celler blev vasket med 30 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl. Vaskede celler blev 23
DK 164108 B
suspenderet i 1 ml pufferopløsning som beskrevet i det foregående, og 5 ul af en opløsning indeholdende 200 ug lysozym og 0,25 M EDTA blev tilsat. Blandingen fik lov at henstå ved 0 °C i 30 minutter, og frysning og optøning 5 blev gentaget 3 gange for at sønderdele cellerne. De sønderdelte celler blev centrifugeret ved 15000 omdr./min. i 30 minutter til opnåelse af en overliggende væske. Den overliggende væske blev opvarmet ved 50 °C i 1 time, og den antivirale aktivitet af interferon blev bestemt efter 10 metoden ifølge Armstrong til måling af restaktiviteten (%).
Resultaterne er vist i tabel 3.
15 TABEL 3
Restaktivitet
Produkt som efter varmebe-
plasmidet handling ved 50°C
Stamme Plasmid koder for i 1 time (%) 20 - IGVT137 pGVTl37 137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 81 IGNC5 pGNC5 l-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 86 25 IGNB4 pGNB4 3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 98 IGNA3 pGNA3 1,3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 23 IGKA2 pGKA2 IFN-r 25 30 -
Referenceeksempel 1
Indsætning af human IFN-r-DNA i udtrykkelsesvektoren 35 pKYPll I dette eksempel blev 6 ug plasmid pIFNr-G4 (3,6 kb) opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning inde- 24
DK 164108 B
holdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM di-thiothreitol og 50 mM NaCl. Derpå blev 12 enheder af hvert af restriktionsenzymerne PvuII og Hindlll tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 2 5 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 7 minutter for at inaktivere enzymerne og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 1,2 ug af et DNA-fragment på 1,3 kb indeholdende human IFN-r-DNA.
10 Separat blev 4 ug pKYPll opløst i 40 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 20 mM dithiothreitol og 50 mM NaCl. 8 enheder BamHI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet 15 ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere enzymet. Derefter blev 30 um af hvert af stofferne dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsat, og 8 enheder Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment, produkt fra New England Biolabs, 1 al) blev tilsat. Udfyldningsreaktion blev ud-20 ført ved 15 °C i 1 time, og reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 68 °C i 15 minutter for at inaktivere DNA polymerase I. 10 enheder Hindlll blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer efterfulgt af opvarmning ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere 25 Hindlll. Nedbrydningsreaktionsopløsningen af plasmid pKYPll blev underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 2,5 ug af et DNA-fragment på ca. 4,7 kb indeholdende P.
trp 30 Derpå blev 0,5 ug af DNA-fragmentet på 1,3 kb indeholdende human IFN-r-DNA og 1,0 ug af DNA-fragmentet på ca. 4,7 kb indeholdende P^ , som var opnået fra plasmid pKYPll, opløst i 20 ul af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^r 5 mM dithiothreitol og 500 uM 35 ATP, og 4 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 18 timer, og Escherichia coli HB101 blev transformeret med den resulterende rekom- 25
DK 164108 B
binante plasmidblanding ved konventionel teknik til op-nåelse af en Ap koloni. Plasmid pGC7 blev skilt fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGC7 blev bekræftet ved nedbrydning med HindllX, Hpal, Sall, EcoRl 5 og Clal og agarosegelelektroforese. Escherichia coli stamme indeholdende pGC7 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGC7 (FERM BP-497).
Referenceeksempel 2 10
Konstruktion af rekombinant plasmid pGKA2 I dette eksempel blev 6 ag af den pGC7 DNA, der blev opnået i referenceeksempel 1, opløst i 50 al (totalvolumen) 15 af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 10 mM NaCl, og 12 enheder BstNI (produkt fra New England Biolabs) blev tilsat. Der blev udført reaktion ved 60 "C i 3 timer, og reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 "C i 5 minutter 20 for at inaktivere BstNI. Derpå blev NaCl tilsat til en endelig koncentration på 150 mM, og 8 enheder Sall blev tilsat. Nedbrydnignsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev igen opvarmet ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere Sall og underkastet rens-25 ning ved LGT-metoden til opnåelse af ca. 0,8 ag af et DNA-fragment på ca. 1125 bp indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA.
Separat blev 3 ug pKYPlO opløst i 40 al (totalvolumen) af 30 en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 100 mM NaCl. 6 enheder af hvert af Hindlll og Sall blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 5 minutter for at 35 inaktivere HindiII og Sall og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af ca. 1,8 ag af et DNA-fragment på ca. 4,1 kb indeholdende Pt .
26
DK 164108 B
Den N-terminale aminosyre i det modne humane IFN-r-poly-peptid er Cys. For at udtrykke moden IFN-r-DNA er det nødvendigt at tilvejebringe en initieringscodon (ATG) lige før den 5'-terminale codon TGT (Cys) og endvidere at 5 indstille længden mellem SD-sekvens nedstrøms fra P^. og ATG til en passende længde på 6-18 bp. Derfor blev følgende DNA-linker syntetiseret:
10 findlll BstNI
Met Cys Tyr Cys 5 * [A G C T T |a T Gi TGTTACTGCC[3' (18-mer) 3* ATACACA ATGACG gVJs’ (15-mer) 15
To enkeltkædede DNA'er, en 18-mer og en 15-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ug af såvel den 18-mere som den 15-mere DNA opløst i 20 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM 20 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 °C i 60 minutter.
25
Derpå blev 2 ug af den phosphorylerede 18-mere DNA og den phosphorylerede 15-mere DNA blandet, og blandingen blev opvarmet ved 70 °C i 5 minutter og fik lov at henstå ved stuetemperatur til annelering til opnåelse af DNA-30 linkeren med den i det foregående angivne struktur.
0,4 ug af BstNI-Sall-fragmentet på 1125 bp opnået i det foregående og afledt fra pGC7 og 1,0 ug af DNA-fragmentet på 4,1 kb opnået ved nedbrydning af udtrykkelsesvektoren 35 pKYPlO med Hindlll og Sall blev opløst i 25 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH
7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol og 500 um ATP. Ca.
27
DK 164108 B
0,1 ug af den ovennævnte DNA-linker blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer. Escherichia coli HB101 blev transformeret under an-5 vendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding ved konventionel teknik til opnåelse af en Ap koloni. Plasmid pGKA2 som vist i fig. 1 blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGKA2 blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, Hindlll, BstNI 10 og Sall og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen fra SD-sekvensen (AAGG) til initieringscodonen (ATG) i plasmidet pGKA2 var "AAGGGTATCGATAAGCTTATG".
15 Escherichia coli stamme indeholdende pGKA2 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-496).
Referenceeksempel 3 20 Konstruktion af plasmid pGBDl med BamHI-skæringssted ned-strøms fra IFN-r-genet I dette eksempel blev 2 ug plasmid pIFNr-G4 (3,6 kb) opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 25 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM di- thiothreitol og 50 mM NaCl (i det følgende benævnt "Y-50 pufferopløsning"). Derefter blev 4 enheder af restriktionsenzymet PvuII tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 2 timer. Nedbrydningsproduktet blev 30 underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 1 ug af et DNA-fragment (3,6 kb) af pIFNr-G4. 0,1 ug af DNA-fragmentet og 5 pmol 5'-phosphoryleret BamHI-linker (5'-pCCGGATCCGG-3', produkt fra Collaborative Research,
Inc. ) blev ligeret ved 4 °C i 18 timer med 2 enheder T4-35 ligase i 20 ul T4-ligasepufferopløsning.
28
DK 164108 B
Escherichia coli HB101 [Boliver, et al.. Gene 2, 75 (1977)] blev transformeret under anvendelse af det således opnåede rekombinante plasmid-DNA ved metoden ifølge Cohen et al. [S.N. Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 5 USA, 69, 2110 (1972)] til opnåelse af en ApR koloni.
Plasmid-DNA blev isoleret fra transformanten ved den kendte metode [H.C. Birnboim, et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)]. DNA blev nedbrudt med restriktions- endonukleaser, såsom BamHI, dens struktur blev analyseret 10 for at konstatere, at man havde opnået rekombinant plasmid pGBDl, hvori BamHI-linker var indsat i PvuII-stedet i pIFNr-G4. Escherichia coli stamme indeholdende pGBDl er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGBD1 (FERM BP-394).
15
Referenceeksempel 4
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVLlO kodende for 1-Ser-IFN-r 20 I dette eksempel blev 6 ug pGBDl, opnået i referenceeksempel 3, opløst i 50 ul Y-50 pufferopløsning. 10 enheder SinI blev tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev der tilsat NaCl 25 til en s lutkoncentration på 100 mM, og 10 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydnignsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. 0,8 ug af et DNA-fragment på ca. 850 bp indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
30
Separat blev 3 ug pKYPlO DNA, fremstillet ved metoden som beskrevet i japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83, opløst i 40 ul (totalvolumen) Y-50 pufferopløsning, og 5 enheder af hvert af HindiII og 35 BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der opnået ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende 29
DK 164108 B
tryptophan-promoter (P^ ) ved LGT-metoden.
Modent humant IFN-r-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For at ændre den første Cys til 5 Ser og for at tilvejebringe en initieringscodon ATG, der er nødvendig til udtrykkelse, lige før første Ser, blev følgende DNA-linker syntetiseret:
Hindlll SinI
10 _
Met lSer| Tyr Cys Gin 5' AGCT Æg| TCT TAC TGC CAG 31 20-mer 3' ATAC AGA ATG ACG GTC CTG 5’ 19-mer 15
To enkeltkædede DNA'er, en 20-mer og en 19-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ag af såvel den 20-mere som den 19-mere DNA opløst i 40 al (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM 20 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 "C i 60 minutter.
25 0,5 ug af SinI-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp afledt fra pGBDl og 1,0 ag af HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb fra udtrykkelsesvektoren pKYPlO, som blev opnået i det foregående, blev opløst i 25 al T4 ligasepufferopløsning.
Ca. 0,1 ag af DNA-linkeren nævnt ^ det foregående blev 30 sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 "C i 17 timer.
35 Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding
R
til opnåelse af en Ap koloni. Et plasmid, pGVLIO som 30
DK 164108 B
vist på fig. 2, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVLlO blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, HindiII og BamHI og agarose-gelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-5 metoden, at DNA-sekvensen fra HinduI-stedet til Sinl-stedet i plasmidet pGVLlO var som følger:
Hindlll SinI
10 Met Ser Tyr Cys Gin Asp
AGCT TATG TCT TAC TGC CAG GAC ATAC AGA ATG ACG GTC CTG
r 15
Det humane iFN-r-polypeptid, som pGVLlO koder for (derivatet kaldes 1-Ser-IFN-r), er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den første Cys i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser.
20 Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVLlO er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGVL10 (FERM BP-544).
Referenceeksempel 5 25
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVMIOl kodende for 3-Ser-IFN-r 6 μg pGBDl-DNA opnået i referenceeksempel 3 blev opløst i 30 50 μΐ Y-50 pufferopløsning. 10 enheder SinI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer.
Derpå blev NaCl tilsat til en slutkoncentration på 100 mM, og 10 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. 0,8 ug af et 35 DNA-fragment på ca. 850 bp indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
31
DK 164108 B
Separat blev 3 ug ρΚΥΡΙΟ-DNA, fremstillet ved metoden beskrevet i japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83, opløst i 40 ni (totalvolumen) Y-50 pufferopløsning, og 5 enheder af hvert af Hindlll og 5 BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 “C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der opnået ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende tryptophanpromotor (P^ ) ved LGT-jmetoden.
10 Modent humant IFN-r-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For at ændre den 3. aminosyre (Cys) til Ser og inkorporere en initieringsaodon (ATG), der er nødvendig for udtrykkelse, lige før den første Cys, blev følgende DNA-linker syntetiseret: 15
Hindlll SinI
Met Cys Tyr [Serl Gin 5' AGCT liATGl TGC TAC TCT CAG|3' 20-mer 20 3' ATAC ACG ATG AGA GTC CTG 5' 19-mer
To enkeltkædede DNA'er, en 20-mer og en 19-mer, blev syn-25 tetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ug af såvel den 20-mere som den 19-mere DNA opløst i 40 μΐ (totalvolumen) af en opløsnihg indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase 30 blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 °C i 60 minutter.
0,5 ug af Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp afledt fra pGBDl og 1,0 ug af HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb 35 af udtrykkelsesvektoren pKYPlO, som blev opnået i det foregående, blev opløst i 25 ul T4 ligasepufferopløsning.
Ca. 0,1 ug af ovennævnte DNA-linker blev sat til bian- 32
DK 164108 B
dingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
5 Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding g til opnåelse af en Ap koloni. Et plasmid pGVMlOl, som vist i fig. 3, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVMlOl blev bekræftet ved ned-10 brydning med EcoRI, Clal, HindiII og BamHI og agarosegel-elektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen fra Hindi Il-stedet til Sinl-stedet i plasmid pGVMlOl var som følger: 15
Hindlll SinI
Met Cys Tyr Ser Gin Asp AGCT TATG TGC TAC TCT CAG GAC Jatac ACG ATG AGA GTC CTG
20
Det humane IFN-r-polypeptid, som pGVMlOl koder for (derivatet kaldes 3-Ser-IFN-r), er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 3.
25 aminosyre (Cys) af det modne humane IFN-r er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVMlOl er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGVM101 (FERM BP-545).
30 Referenceeksempel 6
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVK13 kodende for 1,3-Ser-IFN-r 35 6 ug pGBDl-DNA opnået i referenceeksempel 3 blev opløst i 50 ul Y-50 pufferopløsning. 10 enheder SinI (produkt fra Bio Tec Co.) blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev 33
DK 164108 B
udført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev NaCl tilsat til en endelig koncentration på 100 mM, og 10 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Ca. 0,8 ug af et DNA-fragment på ca. 850 bp 5 indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
Separat blev 3 ug ρΚΥΡΙΟ-DNA opløst i 40 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende Y-100 pufferopløsning, 10 og 5 enheder Hindi 11 og 5 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der opnået ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende ved LGT- metoden .
15
Modent humant IFN-r-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For at ændre den 1. og den 3. aminosyre (Cys) til Ser og til tilvejebringelse af en initierings-codon (ATG), der er nødvendig for udtrykkel se, lige før 20 den første Ser, blev følgende DNA-linker syntetiseret:
Hindlll SinI
Met ISerl Tyr [Seri Gin 25 5' AGCT ijATG} TCT TAC TCT CAG 31 20-mer 3' ATAC AGA ATG AGA GTC CTG 5' 19-mer 30 To enkeltkædede DNA’er, en 20-mer og en 19-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ug af den 20-mere og 2 ug af den 19-mere DNA opløst i 40 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 35 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 "C i 60 minutter.
34
DK 164108 B
Derpå blev 0,4 ug af Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp afledt fra pGBDl og 1,0 ug af Hindlll-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb af udtrykkelsesvektoren pKYPlO, som blev opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligasepuffer-5 opløsning. Ca. 0,1 ug af DNA-linkeren som nævnt i det foregående blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 "C i 17 timer.
10 Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af en Ap koloni. Et plasmid pGVK13, som vist i fig. 4, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVK13 blev bekræftet ved nedbrydning 15 med EcoRI, Hindlll, ClaX og BamHl og agarosegelelektro- forese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen fra Hindlll-stedet til Sinl-stedet i plas-midet pGVK13 var som følger: 1 35
Hindlll sinI
Met Ser Tyr Ser Gin Asp AGCT TATG TCT TAC TCT CAG GAC^ 25
Det humane IFN-r-polypeptid, som pGVK13 koder for (derivatet kaldes 1,3-Ser-lFN-r), er forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 1. og den 30 3. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVK13 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGVK13 (FERM BP-432).
Claims (4)
1. Derivat af et humant interferon-r-polypeptid med 5 formlen 137-Cys-IFN-r(Δ138-146), l-Ser-137-Cys-IFN-r- (Δ138-146) eller 3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146), der kodes af henholdsvis rekombinant plasmid pGVT137 (FERM BP-547), pGNC5 (FERM BP-550) og pGNB4 (FERM BP-549).
2. Rekombinant plasmid pGVT137 (FERM BP-547), pGNC5 (FERM BP-550) og pGNB4 (FERM BP-549).
3. Mikroorganisme transformeret med et rekombinant plasmid ifølge krav 2, hvilken mikroorganisme er
15 Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547), Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) eller Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
4. Fremgangsmåde til fremstilling af et humant 20 interferon-r-polypeptid ifølge krav 1, der omfatter dyrkning i et medium af en mikroorganisme ifølge krav 3, idet mikroorganismen er i stand til at udtrykke det inkorporerede DNA-fragment, akkumulering af polypeptidet i dyrkningsmediet og udvinding af polypeptidet derfra. 25 30
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14395084A JPS6124599A (ja) | 1984-07-11 | 1984-07-11 | 新規ヒトインタ−フエロン−rポリペプチド誘導体 |
JP14395084 | 1984-07-11 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK314485D0 DK314485D0 (da) | 1985-07-10 |
DK314485A DK314485A (da) | 1986-01-12 |
DK164108B true DK164108B (da) | 1992-05-11 |
DK164108C DK164108C (da) | 1992-10-12 |
Family
ID=15350817
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK314485A DK164108C (da) | 1984-07-11 | 1985-07-10 | Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4898931A (da) |
EP (1) | EP0170917B1 (da) |
JP (1) | JPS6124599A (da) |
AT (1) | ATE63923T1 (da) |
AU (1) | AU586822B2 (da) |
CA (1) | CA1303529C (da) |
DE (2) | DE3582973D1 (da) |
DK (1) | DK164108C (da) |
ES (1) | ES8609484A1 (da) |
IL (1) | IL75738A (da) |
NO (1) | NO175487C (da) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8334102D0 (en) * | 1983-12-21 | 1984-02-01 | Searle & Co | Interferons with cysteine pattern |
CA1340265C (en) * | 1985-01-18 | 1998-12-15 | Kirston E. Koths | Oxidation resistant muteins |
GB8619725D0 (en) * | 1986-08-13 | 1986-09-24 | Hoffmann La Roche | Homogenous interferon fragments |
JP2653061B2 (ja) * | 1986-12-27 | 1997-09-10 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
AT393690B (de) * | 1987-10-08 | 1991-11-25 | Hoffmann La Roche | Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente |
DE3829180A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-08 | Boehringer Ingelheim Int | Neues arzneimittel zur vorbeugung und behandlung von durch primaere immundefekte verursachte krankheiten |
DE4036856C1 (da) * | 1990-11-19 | 1992-05-27 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De | |
CN1900116A (zh) * | 1995-01-26 | 2007-01-24 | 拜奥根Idec马萨诸塞公司 | 抗-LT-β-R抗体、含有该抗体的药用组合物及其制药应用 |
DE19535853C2 (de) * | 1995-09-18 | 1999-04-01 | Fraunhofer Ges Forschung | Varianten des rekombinanten humanen Interferon-gamma, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
JP2003513681A (ja) * | 1999-11-12 | 2003-04-15 | マキシゲン・ホールディングス・リミテッド | インターフェロンガンマ・コンジュゲート |
CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
AU782635B2 (en) * | 1999-11-12 | 2005-08-18 | Maxygen Holdings Ltd. | Interferon gamma conjugates |
US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
US7038015B2 (en) | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
US7524931B2 (en) | 2002-07-03 | 2009-04-28 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
JP4896745B2 (ja) | 2004-02-02 | 2012-03-14 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒトインターフェロンポリペプチドおよびこれらの使用 |
CA2609205A1 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Ambrx, Inc. | Improved human interferon molecules and their uses |
EP1991679A2 (fr) * | 2006-03-08 | 2008-11-19 | Biomethodes | Variants de l'interferon- gamma humain (ifngamma) |
FR2898359B1 (fr) * | 2006-03-08 | 2011-07-15 | Biomethodes | Variants ameliores de l'interferon-gamma humain (ifn gamma) |
CA2712606A1 (en) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Ambrx, Inc. | Modified leptin polypeptides and their uses |
MX2021001165A (es) * | 2018-07-30 | 2021-07-15 | Univ Leland Stanford Junior | Agonistas sesgados de interferon-gamma. |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
JPH0787797B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
US4681848A (en) * | 1982-09-22 | 1987-07-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel peptide and use thereof |
IL69851A0 (en) * | 1982-09-30 | 1983-12-30 | Japan Found Cancer | Novel dna and recombinant plasmid containing the same |
US4758656A (en) * | 1983-12-26 | 1988-07-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel human interferon-gamma polypeptide derivative |
AU582574B2 (en) * | 1984-04-19 | 1989-04-06 | Hoechst Aktiengesellschaft | The preparation of polypeptides having human gamma interferon activity |
IL75302A0 (en) * | 1984-06-06 | 1985-09-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel polypeptide and production thereof |
-
1984
- 1984-07-11 JP JP14395084A patent/JPS6124599A/ja active Pending
-
1985
- 1985-07-04 CA CA000486327A patent/CA1303529C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-08 IL IL7573885A patent/IL75738A/en not_active IP Right Cessation
- 1985-07-09 DE DE8585108541T patent/DE3582973D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-09 AT AT85108541T patent/ATE63923T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-07-09 DE DE198585108541T patent/DE170917T1/de active Pending
- 1985-07-09 EP EP85108541A patent/EP0170917B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-10 AU AU44749/85A patent/AU586822B2/en not_active Ceased
- 1985-07-10 DK DK314485A patent/DK164108C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-07-10 NO NO852776A patent/NO175487C/no unknown
- 1985-07-10 US US06/751,205 patent/US4898931A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-10 ES ES545052A patent/ES8609484A1/es not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE63923T1 (de) | 1991-06-15 |
EP0170917A1 (en) | 1986-02-12 |
ES545052A0 (es) | 1986-09-01 |
EP0170917B1 (en) | 1991-05-29 |
DK314485D0 (da) | 1985-07-10 |
DE3582973D1 (de) | 1991-07-04 |
CA1303529C (en) | 1992-06-16 |
NO852776L (no) | 1986-01-13 |
NO175487C (no) | 1994-10-19 |
NO175487B (no) | 1994-07-11 |
AU4474985A (en) | 1986-01-16 |
DK164108C (da) | 1992-10-12 |
ES8609484A1 (es) | 1986-09-01 |
IL75738A0 (en) | 1985-11-29 |
AU586822B2 (en) | 1989-07-27 |
JPS6124599A (ja) | 1986-02-03 |
IL75738A (en) | 1995-06-29 |
DE170917T1 (de) | 1986-09-04 |
DK314485A (da) | 1986-01-12 |
US4898931A (en) | 1990-02-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK164108B (da) | Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid | |
Yelverton et al. | Bacterial synthesis of a novel human leukocyte interferon | |
EP0041313B1 (en) | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon | |
RU2056460C1 (ru) | Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, способной экспрессировать иммунный интерферон человека | |
EP0152613B1 (en) | Novel promoter | |
US4530901A (en) | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides | |
US4737462A (en) | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β | |
FI80720C (fi) | Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider. | |
DK168016B1 (da) | Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid | |
US5096705A (en) | Human immune interferon | |
NO164037B (no) | Fremgangsm te ved fremstilling av et polypeptid av ron alfa (ifnalfa)-type. | |
DK175194B1 (da) | Rekombinante DNA-molekyler, interferon-omega-type gener, transformerede værter indeholdende DNA-informationen, ekspressionsplasmider for interferon-omega-typer, E. coli transformeret hermed, humane interferoner af type I, fremgangsmåde....... | |
EP0456332A1 (en) | Purified interleukin 1 and DNA coding for interleukin 1 and their preparation, vectors containing such DNA and their preparation and use in transforming hosts to permit expression of interleukin 1 | |
DK160945B (da) | Humant interferon-gamma-polypeptid og fremgangsmaade til fremstilling deraf, rekombinant plasmid omfattende et dna-fragment, som koder for peptidet, og mikroorganisme transformeret med plasmidet | |
WO2001057217A1 (en) | Expression and secretion vector for human interferon alpha and process for producing human interferon alpha by employing same | |
WO2007017637A1 (en) | Method for producing recombinant interferon alpha-8 | |
TANAKA et al. | Production of recombinant mouse β-interferon | |
IL71232A (en) | A recombinant plasmid encoding the human itferron-C polypeptide, the process for its preparation, and microorganisms containing it |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PBP | Patent lapsed |