DK164108B - Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid - Google Patents

Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid Download PDF

Info

Publication number
DK164108B
DK164108B DK314485A DK314485A DK164108B DK 164108 B DK164108 B DK 164108B DK 314485 A DK314485 A DK 314485A DK 314485 A DK314485 A DK 314485A DK 164108 B DK164108 B DK 164108B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
ifn
dna
cys
ser
plasmid
Prior art date
Application number
DK314485A
Other languages
English (en)
Other versions
DK314485D0 (da
DK164108C (da
DK314485A (da
Inventor
Seiga Itoh
Yasutoshi Takeichi
Moriyuki Sato
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=15350817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK164108(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Kk filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Kk
Publication of DK314485D0 publication Critical patent/DK314485D0/da
Publication of DK314485A publication Critical patent/DK314485A/da
Publication of DK164108B publication Critical patent/DK164108B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK164108C publication Critical patent/DK164108C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

i
DK 164108 B
Opfindelsen angår et derivat af et humant interferon-r-polypeptid ifølge krav 1, der kodes af et rekombinant plasmid ifølge krav 1 og 2. Opfindelsen angår endvidere en mikroorganisme ifølge krav 3, der er transformeret med 5 et sådant rekombinant plasmid. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et derivat af humant interferon-r-polypeptid ifølge krav 4.
Interferoner (i det følgende betegnet I FN) kan så vidt 10 vides klassificeres i tre grupper, nemlig lFN-α, IFN-/5 og IFN-r. IFN-a dannes hovedsageligt ud fra leukocyter, IFN-β ud fra fibroblaster og IFN-r ud fra T-lymfocyter. Disse IFN'er er blevet beskrevet som biologisk aktive stoffer med antiviral aktivitet, aktiverende aktivitet på natur-15 lige killer-celler og makrofager, antitumoraktivitet og lignende.
Hvad angår IFN-r, er det rapporteret, at det har en stærkere celleinhiberende aktivitet end andre IFN'er, baseret 20 på det eksperiment, der gør brug af dyreceller [B.Y.
Rubin og S.L. Gupta: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 5928-5932 (1980)]. Endvidere er kloning af en IFN-r-cDNA og bestemmelse af dens basesekvens for nylig rapporteret [P.W. Gray, et al., Nature 295, 503 (1982); R. Devos, et 25 al., Nucleic Acids Research 10, 2487 (1982)].
Ved opfindelsen har man nu uafhængigt klonet en cDNA kodende for et hidtil ukendt IFN-r, hvori, som det fremgår af basesekvensen som vist i tabel 1, den 9. aminosyre 30 af det modne IFN- r rapporteret af Devos et al., lysin (Lys) (AAA), er erstattet med glutamin (Gin) (CAA). Endvidere blev IFN-r-cDNA'en inkorporeret i vektor pKYP-10, der har en tryptophanpromoter (japansk offentliggjort, u-undersøgt patentansøgning nr. 110600/83), og masseproduk-35 tion af IFN-r er opnået i Escherichia coli.
2
DK 164108 B
Derefter har opfinderne af den foreliggende opfindelse undersøgt dannelsen af derivater af IFN-r-polypeptid under anvendelse af den i tabel 1 viste IFN-r-cDNA som udgangsmateriale.
5
Det -blev rapporteret, at deletion af 11 aminosyrer fra den C-terminale ende af α-IFN nedsatte den specifikke aktivitet til 1/3 [A.E. Franke, et al., DNA 3L, 223-230 (1982)]:, hvorimod addition af 18 aminosyrer til den N-10 terminale ende af α-IFN ikke ændrede den specifikke aktivitet [R.M. King, et al., J. Gen. Virol. 64, 1815-1818 (1983)].
Opfinderne af den foreliggende opfindelse har fundet, at 15 deletion af 5 aminosyrer fra den N-terminale ende af
Hepatitis B virus nedsatte den specifikke aktivitet til ca. 1/100 [T. Nishi, et al., DNA 2, 265-273 (1983)], og addition af 7 aminosyrer til den N-terminale ende af Hepatitis B virus nedsatte den specifikke aktivitet til 20 ca. 1/10 [S. Itoh, et al., DNA 3, 157-165 (1984)].
I EP offentliggørelsesskrift nr. 95 350 beskrives et humant IFN-r-lignende polypeptid, hvis aminosyresekvens er angivet på side 2 i EP offentliggørelsesskrift nr.
25 9 5 3 50. Aminosyreresten på position 9 er en Lys-rest (derivaterne i nærværende opfindelse har en Gin-rest på position 9).
EP offentliggørelsesskrift nr. 146 944 (DK patentansøg-30 ning nr. 6108/84, tilhørende ansøgeren), der er et dokument under Art. 54(3) EPC, beskriver fem derivater af det humane IFN-r-polypeptid. Alle har de en carboxyl-terminus, der er identisk med det naturligt forekommende humane IFN-r. Disse derivater er derfor forskellige fra 35 derivaterne ifølge opfindelsen, der har en deletion af aminosyrepositionerne 138-146.
3
DK 164108 B
Opfinderne af den foreliggende opfindelse har konstrueret et derivat af IFN-r, hvori den 3. aminosyre i IFN-r som vist i tabel 1, cystein (Cys), var erstattet med tyrosin (Tyr) (i det følgende kaldt 3-Tyr-IFN-T), og fundet, at 5 den specifikke aktivitet var 2 til 4 gange så stærk som aktiviteten af moder-IFN-r . Endvidere konstruerede man de derivater, hvori Cys i stilling 1 var erstattet med serin (Ser) (1-Ser-IFN-r), Cys i stilling 3 var erstattet med Ser (3-Ser-IFN-r), Cys i stilling 1 og 3 var erstattet 10 med Ser (1,3-Ser-IFN-r), og N-terminale amiriosyrer i IFN-r vist i tabel 1 var deleteret. Ækvivalent eller større interferonaktivitet blev detekteret for alle derivaterne sammenlignet med udgangs-IFN-r.
15 Det har været kendt, at modent murint IFN-r består af 136 aminosyrer, hvilket antal er 10 mindre end antallet af aminosyrer i humant IFN-r, og det er mere varmestabilt end humant IFN-r. Murint IFN-r har Cys i position 136 såvel som i position 1 og 3, og disse Cys danner disulfid-20 bindinger i molekylet, hvilket betragtes som bidragende til stabilisering af IFN [D. Goeddel, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 80, 5842-5846 (1984)].
Opfinderne af den foreliggende opfindelse har fremstillet 25 molekylmodellen af IFN-r og antaget, at dannelsen af di-sulfidbinding i molekylet for humant IFN-r var mulig ved indføring af Cys mellem position 135 og 138 fra den N-terminale ende, foretrukkent i position 137. Adskillige derivater af IFN-r, hvori C-terminale aminosyrer var de-30 leteret og Met i position 137 erstattet med Cys, har vist sig at have forøget varmestabilitet og specifik aktivitet .____
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte deriva-35 ter af humant IFN-r-polypeptid, hvori visse aminosyrer fra humant IFN-r-polypeptid er fjernet, og visse aminosyrer, forskellige fra nævnte aminosyrer, er erstattet 4
DK 164108 B
med andre aminosyrer. De hidtil ukendte derivater har høj IFN-r-aktivitet og forventes at blive nyttige som lægemidler, såsom antivirale og antitumore midler.
5 På tegningen viser:
Fig. 1 et diagram for konstruktionen af plasmid pGVT137.
Som steder for Hinf I og Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
10
Fig. 2 er et diagram for konstruktionen af plasmid pGNC5.
Som steder for Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
15 Fig. 3 er et diagram for konstruktionen af plasmid pGNB4.
Som steder for Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
Fig. 4 er et diagram for konstruktionen af plasmid pGNA3.
20 Som steder for Taql er kun angivet de, der anvendes til konstruktionen.
Det tilsigtes med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et rekombinant plasmid, hvori inkorporeres en DNA 25 kodende for et hidtil ukendt derivat af humant IFN-r, en mikroorganisme indeholdende plasmidet, en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt derivat af humant IFN-r-polypeptid under anvendelse af mikroorganismen og derivatet af humant IFN-r-polypeptid som sådant.
30
Konstruktionen af det rekombinante plasmid udføres ved som udgangsmateriale at anvende cDNA opnået fra messenger-RNA kodende for IFN-r ved rekombinant DNA teknologi eller kromosomal DNA kodende for IFN-r.
I den foreliggende opfindelse kan en vilkårlig human IFN-r-cDNA anvendes, og pIFNr-G4 er særlig foretrukket.
35 5
DK 164108 B
Escherichia coli indeholdende pIFNr-G4 er blevet deponeret i American Type Culture Collection, USA under betegnelsen ATCC 39123.
5 DNA-sekvensen i IFN-r-DNA i pIFNr-G4 blev bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)] og er vist i tabel 1.
10 15 20 25 30 35 6
DK 164108 B
TABEL 1
CACATTGTTCTGATCATCTGAAGATCAGCTATTAGAAGAGAAAGATCAGTTAAGTCCTTTGGACCTGATCAGCTTGATACAAGAACTACTGATTT
-20 net lys tyr thr ser tyr ile leu ala phe gin leu cys ile val leu
CAACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCGGAAACG ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG
1 _ 10 20
gly ser leu gly. CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL GLN GLU ALA GLU ASK LEU LYS LYS TYR PHE ASK ALA
• GGT TCT CTT GGC'TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GT A CMl GAA GCA GAA AAC CTTAAG AAA TAT TTT AAT GCA
1 f 30 40
GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASK TRP LYS GLU GLU SER ASP
GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAG
50 60
ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASK PHE LYS ASP ASP GLN SER
AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC
70 80 90
ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASK VAL LYS PHE PHE ASK SER ASK LYS LYS LYS ARG
ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA
100 110
ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASK TYR SER VAL THR ASP LEU ASK VAL GLH ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU
GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC HG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC
120 130 140 ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU ΡΗΕΡΓΤ
ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA
(!) 146
GLY ARG ARG ALA SER GLN
GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA TGSTTGTCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATTTAACATTATTTA
TATGGGGAATATATTTTTAGACTCATCAATCAAATAAGTATTTATAATAGCAACTTTTGTGTAATGAAAATGAATATCTATTAATATATGTATTA
TTTATAATTCC7ATATCCTGTGACTGTCTCACTTAATCCTTTGTTTTCTGACTAATTAGGCAAGGCTATGTGATTACAAGGCTTTATCTCAGGGG
CCAACTAGGCAGCCAACCTAAGCAAGATCCCATGGGTTGTGTGTTTATTTCACTTGATGATACAATGAACACTTATAAGTGAAGTGATACTATCC
AGTTACTA CCCCCCC-^......
7
DK 164108 B
Sammenligning mellem den humane IFN-r-cDNA i pIFNr-G4 og den kendte IFN-r-cDNA [R. Devos, et al., Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)] viser følgende. Den første base af den triplet, der koder for den 9. aminosyre fra 5 den N-terminale ende i det modne humane IFN-r-polypeptid, lysin, er i den kendte cDNA adenin (A) [R. Davos, et al.. Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)]. På den anden side, da den tilsvarende base i plFNr-G4 cDNA er cytosin (C), er den 9. aminosyre fra den N-terminale ende af det 10 humane IFN-r-polypeptid, indkodet af pIFNr-^G4 cDNA, glu-tamin og ikke lysin. Det er derfor indlysende, at pIFNr-G4 koder for et hidtil ukendt humant IFN-r-polypeptid.
Derivater af IFN-r opnået ved deletion eller udskiftning 15 af aminosyrer i IFN-r vist i tabel 1 er også hidtil ukendte IFN-r-derivater.
Som det plasmid, der skal inkorporere en DNA kodende for IFN-r-derivat, kan et vilkårligt plasmid anvendes, så 20 længe det deri inkorporerede DNA kan udtrykkes i
Escherichia coli. Foretrukkent kan anvendes et plasmid, hvori en fremmed DNA kan indsættes nedstrøms for en egnet promoter, såsom tryptophan-promoter (Ptrp), lac-promoter eller PT-promoter af λ-fag, og længden mellem Shine-25 Dalgarno-sekvens (i det følgende benævnt SD-sekvens) og initieringscodon (ATG) indstilles, f.eks. til 6-18 basepar. Foretrukne eksempler er pKYPlO, pKYPll og pKYP12, som blev konstrueret af opfinderne til den foreliggende opfindelse (japansk offentliggjort uundersøgt patent-30 ansøgning nr. 110600/83).
Som vist på fig. 1 kløves pGBDl (referenceeksempel 1) med BamHI og Taql, og nedbrydningsproduktet renses ved poly-acrylamidgelelektroforese [A.M. Maxam, et al., Proc.
35 Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)] til opnåelse af et DNA-fragment på ca. 310 basepar (i det følgende benævnt bp).
8
DK 164108 B
Derpå kløves pGKA2 (referenceeksempel 2) med Hindlll og Hinf I, og et DNA-f ragment på ca. 400 bp indeholdende en stor del af IFN-r strukturgenet opnås ved polyacrylamid-gelelektroforese.
5 pKYPlO (japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83) kløves med Hindlll og BamHI til opnåelse af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende en tryptophan-promoter. For at opnå et IFN-r derivat, hvori amino- •5, ^ 10 syren i position 137 af det modne humane IFN-r-polypep-tid, Met, er erstattet med Cys, og aminosyrerne i positionerne 138-146 er deleteret, syntetiseres den i det følgende viste DNA-linker separat.
15
Hinfl 135 136 137 Bglll Tagl
Ser Gin Cys t*niuti«n 5' AGT CAGTGCTAA |G A T C T T 3' 3' GTCACGATTCTAGA AG cj 5' 20
De rensede DNA-fragmenter og den syntetiske DNA-linker ligeres med T4 DNA-ligase til opnåelse af det rekombi-nante plasmid pGVT137, der er vist på fig. 1. Plasmidet 25 koder for IFN-r-derivatet [137-Cys-IFN-r-(Al38-146)], der har Cys som aminosyren i position 137 og ikke har aminosyrerne i positionerne 138-146.
For at konstruere det rekombinante pGNC5, der koder for 30 derivatet [l-Ser-137-Cys-IFN-r-(Al38-146)], skæres pGVLlO derpå (referenceeksempel 4) med Hindlll og Taql, og et DNA-fragment på ca. 300 bp opnås. Separat skæres pGVT137 DNA opnået i eksempel 1 med Bglll og Taql henholdsvis Hindlll og Bglll til opnåelse af DNA-fragmenter på ca.
35 130 bp og ca. 4,6 kb. DNA-fragmenterne ligeres med T4 DNA
ligase til opnåelse af det rekombinante plasmid pGNCS, der er vist på fig. 2.
9
DK 164108 B
Det rekombinante plasmid pGNB4, der koder for 3-Ser-137-Cys-IFN-T-(Al38-146), og det rekombinante plasmid pGN3, der koder for 1,3 Ser-137-Cys-IFN-r-(Al38-146), konstrueres efter samme metode som beskrevet i det foregående 5 med den undtagelse, at plasmiderne pGVMIOl (fig. 3) og pGVKl3 (fig. 4) anvendes som kilde for DNA kodende for den N-terminale del af IFN-r.
De reaktionsbetingelser, der kræves for den rekombinante 10 DNA teknologi som beskrevet i det foregående, er almindeligvis som følger.
Nedbrydning af DNA med restriktionsenzymer udføres sædvanligvis ved omsætning af 0,1 til 20 ag DNA med 0,1 til 15 100 enheder, foretrukkent 1 til 3 enheder restriktions enzym pr. 1 ag DNA i en blanding af 2 til 200 mM, foretrukkent 10 til 40 mM Tris-HCl (pH 6,0-9,5, foretrukkent pH 7,0-8,0), 0 til 200 mM NaCl og 2 til 20 mM, foretrukkent 5 til 10 mM MgCl2 ved 20 til 70 °C (optimal tempera-20 tur afhænger af anvendte restriktionsenzymer) i 15 minutter til 24 timer. Reaktionen standses sædvanligvis ved opvarmning til 55-75 °C i 5-30 minutter eller også ved inaktivering af restriktionsenzymet med et reagens, såsom phenol eller diethylpyrocarbonat.
25
Rensning af DNA-fragmenterne dannet ved nedbrydning med restriktionsenzymer udføres ved agarosegelelektroforese under anvendelse af agarosegel, der gelerer ved lav temperatur [L. Wieslander, Analytical Biochemistry 98, 305 30 (1979), i det følgende benævnt LGT-metoden] eller poly- acrylamidgelelektroforese.
Ligering af DNA-fragmenterne udføres med 0,3-10 enheder T4 DNA-ligase i en blanding af 2-200 mM, foretrukkent 10-35 40 mM, Tris-HCl (pH 6,1-9,5, foretrukkent 7,0-8,0), 2-20 mM, foretrukkent 5-10 mM MgCl2, 0,1-10 mM, foretrukkent 0,5-2,0 mM ATP og 1-50 mM, foretrukkent 5-10 mM dithio- 10
DK 164108 B
threitol ved 1-37 °C, foretrukkent 3-20 °C i 15 minutter til 72 timer, foretrukkent 2-20 timer. Den rekombinante plasmid-DNA dannet ved ligeringsreaktionen indføres i Escherichia coli ved transformationsmetoden ifølge Cohen 5 et al. [S.N. Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, -2110 (1972)], om nødvendigt. Isolation af den rekombinante plasmid-DNA fra Escherichia coli indeholdende DNA’en udføres ved den metode, der er beskrevet i eksempel 1, eller metoden ifølge Birnboim, et al. [H.C.
10 Birnboim, et al., Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1979) ]. Plasmid-DNA nedbrydes med 1-10 typer restrik-tionsendonukleaser, og kløvningsstederne undersøges ved agarosegelelektroforese eller polyacrylamidgelelektro-forése. Om nødvendigt undersøges DNA-sekvensen af DNA'en 15 yderligere ved Maxam-Gilbert sekventeringsmetoden [Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)].
De rekombinante plasmider kan fremstilles under de i det foregående beskrevne betingelser.
20
Derivatet af IFN-τ-polypeptid ifølge opfindelsen fremstilles ved følgende metode.
Escherichia coli K-12 HB101 transformeres med et plasmid, 25 såsom pGVA4, og en Escherichia coli-stamme indeholdende pGVA4 udvælges fra de ampicillinresistente (i det føl-
R
gende benævnt Ap ) kolonier. Escherichia coli-stamme indeholdende pGVA4 dyrkes i et medium til fremstilling af et derivat af IFN-r-polypeptid i mediet.
30
Som medium kan der enten anvendes et syntetisk medium eller et naturligt medium, så længe det er egnet til dyrkning af Escherichia coli og produktionen af IFN-r-polypeptidderivatet.
Som carbonkilde kan der f.eks. anvendes glucose, fructose, lactose, glycerol, mannitol og sorbitol.
35 11
DK 164108 B
Som nitrogenkilde der kan der f.eks. anvendes NH^Cl, (NH^^SO^, casaminosyre, gærekstrakt, polypepton, kødekstrakt, "Bactotrypton" og majsstøbevæske.
5 Desuden kan der anvendes næringsstoffer, såsom K^HPO^, KJ^PO^, NaCl, MgSO^, vitamin B1 og MgCl2-
Dyrkningen udføres ved pH 5,5 til 8,5 og ved 18 til 40 °C med luftning og omrøring.
10
Efter dyrkning i 5-90 timer akkumuleres derivatet af humant IFN-r-polypeptid i dyrkede celler. De indsamlede celler behandles med lysozym, sønderdeles ved gentagen frysning og optøning og underkastes centrifugering. Den 15 således opnåede ovenliggende væske underkastes ekstraktion efter en konventionel metode til ekstraktion af polypeptider til udvinding af polypeptidet.
Bestemmelse af den humane IFN-r-aktivitet udføres efter 20 metoden ifølge Armstrong [J.A. Armstrong, et al., Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)].
Visse specifikke udførelsesformer for den foreliggende opfindelse forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgen- 25 de eksempler.
EKSEMPEL 1
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVT137 kodende for 30 137-Cys-IFN-r-(Al38-146) 10 ug pGBDl-DNA opnået i referenceeksempel 3 blev opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning bestående af 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 35 100 mM NaCl (i det følgende benævnt "Y-100 bufferopløs ning*' ). Derpå tilsættes 20 enheder restriktionsenzym BamHI (produkt fra Takara Shuzo Co., ligesom alle i det 12
DK 164108 B
følgende anvendte restriktionsenzymer er produkter fra Takara Shuzo Co. med mindre andet er angivet), og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Derefter blev der tilsat 20 enheder restriktionsenzym Taql, 5 og nedbrydningsreaktionen foregik ved 65 °C i 2 timer.
Ca. 0,5 ug af et DNA-fragment på ca. 310 bp - indeholdende 3'-non-translationalt område blev opnået fra reaktions-opløsningen ved polyacrylgelelektroforese.
10 Separat blev 10 ug pGKA2-DNA opnået i referénceeksempel 2 opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og Hinfl blev sat til opløsningen. Nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 15 3 timer. Et DNA-fragment på ca. 400 bp indeholdende en stor del af IFN-r-strukturgenet blev opnået fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese. 3 ug pKYPlO fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83 20 blev opløst i 40 ni (totalvolumen) af en opløsning indeholdende Y-100 pufferopløsning, og 6 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og BamHI blev sat til opløsningen. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. 1,8 ng af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indehol-25 dende en tryptophan-promoter (P^ ) blev opnået fra reak tionsopløsningen ved LGT-metoden. Separat blev følgende DNA-linker syntetiseret for at ændre den 137. aminosyre (Met) i det modne humane IFN-r-polypeptid til Cys og for at give en terminal codon (TAA), nødvendig til afslutnin-30 gen af udtrykkeisen, umiddelbart efter aminosyre nr. 137,
Cys.
Hinfl 135 136 137 Bglll Taql
Ser Gin Cys termination 35 5'| A G T C A G |t~ G Ci T A A [G A T C T T 3' 18-mer 3’ GTCACGATTCTAGAAGC5' 17-mer 13
DK 164108 B
To enkeltkædede DNA'er, en 18-mer og en 17-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode [R. Crea, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 5765 (1978)]. Derpå blev 2 ug af såvel den 18-mere som den 17-mere DNA opløst 5 i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase (produkt fra Takara Shuzu Co.) blev tilsat, og phospho-ryleringsreaktion blev udført ved 37 °C i 60 minutter.
10
Derpå blev 0,5 ag af Taql-BamHI-fragmentet på ca. 310 bp afledt fra pGBDl, 0,5 ag af Hindlll-HinfI-fragmentet på ca. 400 bp afledt fra pGKA2 og 1,0 ug af HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb af udtrykkel ses vektoren pKYPlO, 15 som opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-puf feropløsning. Ca. 0,1 ug af den i det foregående nævnte DNA-linker blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
20
Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af en AP koloni.
25 Plasmid pGVT137 vist på fig. 1 blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVT137 blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, Bglll og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved metoden ifølge [A.M. Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 30 USA, 74, 560 (1977)], at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql i plasmidet pGVT137 var som følger:
Hinfl 135 136 137 Bglll Taql
Ser Gin Cys ttniutiei 35 AGT CAGTGCTAA b A T C T T _ GTCACGATTCTAGAA GCj 14
DK 164108 B
Det humane IFN-r-polypeptidderivat, som pGVT137 koder for [derivatet kaldes 137-Cys-IFN-r(Δ138-146)], er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 137. aminosyre (Met) i det modne humane IFN-r er 5 erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale ende, aminosyre 138 (Leu) til 146 (Gin) er deleteret.
Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVT137 er blevet deponeret hos Fermentation Research Institute, 10 Agency of Industrial Science and Technology" (i det følgende benævnt FRI) som Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547).
EKSEMPEL 2 15
Konstruktion af rekombinant plasmid pGNC5 kodende for 1-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146): 10 ug pGVLIO DNA opnået i referenceeksempel 4 blev opløst 20 i 50 ul Y-100 pufferopløsning. 20 enheder restriktionsenzym HindiII blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev foretaget ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev der tilsat 20 enheder restriktionsenzym Taql, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,5 25 ug af et DNA-fragment på ca. 300 bp indeholdende det 5'-terminale område af IFN-r strukturgenet ud fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 10 ug pGVT137 opnået i eksempel 1 opløst i 30 50 ul Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder restriktions enzym Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder restriktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,4 ug af 35 et DNA-fragment på ca. 130 bp indeholdende det 3'-terminale område af IFN-r strukturgenet fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
15
DK 164108 B
Separat blev 5 ag plasmid pGVT137 DNA opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, og 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev foretaget ved 37 °C i 3 timer.
5
Ca. 2,0 ug af et DNA-fragment på ca. 4,6 kb indeholdende det 3'-non-translationale område og Ptrp blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
10 Derpå blev 0,4 ug af Hindlll-Taql fragmentet (ca. 300 bp) afledt fra pGVLlO, 0,5 ug af Bglll-Taql fragmentet (ca.
130 bp) afledt fra pGVT137 og 1,0 ug af Hindlll-BgIII fragmentet (ca. 4,6 kb) afledt fra det samme plasmid, som var opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-15 pufferopløsning. 6 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
Escherichia coli stamme HB101 blev transformeret med den
resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af R
20 en Ap koloni.
Plasmid pGNC5, der er vist på fig. 2, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGNC5 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, EcoRI, Blgll, 25 Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen omkring Hindlll-Sinl var som følger:
Sin! 30 . .
Hindlll Met Ser Tyr Cys Gin Asp
U G C T I ATGTCTTACTGCCAGGAC
J ‘“““l 35 og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger: 16
DK 164108 B
HinfI Bglll Taql 135 136 137 5 Ser Gin Cys termination
AGTCAGTGCTAAGATCTTCG
L-^-j I J
Det humane IFN-r-polypeptidderivat, som pGNC5 koder for 10 [derivatet kaldes l-Ser-137-Cys-IFN-r(Al36-146)], er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 1. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser, aminosyre 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale ende, 15 aminosyre 138 (Leu) til aminosyre 146 (Gin), er delete-ret. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGNC5 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) 20 EKSEMPEL 3
Konstruktion af rekombinant plasmid pGNB4 kodende for 3-
Ser-137-Cys-IFN-r(M38-146): 25 10 ug pGVMIOl DNA opnået i referenceeksempel 5 blev op løst i 50 ul Y-100 pufferopløsning. 20 enheder restriktionsenzym Hindlll blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev foretaget ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev der tilsat 20 enheder restriktionsenzym Taql, og nedbrydningsreak-30 tionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,5 ug af et DNA-fragment på ca. 300 bp indeholdende det 5'-terminale område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
35 Separat blev 10 ug pGVT137 opnået i eksempel 1 opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder restriktionsenzym Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev ud- 17
DK 164108 B
ført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder restriktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,4 ug af et DNA-fragment på ca. 130 bp indeholdende det 3'-termi-5 nåle område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 5 ug plasmid pGVT137 DNA opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, 10 enheder af hvert af restrik-10 tionsenzymerne Hindlll og Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev foretaget ved 37 °C i 3 timer.
Ca. 2,0 ug af et DNA-fragment på ca. 4,6 kb indeholdende det 3'-non-translationale område og blev opnået fra 15 reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
Derpå blev 0,4 ug af Hindlll-Taql fragmentet (ca. 300 bp) afledt fra pGVMIOl, 0,5 ug af Bglll-Taql fragmentet (ca.
130 bp) afledt fra pGVT137 og 1,0 ug af Hindlll-BgIII 20 fragmentet (ca. 4,6 kb) afledt fra det samme plasmid, som blev opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-pufferopløsning. 6 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 "C i 17 timer.
25 Escherichia coli stamme HB101 blev transformeret med den
resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af R
en Ap koloni.
Plasmid pGNB4, vist i fig. 3, blev isoleret fra dyrk-30 ningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGNB4 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, EcoRI, Blgll, Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen omkring Hindlll-SinI i pGNB4 var som følger: 35 18
DK 164108 B
Sinl
Hindlll Met Cys Tyr Ser Gin Asp k Iagcttatgtgctactctcaggac og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger: 10
Hinfl Bglll Taql 135 136 137
Ser Gin Cys f rad nation AGTCAGTGCTAA G A T C T T IC G 15 » I “
Det humane IFN-τ-polypeptidderivat, som p6NB4 koder for [derivatet kaldes 3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146)], er 20 klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 3. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser, aminosyre 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale ende, aminosyre 138 (Leu) til aminosyre 146 (Gin), er 25 deleteret. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGNB4 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549) EKSEMPEL 4 30
Konstruktion af rekombinant plasmid pGNA3 kodende for 1,3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146): 10 ug pGVK13 DNA opnået i referenceeksempel 6 blev opløst 35 i 50 ul Y-100 pufferopløsning. 20 enheder restriktionsenzym HindiII blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev foretaget ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder re- 19
DK 164108 B
striktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,5 ug af et DNA-fragment på ca. 300 bp indeholdende det 5'-terminale område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsop-5 løsningen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 10 Mg pGVT137 opnået i eksempel 1 opløst i 50 μΐ Y-100 pufferopløsning, og 20 enheder restriktionsenzym Bglll blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev ud-10 ført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev 20 enheder restriktionsenzym Taql tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 65 °C i 2 timer. Der blev opnået ca. 0,4 wg af et DNA-fragment på ca. 130 bp indeholdende det 3'-terminale område af IFN-r-strukturgenet fra reaktionsopløsnin-15 gen ved polyacrylamidgelelektroforese.
Separat blev 5 ug plasmid pGVT137 DNA opløst i 50 ul Y-100 pufferopløsning, 10 enheder af hvert af restriktionsenzymerne Hindlll og Bglll blev tilsat. Nedbryd-20 ningsreaktionen blev foretaget ved 37 °C i 3 timer.
Ca. 2,0 ug af et DNA-fragment på ca. 4,6 kb indeholdende det 3’-non-translationale område og Ptrp blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
25
Derpå blev 0,4 ug af HindiII-Taql fragmentet (ca. 300 bp) afledt fra pGVK13, 0,5 ug af Bglll-Taql fragmentet (oa.
130 bp) afledt fra pGVT137 og 1,0 ug af Hindlll-BgIII fragmentet (ca. 4,6 kb) afledt fra det samme plasmid, som 30 blev opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligase-pufferopløsning. 6 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
Escherichia coli stamme HB101 blev transformeret med den
35 resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af R
en Ap koloni.
20
DK 164108 B
Plasmid pGNA3, vist i fig. 4, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGNA3 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, EcoRI, Blgll, Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet 5 ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen omkring Hindlll-SinX i pGNA3 var som følger:
Sinl
Hindu I Met Ser Tyr Ser Gin Asp 10 i
AGCTTATGTCTTACTCTCAGGAC
og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger: 15
Hinfl Bglli Taql 135 136 137
Ser Gin Cys termination 20
AGTCAGTGCTAAGATCTTCG
L-Sj
Det humane IFN-r-polypeptidderivat, som pGNA3 koder for 25 [derivatet kaldes l,3-Ser-137-Cys-IFN-r(Al38-146)], er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 1. og den 3. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser, aminosyre 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra den C-terminale 30 ende, aminosyre 138 (Leu) til aminosyre 146 (Gin), er deleteret. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGNA3 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGNA3 (FERM BP-548).
35 EKSEMPEL 5
Produktion af IFN-r derivater med Escherichia coli stam- 21
DK 164108 B
mer indeholdende pGVT137, pGNC5, pGNB4 og pGNA3
Escherichia coli HBlOl-stammer indeholdende rekombinante plasmider pGVT137, pGNC5, pGNB4 og pGNA3 opnået i eksem-5 pel 1-4, som kaldes henholdsvis IGVT137, IGNC5, IGNB4 og IGNA3, blev dyrket ved 37 °C i 18 timer i LG-medium (10 g trypton, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl, 2 g glucose, 1 liter vand, indstillet til pH 7,0 med NaOH). 0,2 ml af dyrkningsbouillonen blev inokuleret i 10 ml MCG-medium (0,6% 10 Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5% NaCl, 0,1% NH4cr,~ 0,5% glucose, 0,5% casaminosyre, 1 mM MgS04, 4 ag/ml vitamin B^, pH 7,2) og dyrkning blev udført ved 30 °C i 4-8 timer. Derpå blev 10 ag/ml indolylacrylsyre (i det følgende benævnt IAA), som er en inducer for tryptophan, tilsat, og dyrk-15 ning blev fortsat i 2-12 timer. Dyrkningsbouillonen blev centrifugeret ved 8000 omdr./min. i 10 minutter, og de høstede celler blev vasket med en pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl (pH 7,5). Vaskede celler blev suspenderet i 1 ml af pufferopløsningen som 20 beskrevet i det foregående, og 5 al af en opløsning indeholdende 200 ag lysozym og 0,25 M EDTA (ethylendiamin-tetraeddikesyre) blev tilsat. Blandingen fik lov at henstå ved 0 °C i 30 minutter, og frysning og optøning blev gentaget 3 gange for at sønderdele cellerne. De sønder-25 delte celler blev centrifugeret ved 15000 omdr./min. i 30 minutter til opnåelse af en overliggende væske. Mængden af interferon i den overliggende væske blev bestemt efter metoden ifølge Armstrong [J.A. Armstrong, et al., Appl. Microbiol., 21, 723-725 (1971)], hvori Sindvis-virus blev 30 anvendt som virus, og FL-celler afledt fra humane amnion-celler blev anvendt som dyrecellerne. Resultaterne er vist i tabel 2.
35 TABEL 2 22
DK 164108 B
IFN-r
Produkt, som (enheder/ 5 Stamme Plasmid plasmidet koder for ml) IGVT137 PGVT137 137-Cys-IFN-r(Δ138-146) 8 x 104 IGNA3 pGNA3 l,3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 8 x 105 10 IGNB4 pGNB4 3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 1 x 106 IGNC5 pGNC5 l-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 5 x 105 IGKA2 pGKA2 IFN-r 2 x 104 15 -—- IGKA2 er en stamme indeholdende plasmid pGKA2, der koder for IFN-r.
20 EKSEMPEL 6
Eksperiment vedrørende varmestabilitet af IFN-r-derivater; 137-Cys-IFN-r(Δ138-146), 1-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146), 3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146) og 1,3-Ser-137-Cys-25 IFN-r(Δ138-146)
Escherichia coli HBlOl-stammer indeholdende rekombinante plasmider pGVT137, pGNC5, pGNB4 og pGNA3 opnået i eksempel 1-4, som kaldes henholdsvis IGVT137, IGNC5, IGNB4 og 30 IGNA3, blev dyrket ved 37 °C i 18 timer i LG-medium. 0,2 ml af dyrkningsbouillonen blev inokuleret i 10 ml MCG-me-dium, og der blev foretaget dyrkning ved 30 °C i 4-8 timer. Derpå blev 10 ug/ml I AA tilsat, og dyrkningen blev fortsat i 2-12 timer. Dyrkningsbouillonen blev centrifu-35 geret ved 8000 omdr./min. i 10 minutter, og de høstede celler blev vasket med 30 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl. Vaskede celler blev 23
DK 164108 B
suspenderet i 1 ml pufferopløsning som beskrevet i det foregående, og 5 ul af en opløsning indeholdende 200 ug lysozym og 0,25 M EDTA blev tilsat. Blandingen fik lov at henstå ved 0 °C i 30 minutter, og frysning og optøning 5 blev gentaget 3 gange for at sønderdele cellerne. De sønderdelte celler blev centrifugeret ved 15000 omdr./min. i 30 minutter til opnåelse af en overliggende væske. Den overliggende væske blev opvarmet ved 50 °C i 1 time, og den antivirale aktivitet af interferon blev bestemt efter 10 metoden ifølge Armstrong til måling af restaktiviteten (%).
Resultaterne er vist i tabel 3.
15 TABEL 3
Restaktivitet
Produkt som efter varmebe-
plasmidet handling ved 50°C
Stamme Plasmid koder for i 1 time (%) 20 - IGVT137 pGVTl37 137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 81 IGNC5 pGNC5 l-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 86 25 IGNB4 pGNB4 3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 98 IGNA3 pGNA3 1,3-Ser-137-Cys-IFN-r (Δ138-146) 23 IGKA2 pGKA2 IFN-r 25 30 -
Referenceeksempel 1
Indsætning af human IFN-r-DNA i udtrykkelsesvektoren 35 pKYPll I dette eksempel blev 6 ug plasmid pIFNr-G4 (3,6 kb) opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning inde- 24
DK 164108 B
holdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM di-thiothreitol og 50 mM NaCl. Derpå blev 12 enheder af hvert af restriktionsenzymerne PvuII og Hindlll tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 2 5 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 7 minutter for at inaktivere enzymerne og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 1,2 ug af et DNA-fragment på 1,3 kb indeholdende human IFN-r-DNA.
10 Separat blev 4 ug pKYPll opløst i 40 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 20 mM dithiothreitol og 50 mM NaCl. 8 enheder BamHI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet 15 ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere enzymet. Derefter blev 30 um af hvert af stofferne dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsat, og 8 enheder Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment, produkt fra New England Biolabs, 1 al) blev tilsat. Udfyldningsreaktion blev ud-20 ført ved 15 °C i 1 time, og reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 68 °C i 15 minutter for at inaktivere DNA polymerase I. 10 enheder Hindlll blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer efterfulgt af opvarmning ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere 25 Hindlll. Nedbrydningsreaktionsopløsningen af plasmid pKYPll blev underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 2,5 ug af et DNA-fragment på ca. 4,7 kb indeholdende P.
trp 30 Derpå blev 0,5 ug af DNA-fragmentet på 1,3 kb indeholdende human IFN-r-DNA og 1,0 ug af DNA-fragmentet på ca. 4,7 kb indeholdende P^ , som var opnået fra plasmid pKYPll, opløst i 20 ul af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^r 5 mM dithiothreitol og 500 uM 35 ATP, og 4 enheder T4 DNA-ligase blev tilsat. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 18 timer, og Escherichia coli HB101 blev transformeret med den resulterende rekom- 25
DK 164108 B
binante plasmidblanding ved konventionel teknik til op-nåelse af en Ap koloni. Plasmid pGC7 blev skilt fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGC7 blev bekræftet ved nedbrydning med HindllX, Hpal, Sall, EcoRl 5 og Clal og agarosegelelektroforese. Escherichia coli stamme indeholdende pGC7 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGC7 (FERM BP-497).
Referenceeksempel 2 10
Konstruktion af rekombinant plasmid pGKA2 I dette eksempel blev 6 ag af den pGC7 DNA, der blev opnået i referenceeksempel 1, opløst i 50 al (totalvolumen) 15 af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 10 mM NaCl, og 12 enheder BstNI (produkt fra New England Biolabs) blev tilsat. Der blev udført reaktion ved 60 "C i 3 timer, og reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 "C i 5 minutter 20 for at inaktivere BstNI. Derpå blev NaCl tilsat til en endelig koncentration på 150 mM, og 8 enheder Sall blev tilsat. Nedbrydnignsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev igen opvarmet ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere Sall og underkastet rens-25 ning ved LGT-metoden til opnåelse af ca. 0,8 ag af et DNA-fragment på ca. 1125 bp indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA.
Separat blev 3 ug pKYPlO opløst i 40 al (totalvolumen) af 30 en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 100 mM NaCl. 6 enheder af hvert af Hindlll og Sall blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 5 minutter for at 35 inaktivere HindiII og Sall og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af ca. 1,8 ag af et DNA-fragment på ca. 4,1 kb indeholdende Pt .
26
DK 164108 B
Den N-terminale aminosyre i det modne humane IFN-r-poly-peptid er Cys. For at udtrykke moden IFN-r-DNA er det nødvendigt at tilvejebringe en initieringscodon (ATG) lige før den 5'-terminale codon TGT (Cys) og endvidere at 5 indstille længden mellem SD-sekvens nedstrøms fra P^. og ATG til en passende længde på 6-18 bp. Derfor blev følgende DNA-linker syntetiseret:
10 findlll BstNI
Met Cys Tyr Cys 5 * [A G C T T |a T Gi TGTTACTGCC[3' (18-mer) 3* ATACACA ATGACG gVJs’ (15-mer) 15
To enkeltkædede DNA'er, en 18-mer og en 15-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ug af såvel den 18-mere som den 15-mere DNA opløst i 20 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM 20 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 °C i 60 minutter.
25
Derpå blev 2 ug af den phosphorylerede 18-mere DNA og den phosphorylerede 15-mere DNA blandet, og blandingen blev opvarmet ved 70 °C i 5 minutter og fik lov at henstå ved stuetemperatur til annelering til opnåelse af DNA-30 linkeren med den i det foregående angivne struktur.
0,4 ug af BstNI-Sall-fragmentet på 1125 bp opnået i det foregående og afledt fra pGC7 og 1,0 ug af DNA-fragmentet på 4,1 kb opnået ved nedbrydning af udtrykkelsesvektoren 35 pKYPlO med Hindlll og Sall blev opløst i 25 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH
7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol og 500 um ATP. Ca.
27
DK 164108 B
0,1 ug af den ovennævnte DNA-linker blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer. Escherichia coli HB101 blev transformeret under an-5 vendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding ved konventionel teknik til opnåelse af en Ap koloni. Plasmid pGKA2 som vist i fig. 1 blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGKA2 blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, Hindlll, BstNI 10 og Sall og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen fra SD-sekvensen (AAGG) til initieringscodonen (ATG) i plasmidet pGKA2 var "AAGGGTATCGATAAGCTTATG".
15 Escherichia coli stamme indeholdende pGKA2 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-496).
Referenceeksempel 3 20 Konstruktion af plasmid pGBDl med BamHI-skæringssted ned-strøms fra IFN-r-genet I dette eksempel blev 2 ug plasmid pIFNr-G4 (3,6 kb) opløst i 50 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 25 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM di- thiothreitol og 50 mM NaCl (i det følgende benævnt "Y-50 pufferopløsning"). Derefter blev 4 enheder af restriktionsenzymet PvuII tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 2 timer. Nedbrydningsproduktet blev 30 underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 1 ug af et DNA-fragment (3,6 kb) af pIFNr-G4. 0,1 ug af DNA-fragmentet og 5 pmol 5'-phosphoryleret BamHI-linker (5'-pCCGGATCCGG-3', produkt fra Collaborative Research,
Inc. ) blev ligeret ved 4 °C i 18 timer med 2 enheder T4-35 ligase i 20 ul T4-ligasepufferopløsning.
28
DK 164108 B
Escherichia coli HB101 [Boliver, et al.. Gene 2, 75 (1977)] blev transformeret under anvendelse af det således opnåede rekombinante plasmid-DNA ved metoden ifølge Cohen et al. [S.N. Cohen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 5 USA, 69, 2110 (1972)] til opnåelse af en ApR koloni.
Plasmid-DNA blev isoleret fra transformanten ved den kendte metode [H.C. Birnboim, et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)]. DNA blev nedbrudt med restriktions- endonukleaser, såsom BamHI, dens struktur blev analyseret 10 for at konstatere, at man havde opnået rekombinant plasmid pGBDl, hvori BamHI-linker var indsat i PvuII-stedet i pIFNr-G4. Escherichia coli stamme indeholdende pGBDl er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGBD1 (FERM BP-394).
15
Referenceeksempel 4
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVLlO kodende for 1-Ser-IFN-r 20 I dette eksempel blev 6 ug pGBDl, opnået i referenceeksempel 3, opløst i 50 ul Y-50 pufferopløsning. 10 enheder SinI blev tilsat, og nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev der tilsat NaCl 25 til en s lutkoncentration på 100 mM, og 10 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydnignsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. 0,8 ug af et DNA-fragment på ca. 850 bp indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
30
Separat blev 3 ug pKYPlO DNA, fremstillet ved metoden som beskrevet i japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83, opløst i 40 ul (totalvolumen) Y-50 pufferopløsning, og 5 enheder af hvert af HindiII og 35 BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der opnået ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende 29
DK 164108 B
tryptophan-promoter (P^ ) ved LGT-metoden.
Modent humant IFN-r-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For at ændre den første Cys til 5 Ser og for at tilvejebringe en initieringscodon ATG, der er nødvendig til udtrykkelse, lige før første Ser, blev følgende DNA-linker syntetiseret:
Hindlll SinI
10 _
Met lSer| Tyr Cys Gin 5' AGCT Æg| TCT TAC TGC CAG 31 20-mer 3' ATAC AGA ATG ACG GTC CTG 5’ 19-mer 15
To enkeltkædede DNA'er, en 20-mer og en 19-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ag af såvel den 20-mere som den 19-mere DNA opløst i 40 al (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM 20 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 "C i 60 minutter.
25 0,5 ug af SinI-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp afledt fra pGBDl og 1,0 ag af HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb fra udtrykkelsesvektoren pKYPlO, som blev opnået i det foregående, blev opløst i 25 al T4 ligasepufferopløsning.
Ca. 0,1 ag af DNA-linkeren nævnt ^ det foregående blev 30 sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 "C i 17 timer.
35 Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding
R
til opnåelse af en Ap koloni. Et plasmid, pGVLIO som 30
DK 164108 B
vist på fig. 2, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVLlO blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, HindiII og BamHI og agarose-gelelektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-5 metoden, at DNA-sekvensen fra HinduI-stedet til Sinl-stedet i plasmidet pGVLlO var som følger:
Hindlll SinI
10 Met Ser Tyr Cys Gin Asp
AGCT TATG TCT TAC TGC CAG GAC ATAC AGA ATG ACG GTC CTG
r 15
Det humane iFN-r-polypeptid, som pGVLlO koder for (derivatet kaldes 1-Ser-IFN-r), er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den første Cys i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser.
20 Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVLlO er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGVL10 (FERM BP-544).
Referenceeksempel 5 25
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVMIOl kodende for 3-Ser-IFN-r 6 μg pGBDl-DNA opnået i referenceeksempel 3 blev opløst i 30 50 μΐ Y-50 pufferopløsning. 10 enheder SinI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer.
Derpå blev NaCl tilsat til en slutkoncentration på 100 mM, og 10 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktionen blev udført ved 37 °C i 3 timer. 0,8 ug af et 35 DNA-fragment på ca. 850 bp indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
31
DK 164108 B
Separat blev 3 ug ρΚΥΡΙΟ-DNA, fremstillet ved metoden beskrevet i japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83, opløst i 40 ni (totalvolumen) Y-50 pufferopløsning, og 5 enheder af hvert af Hindlll og 5 BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 “C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der opnået ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende tryptophanpromotor (P^ ) ved LGT-jmetoden.
10 Modent humant IFN-r-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For at ændre den 3. aminosyre (Cys) til Ser og inkorporere en initieringsaodon (ATG), der er nødvendig for udtrykkelse, lige før den første Cys, blev følgende DNA-linker syntetiseret: 15
Hindlll SinI
Met Cys Tyr [Serl Gin 5' AGCT liATGl TGC TAC TCT CAG|3' 20-mer 20 3' ATAC ACG ATG AGA GTC CTG 5' 19-mer
To enkeltkædede DNA'er, en 20-mer og en 19-mer, blev syn-25 tetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ug af såvel den 20-mere som den 19-mere DNA opløst i 40 μΐ (totalvolumen) af en opløsnihg indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase 30 blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 °C i 60 minutter.
0,5 ug af Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp afledt fra pGBDl og 1,0 ug af HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb 35 af udtrykkelsesvektoren pKYPlO, som blev opnået i det foregående, blev opløst i 25 ul T4 ligasepufferopløsning.
Ca. 0,1 ug af ovennævnte DNA-linker blev sat til bian- 32
DK 164108 B
dingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer.
5 Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding g til opnåelse af en Ap koloni. Et plasmid pGVMlOl, som vist i fig. 3, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVMlOl blev bekræftet ved ned-10 brydning med EcoRI, Clal, HindiII og BamHI og agarosegel-elektroforese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen fra Hindi Il-stedet til Sinl-stedet i plasmid pGVMlOl var som følger: 15
Hindlll SinI
Met Cys Tyr Ser Gin Asp AGCT TATG TGC TAC TCT CAG GAC Jatac ACG ATG AGA GTC CTG
20
Det humane IFN-r-polypeptid, som pGVMlOl koder for (derivatet kaldes 3-Ser-IFN-r), er klart forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 3.
25 aminosyre (Cys) af det modne humane IFN-r er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVMlOl er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGVM101 (FERM BP-545).
30 Referenceeksempel 6
Konstruktion af rekombinant plasmid pGVK13 kodende for 1,3-Ser-IFN-r 35 6 ug pGBDl-DNA opnået i referenceeksempel 3 blev opløst i 50 ul Y-50 pufferopløsning. 10 enheder SinI (produkt fra Bio Tec Co.) blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev 33
DK 164108 B
udført ved 37 °C i 3 timer. Derpå blev NaCl tilsat til en endelig koncentration på 100 mM, og 10 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Ca. 0,8 ug af et DNA-fragment på ca. 850 bp 5 indeholdende en stor del af den humane IFN-r-DNA blev opnået fra reaktionsopløsningen ved LGT-metoden.
Separat blev 3 ug ρΚΥΡΙΟ-DNA opløst i 40 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende Y-100 pufferopløsning, 10 og 5 enheder Hindi 11 og 5 enheder BamHI blev tilsat. Nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der opnået ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,3 kb indeholdende ved LGT- metoden .
15
Modent humant IFN-r-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For at ændre den 1. og den 3. aminosyre (Cys) til Ser og til tilvejebringelse af en initierings-codon (ATG), der er nødvendig for udtrykkel se, lige før 20 den første Ser, blev følgende DNA-linker syntetiseret:
Hindlll SinI
Met ISerl Tyr [Seri Gin 25 5' AGCT ijATG} TCT TAC TCT CAG 31 20-mer 3' ATAC AGA ATG AGA GTC CTG 5' 19-mer 30 To enkeltkædede DNA’er, en 20-mer og en 19-mer, blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode. Derpå blev 2 ug af den 20-mere og 2 ug af den 19-mere DNA opløst i 40 ul (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol, 0,1 35 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4 polynukleotidkinase blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 "C i 60 minutter.
34
DK 164108 B
Derpå blev 0,4 ug af Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp afledt fra pGBDl og 1,0 ug af Hindlll-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb af udtrykkelsesvektoren pKYPlO, som blev opnået i det foregående, opløst i 25 ul T4 ligasepuffer-5 opløsning. Ca. 0,1 ug af DNA-linkeren som nævnt i det foregående blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4 DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 "C i 17 timer.
10 Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den resulterende rekombinante plasmidblanding til opnåelse af en Ap koloni. Et plasmid pGVK13, som vist i fig. 4, blev isoleret fra dyrkningsbouillonen for kolonien. Strukturen af pGVK13 blev bekræftet ved nedbrydning 15 med EcoRI, Hindlll, ClaX og BamHl og agarosegelelektro- forese. Det blev bekræftet ved Maxam-Gilbert-metoden, at DNA-sekvensen fra Hindlll-stedet til Sinl-stedet i plas-midet pGVK13 var som følger: 1 35
Hindlll sinI
Met Ser Tyr Ser Gin Asp AGCT TATG TCT TAC TCT CAG GAC^ 25
Det humane IFN-r-polypeptid, som pGVK13 koder for (derivatet kaldes 1,3-Ser-lFN-r), er forskelligt fra det kendte humane IFN-r-polypeptid derved, at den 1. og den 30 3. aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-r er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme indeholdende plasmid pGVK13 er blevet deponeret hos FRI som Escherichia coli IGVK13 (FERM BP-432).

Claims (4)

1. Derivat af et humant interferon-r-polypeptid med 5 formlen 137-Cys-IFN-r(Δ138-146), l-Ser-137-Cys-IFN-r- (Δ138-146) eller 3-Ser-137-Cys-IFN-r(Δ138-146), der kodes af henholdsvis rekombinant plasmid pGVT137 (FERM BP-547), pGNC5 (FERM BP-550) og pGNB4 (FERM BP-549).
2. Rekombinant plasmid pGVT137 (FERM BP-547), pGNC5 (FERM BP-550) og pGNB4 (FERM BP-549).
3. Mikroorganisme transformeret med et rekombinant plasmid ifølge krav 2, hvilken mikroorganisme er
15 Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547), Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) eller Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
4. Fremgangsmåde til fremstilling af et humant 20 interferon-r-polypeptid ifølge krav 1, der omfatter dyrkning i et medium af en mikroorganisme ifølge krav 3, idet mikroorganismen er i stand til at udtrykke det inkorporerede DNA-fragment, akkumulering af polypeptidet i dyrkningsmediet og udvinding af polypeptidet derfra. 25 30
DK314485A 1984-07-11 1985-07-10 Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid DK164108C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14395084A JPS6124599A (ja) 1984-07-11 1984-07-11 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体
JP14395084 1984-07-11

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK314485D0 DK314485D0 (da) 1985-07-10
DK314485A DK314485A (da) 1986-01-12
DK164108B true DK164108B (da) 1992-05-11
DK164108C DK164108C (da) 1992-10-12

Family

ID=15350817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK314485A DK164108C (da) 1984-07-11 1985-07-10 Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid

Country Status (11)

Country Link
US (1) US4898931A (da)
EP (1) EP0170917B1 (da)
JP (1) JPS6124599A (da)
AT (1) ATE63923T1 (da)
AU (1) AU586822B2 (da)
CA (1) CA1303529C (da)
DE (2) DE3582973D1 (da)
DK (1) DK164108C (da)
ES (1) ES8609484A1 (da)
IL (1) IL75738A (da)
NO (1) NO175487C (da)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8334102D0 (en) * 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
CA1340265C (en) * 1985-01-18 1998-12-15 Kirston E. Koths Oxidation resistant muteins
GB8619725D0 (en) * 1986-08-13 1986-09-24 Hoffmann La Roche Homogenous interferon fragments
JP2653061B2 (ja) * 1986-12-27 1997-09-10 武田薬品工業株式会社 新規ポリペプチドおよびその製造法
AT393690B (de) * 1987-10-08 1991-11-25 Hoffmann La Roche Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente
DE3829180A1 (de) * 1988-08-29 1990-03-08 Boehringer Ingelheim Int Neues arzneimittel zur vorbeugung und behandlung von durch primaere immundefekte verursachte krankheiten
DE4036856C1 (da) * 1990-11-19 1992-05-27 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De
CN1900116A (zh) * 1995-01-26 2007-01-24 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗－LT－β－R抗体、含有该抗体的药用组合物及其制药应用
DE19535853C2 (de) * 1995-09-18 1999-04-01 Fraunhofer Ges Forschung Varianten des rekombinanten humanen Interferon-gamma, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
JP2003513681A (ja) * 1999-11-12 2003-04-15 マキシゲン・ホールディングス・リミテッド インターフェロンガンマ・コンジュゲート
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
AU782635B2 (en) * 1999-11-12 2005-08-18 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US7524931B2 (en) 2002-07-03 2009-04-28 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
JP4896745B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-14 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒトインターフェロンポリペプチドおよびこれらの使用
CA2609205A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
EP1991679A2 (fr) * 2006-03-08 2008-11-19 Biomethodes Variants de l'interferon- gamma humain (ifngamma)
FR2898359B1 (fr) * 2006-03-08 2011-07-15 Biomethodes Variants ameliores de l'interferon-gamma humain (ifn gamma)
CA2712606A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
MX2021001165A (es) * 2018-07-30 2021-07-15 Univ Leland Stanford Junior Agonistas sesgados de interferon-gamma.

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
US4681848A (en) * 1982-09-22 1987-07-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel peptide and use thereof
IL69851A0 (en) * 1982-09-30 1983-12-30 Japan Found Cancer Novel dna and recombinant plasmid containing the same
US4758656A (en) * 1983-12-26 1988-07-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel human interferon-gamma polypeptide derivative
AU582574B2 (en) * 1984-04-19 1989-04-06 Hoechst Aktiengesellschaft The preparation of polypeptides having human gamma interferon activity
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ATE63923T1 (de) 1991-06-15
EP0170917A1 (en) 1986-02-12
ES545052A0 (es) 1986-09-01
EP0170917B1 (en) 1991-05-29
DK314485D0 (da) 1985-07-10
DE3582973D1 (de) 1991-07-04
CA1303529C (en) 1992-06-16
NO852776L (no) 1986-01-13
NO175487C (no) 1994-10-19
NO175487B (no) 1994-07-11
AU4474985A (en) 1986-01-16
DK164108C (da) 1992-10-12
ES8609484A1 (es) 1986-09-01
IL75738A0 (en) 1985-11-29
AU586822B2 (en) 1989-07-27
JPS6124599A (ja) 1986-02-03
IL75738A (en) 1995-06-29
DE170917T1 (de) 1986-09-04
DK314485A (da) 1986-01-12
US4898931A (en) 1990-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK164108B (da) Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid, rekombinant plasmid til brug ved fremstilling deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme indeholdende rekombinant plasmid
Yelverton et al. Bacterial synthesis of a novel human leukocyte interferon
EP0041313B1 (en) Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon
RU2056460C1 (ru) Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, способной экспрессировать иммунный интерферон человека
EP0152613B1 (en) Novel promoter
US4530901A (en) Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4737462A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
FI80720C (fi) Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
DK168016B1 (da) Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid
US5096705A (en) Human immune interferon
NO164037B (no) Fremgangsm te ved fremstilling av et polypeptid av ron alfa (ifnalfa)-type.
DK175194B1 (da) Rekombinante DNA-molekyler, interferon-omega-type gener, transformerede værter indeholdende DNA-informationen, ekspressionsplasmider for interferon-omega-typer, E. coli transformeret hermed, humane interferoner af type I, fremgangsmåde.......
EP0456332A1 (en) Purified interleukin 1 and DNA coding for interleukin 1 and their preparation, vectors containing such DNA and their preparation and use in transforming hosts to permit expression of interleukin 1
DK160945B (da) Humant interferon-gamma-polypeptid og fremgangsmaade til fremstilling deraf, rekombinant plasmid omfattende et dna-fragment, som koder for peptidet, og mikroorganisme transformeret med plasmidet
WO2001057217A1 (en) Expression and secretion vector for human interferon alpha and process for producing human interferon alpha by employing same
WO2007017637A1 (en) Method for producing recombinant interferon alpha-8
TANAKA et al. Production of recombinant mouse β-interferon
IL71232A (en) A recombinant plasmid encoding the human itferron-C polypeptide, the process for its preparation, and microorganisms containing it

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed