EP1991679A2 - Variants de l'interferon- gamma humain (ifngamma) - Google Patents

Variants de l'interferon- gamma humain (ifngamma)

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EP1991679A2
EP1991679A2 EP07731116A EP07731116A EP1991679A2 EP 1991679 A2 EP1991679 A2 EP 1991679A2 EP 07731116 A EP07731116 A EP 07731116A EP 07731116 A EP07731116 A EP 07731116A EP 1991679 A2 EP1991679 A2 EP 1991679A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ifnγ
variant
pharmaceutical composition
composition according
agent
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07731116A
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German (de)
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Inventor
José BERENGUER
Marc Delcourt
Hélène CHAUTARD
Thierry Menguy
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Biomethodes SA
Original Assignee
Biomethodes SA
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Publication date
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Priority claimed from FR0603150A external-priority patent/FR2899589A1/fr
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Publication of EP1991679A2 publication Critical patent/EP1991679A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention falls within the field of protein enhancement. It relates to the improvement of human ⁇ interferon (IFN ⁇ ), as well as compositions comprising an improved IFN ⁇ , a nucleic acid encoding it, and their uses.
  • IFN ⁇ human ⁇ interferon
  • IFN ⁇ is a cytokine of 166 amino acids.
  • the molecule has a signal peptide allowing its membrane translocation and its secretion, a cleavage site and a so-called mature protein part.
  • the signal peptide of IFN ⁇ is made up of the first 23 or 20 first amino acids according to the authors. Indeed, there is doubt in the literature on the presence of the amino acid triplet Cys-Tyr-Cys (CYC) in N-terminal of the mature sequence.
  • CYC Cys-Tyr-Cys
  • IFN ⁇ exists as a homodimer in which the two subunits are not covalently bound. Each subunit has two N-glycosylation sites (positions 48 and 120 of the 166 aa precursor).
  • each of these monomers has six alpha helices with a compact part consisting of the first 4 most N-terminal alpha helices (alpha A, B, C, and D helices) and a C-terminal part consisting of two isolated alpha helices and closely interaction with the second IFN ⁇ monomer.
  • IFN ⁇ is the typical example of a pleiotropic cytokine with a broad spectrum of activities. Indeed, interferons (IFNs) are endowed with activities such as inhibition of viral replication, inhibition of cell multiplication and induction of apoptosis.
  • IFNs interferons
  • stimulation of macrophages by IFN ⁇ induces the following responses:
  • MHC major histocompatibility complex
  • IFN ⁇ increased cytokine production and endogenous IFN production.
  • the action of IFN ⁇ on T lymphocytes is to promote their differentiation thus modulating the specific immune response.
  • IFN ⁇ is a molecule developed as a human therapeutic agent in the treatment of many diseases, of various natures.
  • Commercial IFN ⁇ (Actimmune, and Biogamma) are now used for two main therapeutic indications: chronic granulomatosis and idiopathic pulmonary fibrosis, in combination with oral prednisolone.
  • Many new secondary therapeutic indications are currently being developed at different clinical phases, in particular for their role as immunosuppressors, for example in addition to pegylated IFN ⁇ / ribavirin in the context of the treatment of Hepatitis C.
  • IFNs The main adverse effects of IFNs are dose-dependent and therefore closely related to the rate of administration. These effects are cumulative and worsen over time. In addition to the acute toxicity resulting after injection (2-8 hours after subcutaneous injection), nausea and vomiting, the most frequent adverse effects are flu-like symptoms (chills, headache, asthenia), inflammatory reactions at the site of injection and elevation of liver transaminases. The most serious adverse effects are cases of depression, lymphopenia or rare cases of necrosis at the subcutaneous injection site. In patients treated with high doses of IFN, diabetes may occur after the start of treatment. In addition, the tolerance of IFN injection is sometimes limited in time and results in the development of neutralizing antibodies (in approximately 10-20% of patients).
  • US 4,832,959 contains polypeptides with partial sequences of human IFN ⁇ including residues 1-127, 5-146 and 5-127 of mature IFN ⁇ and having the 3 additional amino acids CYC.
  • US 6,120,762 discloses a peptide fragment comprising residues 118-157 of precursor PIFN ⁇ and its use.
  • WO2004005341 describes the methods for generating and producing a series of active mutants of PIFN ⁇ comprising the 143 amino acids of the mature form of IFN ⁇ without CYC with a variation comprising at least one of the mutations in the S 155 and S 165 group and at least a mutation in the group Rl 60, Rl 62 and Rl 63. These mutants would be useful especially in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis.
  • EP 0 219 781 discloses the use of partial sequences of human IFN ⁇ including amino acids 3-124 of the mature protein. The importance of the last 20 amino acids on the activity and stability of IFN ⁇ has been and still is a source of controversial studies. Human IFN ⁇ s with the truncated C-terminus have been described by Slodowski et al who performed truncations of different size (from 10 to 20 truncated amino acids) (Eur J. Biochem 202: 1133-1140, 1991). .
  • WO 2004/022593 in silico analysis of the sequences of numerous therapeutic proteins, including IFN ⁇ , for the existence of proteolysis sites sensitive to proteases present in human serum (such as trypsin, endoproteinase Asp-N, chymotrypsin and proline endopeptidase).
  • proteolysis sites sensitive to proteases present in human serum such as trypsin, endoproteinase Asp-N, chymotrypsin and proline endopeptidase.
  • the mutations expected to provide protection against the proteases mentioned are: L53V, L53I, K57Q, K57N, K60Q, K60N, E61Q, E61N, E61H, E62Q, E62N, E62H, K78Q, K78N, K81Q, K81N, K84Q, K84N, D85Q, D85N, D86Q.
  • IFN ⁇ in monomeric form in particular
  • IFN ⁇ in monomeric form in particular
  • WO 92/08737 discloses PIFN ⁇ variants comprising an additional N-terminal methionine in position -1, the first 132 amino acids of the mature sequence without CYC, the 133rd amino acid being a leucine instead of a glutamine.
  • US 6,046,034 discloses thermostable variants of human IFN ⁇ for which pairs of cysteines have been incorporated at specific locations in the IFN ⁇ structure so as to create inter-monomer and intra-monomer disulfide bridges and thus provide stabilization of the IFN ⁇ homodimer.
  • the only pair of cysteines that preserve the biological activity of IFN ⁇ is E30C-S92C, which links helices A and D of the same monomer, while the other pairs of inter-monomeric cysteines destroy the biological activity of IFN ⁇ .
  • these mutants also have a truncated C-terminus corresponding to the Delta 10 mutant.
  • WO 99/03887 discloses protein variants of the structural super-family of growth hormone (of which IFN ⁇ is a part).
  • IFN ⁇ is described as an example of this super-family, but no experimental example of modifications is described in the case of IFN ⁇ .
  • WO 01/36001 discloses novel IFN ⁇ molecules modified by insertions of glycosylation sites and / or derivation by PEG type entities. These molecules have improved properties such as improved half-life and / or improved bioavailability.
  • WO03002152 discloses a pharmaceutical composition containing a sulfoalkyl ether interferon cyclodextrin derivative, the stability of which would be improved. None of these variants are currently available as a drug. It is for this reason that there is still a strong demand for an improved IFN ⁇ , and in particular an IFN ⁇ having a better stability under physiological conditions. This gain in stability under physiological conditions can be evaluated by a gain of stability at high temperature.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising at least one substitution selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, and T95V, the variant not carrying a non-peptide group attached to the residue (s) introduced (s) by the first substitution (s).
  • the variant differs from a polypeptide having a sequence selected from SEQ ID Nos. 2, 4 and 6 by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10. residue (s), preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residue (s).
  • the variant has a single substitution.
  • the variant further comprises at least one other substitution selected from the group consisting of M157C, G41S and M100N.
  • the variant may comprise or a combination of two substitutions selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, El 16C 5 L158C, S74G, R162C, S122D, MlOON, L126P, N58R, T95V, M157C and G41S.
  • the variant comprises or has a combination of substitutions selected from the group consisting of S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + MlOON, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + El 16C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + MlOON, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, E62C + El 16C,
  • the variant comprises or has a combination of substitutions selected from the group consisting of S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S.
  • the variant comprises or has the combination S63C + G41S.
  • the variant does not have a deletion of 1 to 11 residues at the C-terminus.
  • the variant has a deletion of 1 to 11 residues at the C-terminus.
  • the variant does not carry a non-peptide group selected from the group consisting of a polymer molecule, a lipophilic molecule, and an organic derivatization agent.
  • the variant carries a non-peptide group selected from the group consisting of a polymer molecule, a lipophilic molecule, and an organic derivatization agent.
  • the non-peptide group in question is especially a polymer molecule, preferably a polyethylene glycol.
  • the variant is glycosylated.
  • the variant is not glycosylated.
  • the pharmaceutical composition further comprises at least one other active ingredient.
  • the at least one other active ingredient is preferably selected from the group consisting of an antibody, an antitumor or chemotherapy agent, a glucocorticoid, an antihistamine agent, an adrenocortical hormone, an antiallergic agent, a vaccine , a broncodilator, a steroid, a beta-adrenergic agent, an immunomodulatory agent, a cytokine such as interferon alpha or beta, interleukin 1 or 2, TNF (tumor necrosis factor), hydroxyurea, an agent alkylating agent, a folic acid antagonist, an antimetabolite of nucleic acid metabolism, a fusal poison, an antibiotic, a nucleotide analogue, a retinoid, a lipoxygenase and cyclooxygenase inhibitor, a fumaric acid and its salts, an analgesic, a spasm
  • the at least one other active ingredient is a type I interferon, in particular alpha or beta interferon.
  • the pharmaceutical composition may be formulated for oral, parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intradermal), sublingual, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, intraocular, or intraatrial administration.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition according to the present invention as a medicament.
  • the present invention relates to a product comprising a pharmaceutical composition according to the present invention and another active ingredient for a combined preparation for simultaneous, sequential or separate use as an antiviral, antiproliferative or immunomodulatory drug.
  • the other active ingredient is selected from the group consisting of an antibody, an antitumor or chemotherapy agent, a glucocorticoid, an antihistamine agent, an adrenocortical hormone, an antiallergic agent, a vaccine, a broncodilator, a steroid, a beta-adrenergic agent, an immunomodulatory agent, a cytokine such as interferon alpha or beta, interleukin 1 or 2, TNF (tumor necrosis factor), hydroxyurea, an alkylating agent, a folic acid antagonist, an antimetabolite of nucleic acid metabolism, a fusal poison, an antibiotic, a nucleotide analogue, a retinoid, a lipoxygenase and
  • the other active ingredient is a type I interferon, in particular alpha or beta interferon.
  • the two active ingredients can be administered by the same route of administration or by two separate routes of administration.
  • the medicament is for the treatment of a selected pathology among asthma, chronic familial granulomatosis, idiopathic pulmonary fibrosis, an atypical mycobacterium infection, kidney cancer, osteopetrosis, scleroderma generalized, chronic hepatitis virus B or C, septic shock, allergic dermatitis, and rheumatoid arthritis.
  • the present invention further relates to the use of a pharmaceutical composition according to the present invention for the preparation of an antiviral, antiproliferative or immunomodulatory drug.
  • the medicament is for the treatment of a selected pathology among asthma, chronic familial granulomatosis, idiopathic pulmonary fibrosis, atypical mycobacterium infection, kidney cancer, osteopetrosis, scleroderma. generalized, chronic hepatitis virus B or C, septic shock, allergic dermatitis, and rheumatoid arthritis.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a thermostable variant of IFN ⁇ as described in the compositions above. It also relates to a nucleic acid expression cassette according to the present invention, a vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the present invention, and a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector according to the present invention. Finally, it relates to the use of such a nucleic acid, of such an expression cassette, of such a vector or of such a host cell to produce a thermostable variant of IFN ⁇ as described in the compositions herein. - above.
  • FIG. 1 Diagram of the pNCK vector used for the generation of mutant libraries and their selection in Thermus thermophiles.
  • FIG. 2 Results of the functional analysis of the simple mutants of the IFN ⁇ selected by Thermus thermophilus - thermostability analysis (% of residual activity panel A), total relative activity with respect to the wild-type protein (panel B) and index of product-defined improvement (residual activity by relative total activity against wild-type protein / 100) (panel C).
  • FIG. 3 Results of functional analysis of simple mutants of IFN ⁇ resulting from the double and multiple positions selected by Thermus thermophilus - Thermostability analysis (% of residual activity panel A), total relative activity with respect to the wild-type protein (panel B) and product-defined improvement index (residual activity by relative total activity against wild-type protein / 100) (panel C).
  • Figure 4 The era of the functional analysis results of single point mutants of IFN-g generated systematically and have been upgraded to their stability and / or activity - heat stability analysis (% residual activity of panel A) activity total relative to wild-type protein (panel B) and product-defined improvement index (residual activity by relative total activity against wild-type protein / 100) (panel C).
  • Figure 5 2nd part of the functional analysis results of single point mutants of IFN-g generated systematically and have been upgraded to their stability and / or activity - heat stability analysis (% residual activity of panel A) activity total relative to wild-type protein (panel B) and product-defined improvement index (residual activity by relative total activity against wild-type protein / 100) (panel C).
  • Figure 6 3rd part of the functional analysis results of single point mutants of IFN-g generated systematically and have been upgraded to their stability and / or activity - heat stability analysis (% residual activity of panel A) activity total relative to wild-type protein (panel B) and product-defined improvement index (residual activity by relative total activity against wild-type protein / 100) (panel C).
  • FIG 7 Evaluation of the thermostability of protein variants of human PIFN ⁇ by measuring their half-life in vitro during kinetics of thermal denaturation at 59 ° C in the presence of a concentration of adjusted FBS. These measures consist in monitoring the retention of PIFN ⁇ activity as a function of denaturation time at 59 ° C. These data allow us to calculate the "in vitro half-life" of these molecules under these conditions. These half life calculations are listed in Table 3.
  • Figure 8 Pharmacokinetics of thermostable variants of human IFN ⁇ after intravenous administration. The amount of IFN ⁇ is monitored by an ELISA test on C57BL / 6 mouse serum samples after intravenous injection of 100 ⁇ l at 10 ⁇ g / ml.
  • Figure 9 Example of pharmacokinetics of thermostable variants of human PIFN ⁇ after subcutaneous administration. Plasma IFN ⁇ gamma concentration is monitored by ELISA quantification on C57BL / 6 mouse serum samples after subcutaneous injection of 100 ⁇ l at 6.7 ⁇ g / ml. Table 1: Mutants from the primary selection of the PIFN ⁇ library in Thermus thermophilus. The numbers correspond to the position of the mutation in the form of the 166 residue precursor.
  • Table 2 Mutants validated in secondary selection test in Thermus thermophilus. The numbers correspond to the position of the mutation in the form of the 166 residue precursor.
  • Table 3 Summary of "in vitro" half-life calculations of thermostable variants of IFN ⁇ in thermal inactivation experiments at 59 ° C and calculation of half-life improvement ratio of variants compared to half - life of wild IFN ⁇ produced in CHO.
  • Table 4 Summary of terminal half-life calculations for the elimination of thermostable variants of IFN ⁇ during intravenous injection experiments and calculation of the half-life improvement ratio of the variants with respect to the half-life of IFN ⁇ wild product in CHO. Terminal elimination half-lives (Tl / 2i.v) were calculated using Kinetica Vs 4.4 software by modeling IV bolus administration in a non-compartmentalized system.
  • Table 5 Recapitulation of total area under the curve (AUC early sc) and elimination half-lives (T1 / 2 sc) in subcutaneous injection experiments. Calculation of the respective improvement ratios of the total area under the curve and the half-lives of the variants relative to the total area under the curve and the half-life of wild-type IFN ⁇ produced in CHO. These parameters were calculated using the Kinetica Vs 4.4 software. Detailed description of the invention
  • the present invention relates to variants of human gamma interferon (IFN ⁇ ) whose stability, in particular the thermal stability, is increased compared to wild-type IFN ⁇ .
  • IFN ⁇ human gamma interferon
  • the PIFN ⁇ protein variants of this invention were obtained by coupling the generation of a wide variety of mutations by directed evolution to a direct selection method of the improved variants for their thermostability. The stability against the thermal denaturation of the improved candidates as well as the conservation of their activity was validated by biological tests.
  • the variants of this invention are alternatives to recombinant IFN ⁇ currently used in the therapeutic field, particularly in the treatment of chronic granulomatosis and idiopathic pulmonary fibrosis.
  • the numbering adopted in the present application will be that which takes into account all the residues of IFN ⁇ with the signal peptide sequence included (total amino acid numbering of 1 for the N-terminal methionine signal peptide included at 166 for glutamine of the C-terminus interferon - the sequence SEQ ID No. 2).
  • the position of the substitution in the other two forms can easily be determined by those skilled in the art.
  • substitution indicates the substitution of the cysteine residue at position 21 of SEQ ID No. 2 with a glycine.
  • substitution and “mutation” are interchangeable.
  • sign indicates a combination of two substitutions.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising at least one substitution described in Table 1, Table 2 and Figures 2 to 9.
  • the present invention preferably relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising at least one substitution selected from one of the groups consisting of:
  • variant or the fragment thereof has one or more substitutions as indicated with respect to the SEQ ID Nos. 2, 4 and 6 polypeptide sequences, but that it may have other modifications, in particular substitutions, deletions or additions.
  • thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising a combination of substitutions selected from the groups mentioned above.
  • the combination may consist of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 substitutions selected from this group.
  • thermostable variant of human PIFN ⁇ according to the present invention may comprise other mutations not described in this group, preferably substitutions, in particular some known in the art.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human PIFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising at least one substitution selected from the group consisting of C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, KIOH, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R , A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q and R162E or
  • the present invention relates to a thermostable variant of human PIFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising at least one of mutations selected from the group consisting of Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising at least a first substitution selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C , L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, and T95V.
  • the variant does not carry a non-peptide group attached to the residue (s) introduced by said one or more first substitutions.
  • This variant may further comprise at least one other substitution selected from the group consisting of M157C, G41S and M100N.
  • the present invention also relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof having either a single C23S or M157C substitution, or a C23S or M157C substitution in combination with one or more substitutions. selected from the group consisting of C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, MlOON, K109C, K109Q, K109L, KI HOl, T119Y, Tl 19P 5 Y121T, S122H, S122P, K131I, E
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof having either a single C23S or M157C substitution, or a C23S or M157C substitution in combination with one or more selected substitutions. from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, M100N, T95V and G41S.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof having either a single M157C substitution or an M157C substitution in combination with one or more substitutions selected from group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, MlOON, T95V and G41S.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof having a single substitution selected from a group consisting of:
  • the substitution is selected from the group consisting of C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q and R162E.
  • substitution can be selected from the group consisting of C23S, Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157C, M157L, L1 581, F159C, F159V, R16OA, R162E, R162Q and R162D. .
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof. having a single substitution selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, El16C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, and T95V.
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof having a combination of substitutions selected from the group consisting of C21G + F159C, A147E + R162D, M100N + T119Y, Y76D. + K131I, T50Y + Y121T + M140P, P26D + S122P,
  • the present invention relates to a thermostable variant of human IFN ⁇ or a functional fragment thereof comprising or having a combination of two substitutions selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C , L158C, S74G, R162C, S122D, MlOON, L126P, N58R, T95V, M157C and G41S, preferably a combination selected from the group consisting of S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C , S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + E
  • the present invention relates to a variant comprising or having a combination of substitutions selected from the group consisting of S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, preferably the combination S63C + G41S.
  • variants SEQ ID Nos. 1-6 describe the protein sequences of the precursor and mature human IFN ⁇ as well as the nucleic sequences coding therefor.
  • the variant according to the present invention corresponds to the precursor protein of 166 amino acids (SEQ ID No. 2), or to the mature protein with or without the tripeptide CYC (SEQ ID Nos. 6 and 4, respectively) comprising at least one substitution or a combination of substitutions according to the present invention.
  • variant is meant in particular a polypeptide differing from a polypeptide having a sequence selected from the sequences SEQ ID Nos. 2, 4 and 6 by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or Residue (s), preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residue (s).
  • “functional fragment” is meant a fragment of human PIFN ⁇ exhibiting the activity of human IFN ⁇ .
  • this fragment may correspond to the precursor or mature human IFN ⁇ , with or without the CYC tripeptide, with a C-terminal deletion of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids, preferably from 1 to 15 residues, even more preferably from 1 to 11 residues.
  • the fragment may comprise 100, 110, 120, 130 or 140 consecutive amino acids of human IFN ⁇ .
  • human IFN ⁇ activity is meant the ability to bind to the human IFN ⁇ receptor and to induce signal transduction induced by binding human IFN ⁇ to its receptor as determined in vitro or in vivo.
  • the activity of PIFN ⁇ can be measured by the methods described hereinafter in the description and in the examples.
  • thermostability is meant the ability of the protein to retain its activity after being subjected to the action of heat. For example, the protein can be incubated for 10 minutes at 59 ° C. The thermostability of the variant is then estimated by the percentage of residual activity after this pretreatment. This measurement of the thermostability of a variant is then compared to the same value obtained using the wild-type IFN ⁇ subjected to the same conditions.
  • thermostable variants of the present invention retain an activity (condition without pretreatment) which corresponds to at least 10% of the activity of wild-type human IFN ⁇ , preferably at least 20, 30, 40, 50, 60 , 70, 80 or 90% of the activity of wild-type human IFN ⁇ .
  • the thermostable variants of the present invention retain an activity equivalent to that of wild-type human IFN ⁇ , or even increased.
  • non-peptide group is meant a non-peptide molecule that can be attached to the side chain of an amino acid of human IFN ⁇ .
  • This molecule may be a polymer molecule, a lipophilic molecule, a carbohydrate or an organic derivatization agent.
  • the carbohydrate can be attached to IFN ⁇ by glycosylation in vitro or in vivo, for example by N- or O-glycosylation.
  • a lipophilic molecule may be for example a saturated or unsaturated fatty acid, a terpene, a vitamin, a steroid or carotenoid.
  • a polymer molecule may be a polyol, a polyamine, an acid polycarbocyl or a polyalkylene oxide, particularly a polyethylene glycol (PEG). This type of molecule is well known to those skilled in the art.
  • a variant bearing a PEG group will be referred to as pegylated.
  • the variant of human IFN ⁇ according to the present invention may be glycosylated, preferably at positions 48 and 120. In another embodiment, the variant may not be glycosylated. When the variant comprises the G41S substitution, it can be glycosylated at the N39 position by N-glycosylation. In an alternative mode, such a variant may not be glycosylated at this position.
  • the variant may be modified by adding a polymer molecule, in particular by adding polymers (Kita et al., Drug Des., Deliv., 6: 157-167, 1990, EP 236987 and US 5,109,120). or by pegylation (WO99 / 03887, see WO2004005341 "Conjugation of a polymer molecule").
  • the polymer molecule is attached to a position other than the positions 41, 58, 62, 63, 74, 95, 99, 100, 116, 122, 126, 157, 158, 159 and 162.
  • the molecule is not attached to a residue introduced by a substitution made in a variant according to the present invention, in particular a substitution selected from S63C, E62C, F159C, D99Y, M100N , E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, T95V, G41S and M157C.
  • the variant of the present invention does not carry a polymer molecule. In particular, it is not peggylated.
  • IFN ⁇ in vitro activity
  • the anti-viral response to doses of IFN ⁇ can be measured on different pairs of systems (virus / adherent cell line responding to IFN ⁇ and sensitive to the virus used).
  • the viruses used will be vaccinia virus or lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).
  • Herpes simplex virus (HSV) and cytomegalovirus can also be used.
  • the activity of IFN ⁇ can also be tested using a reporter gene, for example luciferase, under the control of an IFN ⁇ sensitive promoter containing GAS elements (gamma-interferon activation sites) or ISRE (interferon stimulated response element).
  • a reporter gene for example luciferase
  • GAS elements gamma-interferon activation sites
  • ISRE interferon stimulated response element
  • the reporter gene is assayed following stimulation with IFN ⁇ .
  • the pGAS / Luciferase and pISRE / Luciferase vectors are commercially available (# 219091, Stratagene).
  • the pGAS / luciferase vector method is used to measure the activity of IFN ⁇ .
  • thermostability of IFN ⁇ while maintaining its biological activity makes it possible to envisage the development of more effective treatments allowing, with equal biological activity, a reduction of the therapeutic doses used, and thus a reduction of the side effects. associated with the treatment. It also allows higher dose IFN ⁇ treatments to reduce viral infections such as herpes, as these treatments have so far been unenforceable with this type of molecule. Furthermore, the variants according to the present invention may have the advantage of having a longer half-life during the storage of these variants, and therefore a better conservation, compared to wild-type IFN ⁇ , especially at room temperature. .
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising a variant of thermostable IFN ⁇ according to the present invention.
  • the present invention preferably relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a thermostable IFN ⁇ variant or a functional fragment thereof comprising at least one selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, and T95V, the variant not carrying a non-peptide moiety attached to the residue (s) introduced by the first substitution (s).
  • the variant differs from a polypeptide having a sequence selected from SEQ ID Nos. 2, 4 and 6 by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10. residue (s), preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residue (s).
  • the variant has a single substitution.
  • the variant further comprises at least one other substitution selected from the group consisting of M157C, G41S and M100N.
  • the variant may comprise or have a combination of two substitutions selected from the group consisting of S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, M100N, L126P, N58R, T95V, M157C and G41S.
  • the variant comprises or has a combination of substitutions selected from the group consisting of S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + El 16C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + M100N, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C, E62C + L158
  • the variant comprises or has a combination of substitutions selected from the group consisting of S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + El 16C 5 S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + MlOON, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S.
  • the variant comprises or has the combination S63C + G41S.
  • the variant does not have a deletion of 1 to 11 residues at the C-terminus.
  • the variant has a deletion of 1 to 11 residues at the C-terminus.
  • the variant does not carry a non-peptide group selected from the group consisting of a polymer molecule, a lipophilic molecule, and an organic derivatization agent.
  • the variant carries a non-peptide group selected from the group consisting of a polymer molecule, a lipophilic molecule, and an organic derivatization agent.
  • the non-peptide group in question is especially a polymer molecule, preferably a polyethylene glycol.
  • the variant is glycosylated.
  • the variant may in particular be glycosylated in the N39 position by N-glycosylation when it comprises the G41S substitution.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient are well known to those skilled in the art (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990], Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard , Eds., Taylor & Francis [2000] and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
  • a pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated in various forms, in particular liquid, gel, lyophilized, powder, compressed solid, and others.
  • the present invention also relates to a variant of the thermostable IFN ⁇ according to the present invention or a composition according to the present invention as a medicament.
  • the pharmaceutical compositions of the invention are suitable or formulated for oral, parenteral (intradermal, intramuscular, intravenous, subcutaneous), sublingual, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, intraocular, intraauricular, said active ingredient being administrable in unit dosage form.
  • compositions are solutions adapted for parenteral administration.
  • parenteral formulations also include frozen or freeze-dried forms.
  • the composition will be thawed or dissolved before use.
  • lyophilization the composition will be prepared by adding a pharmaceutically acceptable diluent such as sterile water or a physiological buffer.
  • the unit dosage forms may be, for example, tablets, capsules, granule gels, powders, oral or injectable solutions or suspensions, transdermal patches (patches), sublingual, oral, intratracheal, Intraocular, intranasal, intra-auricular, inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms, rectal administration forms or implants.
  • the pharmaceutical composition is liquid.
  • Said unit forms are dosed to allow a daily administration of 0.001 to 100 ⁇ g of active ingredient per kg of body weight, according to the dosage form.
  • the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of the patient.
  • the IFN ⁇ is administered parenterally, and preferentially by subcutaneous injection.
  • a usual dose of IFN ⁇ by subcutaneous injection is between 1 and 100 ⁇ g / m 2 if the body surface area is greater than 0.5 m 2 and between 0.01 and 10 ⁇ g / kg body weight if the body surface area is less than or equal to 0.5 m 2 .
  • IFN ⁇ is the typical example of a pleiotropic cytokine with a broad spectrum of activities. Indeed, interferons (IFNs) are endowed with activities such as inhibition of viral replication, inhibition of cell multiplication and induction of apoptosis.
  • IFNs interferons
  • stimulation of macrophages by IFN ⁇ induces the following responses:
  • MHC major histocompatibility complex
  • B lymphocytes differentiate of B lymphocytes into antibody secreting plasma cells, which results in the production of type G immunoglobulin and complement activation;
  • PIFN ⁇ The action of PIFN ⁇ on T lymphocytes is to promote their differentiation thus modulating the specific immune response.
  • the main effect sought and developed in clinical phases is mainly the immunomodulatory aspect, the aspect of anti-viral therapeutic molecule being less developed to date.
  • IFN ⁇ is a molecule developed as a therapeutic agent human in the treatment of many quite varied diseases.
  • Commercial IFN ⁇ (Actimmune, and Biogamma) are used for two main therapeutic indications: chronic granulomatosis and idiopathic pulmonary fibrosis, in combination with oral prednisolone.
  • numerous new secondary therapeutic indications are currently being developed at different clinical phases (II and III), in particular for their role as immunosuppressors, for example in addition to PEGylated IFN ⁇ / ribavirin in the part of the treatment of Hepatitis C.
  • kidney cancer There may also be mentioned atypical mycobacterium infections; kidney cancer; osteopetrosis; generalized scleroderma; chronic hepatitis B virus; chronic hepatitis C virus; septic shock ; allergic dermatitis; rheumatoid arthritis; ovarian cancer; fibrosis of the liver; asthma; and lymphoma.
  • IFN ⁇ is also useful in the treatment of various viral infections, has activity against infection by human papillomaviruses, and hepatic infections with virus B and virus C.
  • the present invention relates to the use of a variant of the thermostable IFN ⁇ according to the present invention or of a pharmaceutical composition according to the present invention for the preparation of an antiviral, antiproliferative or immunomodulatory drug.
  • this medicament is intended to treat inflammatory diseases, cancers, infections, bone disorders, autoimmune diseases, etc.
  • the medicament is intended for the treatment of a pathology selected from asthma, chronic familial granulomatosis, idiopathic pulmonary fibrosis, atypical mycobacterial infection, kidney cancer, osteopetrosis, generalized scleroderma, chronic hepatitis B or C virus, septic shock, allergic dermatitis, and rheumatoid arthritis.
  • the medicament is for the treatment of a pathology selected from prurigo, neurodermatitis, type I diabetes, vascular stenosis, basal cell carcinoma, cancer or lymphoma such as ovarian cancer, kidney cancer, leukemia such as hyperproliferative disorder B or T cells, chronic myeloid leukemia and related syndromes, breast cancer, lung cancer, melanoma, colon cancer, brain cancer, pleural cancer, stomach cancer , pancreatic cancer, viral infection, e.g., hepatitis C or B virus, Crohn's disease, psoriasis, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis.
  • a pathology selected from prurigo, neurodermatitis, type I diabetes, vascular stenosis, basal cell carcinoma, cancer or lymphoma
  • ovarian cancer kidney cancer
  • leukemia such as hyperproliferative disorder B or T cells, chronic myeloid leukemia and related syndromes
  • breast cancer lung cancer, melanoma
  • thermostable variant of IFN ⁇ may be used in combination with another active ingredient, for example an active ingredient selected from an antibody, an antitumor agent or chemotherapy agent, a glucocorticoid, an antihistamine agent, an adrenocortical hormone, an antiallergic agent, a vaccine, a broncodilator, a steroid, a beta-adrenergic agent, an immunomodulatory agent, a cytokine such as interferon alpha or beta, interleukin 1 or 2, TNF ( tumor necrosis factor), hydroxyurea, alkylating agent, folic acid antagonist, nucleic acid metabolism antimetabolite, fusal poison, antibiotic, nucleotide analogue, retinoid, lipoxygenase inhibitor, and cyclooxygenase, fumaric acid and its salts, an analgesic, a spasmolytic, a calcium antagonist and a combination thereof.
  • an active ingredient selected from an antibody, an antitum
  • the additional active principle may be administered before, simultaneously with or after the administration of IFN ⁇ according to the present invention.
  • it can be administered by the same route of administration or by two separate routes of administration.
  • the present invention relates to a product comprising the thermostable variant of PIFN ⁇ or a pharmaceutical composition according to the present invention and another active ingredient, preferably selected from the above list, for a combined preparation intended for simultaneous, sequential or separated for the treatment of one of the pathologies mentioned above.
  • the combination with an antibody is useful for the treatment of cancer.
  • IFN ⁇ is able to increase the effect of antibodies by ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity).
  • the antibody is preferably directed against an antigen exposed by the cancer cells.
  • the antibody may be a polyclonal, monoclonal, humanized, or chimeric antibody.
  • the antibody is monoclonal and humanized.
  • the antigen may be CD20.
  • This antibody may be Rituximab.
  • glucocorticoid is useful for the treatment of alveolar lung diseases such as idiopathic pulmonary fibrosis.
  • suitable glucocorticoids are hydrocortisone, cortisone, dexamethasone, betamethasone, prednisolone, methyl prednisolone and their pharmaceutically acceptable salts.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the use of a combination of IFN ⁇ according to the present invention and prednisolone.
  • an antihistamine agent an adrenocortical hormone, an antiallergic agent is useful in particular for the treatment of skin diseases such as a prurigo or a neurodermatitis.
  • the combination with an antiallergic agent, a broncodilator, a steroid, a beta-adrenergic agent, an immunomodulatory agent, or a cytokine is useful in particular for the treatment of asthma.
  • the present invention further relates to a method of antiviral, antiproliferative or immunomodulatory treatment in a patient in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of a thermostable IFN ⁇ variant or a pharmaceutical composition according to the present invention. to the patient.
  • the method of treatment is intended for the treatment of a pathology mentioned above.
  • the method may further comprise the administration of another active ingredient, preferably selected from those mentioned above.
  • An effective therapeutic amount is the amount necessary to decrease or suppress the symptoms of the disease or to cure or slow the progression of the disease.
  • the patient is preferably a human.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a thermostable variant of human PIFN ⁇ according to the present invention.
  • the present invention also relates to a cassette for expressing a nucleic acid according to the present invention. It also relates to a vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the present invention.
  • the vector may be selected from a plasmid and a viral vector.
  • the nucleic acid can be DNA (cDNA or gDNA), RNA, a mixture of both. It can be in simple chain or duplex form or a mixture of both. It can comprise modified nucleotides, comprising, for example, a modified linkage, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar. It can be prepared by any method known to those skilled in the art, including chemical synthesis, recombination, mutagenesis, etc.
  • the expression cassette comprises all the elements necessary for the expression of the thermostable variant of human IFN ⁇ according to the present invention, in particular the elements necessary for transcription and translation in the host cell.
  • the host cell may be prokaryotic or eukaryotic.
  • the expression cassette comprises a promoter and a terminator, optionally an amplifier.
  • the promoter may be prokaryotic or eukaryotic. Examples of preferred prokaryotic promoters are: LacI, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, T3 or T7 bacteriophage RNA polymerase promoters, polyhedrin promoter, phage lambda PR or PL promoter.
  • eukaryotic promoters examples include: early CMV promoter, HSV thymidine kinase promoter, SV40 early or late promoter, mouse L-metallothionein promoter, and LTR regions of some retroviruses.
  • a suitable promoter the skilled person can advantageously refer to the work of Sambrook et al. (1989) or the techniques described by Fuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biology.
  • the present invention relates to a vector carrying a nucleic acid or an expression cassette encoding a thermostable variant of human IFN ⁇ according to the present invention.
  • the vector is preferably an expression vector, i.e. it comprises the elements necessary for the expression of the variant in the host cell.
  • the host cell may be a prokaryote, for example E. coli, or a eukaryotic.
  • the eukaryote may be a lower eukaryote such as a yeast (for example, S cerevisiae) or a fungus (for example of the genus Aspergillus) or a higher eukaryote such as an insect cell (Sf9 or Sf21 for example), mammalian or plant.
  • the cell may be a mammalian cell, for example COS (green monkey cell line) (e.g., COS 1 (ATCC CRL-1650), COS7 (ATCC CRL-1651), CHO (US 4,889,803; US 5,047,335, CHO- Kl (ATCC CCL-61)), mouse cells and human cells.
  • COS green monkey cell line
  • the vector may be a plasmid, a phage, a phagemid, a cosmid, a virus, a YAC, a BAC, an Agrohacterium pTi plasmid, etc.
  • the vector may preferably comprise one or more elements selected from an origin of replication, a multiple cloning site and a selection gene.
  • the vector is a plasmid
  • prokaryotic vectors are the following: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pCO4, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3 5 pDR540, pBR322, and pRIT5 (Pharmaci a), pET (Novagen).
  • Non-exhaustive examples of eukaryotic vectors are: pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); and pQE- (QLAexpress).
  • the viral vectors may be non-exhaustively adeno viruses, AAVs, HSVs, lentiviruses, etc.
  • the expression vector is a plasmid or a viral vector.
  • the IFN ⁇ coding sequence according to the present invention may comprise or not comprise the signal peptide.
  • a methionine may be optionally added at the N-terminus.
  • a heterologous signal peptide can be introduced.
  • This heterologous signal peptide can be derived from a prokaryote such as E. coli or from a eukaryotic, especially a mammalian, insect or yeast cell.
  • the present invention relates to the use of a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention to transform or transfect a cell.
  • the present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding a thermostable variant of human IFN ⁇ and its use for producing a thermostable variant of recombinant human IFN ⁇ according to the present invention.
  • the term "host cell” encompasses the daughter cells resulting from the culture or growth of this cell. In a particular embodiment, the cell is non-human and non-embryonic.
  • thermostable variant of recombinant human IFN ⁇ comprising the transformation or transfection of a cell with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the thermostable variant of human IFN ⁇ produced by the cell.
  • the method for producing a thermostable variant of recombinant human IFN ⁇ according to the present invention comprising providing a cell comprising a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the thermostable variant of human PIFN ⁇ produced by the cell.
  • the cell may be transformed / transfected transiently or stably by the nucleic acid encoding the variant.
  • This nucleic acid may be contained in the cell as an episome or in a chromosomal form.
  • Methods of producing recombinant proteins are well known to those skilled in the art. For example, the specific modes described in US 5,004,689, EP 446,582, Wang et al. (Sci Sin B 24: 1076-1084, 1994 and Nature 295, page 503) for production in E. coli, and JAMES et al. (Protein Science (1996), 5: 331-340) for mammalian cell production.
  • the present invention may also relate to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding a thermostable IFN ⁇ variant according to the present invention, an expression cassette, a vector or a host cell according to the present invention, its use for the preparation of a medicine, in particular for treating the diseases mentioned above. It also relates to a method of treating a patient in need thereof comprising administering such a composition in a therapeutically effective amount.
  • thermostable protein variants called THR and described in the French patent application number 0505935.
  • This method is based on the preparation of fusion protein between human PIFN ⁇ variants and a variant of a kanamycin resistance protein with increased thermostability (This double mutant of kanamycin nucleotidyl transferase is described in Liao, Enzyme Microb Technol., 1993, 15, 286-92).
  • the human IFN ⁇ variant library was prepared by the Massive Mutagenesis® method described in FR2813314, and was transformed at high temperature into Thermus thermophilus strain HB27. The transforming clones of this library were selected at increasing concentrations of kanamycin for which the production of the IFN ⁇ (wild) -KNTase fusion no longer allows the cells to grow.
  • Variants of human IFN ⁇ selected by our selection method or systematically generated on all PIFN ⁇ positions were transiently expressed in COS7 animal cells. These proteins are secreted in the culture supernatant. In order to evaluate the stability and the conservation of the activity of these variants, the COS7 cell culture supernatants were subjected to thermal denaturation (10 minutes at 59 ° C.). These proteins (denatured or otherwise) were then activated on transfected HeLa cells containing luciferase as the reporter gene. After 16 hours of stimulation, for each mutant and for each condition, we measured the signal of flrefly luciferase corresponding to the activity of PIFN ⁇ tested.
  • the basal activity of the undenatured variant was also compared to that of the non-mutated IFN ⁇ .
  • THR system The vector that was used included the origins of replication of E. coli and T. Thermophilus, an ampicillin resistance gene that allows for the selection of transformants in E. coli, a gene encoding the thermostable KNTase under control. a promoter active in both E. coli and T. thermophilus (pslpA promoter). See Figure 1. The nucleotide sequence of IFN ⁇ (encoding the mature 146 amino acid SEQ ID NO: 5) was cloned between the NcoI and NotI sites of the N-terminal vector of KNTase.
  • linker a linker peptide which presented the peptide sequence AAAGSSGSI (SEQ ID No. 8) and was encoded by the GCG-GCC-nucleic sequence
  • Eukaryotic expression system For the expression of IFN ⁇ in mammalian cells, we used pORP / IFN ⁇ (Invivogen) in which PIFN ⁇ is cloned into an expression cassette containing the hybrid promoter (EF-l ⁇ -HLTV ) and the strong polyadenylation signal of SV40.
  • thermostable mutants described in the bibliography were constructed and used as positive controls. They encode for:
  • the delta IFN ⁇ protein (C-terminal end of the deleted protein of these last 10 amino acids activated and improved stability, TM + 7.5 ° C and antiviral activity multiplied by 4, Slodowski et al., 1991).
  • mutants are generated at the level of the pNCK-IFN ⁇ and PORF-IFN ⁇ matrices by the Massive Mutagenesis® method described in FR2813314.
  • thermostable mutants by the THR method
  • a library of IFN ⁇ variants cloned into the pNCK vector was generated using Massive Mutagenesis®. Total diversity has been introduced in all positions (from 21 to 166). The library was then transformed at high temperature (70 ° C.) in Thermus thermophilus strain HB27 and selected at 20 or 40 ⁇ g / ml of kanamycin (conditions where the IFN ⁇ (wild) -KNTase fusion no longer allows the cell to push). Mutations identified after sequencing on clones growing on selective medium are listed in Table 1. The different mutants from this primary selection were then uniaxtransformed and their level of resistance was compared to that of the wild-type construct. 21 mutants, giving the strain resistance more or less important but still superior to the wild were thus confirmed (Table 2).
  • HeLa cells (human cervix epitheloid carcinoma cells), COS-7 cells (African green monkey SV40 transformed kidney cells) and CHO cells (Chinese Hamster Ovary) were cultured under standard culture conditions (37 ° C. in the atmosphere).
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium Medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • COS7 cells In order to perform transfections of COS7 cells by native or mutated pORF / IFN ⁇ constructs, these cells were trypsinized when they reached 90% confluency. COS7 cells were re-seeded at a ratio of 1 A (that is to say so that they represent, once adhered on the surface, a confluence of about 25%). Transfection of COS7 cells was performed in a 24-well plate with seeding of 30,000 to 60,000 cells per well when the cells reached 70-80% confluency. Transfection was performed with approximately 50ng of DNA and Jet PEI (Polyplus transfection) using a PEI / DNA Jet ratio of 5 leaving 30 minutes at room temperature.
  • Jet PEI Polyplus transfection
  • the reference ELISA kit for determining the total amount of IFN ⁇ is from Clinisciences (# 88-7316-86). We verified that the antibodies used in this
  • IFN ⁇ specifically activates the IFN ⁇ receptors present on HeLa cells.
  • the stimulation of the Jak / Statl pathway of HeLa cells by IFN ⁇ is carried out with, in particular, the consequence of which is the activation of the transcription of genes under the control of promoters possessing GAS sequences. for "Gamma Activated Site”. It is then possible to measure and compare the activities of IFN ⁇ variants by transfecting in HeLa cells a reporter gene system in which luciferase (firefly luciferase) is downstream of a promoter possessing several GAS sites (plasmid pGAS Stratagene Luciferase).
  • TM Promega
  • the lysis was carried out for 10 min with stirring at room temperature so as to release the luciferase produced in response to the specific stimulation of IFN ⁇ .
  • Measurement of activity was initiated by the addition of Bright GIo TM reagent (Promega) and the amount of accumulated luciferase was then counted with a luminometer (FLX 800, Bio-Tek Instrument). The crude activity in IFN ⁇ is expressed in RLU for "relative luciferase unit".
  • the calculation of the total activity (relative to the wild-type protein) of each variant (undenatured) is an average carried out on the basis of results obtained on 5 different manipulations (at least duplicates) and on culture supernatants coming from minimum of two independent transfections.
  • the error bars presented are calculated by the standard error formula on the average (sem).
  • One way to present the total activity results is to report the baseline activity of each variant as a percentage of the baseline activity of the non-mutated IFN ⁇ expressed under the same conditions for each transfection.
  • the amount of luciferase was measured after stimulation of the cells with 10 ⁇ l of supernatants of COS7 cells diluted to 1 / 100th containing IFN ⁇ which, depending on the case, were submitted. at a heat treatment of 10 minutes at 59 ° C or have not been treated.
  • One of the ways to present the fraction of activity of each conserved variant after thermal denaturation is to calculate the conserved residual activity of each variant defined by the percentage of the basal activity of the same variant before denaturation.
  • the calculation of the residual activity with respect to a total activity determined before denaturation is an average carried out on the basis of results obtained on 5 different manipulations (at least duplicates) and on culture supernatants coming, at least, from two independent transfections. .
  • the error bars presented are calculated on the standard error formula on the mean (s.e.m).
  • This half-life was obtained by controlling particularly all the following parameters: the same initial concentration of IFN ⁇ of 1000 g / ml, a concentration of serum SVF in the final sample to be denatured equivalent and adjusted to 0.15% and a temperature denaturation of 59 0 C for 30 minutes with sampling every 10 minutes.
  • the IFN ⁇ concentrations of the CHO cell supernatants were estimated by ELISA. These different lots of IFN ⁇ variants were then diluted to 1000 ⁇ g / ml in 0.15% IMDM SVF medium. These dilutions were then aliquoted to undergo thermal denaturation pretreatment at 59 ° C for 0, 10 and 30 minutes.
  • One of the ways of presenting the data is to postpone the gross activity corresponding to the specific stimulation of the transduction pathway by variant IFN ⁇ , a crude activity then expressed in RLU for "relative luciferase unit”.
  • Another way to present the fraction of activity conserved after thermal denaturation (also called residual activity) of each variant is to calculate, for each denaturation time, the residual percentage of activity retained relative to the basal activity of the even varying before denaturation. These calculations are done after subtraction of the signal share due to untransfected cells.
  • T 1/2 The half-lives of each variant thus determined are then compared with that of wild-type IFN ⁇ .
  • a (t) is the IFN gamma activity at time tps t and b is a constant.
  • thermostable variants of IFN ⁇ the biological half-life or terminal elimination half-life (hereinafter referred to as "half-life in vivo"), as well as the areas under the curve for different modes of administration (intravenous (iv) or subcutaneous (sc) injection).
  • iv biological half-life or terminal elimination half-life
  • sc subcutaneous injection
  • the measurement of the elimination half-life can be realized in multiple ways:
  • the half-life is then estimated by an anti-viral activity test directly on the murine sera (Hep-2 cells infected with a virus (vesicular stomatitis virus or VVS).
  • a virus vesicular stomatitis virus or VVS.
  • the ELISA is used as an alternative for detecting IFN ⁇ levels in murine serum.
  • Another way described in Croos and Roberts is to carry out experiments with radiolabelled isotope-labeled IFN ⁇ and to monitor the absorption of this labeled molecule in tissues and tissues. its passage into the serum of female Sprague-Dawley rats after subcutaneous injection. The tissue and blood samples are then analyzed for the amount of labeled IFN ⁇ they contain.
  • the use of ELISA method for determining the pharmacokinetic parameters of IFN has been described for IFN alpha by subcutaneous administration by Rostaing et al. (1998), J. Am. Soc. Nephrol.9 (12): 2344-48 and by intramuscular administration by Merimsky et al (1991) Cancer Chemother. Pharmacol. 27 (5).]
  • Wild-type IFN ⁇ and mutants were expressed from COS and CHO cells. These culture supernatants were centrifuged a second time at 4000 RPM, 10 min, and filtered through Millipore filter PES 0.22 .mu.m. The volumes of the filtered supernatants are then concentrated by centrifugation on Vivaspin filtration units with a cutoff of 5000 daltons (Sartorius). The IFN ⁇ concentrations are then estimated for these samples by applying the appropriate prior dilutions. The wild-type and variant IFN ⁇ lots are administered according to two modes:
  • mice 8 week old C57BL / 6J mice with an average weight between 20 and 30 grams are used. These animals are acclimatized one week in a room under a constant temperature of 24.1 0 C, a constant humidity of 55% and with rest / sleep cycles of 12h.
  • mice blood samples are collected at the following different times after administration of the molecule of interest. Retro-orbital samples are taken for the 3h, 6h, 24h, 48h, 72h, 96h, 12h, 144h, 168h, 192h and cardiac post-mortem samples for the final time at 216 hours.
  • the serum is prepared by allowing the blood to coagulate for 20 minutes at room temperature and recovering the fraction corresponding to the supernatant from a centrifugation at 5000 g, 20 min at 20 ° C.
  • the serum is then isolated and stored at -80 ° C until the activity of IFN ⁇ is measured using the ELISA assay described above.
  • the plasma concentration of IFN ⁇ is then evaluated over time by monitoring the amount of IFN ⁇ detected by ELISA in each mouse serum. For each sample taken in retro-orbital, the quantification of IFN ⁇ obtained results from the average of at least 3 different sera from 3 mice. These different pharmacokinetic experiments were reproduced for each variant at least twice from IFN ⁇ lots from different transfections. Finally, the concentration of IFN ⁇ in the serum is reported over time.
  • Another parameter described in Tables 4 and 5 are the ratio of improvement of the half-life or the area under the curve of each of the mutants with respect to the respective parameters of the unmutated wild-type molecule produced under the same conditions and relative to the respective parameters of bacterial recombinant human IFN ⁇ when data are available. The higher these ratios, the greater the improvement of the variant compared to that of the non-mutated human IFN ⁇ .
  • mutations S63C, G41S as well as their combination result in a marked improvement in the in vivo half-life of these variants compared to that of the recombinant human IFN ⁇ produced in CHO and that of recombinant human IFN ⁇ produced in vitro. bacterium. After subcutaneous administration, the double mutant still shows a marked improvement in these pharmacokinetic parameters compared to recombinant human IFN ⁇ produced in CHO.

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Abstract

La présente invention concerne des variants de l'interféron gamma humain présentant une thermostabilité améliorée, un acide nucléique codant pour celles-ci, une composition pharmaceutique les comprenant, ainsi que leur utilisation pour le traitement d'infection virale, et de cancer.

Description

VARIANTS AMELIORES DE L'INTERFERON- GAMMA HUMAIN QFNy)
Introduction
La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines. Elle porte sur l'amélioration de l'interféron γ humain (IFNγ), ainsi que des compositions comprenant un IFNγ amélioré, un acide nucléique codant celui-ci, et leurs utilisations.
L'IFNγ est une cytokine de 166 acides aminés. La molécule possède un peptide signal permettant sa translocation membranaire et sa sécrétion, un site de clivage et une partie dite protéine mature. Le peptide signal de l'IFNγ est constitué des 23 premiers ou des 20 premiers acides aminés selon les auteurs. En effet, il existe un doute dans la littérature sur la présence du triplet d'acides aminés Cys-Tyr-Cys (CYC) en N-terminal de la séquence mature. L'IFNγ existe sous forme d'un homodimère dans lequel les deux sous unités ne sont pas liées covalemment. Chaque sous-unité possède deux sites de N- glycosylation (positions 48 et 120 du précurseur de 166 aa). On notera, si les CYC ne sont pas inclus, l'absence de ponts disulfures et de cystéines sur la protéine mature in vivo. Chacun de ces monomères possèdent six hélices alpha avec une partie compacte constituée des 4 premières hélices alpha les plus N-terminales (hélices alpha A, B, C, et D) et une partie C-terminale composée de deux hélices alpha isolées et étroitement en interaction avec le second monomère d'IFNγ.
L'IFNγ est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités. En effet, les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la réplication virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de l'apoptose.
Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNγ induit les réponses suivantes :
- l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs anti-microbiens et anti-tumoraux) ;
- la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes, expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la surface des macrophages ; - la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, ce qui a pour conséquence la production d'IgG et l'activation du complément ;
- l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou
- l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN endogène. L'action de l'IFNγ sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation modulant ainsi la réponse immunitaire spécifique.
En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice), l'IFNγ est une molécule développée comme agent thérapeutique humain dans le traitement de nombreuses maladies, de natures variées. Les IFNγ commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont aujourd'hui utilisés pour deux indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale. De nombreuses nouvelles indications thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à différentes phases cliniques, en particulier pour leur rôle d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNα pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi : infections à mycobactérie atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B ; hépatite chronique à virus C ; différentes infections virales dont à papillomavirus ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite rhumatoïde ; cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome.
Les principaux effets indésirables des IFNs sont dose-dépendants et donc étroitement liés au rythme d'administration. Ces effets sont cumulatifs et s'aggravent avec le temps. Outre la toxicité aiguë entraînant après injection (2 à 8 heures après injection sous cutanée) malaises, nausées et vomissements, les effets indésirables les plus fréquents sont les symptômes pseudo-grippaux (frissons, céphalées, asthénie), les réactions inflammatoires au site d'injection et l'élévation des transaminases du foie. Les effets indésirables les plus sérieux sont des cas de dépressions, lymphopénies ou de rares cas de nécrose au site d'injection sous-cutanés. Chez des malades traités avec de fortes doses d'IFN, un diabète peut survenir après le début du traitement. En outre, la tolérance de l'injection d'IFN est parfois limitée dans le temps et se traduit par le développement d'anticorps neutralisants (chez approximativement 10-20% des patients).
La demi-vie de l'IFNγ humain recombinant in vivo est de 25-35 min seulement. Pour cette raison, un traitement efficace avec PIFNγ implique des injections fréquentes. Dès 1990, et l'utilisation de l'IFNγ humain recombinant commercialisé sous le nom d'Actimmune (Intermune inc), le besoin d'améliorer la demi-vie de l'IFNγ s'est fait ressentir, d'autant plus que de tous les interférons la stabilité thermique de l'IFNγ est la plus faible. Un IFNγ plus stable permettrait en effet une fréquence d'administration moins importante, ce qui améliorerait le confort du patient. Un IFNγ plus stable permettrait également un meilleur effet in vivo, puisque l'effet in vivo est la conséquence de la combinaison entre l'activité spécifique de la protéine et sa durée d'action. Les intérêts économiques à améliorer la stabilité de PIFNγ sont donc clairs : une molécule plus stable (soit parce qu'il s'agit d'un variant, soit parce que des additifs sont ajoutés à la molécule, soit parce que la formulation est améliorée, etc..) pourra permettre d'obtenir des médicaments de seconde génération, susceptibles de remplacer les molécules actuellement sur le marché. On peut même considérer qu'un IFNγ plus stable permettrait d'étendre les indications de cette molécule : En effet, dans le cas d'un certain nombre de pathologies, les IFNα et β, entre autres molécules, ont constitué le traitement de référence. L'IFNγ n'a pas été retenu en raison de sa durée de vie trop courte. Enfin, à plus long terme, on peut espérer qu'un IFNγ stabilisé puisse permettre des formulations différentes d'administration de la molécule (forme orale notamment).
De nombreux travaux de recherche ont déjà été menés sur l'IFNγ :
Variants naturels de l'IFNγ
Plusieurs formes mutées naturelles ont été décrites. L'une de ces formes est celle incluant la séquence N-terminale CYC. Deux variants naturels de l'IFNγ humain présentant une mutation ponctuelle ont également été décrits K29Q et Rl 6OQ (Nishi et al. (J. Biochem. 97:153-159, 1985). Mais ces polymorphismes ne sont associés pour l'instant à aucun effet. Mutants artificiels de l'IFNγ
US 4,832,959 contient des polypeptides avec des séquences partielles de l'IFNγ humain comprenant les résidus 1-127, 5-146 et 5-127 de l'IFNγ mature et possédant les 3 acides aminés additionnels CYC.
US 6,120,762 décrit un fragment peptidique comprenant les résidus 118-157 de PIFNγ précurseur et son utilisation.
WO2004005341 décrit les méthodes pour générer et produire une série de mutants actifs de PIFNγ comprenant les 143 acides aminés de la forme mature de l'IFNγ sans CYC avec une variation comprenant au moins une des mutations dans le groupe S 155 et S 165 et au moins une mutation dans le groupe Rl 60, Rl 62 et Rl 63. Ces mutants seraient utiles notamment dans le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique.
De nombreuses formes tronquées à divers endroits de la région C-terminale de l'IFNγ ont été décrites. EP 0 219 781 décrit l'utilisation de séquences partielles d'IFNγ humain comprenant les acides aminés 3-124 de la protéine mature. L'importance des 20 derniers acides aminés sur l'activité et la stabilité de l'IFNγ a constitué et constitue encore une source d'études controversées. Des IFNγ humains avec l'extrémité C- terminale tronquée ont été décrits par Slodowski et al qui ont réalisé des troncatures de taille différente (de 10 à 20 acides aminés tronqués) (Eur. J. Biochem. 202:1133-1140, 1991).
Dans le brevet EP 0 306870, des variants de l'IFNγ ont été générés avec une activité qui est significativement augmentée en coupant de 7 à 11 résidus C-terminaux. De plus, il est connu que, lorsque l'IFNγ est produit en cellules de mammifères, une population hétérogène de polypeptide IFNγ est obtenue à cause de troncatures naturelles par des activités d'endo- et d'exo- protéases sécrétées par la cellule hôte productrice. L'une des façons de résoudre ce problème de production est décrit dans le brevet US 6,958,388 : cela consiste à produire un IFNγ tronqué contenant les 155 premiers acides aminés de la protéine totale associée par exemple aux mutations améliorant la glycosylation de la molécule (S122T, E61N+S63T). WO 2004/022593 analyse in silico des séquences de nombreuses protéines à visée thérapeutique, y compris PIFNγ, pour l'existence de sites de protéolyse sensibles à des protéases présentes dans le sérum humain (telles que la trypsine, l'endoprotéinase Asp- N, la chymotrypsine et la proline endopeptidase). Les mutations censées apporter une protection contre les protéases citées sont les suivantes : L53V, L53I, K57Q, K57N, K60Q, K60N, E61Q, E61N, E61H, E62Q, E62N, E62H, K78Q, K78N, K81Q, K81N, K84Q, K84N, D85Q, D85N, D86Q.
Les améliorations (activité ou stabilité) susceptibles d'être apportées par ces mutations n'ont à ce jour pas été vérifiées expérimentalement pour aucun de ces mutants : il ne s'agit donc ici que de théories scientifiques.
Mutants de l'IFNγ avec une amélioration de la thermostabilité
On sait que l'IFNγ (sous forme monomérique en particulier) est peu stable. Cela se traduit par une sensibilité importante de la protéine dite sauvage à deux critères : pH acide et température. Il est attendu que la stabilité accrue de mutants dans ces conditions non physiologiques sera associée au même gain de stabilité dans les conditions physiologiques. Des travaux ont ainsi porté sur la recherche de mutants ayant en premier lieu gagné en thermostabilité, ce paramètre étant le plus simple à mesurer.
WO 92/08737 décrit des variants de PIFNγ comprenant une méthionine additionnelle en N-terminal en position -1, les 132 premiers acides aminés de la séquence mature sans CYC, le 133ème acide aminé étant une leucine au lieu d'une glutamine. Ce variant, tronqué des 10 acides aminés C-terminaux de l'IFNγ, est appelé Delta 10 L ou encore ClOL. Il aurait une activité biologique améliorée et présente une stabilité à la température légèrement améliorée (tm 55°C) comparée à l'IFNγ sauvage (tm = 52- 53°C).
US 4,898,931 décrit une série de mutants de l'IFNγ produit chez E.coli avec des troncatures des 9 derniers résidus C-terminaux couplées aux mutations de certains acides aminés N- et C-terminaux. Ces mutations introduisent des ponts disulfures qui confèrent alors à ces molécules des propriétés thermostables tout en conservant une activité anti-virale et anti-tumorale. Dans ce brevet, les acides aminés CYC font partie de la protéine mature et des variants des cystéines de ce triplet ont été réalisés. Sauvage (séquence totale) 25% d'activité résiduelle après 1 h à 50°C
Mutation Ml 57C + Delta 9 81% d'activité résiduelle après 1 h à 50°C
Mutation C21S-M157C et Delta 9 86% d'activité résiduelle après 1 h à 50°C
Mutation C23S-M157C et Delta 9 98% d'activité résiduelle après 1 h à 50°C
Mutation C21S-C23S-M157C et Delta 9 23% d'activité résiduelle après 1 h à 50°C
US 6,046,034 décrit des variants thermostables de l'IFNγ humain pour lesquels des paires de cystéines ont été incorporées à des endroits précis de la structure de l'IFNγ de façon à créer des ponts disulfures inter-monomère et intra-monomère et ainsi assurer la stabilisation de l'homodimère d'IFNγ. La seule paire de cystéines qui permet la conservation de l'activité biologique de l'IFNγ est E30C-S92C qui relie les hélices A et D d'un même monomère, les autres paires de cystéines inter-monomère détruisant l'activité biologique de l'IFNγ. Dans ce brevet, ces mutants possèdent aussi une extrémité C-terminale tronquée correspondant au mutant Delta 10.
La modification de l'IFNγ par ajout de polymères a été reportée par Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990), et dans les brevets EP 236987 et US 5,109,120.).
WO 99/03887 décrit des variants de protéines de la super-famille structurale de l'hormone de croissance (dont fait partie l'IFNγ). Dans ce brevet, certains résidus non essentiels de la structure peptidique sont remplacés par une cystéine : l'IFNγ y est décrit comme exemple de cette super-famille mais aucun exemple expérimental de modifications n'est décrit dans le cas de l'IFNγ.
WO 01/36001 décrit de nouvelles molécules d'IFNγ modifiées par insertions de sites de glycosylations et/ou de dérivation par des entités type PEG. Ces molécules ont des propriétés améliorées telles qu'une demi-vie améliorée et/ou une bio-disponibilité améliorée.
WO03002152 décrit une composition pharmaceutique contenant un dérivé sulfoalkyl éther cyclodextrine d'interféron, dont la stabilité serait améliorée. Aucun de ces variants n'est pour l'instant disponible sous forme de médicament. C'est pour cette raison qu'il existe toujours une forte demande pour un IFNγ amélioré, et notamment un IFNγ présentant une meilleure stabilité dans les conditions physiologiques. Ce gain de stabilité en conditions physiologiques peut être évalué par un gain de stabilité à haute température.
Résumé de l'invention
La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
En particulier, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V, le variant ne portant pas de groupement non-peptidique attaché sur le(s) résidu(s) introduit(s) par la ou les premières substitution(s). Dans un mode de réalisation, le variant diffère d'un polypeptide présentant une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s), de préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s). Dans un mode de réalisation particulier, le variant présente une unique substitution. Dans un autre mode de réalisation, le variant comprend en outre au moins une autre substitution sélectionnée parmi le groupe constitué de M157C, G41S et M100N. Notamment, le variant peut comprendre ou présenter une combinaison de deux substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, El 16C5 L158C, S74G, R162C, S122D, MlOON, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S. Dans un mode de réalisation préféré, le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + MlOON, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + El 16C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + MlOON, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C + E116C, F159C + L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C + MlOON, F159C + L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C + G41S, D99Y + E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y + S122D, D99Y + MlOON, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y + M157C, D99Y + G41S, E116C + L158C, E116C + S74G, E116C + R162C, E116C + S122D, E116C + MlOON, E116C + L126P, E116C + N58R, E116C + T95V, E116C + M157C, E116C + G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C + M100N, L158C + L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C + G41S, S74G + R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S74G + N58R, S74G + T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C + M100N, R162C + L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C + G41S, S122D + L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D + M100N, S122D + G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P + M100N, L126P + G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R + G41S, T95V + M157C, T95V + M100N, T95V + G41S, M157C + MlOON et M157C + G41S. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S. Dans le mode de réalisation tout particulièrement préféré, le variant comprend ou présente la combinaison S63C + G41S. Dans un mode de réalisation particulier, le variant ne présente pas de délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant présente une délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale. Dans un mode de réalisation particulier, le variant ne porte pas de groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de dérivatisation. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant porte un groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de dérivatisation. Le groupement non-peptidique considéré est tout particulièrement une molécule polymère, de préférence un polyéthylène glycol. Dans un mode de réalisation particulier, le variant est glycosylé. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant n'est pas glycosylé. Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprend en outre au moins un autre principe actif. L' au moins un autre principe actif est de préférence sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, et un antagoniste du calcium. Dans un mode de réalisation préféré, l'au moins un autre principe actif est un interféron de type I, notamment un interféron alpha ou béta. La composition pharmaceutique peut être formulée pour une administration orale, parentérale (par exemple sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, ou intradermique), sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, ou intra- auriculaire.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique selon la présente invention en tant que médicament.
La présente invention concerne un produit comprenant une composition pharmaceutique selon la présente invention et un autre principe actif pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée en tant que médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. De préférence, l'autre principe actif est sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, et un antagoniste du calcium. Dans un mode de réalisation préféré, l'autre principe actif est un interféron de type I, notamment un interféron alpha ou béta. Les deux principes actifs peuvent être administrés par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes. Dans un mode de réalisation particulier, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde.
La présente invention concerne en outre l'utilisation d'une composition pharmaceutique selon la présente invention pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. Dans un mode de réalisation préféré, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde.
La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFNγ tel que décrit dans les compositions ci-dessus. Elle concerne également une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention, et une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention. Elle concerne enfin l'utilisation d'un tel acide nucléique, d'une telle cassette d'expression, d'un tel vecteur ou d'une telle cellule hôte pour produire un variant thermostable de l'IFNγ tel que décrit dans les compositions ci- dessus.
Brève description des figures et tableaux
Figure 1 : Schéma du vecteur pNCK utilisé pour la génération des banques de mutants et leur sélection dans Thermus thermophiîus. Figure 2 : Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNγ sélectionnés par Thermus thermophilus - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 3 : Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNγ issus des positions doubles et multiples sélectionnées par Thermus thermophilus - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C). Figure 4 : lere partie des résultats d'analyse fonctionnelle des simples mutants ponctuels de l'IFNγ générés de façon systématique et ayant été améliorés pour leur stabilité et/ou leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 5 : 2eme partie des résultats d'analyse fonctionnelle des simples mutants ponctuels de l'IFNγ générés de façon systématique et ayant été améliorés pour leur stabilité et/ou leur activité — Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 6 : 3eme partie des résultats d'analyse fonctionnelle des simples mutants ponctuels de l'IFNγ générés de façon systématique et ayant été améliorés pour leur stabilité et/ou leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 7 : Evaluation de la thermostabilité des variants protéiques de PIFNγ humain par mesure de leur demi-vie in vitro lors d'une cinétique de dénaturation thermique à 59°C en présence d'une concentration de SVF ajustée. Ces mesures consistent au suivi en fonction du temps de dénaturation à 59°C de la conservation de l'activité de PIFNγ. Ces données nous permettent de calculer la « demi-vie in vitro » de ces molécules dans ces conditions. Ces calculs de demi vie sont répertoriés dans le tableau N°3. Figure 8 : Pharmacocinétique de variants thermostables de l'IFNγ humain après administration par voie intraveineuse. Le suivi de la quantité d'IFNγ est réalisé par un test ELISA sur des prélèvements de sérum de souris C57BL/6 après injection intraveineuse de 100 μl à 10 μg/ml.
Figure 9 : Exemple de pharmacocinétique de variants thermostables de PIFNγ humain après administration par voie sous-cutanée. Le suivi de la concentration plasmatique en IFNγ gamma est réalisé par quantification ELISA sur des prélèvements de sérum de souris C57BL/6 après injection en sous-cutané de 100 μl à 6,7 μg/ml. Tableau 1 : Mutants issus de la sélection primaire de la banque de PIFNγ dans Thermus thermophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du précurseur de 166 résidus.
Tableau 2 : Mutants validés en test de sélection secondaire dans Thermus thermophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du précurseur de 166 résidus.
Tableau 3 : Récapitulatif des calculs de demi- vie « in vitro » des variants thermostables de l'IFNγ lors des expériences d'inactivation thermique à 59°C et calcul du ratio d'amélioration des demi-vies des variants par rapport à la demi- vie de l'IFNγ sauvage produit en CHO.
Tableau 4 : Récapitulatif de calculs de demi- vie terminale d'élimination des variants thermostables de IFNγ lors des expériences d'injection par voie intraveineuse et calcul du ratio d'amélioration des demi-vies des variants par rapport à la demi-vie de IFNγ sauvage produit en CHO. Les demi-vies terminales d'élimination (Tl/2i.v) ont été calculées à l'aide du logiciel Kinetica Vs 4.4 en modélisant l'administration par IV bolus dans un système non compartimenté.
Tableau 5 : Récapitulatif des calculs de l'aire totale sous la courbe (AUC tôt. s.c) et des demi-vies d'élimination (Tl/2. s.c) lors des expériences d'injection par voie sous- cutanée. Calcul des ratios d'amélioration respectif de l'aire totale sous la courbe et des demi-vies des variants par rapport à l'aire totale sous la courbe et la demi-vie de IFNγ sauvage produit en CHO. Ces paramètres ont été calculés à l'aide du logiciel Kinetica Vs 4.4. Description détaillée de l'invention
La présente invention concerne des variants de l'interféron gamma humain (IFNγ) dont la stabilité, en particulier la stabilité thermique, est accrue par rapport à l'IFNγ sauvage. Les variants protéiques de PIFNγ de cette invention ont été obtenus en couplant la génération d'une grande diversité de mutations par évolution dirigée à une méthode de sélection directe des variants améliorées pour leur thermostabilité. La stabilité face à la dénaturation thermique des candidats améliorés ainsi que la conservation de leur activité a été validée par des tests biologiques. Les variants de cette invention constituent des alternatives aux IFNγ recombinants actuellement utilisés dans le domaine thérapeutique, notamment dans les traitements de la granulomatose chronique et de la fibrose pulmonaire idiopathique.
Compte-tenu des doutes résidants sur la présence des acides aminés CYC en N-terminal de la protéine mature de l'IFNγ, et de ce fait sur la numération correspondant aux acides aminés de la protéine mature, la numérotation adoptée dans la présente demande sera celle qui tient compte de l'ensemble des résidus de l'IFNγ avec la séquence du peptide signal incluse (numérotation en acides aminés totaux de 1 pour la méthionine N- terminale peptide signal inclus à 166 pour la glutamine de l'extrémité C-terminale de l'interféron - la séquence SEQ ID No 2). La position de la substitution dans les deux autres formes (mature sans CYC, SEQ ID No 4, ou avec CYC, SEQ ID No 6) pourra facilement être déterminée par l'homme du métier.
La terminologie utilisée pour désigner une substitution est la suivante. C21G indique la substitution du résidu cystéine en position 21 de la SEQ ID No 2 par une glycine. Les termes « substitution » et « mutation » sont interchangeables. Le signe « + » indique une combinaison de deux substitutions.
La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution décrite dans le tableau 1, le tableau 2 et les figures 2 à 9. La présente invention concerne de préférence un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi un des groupes consistant en :
(a) C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, S23C, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, L53I, G54Q, G54S, G54T, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Q69F, Q69T, V73I, S74G, Y76D, K78Q, L79V, F80V, K81I, D86C, D86Q, D86H, D86I, D86V, Q87I, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F, I96L, K97I, K97R, E98K, D99N, D99C, D99Q, D99E, D99I, D99M, D99S, D99T, D99W, D99Y, D99V, MlOOI, M100V, MlOON3 N101G, N101H, N101F, NlOlV, K103R, N106D, N106Q, N106G, S107C, S107G, S107E, K109C, K109Q, K109L, K110H, D113S, E116C, E116Q, E116H, El 161, El 16V, T119C, Tl 191, T119M, Tl 19V, T119Y, T119P, N120Q, N120E, N120L, N120T, Y121T, S122D, S122C, S122E, S122I, S122L, S122K, S122P, S122H, V123T, V123H, V123P, T124C, T124H, L126R, L126I, L126K, L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E, N127G, N127I, N127K, N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R, Q129C, Q129H, Q129I, Q129Y, Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131M, K131I, E135V, M140P, A141H, A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, T149E, T149M, K151A, K151C, K151H, K151S, K151V, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R162C, R162I, R162L, R162K, R162V,R163T, R163L, R163G, A164G, A164S, A164E et S165V ou une combinaison de ceux-ci; ou
(b) C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S 165V ou une combinaison de ceux-ci ; ou
(c) L53I, G54Q, G54S, G54T, Q69F, Q69T, V73I, S74G, K78Q, L79V, F80V, K81I, D86C, D86Q, D86H, D86I, D86V, Q87I, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F, I96L, K97I, K97R, D99N, D99C, D99Q, D99E, D99I, D99M, D99S, D99T, D99W, D99Y, D99V, MlOOI, MlOOV, NlOlG, NlOlH, NlOlF, NlOlV, K103R, N106D, N106Q, N106G, S107C, S107G, S107E, D113S, E116C, E116Q, E116H, El 161, El 16V5 T119C, Tl 191, T119M, Tl 19V, N120Q, N120E, N120L, N120T, S122D, S122C, S122E, S 1221, S122L, S122K, S122P, V123T, V123H, V123P, T124C, T124H, L126R, L126I, L126K, L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E, N127G, N127I, N127K, N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R, Q129C, Q129H, Q129I, Q129Y, Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131I, K131M, A141H, A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, T149E, T149M, K151A, K151C, K151H, K151S, K151V, R162C, R162E, R162I, R162L, R162K, Rl 62V, A164G, A164S ou une combinaison de ceux-ci ; ou (d) S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V.
Par « comprendre » est entendu que le variant ou le fragment de celui-ci présente une ou plusieurs substitutions telles qu'indiquées par rapport aux séquences polypeptidiques SEQ ID Nos 2, 4 et 6, mais qu'il peut présenter d'autres modifications, notamment des substitutions, des délétions ou des additions.
Par « présenter » est entendu que le variant ou le fragment de celui-ci ne comporte que la ou les substitution(s) indiquée(s) par rapport aux séquences polypeptidiques SEQ ID
Nos 2, 4 et 6.
La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant une combinaison de substitutions sélectionnées dans les groupes mentionnés ci-dessus. La combinaison peut consister en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions sélectionnées dans ce groupe. Par ailleurs, le variant thermostable de PIFNγ humain selon la présente invention peut comprendre d'autres mutations non-décrites dans ce groupe, de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. A titre d'illustration, les substitutions connues sont décrites dans WO 92/08737, WO 99/03887, WO01/36001, WO02/81507, WO03/002152, WO2004/005341, WO2004/022593, US 6,958,388, US 4,898,931, US 6,046,034 et WO2006/120580. Par exemple, la présente invention concerne un variant thermostable de PIFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, KI lOH, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E ou une combinaison de ceux-ci. Dans un autre exemple, la présente invention concerne un variant thermostable de PIFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une des mutations sélectionnées parmi le groupe consistant en Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D ou une combinaison de ceux- ci.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une première substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V. Dans un mode de réalisation préféré, le variant ne porte pas de groupement non-peptidique attaché sur le(s) résidu(s) introduit(s) par ladite ou lesdites premières substitutions. Ce variant peut comprendre en outre au moins une autre substitution sélectionnée parmi le groupe constitué de M157C, G41S et M100N.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, MlOON, K109C, K109Q, K109L, KI lOH, T119Y, Tl 19P5 Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E, S165V, L53I, G54Q, G54S, G54T, Q69F, Q69T, V73I, S74G, K78Q, L79V, F80V, K81I, D86C, D86Q, D86H, D86I, D86V, Q87I, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F, I96L, K97I, K97R, D99N, D99C, D99Q, D99E, D99I, D99M, D99S, D99T, D99W, D99Y, D99V, MlOOI, M100V, NlOlG, NlOlH, NlOlF, NlOlV, K103R, N106D, N106Q, N106G, S107C, S107G, S107E, D113S, E116C, E116Q, E116H, El 161, El 16V, T119C, Tl 191, T119M, Tl 19V, N120Q, N120E, N120L, N120T, S122D, S122C, S122E, S 1221, S122L, S122K, S122P, V123T, V123H, V123P, T124C, T124H, L126R, L126I, L126K, L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E, N127G, Nl 271, N127K, N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R, Q129C, Q129H, Q 1291, Q129Y, Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131I, K131M, A141H, A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, T149E, T149M, K151A, K151C, K151H, K151S, K151V, R162C, R162E, R162I, R162L, R162K, R162V, A164G et A164S. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, M100N, T95V et G41S. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution M157C, soit une substitution M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, MlOON, T95V et G41S.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi un des groupes consistant en :
(a) C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, MlOON, K109C, K109Q, K109L, KI lOH, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, Rl 6OA, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. ou
(b) L53I, G54Q, G54S, G54T, Q69F, Q69T, V73I, S74G, K78Q, L79V, F80V, K81I, D86C, D86Q, D86H, D86I, D86V, Q87I, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F, I96L, K97I, K97R, D99N, D99C, D99Q, D99E, D99I, D99M, D99S, D99T, D99W, D99Y, D99V, MlOOI, MlOOV, NlOlG, NlOlH, NlOlF, NlOlV, K103R, N106D, N106Q, N106G, S107C, S107G, S107E, D113S, E116C, E116Q, E116H, El 161, El 16V, T119C, Tl 191, T119M, Tl 19V, N120Q, N120E, N120L, N120T, S122D, S122C, S122E, S 1221, S122L, S122K, S122P, V123T, V123H, V123P, T124C, T124H, L126R, L126I, L126K, L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E, N127G, N127I, N127K, N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R, Q129C, Q129H, Q129I, Q129Y, Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131I, K131M, A141H, A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, T149E, T149M, K151A, K151C, K151H, K151S, K151V, R162C, R162E, Rl 621, R162L, R162K, Rl 62V, A164G et A164S; ou
(c) S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V.
Par exemple, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157C, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. Notamment, la substitution peut être sélectionnée parmi le groupe consistant en C23S, Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157C, M157L, Ll 581, F159C, F159V, Rl 6OA, R162E, R162Q et R162D. . De préférence, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, El 16C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G+F159C, A147E+R162D, M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P,
Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et
Y22T+K109C+T119P+A147F+R163L.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNγ humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant ou présentant une combinaison de deux substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, MlOON, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S, de préférence une combinaison sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + E116C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + M100N, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C + E116C, F159C + L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C + M100N, F159C + L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C + G41S, D99Y + E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y + S122D, D99Y + M100N, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y + M157C, D99Y + G41S, E116C + L158C, E116C + S74G, E116C + R162C, E116C + S122D, E116C + M100N, E116C + L126P, E116C + N58R, E116C + T95V, E116C + M157C, E116C + G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C + M100N, L158C + L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C + G41S, S74G + R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S74G + N58R, S74G + T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C + M100N, R162C + L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C + G41S, S122D + L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D + MlOON, S122D + G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P + MlOON, L126P + G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R + G41S, T95V + M157C, T95V + MlOON, T95V + G41S, M157C + MlOON et M157C + G41S. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un variant comprenant ou présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, de préférence la combinaison S63C + G41S.
Les séquences SEQ ID Nos 1-6 décrivent les séquences protéiques de l'IFNγ humain précurseur et mature ainsi que des séquences nucléiques codant celles-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le variant selon la présente invention correspond à la protéine précurseur de 166 acides aminés (SEQ ID No 2), ou à la protéine mature avec ou sans le tripeptide CYC (SEQ ID Nos 6 et 4, respectivement) comprenant au moins une substitution ou une combinaison de substitutions selon la présente invention. Par « variant » est notamment entendu un polypeptide différant d'un polypeptide présentant une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s), de préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s).
Par « fragment fonctionnel » est entendu un fragment de PIFNγ humain présentant l'activité de l'IFNγ humain. Par exemple, ce fragment peut correspondre à l'IFNγ humain précurseur ou mature, avec ou sans le tripeptide CYC, avec une délétion C- terminale de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, de préférence de 1 à 15 résidus, de manière encore plus préféré de 1 à 11 résidus. Le fragment peut comprendre 100, 110, 120, 130 ou 140 acides aminés consécutifs de l'IFNγ humain.
Par « activité de l'IFNγ humain » est entendu la capacité de se fixer sur le récepteur à l'IFNγ humain et provoquer la transduction du signal induit par la fixation de l'IFNγ humain à son récepteur comme déterminé in vitro ou in vivo. L'activité de PIFNγ humain peut être mesurée par les méthodes décrites ci-après dans la description et dans les exemples.
Les variants selon la présente invention présentent une augmentation de la thermostabilité par rapport à l'IFNγ humain sauvage. Cette augmentation est d'au moins 5 %, de préférence au moins 10, 20 ou 30 %. Par « thermostabilité », est entendu la capacité de la protéine à conserver son activité après avoir été soumise à l'action de la chaleur. Par exemple, la protéine peut être incubée 10 minutes à 59°C. La thermostabilité du variant est alors estimée par le pourcentage d'activité résiduelle après ce prétraitement. Cette mesure de la thermostabilité d'un variant est alors comparée à la même valeur obtenue en utilisant l'IFNγ sauvage soumis aux mêmes conditions.
Un variant qui présente une thermostabilité améliorée mais une activité réduite peut être utilisable. De préférence, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité (condition sans prétraitement) qui correspond à au moins 10 % de l'activité de l'IFNγ humain sauvage, de préférence à au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 % de l'activité de PIFNγ humain sauvage. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité équivalente à celle de PIFNγ humain sauvage, voire augmentée.
Un facteur intéressant de sélection des variants d'intérêt est l'activité relative du variant multiplié par le pourcentage d'activité résiduelle.
Par « groupement non-peptidique » est entendu une molécule non-peptidique qui peut être attaché à la chaîne latérale d'un acide aminé de l'IFNγ humain. Cette molécule peut être une molécule polymère, une molécule lipophilique, un carbohydrate ou un agent organique de dérivatisation. Le carbohydrate peut être attaché à l'IFNγ par glycosylation in vitro ou in vivo, par exemple par N- ou O-glycosylation. Une molécule lipophilique peut être par exemple un acide gras saturé ou insaturé, un terpène, une vitamine, un stéroïde ou caroténoïde. Une molécule polymère peut être un polyol, un polyamine, un polycarbocylique acide ou un polyalkylène oxyde, en particulier un polyéthylène glycol (PEG). Ce type de molécules est bien connu de l'homme du métier. Un variant portant un groupe PEG sera désigné comme étant « peggylé ». Le variant de l'IFNγ humain selon la présente invention peut être glycosylé, de préférence aux positions 48 et 120. Dans un autre mode de réalisation, le variant peut ne pas être glycosylé. Lorsque le variant comprend la substitution G41S, il peut être glycosylé en position N39 par une N-glycosylation. Dans un mode alternatif, un tel variant peut ne pas être glycosylé à cette position.
Dans un mode de réalisation, le variant peut être modifié par ajout d'une molécule polymère, en particulier par ajout de polymères (Kita et al., Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990 ; EP 236987 et US 5,109,120) ou par pégylation (WO99/03887 ; Voir WO2004005341 « Conjugation of a polymer molécule »). Dans un mode de réalisation préféré d'un variant de PIFNγ humain selon la présente invention, la molécule polymère est attachée à une position autre que les positions 41, 58, 62, 63, 74, 95, 99, 100, 116, 122, 126, 157, 158, 159 et 162. Notamment, la molécule n'est pas attachée à un résidu introduit par une substitution faite dans un variant selon la présente invention, en particulier une substitution sélectionnée parmi S63C, E62C, F159C, D99Y, M100N, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, T95V, G41S et M157C.
Dans un autre mode de réalisation, le variant de la présente invention ne porte pas de molécule polymère. En particulier, il n'est pas peggylé.
L'activité in vitro de l'IFNγ est généralement déterminée par la réduction de l'effet cytopathique de virus sur une lignée cellulaire par traitement avec des quantités croissantes d'IFNγ. Il existe d'autres tests biologiques spécifiques de l'IFNγ (Meager, Journal of immunological Methods, 261, (2002) 21-36 pour une revue). Ces nouveaux tests permettent notamment d'évaluer plus spécifiquement l'une des caractéristiques de l'activité pléiotrope de l'IFNγ. Il existe également des tests d'activité in vivo.
La réponse anti- virale à des doses d'IFNγ peut être mesurée sur différents couples de systèmes (virus /lignée cellulaire adhérente répondant à l'IFNγ et sensible au virus employé). Par exemple, on peut citer les couples suivants : VSV/MDBK ; VSV ou EMCV/ A549 ; VSV, EMCV, SFV ou virus Sindbis/ WISH ; VSV ou EMCV/ HeLa ; VSV, EMCV ou Mengovirus/ FS4, FS71, ou Hep2 ; VSV, EMCV, Mengovirus ou virus Sindbis/ FL ; EMCV/ 2D9, avec VSV = virus de la stomatite vésiculaire ; EMCV = virus de Fencéphalomyocardite ; SFV = virus de la forêt de Semliki. De préférence, les virus utilisés seront le virus de la vaccine ou le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Le virus de l'herpès simplex (HSV) et le cytomégalovirus peuvent également être utilisés.
L'activité de l'IFNγ peut également être testée en utilisant un gène rapporteur, par exemple la luciférase, sous le contrôle d'un promoteur sensible à l'IFNγ contenant des éléments GAS (gamma-interféron activation sites) ou ISRE (interferon stimulated response élément) . Ainsi, le gène rapporteur est dosé suite à une stimulation par l'IFNγ. Les vecteurs pGAS/Luciférase et pISRE/Luciférase sont disponibles commercialement (#219091, Stratagene). Dans un mode de réalisation préféré, la méthode avec le vecteur pGAS/luciférase est utilisée pour mesurer l'activité de l'IFNγ.
L'augmentation de la thermostabilité de l'IFNγ tout en conservant son activité biologique permet d'envisager l'élaboration de traitements plus efficaces permettant, à activité biologique égale, une réduction des doses thérapeutiques utilisées, et par là même une réduction des effets secondaires associés au traitement. Cela permet également des traitements à plus forte dose d'IFNγ pour réduire les infections virales telles que l'herpès, ces traitements étant jusqu'ici inenvisageables avec ce type de molécules. Par ailleurs, les variants selon la présente invention peuvent présenter l'avantage d'avoir un temps de demi- vie plus long lors du stockage de ces variants, et donc une meilleure conservation, par rapport à l'IFNγ sauvage, notamment à température ambiante.
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un variant de l'IFNγ thermostable selon la présente invention.
Ainsi, la présente invention concerne de préférence une composition pharmaceutique comprenant un variant de l'IFNγ thermostable ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V, le variant ne portant pas de groupement non-peptidique attaché sur le(s) résidu(s) introduit(s) par la ou les premières substitution(s). Dans un mode de réalisation, le variant diffère d'un polypeptide présentant une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s), de préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s). Dans un mode de réalisation particulier, le variant présente une unique substitution. Dans un autre mode de réalisation, le variant comprend en outre au moins une autre substitution sélectionnée parmi le groupe constitué de M157C, G41S et M100N. Notamment, le variant peut comprendre ou présenter une combinaison de deux substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, M100N, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S. Dans un mode de réalisation préféré, le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + El 16C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + M100N, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C + E116C, F159C + L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C + M100N, F159C + L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C + G41S, D99Y + E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y + S122D, D99Y + M100N, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y + M157C, D99Y + G41S, E116C + L158C, E116C + S74G, E116C + R162C, E116C + S122D, E116C + M100N, E116C + L126P, E116C + N58R, E116C + T95V, E116C + M157C, E116C + G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C + M100N, L158C + L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C + G41S, S74G + R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S74G + N58R, S74G + T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C + MlOON, R162C + L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C + G41S, S122D + L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D + M100N, S122D + G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P + MlOON, L126P + G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R + G41S, T95V + M157C, T95V + M100N, T95V + G41S, M157C + M100N et M157C + G41S. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + El 16C5 S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + MlOON, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S. Dans le mode de réalisation tout particulièrement préféré, le variant comprend ou présente la combinaison S63C + G41S. Dans un mode de réalisation particulier, le variant ne présente pas de délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant présente une délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale. Dans un mode de réalisation particulier, le variant ne porte pas de groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de dérivatisation. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant porte un groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de dérivatisation. Le groupement non-peptidique considéré est tout particulièrement une molécule polymère, de préférence un polyéthylène glycol. Dans un mode de réalisation particulier, le variant est glycosylé. Le variant peut notamment être glycosylé en position N39 par une N-glycosylation lorsqu'il comprend la substitution G41S.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut comprendre en outre un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. De tels supports et excipients sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th édition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd édition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press[2000]).
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être formulée sous différentes formes, notamment de liquide, de gel, lyophilisée, de poudre, de solide compressé, et autres.
La présente invention concerne également un variant de l'IFNγ thermostable selon la présente invention ou une composition selon la présente invention en tant que médicament. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées ou formulées pour l'administration orale, parentérale (intradermique, intramusculaire, intraveineuse, sous- cutanée), sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration.
Un exemple de composition pharmaceutique est une solution adaptée pour une administration parentérale. Bien que la composition puisse être sous forme liquide, adaptée pour une administration immédiate, de telles formulations parentérales comprennent également les formes congelées ou lyophilisées. Dans ce cas, la composition sera décongelée ou mise en solution avant utilisation. Dans le cas de la lyophilisation, la composition sera préparée en ajoutant un diluant pharmaceutiquement acceptable tel que de l'eau stérile ou un tampon physiologique.
Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des gels des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales ou injectables, des timbres transdermiques (patch), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants.
Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est liquide.
Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 100 μg de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient. Dans un mode de réalisation préféré, l'IFNγ est administré par la voie parentérale, et préférentiellement par injection sous-cutanée. Par exemple, une dose habituelle d'IFNγ par injection sous-cutanée est comprise entre 1 et 100 μg/m2 si la surface corporelle est supérieure à 0,5 m2 et entre 0,01 et 10 μg/kg de poids corporel si la surface corporelle est inférieure ou égale à 0,5 m2.
L'IFNγ est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités. En effet, les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la réplication virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de l'apoptose.
Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNγ induit les réponses suivantes :
- l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs anti-microbiens et anti-tumoraux) ;
- la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes, expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la surface des macrophages ;
- la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, ce qui a pour conséquence la production d'immunoglobuline de type G et l'activation du complément ;
- l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou
- l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN endogène.
L'action de PIFNγ sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation modulant ainsi la réponse immunitaire spécifique.
Parmi les propriétés pharmacologiques de FIFNγ, l'effet principal recherché et développé en phases cliniques est principalement l'aspect immunomodulateur, l'aspect de molécule thérapeutique anti- virale étant moins développé à ce jour.
En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice), l'IFNγ est une molécule développée comme agent thérapeutique humain dans le traitement de nombreuses maladies assez variées. Les IFNγ commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont notamment utilisés pour deux indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale. En plus des indications thérapeutiques principales, de nombreuses nouvelles indications thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à différentes phases cliniques (II et III), en particulier pour leur rôle d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNα pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi infections à mycobactérie atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B ; hépatite chronique à virus C ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite rhumatoïde ; cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome.
L'IFNγ est également utile dans le traitement d'infections virales variées, possède une activité contre l'infection par les papillomavirus humains, et les infections hépatiques à virus B et à virus C.
De plus, si le problème de toxicité associée aux fortes doses d'IFNγ était atténué ou résolu par une molécule plus stable, et ayant donc un plus important effet in vivo, l'utilisation de l'IFNγ dans de nouvelles indications, et notamment pour traiter les infections virales type herpès (HSV) de type I et II pourrait être reconsidéré.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFNγ thermostable selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. Ainsi, ce médicament est destiné à traiter des maladies inflammatoires, des cancers, des infections, des troubles osseux, des maladies auto- immunes, etc.. Dans un mode de réalisation préféré, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde. Dans des modes de réalisation alternatifs, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi un prurigo, une névrodermite, le diabète de type I, une sténose vasculaire, un épithélioma basocellulaire, un cancer ou un lymphome tel que un cancer de l'ovaire, un cancer du rein, une leucémie telle qu'un désordre hyperprolifératif des cellules B ou T, la leucémie myéloïde chronique et des syndromes apparentés, un cancer du sein, un cancer des poumons, un mélanome, un cancer du colon, un cancer du cerveau, un cancer de la plèvre, un cancer de l'estomac, un cancer du pancréas, une infection virale, par exemple par le virus de l'hépatite C ou B, la maladie de Crohn, le psoriasis, la sclérose en plaque, et la sclérose amyotrophique latérale.
Le variant thermostable de l'IFNγ selon la présente invention peut être utilisé en combinaison avec un autre principe actif, par exemple un principe actif sélectionné parmi un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, un antagoniste du calcium et une combinaison de ceux- ci. Le principe actif additionnel peut être administré avant, simultanément ou après l'administration de PIFNγ selon la présente invention. De plus, il peut être administré par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes. Ainsi, la présente invention concerne un produit comprenant le variant thermostable de PIFNγ ou une composition pharmaceutique selon la présente invention et un autre principe actif, de préférence sélectionné dans la liste ci-dessus, pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée pour le traitement d'une des pathologies citées ci-dessus.
La combinaison avec un anticorps est utile pour le traitement de cancer. En effet, l'IFNγ est capable d'augmenter l'effet des anticorps par l'ADCC (antibody-dependant cellular cytotoxicity). L'anticorps est de préférence dirigé contre un antigène exposé par les cellules cancéreuses. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, monoclonal, humanisé, ou chimérique. De préférence, l'anticorps est monoclonal et humanisé. Par exemple, dans le cas d'un désordre hyperprolifératif des cellules B tel que le lymphome non-hodgkinien, l'antigène peut être CD20. Cet anticorps peut être le Rituximab.
La combinaison avec un glucocorticoïde est utile pour le traitement des maladies pulmonaires alvéolaires telles que la fibrose pulmonaire idiopathique. Des exemples de glucocorticoïdes adaptés sont l'hydrocortisone, la cortisone, la dexaméthasone, la bétaméthasone, la prednisolone, la méthyl prednisolone et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Un mode de réalisation préféré de la présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison entre PIFNγ selon la présente invention et la prednisolone.
La combinaison avec un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique est utile notamment pour le traitement de maladies de la peau telles que un prurigo ou une névrodermite.
La combinaison avec un agent anti-allergique, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, ou une cytokine est utile notamment pour le traitement de l'asthme.
La présente invention concerne en outre une méthode de traitement antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur chez un patient le nécessitant, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace d'un variant thermostable de l'IFNγ ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention au patient. De préférence, la méthode de traitement est destinée au traitement d'une pathologie citée ci-dessus. Facultativement, la méthode peut comprendre en outre l'administration d'un autre principe actif, de préférence sélectionné parmi ceux cités ci-dessus. Une quantité thérapeutique efficace est la quantité nécessaire pour diminuer ou supprimer les symptômes de la maladie ou pour soigner ou ralentir la progression de la maladie. Le patient est de préférence un humain. La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de PIFNγ humain selon la présente invention. La présente invention concerne également une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide et un vecteur viral.
L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de PARN, un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Il peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, la mutagenèse, etc..
La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du variant thermostable de l'IFNγ humain selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être procary ote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology).
La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d'expression codant pour un variant thermostable de l'IFNγ humain selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, S cerevisiaé) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d'insecte (Sf9 ou Sf21 par exemple), de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS (lignée cellulaire de singe vert) (par exemple, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651), CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335, CHO-Kl (ATCC CCL-61)), des cellules de souris et des cellules humaines. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non- embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrohacterium, etc.. Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-35 pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE- 30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adéno virus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc.. De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral.
La séquence codant FIFNγ selon la présente invention peut comprendre ou ne pas comprendre le peptide signal. Dans le cas où elle ne le comprend pas, une méthionine peut être éventuellement ajoutée à l'extrémité N-terminale. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d'insecte ou d'une levure. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFNγ humain et son utilisation pour produire un variant thermostable de l'IFNγ humain recombinant selon la présente invention. Le terme « cellule hôte » englobe les cellules filles résultant de la culture ou de la croissance de cette cellule. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNγ humain recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNγ humain produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNγ humain recombinant selon la présente invention comprenant la fourniture d'une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de PIFNγ humain produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci. Sin. B 24:1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli, et JAMES et al. (Protein Science (1996), 5:331-340) pour une production en cellules mammifères.
La présente invention peut également concerner une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant un variant de l'IFNγ thermostable selon la présente invention, une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule hôte selon la présente invention, son utilisation pour la préparation d'un médicament, notamment destiné à traiter les maladies citées ci-dessus. Elle concerne en outre une méthode de traitement d'un patient le nécessitant comprenant l'administration d'une telle composition en une quantité thérapeutiquement efficace.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif.
Exemples
Sélection des variants thermostables de l'IFNγ humain
Les inventeurs ont mis en oeuvre une méthode de sélection directe de variants protéiques thermostables appelée THR et décrite dans la demande de brevet français numéro 0505935.
Cette méthode est basée sur la préparation de protéine de fusion entre les variants de PIFNγ humain et un variant d'une protéine de résistance à la kanamycine, présentant une thermostabilité accrue (Ce double mutant de la kanamycine nucléotidyl transférase est décrit dans Liao, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, 286-92). La banque de variants de l'IFNγ humain a été préparée par la méthode de Massive Mutagenesis® décrite dans FR2813314, et a été transformée à haute température dans la souche HB27 de Thermus thermophilus. Les clones transformants de cette banque ont été sélectionnés à des concentrations croissantes en kanamycine pour lesquelles la production de la fusion IFNγ (sauvage)-KNTase ne permet plus aux cellules de pousser. Les clones obtenus dans ces conditions sont théoriquement associés à un gain de stabilité à haute température, comme indiqué dans la demande de brevet FR 05 05935 déposée le 10 juin 2005. Les mutations portées par les clones sélectionnés ont été identifiées et les séquences résultantes sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants isolés lors de cette sélection primaire ont été transformés à nouveau individuellement et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 21 mutants, conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage, ont ainsi été confirmés (tableau 2).
Génération systématique de variants ponctuels de l'IFNγ : Par ailleurs, à partir du clone d'expression pORF/IFNγ, nous avons généré une importante collection de mutations ponctuelles de l'IFNγ présentant une et une seule différence d'acide aminé avec les positions de l'IFNγ dit sauvage (en prenant comme référence la SEQ N°6).
Analyse fonctionnelle des variants de l'IFNγ
Les variants de l'IFNγ humain sélectionnés par notre méthode de sélection ou générés de façon systématique sur toutes les positions de PIFNγ ont été exprimés transitoirement en cellules animales COS7. Ces protéines sont sécrétées dans le surnageant de culture. De façon à évaluer la stabilité et la conservation de l'activité de ces variants, les surnageants de culture de cellules COS7 ont été soumis à une dénaturation thermique (10 minutes à 59°C). On a ensuite fait agir ces protéines (dénaturées ou non) sur des cellules HeLa transfectées contenant la luciférase comme gène rapporteur. Après 16 heures de stimulation, pour chaque mutant et pour chaque condition, nous avons mesuré le signal de la flrefly luciférase correspondant à l'activité de PIFNγ testé. On a ensuite comparé l'activité induite par la protéine non dénaturée à l'activité induite par cette même protéine dénaturée et on en a déduit l'activité résiduelle après dénaturation thermique pour la protéine étudiée (Activité résiduelle = Activité dénaturée/ Activité non dénaturée * 100). L'activité basale du variant non dénaturé a également été comparée à celle de l'IFNγ non muté.
Détails des expériences : Biologie moléculaire
Constructions plasmidiques
Système THR : Le vecteur qui a été utilisé comportait les origines de réplication de E. coli et de T. Thermophilus, un gène de résistance à Fampicilline qui permet la sélection de transformants dans E. coli, un gène codant la KNTase thermostable sous contrôle d'un promoteur actif à la fois chez E. coli et de T. thermophilus (le promoteur pslpA). Voir Figure 1. La séquence nucléotidique de l'IFNγ (codant pour la forme mature de 146 acides aminés SEQ ID N°5) a été clonée entre les sites Ncol et Notl du vecteur en N-terminal de la KNTase. L'IFNγ et la KNTase en fusion sont séparés par une séquence codant un peptide de liaison (« linker ») qui présentait la séquence peptidique AAAGSSGSI (SEQ ID No 8) et était codée par la séquence nucléique GCG-GCC-
GCA-GGA-AGC-TCT-GGT-TCC-ATC (SEQ ID NO 7).
Système d'expression eucaryote : Pour l'expression de l'IFNγ en cellules de mammifères, nous avons utilisé le pORP/IFNγ (Invivogen) dans lequel PIFNγ est clonée dans une cassette d'expression contenant le promoteur hybride (EF-lα-HLTV) et le signal de polyadénylation fort du SV40.
Génération de mutants références de 1 'IFNy
Plusieurs mutants thermostables décrits dans la bibliographie ont été construits et utilisés à titre de contrôles positifs. Ils codent pour :
- la protéine IFNγ E30C/S92C : mutant avec un pont disulfure (gain de stabilité TM +15 °C, Waschutza et al, 1996)
- la protéine IFNγ delta 10 (extrémité C-terminale de la protéine délétée de ces 10 derniers acides aminés activté et stabilité améliorée, TM + 7,5°C et activité antivirale multipliée par 4, Slodowski et al., 1991).
Ces mutants sont générés au niveau des matrices pNCK-IFNγ et PORF-IFNγ par la méthode de Massive Mutagenesis® décrite dans FR2813314.
Génération dans le pORF-IFNy des mutants de VIFNy sélectionnés par la méthode THR
Les mutations simples et multiples correspondants aux mutations identifiées sur les séquences des clones sélectionnés par la méthode THR sont introduites sur le pORF-
IFNγ par la méthode de Massive Mutagenesis® décrite dans FR2813314.
Génération systématique des mutations simples de VIFNy dans le pORF/ IFNy
La génération de façon systématique de tous les variants simples de l' IFNγ (c'est-à-dire la substitution de l'acide aminé de la protéine mature de type sauvage par les 19 autres acides aminés du code génétique) a été réalisée par la méthode de Massive
Mutagenesis® décrite dans FR2813314 sur la matrice pORF/IFNγ.
Sélection de mutants thermostables par la méthode THR
Une banque de variants de l'IFNγ clonée dans le vecteur pNCK a été générée grâce à Massive Mutagenesis®. Une diversité totale a été introduite sur toutes les positions (de 21 à 166). La banque a ensuite été transformée à haute température (70°C) dans la souche HB27 de Thermus thermophilus et sélectionnée sur 20 ou 40 μg/ml de kanamycine (conditions où la fusion IFNγ (sauvage)-KNTase ne permet plus à la cellule de pousser). Les mutations identifiées après séquençage sur des clones poussant sur milieu sélectif sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants issus de cette sélection primaire ont ensuite été retransformés de manière unique et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 21 mutants, conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage ont ainsi été confirmés (tableau 2).
Validation fonctionnelle de Ia stabilité et de l'activité des mutants de l' IFNγ
Tous les réactifs de culture cellulaire ont été fournis par Invitrogen. Les cellules HeLa ((human cervix epitheloid carcinoma cells), les cellules COS-7 (African green monkey SV40 transformed kidney cells) et les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) ont été cultivées dans des conditions standards de culture (37°C en atmosphère humide contenant de 5% à 8% CO2) en utilisant respectivement les milieux Dulbecco's Modified Eagle's Médium (D-MEM) et Iscove's Modified Dulbecco's Médium (IMDM). Tous ces milieux de culture sont préparés selon les recommandations du fournisseur et contiennent un analogue de la L-glutamine (le glutamax). Ils sont supplémentés en sérum de veau fœtal décomplémenté (SVF) ( à raison de 10% final pour les phases de culture et de transfection et en poucentage de SVF réduit dans les phases de production suivant les expériences) et en antibiotiques à raison de 100 units/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine pour HeIa et COS7 et à raison de 50 units/ml de pénicilline et 0.05 mg/ml de streptomycine pour les CHO. Le vecteur pSV-betagal TM (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle du promoteur précoce SV40, a été utilisé pour normaliser les efficacités de toutes les transfections réalisées.
Expression des mutants de l'IFNγ humain en cellules de mammifères CQS7 Afin de réaliser les transfections des cellules COS7 par les constructions pORF/IFNγ natif ou muté, ces cellules ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence. Les cellules COS7 ont été ré-ensemencées suivant le ratio 1A (c'est-à-dire de façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une confluence de 25% environ). La transfection des cellules COS7 a été réalisée en plaque 24 puits avec un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules atteignent 70-80% confluence. La transfection a été réalisée avec environ 50ng d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEI/ ADN de 5 en laissant 30 minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le milieu (500μL IMDM + SVF + antibiotiques) a été changé. Les surnageants contenant PIFNγ (avec un niveau d'expression de l'ordre de 0,5 à lμg/ml) ont été récupérés à T=24H post-transfection. Ils ont été aliquotés et conservés à -20°C avant le dosage de l'activité de PIFNγ.
Expression des mutants de l'IFNγ humain en cellules de mammifères CHO Afin de réaliser les transfections des cellules CHO par les constructions pORF/ IFNγ natif ou muté, ces cellules ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 80% de confluence. Les cellules CHO ont été ré-ensemencées suivant le ratio 1/3 (c'est-à-dire de façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une confluence de 33% environ). La transfection des cellules CHO a été réalisée lorsque les cellules atteignent 70% de confluence. Dans une flasque (T75) avec un ensemencement initial de 4 Millions de cellules par flasque, la transfection a été réalisée avec environ 8μg d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEI/ ADN de 5 et en laissant 30 minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le milieu (1OmIs IMDM + SVF 2 ,5% + antibiotiques) a été échangé, après un bref lavage en PBS IX, contre du milieu IMDM + antibiotiques en absence de SVF additionnel. Les surnageants contenant l'IFNγ (avec un niveau d'expression de l'ordre de 0,5 à lμg/ml) ont été récupérés à T=48H post-transfection. Ils ont été aliquotés et conservés à -20°C avant le dosage de l'activité de l'IFNγ.
Quantification de l'IFNγ humain sauvage et variant
Le kit ELISA de référence pour la détermination de la quantité totale d'IFNγ provient de Clinisciences (# 88-7316-86). Nous avons vérifié que les anticorps utilisés dans cet
ELISA reconnaissaient de la même façon nos variants et la molécule native non mutée en quantifiant ces mêmes protéines par un autre ELISA commercial (Biosource #
KHC4021).
Test primaire d'activité
II a été déjà été décrit que l'IFNγ active spécifiquement les récepteurs à l'IFNγ présents sur les cellules HeLa. La stimulation de la voie des Jak/Statl des cellules HeLa par l'IFNγ s'effectue en ayant, en particulier, pour conséquence l'activation de la transcription des gènes sous le contrôle de promoteur possédant des séquences GAS pour « Gamma Activated Site ». Il est alors possible de mesurer et de comparer les activités des variants de l'IFNγ en transfectant dans les cellules HeLa un système de gène rapporteur dans lequel la luciférase (firefly luciferase) est en aval d'un promoteur possédant plusieurs sites GAS (plasmide pGAS/Luciférase de Stratagene).
Transfection transitoire des cellules HeLa par le pGAS/Luciférase Les cellules HeLa ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence et ont été ré-ensemencées avec un ratio de 1/3. Les transfections de cellules HeLa à 50-80 % de confluence ont été réalisées en plaque 96 puits selon le protocole du fournisseur : 20 000 cellules par puits ont été transfectées avec environ 150ng d'ADN pGAS/Luciférase et du jet PEI dans un rapport Jet PEI/ ADN de 5. Le tout a été vortexé 30s et laissé à température ambiante 30 min. Puis, 20μL du mélange ADN/Jet PEI ont été répartis dans chaque puits de la plaque et les cellules ainsi transfectées sont cultivées pendant 24 heures à 37°C et en 5% CO2.
Crible primaire des variants thermostables de l'IFNγ humain
Mesure de l'activité totale basale des variants de l'IFNγ (protéine non dénaturée) /
(protéine sauvage) :
Les surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNγ ont été dilués au l/100ème. lOμL de ces dilutions de surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNγ ont été ajoutés sur les cellules HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase. Après 16 heures à 37°C 5%
CO2 pendant lesquelles l'expression cytoplasmique de la firefly luciférase s'est effectuée, les culots de cellules ont été récupérés et congelés. 50μL de GIo lysis buffer
TM (Promega), ont été ajoutés pour lyser les cellules. La lyse s'est effectuée pendant 10 min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase produite en réponse à la stimulation spécifique de l'IFNγ. La mesure de l'activité a été initialisée par l'ajout du réactif Bright GIo ™ (Promega) et la quantité de luciférase accumulée a ensuite été comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument). L'activité brute en IFNγ est exprimée en RLU pour « relative luciferase unit ». Le calcul de l'activité totale (par rapport à la protéine sauvage) de chaque variant (non dénaturé) est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées par la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). L'une des façons de présenter les résultats d'activité totale est de rapporter l'activité de base de chaque variant en pourcentage de l'activité de base de l'IFNγ non muté exprimé dans les mêmes conditions pour chaque transfection.
Mesure de l'activité résiduelle des variants après dénaturation thermique par gène rapporteur luciférase :
Comme précédemment décrit par le test primaire d'activité par gène rapporteur, la quantité de luciférase a été mesurée après stimulation des cellules par lOμL de surnageants de cellules COS7 dilués au 1/ lOOème contenant l'IFNγ qui, suivant les cas, ont été soumis à un traitement thermique de 10 minutes à 59°C ou bien n'ont pas été traités. L'une des façons de présenter la fraction d'activité de chaque variant conservée après dénaturation thermique est de calculer l'activité résiduelle conservée de chaque variant définie par le pourcentage de l'activité basale du même variant avant dénaturation. Le calcul de l'activité résiduelle par rapport à une activité totale déterminée avant dénaturation est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées sur la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m).
Mesure d'un indice d'amélioration des variants de l'IFNγ (amélioration de la thermostabilité et/ou de l 'activité) :
Une fois que l'on a vérifié qu'un variant de VIFNy étudié présente à la fois une amélioration de la thermostabilité et une conservation au moins partielle de l'activité intrinsèque de la protéine, on peut calculer le produit de l'activité résiduelle du mutant étudié après prétraitement, par son activité (sans pré-taitement). Cette indice donne une idée de la résultante du gain de thermostabilité et de perte relative d'activité, et donne donc une idée de l'effet in vivo attendu de la protéine. Les valeurs obtenues avec les protéines de référence sont les suivantes : un indice de 37 pour I 'IFNy non muté et d'environ 76 pour le variant delta 10 connu dans la bibliographie. A l'issue du crible primaire, nous avons identifié une série de variants de l'IFNγ humain présentant une amélioration de thermostabilité et/ou d'activité par rapport à PIFNγ humain non muté comme décrit sur les figures 2 à 6. Crible secondaire des variants thermostables de l'IFNγ humain - mesure de la demi-vie in vitro
En vue de comparer l'amélioration de la stabilité intrinsèque des variants de l'IFNγ les plus thermostables issus du crible primaire, nous avons suivi, dans un crible secondaire, l'évolution de l'activité des IFNγ variants en fonction du temps lors d'une dénaturation thermique à 59°C. Nous avons ainsi déterminé une demi-vie à 59°C encore appelée ici « demi-vie in vitro » qui correspond au temps de dénaturation nécessaire pour faire disparaître 50% de l'activité initiale de PIFNγ à 59°C. Cette demi-vie a été obtenue en contrôlant particulièrement tous les paramètres suivants: une même concentration initiale d'IFNγ de lOOOpg/ml, une concentration en sérum SVF dans l'échantillon final à dénaturer équivalente et ajustée à 0,15% et une température de dénaturation de 590C pendant 30 minutes avec des prélèvements toutes les 10 minutes. Les concentrations en IFNγ des surnageants de cellules CHO ont été estimées par ELISA. Ces différents lots d'IFNγ variants ont été ensuite dilués à lOOOpg/ml dans un milieu IMDM SVF 0,15%. Ces dilutions ont été ensuite aliquotées de façon à subir un pré-traitement de dénaturation thermique à 59°C pendant 0, 10 20 et 30 minutes. lOμL de ces dilutions pré-traitées ont été ajoutés dans lOOμl de milieu de culture de cellules HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase comme décrit précédemment. Après 16 heures à 37°C 5% CO2, la lyse des culots de cellules et la quantification de la luciférase correspondante a été effectuée comme précédemment.
L'une des façons de présenter les données est de reporter l'activité brute correspondant à la stimulation spécifique de la voie de transduction par l'IFNγ variant, activité brute exprimée alors en RLU pour « relative luciférase unit ». Une autre façon de présenter la fraction d'activité conservée après dénaturation thermique (encore appelée activité résiduelle) de chaque variant est de calculer, et ce pour chaque temps de dénaturation, le pourcentage résiduel d'activité conservée par rapport à l'activité basale du même variant avant dénaturation. Ces calculs se font après soustraction de la part de signal due aux cellules non transfectées.
Les demi-vies de chaque variant ainsi déterminées sont alors comparées à celle de PIFNγ sauvage. Les demi- vies (T 1/2) sont exprimées en minutes et sont calculées à l'aide de la formule suivante : Tl/2= ln(2)/(k inactivation) Où k inactivation est la constante de vitesse de la phase d' inactivation. Cette constante est calculée sur la moyenne des taux d'inactivation instantanés de chaque temps par la formule suivante :
Ln A (t) = In b - 1 * (k inactivation)
A (t) est l'activité IFN gamma au temps tps t et b est une constante.
Ainsi, pour résumer, les demi-vies « in vitro » calculées ici, présentées dans la figure 7 et récapitulées dans le tableau 3, correspondent au temps pour lequel on a conservé la moitié de l'activité maximale de chacun des variant d'IFNγ.
Un autre paramètre décrit dans le tableau 3 est le ratio d'amélioration de la demi- vie de chacun des mutants par rapport à celle de la molécule sauvage non mutée produite dans les mêmes conditions. Plus ce paramètre est élevé plus l'amélioration de la demi-vie
« in vitro » du variant est importante comparée à celle de l'IFNγ humain non muté.
Ainsi, à l'issue de ce crible secondaire, nous décrivons ici 16 mutants de l'IFNγ présentant une nette amélioration de leur demi-vie in vitro et ce d'un facteur 200 à 1,4 fois comme résumés figure 7 et tableau 3.
Mesure de paramètres pharmacocinétiques des variants thermostables de l'IFNγ humain chez la souris
Ces expériences pharmacocinétiques descriptives ont pour but de déterminer dans le cas des variants thermostables de l'IFNγ la demi- vie biologique ou demi-vie terminale d'élimination (encore appelée ici « demi- vie in vivo »), ainsi que les aires sous la courbe pour différents modes d'administration (injection par voie intraveineuse (i.v) ou par voie sous-cutanée (s.c)). Ces données seront ensuite comparées à celles obtenues dans le cas de l'IFNγ sauvage produit en cellules de mammifères et dans le cas de l'IFNγ standard recombinant produit chez E.coli présentant les caractéristiques de la molécule du marché, c'est à dire un pseudo « Actimmune ».
La mesure de la demi-vie biologique peut être réalisée de multiples façons :
Une méthode décrite par Rutenfranz et al. (J. Interferon Res. 1990, vol. 10, p. 337-341) utilise des injections intraveineuses et intramusculaires sur des souris C57BL/6 de 8 semaines
La demi- vie est alors estimée par un test d'activité anti- virale directement sur les sérums murins (Cellules Hep-2 infectées par un virus (vesicular stomatitis virus ou VVS).
L'ELISA est, dans cet exemple, utilisé comme alternative pour détecter les niveaux d'IFNγ dans le sérum murin. Une autre façon décrite dans Croos and Roberts (J.Pharm., 1993, vol 45, p. 606609) consiste à réaliser des expériences avec de PIFNγ marqué par un isotope radioactif et de suivre l'absorption de cette molécule marquée dans les tissus et son passage dans le sérum de rats femelle Sprague-Dawley après injection sous-cutanée. Les échantillons de tissus et de sang sont alors analysés pour la quantité d'IFNγ marqué qu'ils contiennent. L'utilisation de méthode ELISA pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'IFN a été décrite pour l'IFN alpha par administration sous-cutanée par Rostaing et al. (1998), J. Am. Soc. Nephrol.9 (12): 2344-48 et par administration intramusculaire par Merimsky et al.(1991), Cancer Chemother. Pharmacol. 27 (5).]
L'IFNγ sauvage et les mutants ont été exprimés à partir de cellules COS et CHO. Ces surnageants de culture ont été centrifugés une seconde fois à 4000 RPM, 10 min, et filtrés sur filtre Millipore PES 0,22μm. Les volumes des surnageants filtrés sont alors concentrés par centrifugation sur des unités de filtration Vivaspin de seuil de coupure de 5000 daltons (Sartorius). Les concentrations en IFNγ sont alors estimées pour ces échantillons en appliquant les dilutions préalables adaptées. Les lots d'IFNγ variants et sauvage sont administrés selon deux modes :
- par une injection de lOOμl de solutions d'IFNγ concentrées à 10 μg/ml dans les veines caudales de souris C57BL/6J. ou bien par une injection de lOOμl de solution d'IFNγ concentrées à 6,7 μg/ml en sous-cutané dans le ventre de souris C57BL/6J.
Pour ces expériences, sont utilisées des souris C57BL/6J âgées de 8 semaines d'un poids moyen entre 20 et 30 grammes. Ces animaux sont acclimatés une semaine dans une pièce sous une température constante de 24,10C, une humidité constante de 55% et avec des cycles repos/sommeil de 12h.
Les échantillons de sang de souris sont collectés aux différents temps suivants après administration de la molécule d'intérêt. Des prélèvements rétro-orbitaux sont réalisés pour les temps 3h, 6h, 24h, 48h, 72h, 96h, 12Oh, 144h, 168h, 192h et des prélèvements cardiaques post-mortem pour le temps final à 216 heures.
Le sérum est préparé en laissant coaguler le sang pendant 20 minutes à température ambiante et en récupérant la fraction correspondant au surnageant d'une centrifugation à 5000 g, 20 min à 20°C. Le sérum est ensuite isolé et stocké à -80°C en attendant que l'activité de l'IFNγ soit mesurée en utilisant le dosage ELISA décrit plus haut. On évalue ensuite la concentration plasmatique en IFNγ au cours du temps par le suivi de la quantité d'IFNγ détectée par ELISA dans chaque sérum de souris. Pour chaque prélèvement effectué en rétro-orbital, la quantification d'IFNγ obtenue résulte de la moyenne d'au minimum 3 sérums différents issus de 3 souris. Ces différentes expériences de pharmacocinétique ont été reproduites pour chaque variant au minimum deux fois à partir de lots d'IFNγ provenant de transfections différentes. Au final, on reporte la concentration en IFNγ dans le sérum au cours du temps. Les paramètres [Ty2 i.v, AUCu,] [Ti/2sc et AUCSC], sont calculés à l'aide du logiciel Kinetica (Vs 4.4.1 Thermo Electron inc).en utilisant un modèle d'analyse pharmacocinétique « Intra Veinous bolus non-compartimental » et « extravascular bolus» respectivement.
Un autre paramètre décrit dans les tableaux 4 et 5 sont les ratio d'amélioration de la demi-vie ou de l'aire sous la courbe de chacun des mutants par rapport aux paramètres respectifs de la molécule sauvage non mutée produite dans les mêmes conditions et par rapport aux paramètres respectifs de l'IFNγ humain recombinant bactérien quand les données sont disponibles. Plus ces ratios sont élevés, plus l'amélioration du variant est importante comparée à celle de l'IFNγ humain non muté.
Les résultats de ces expériences et leur analyse sont présentés respectivement figure 8 et tableau 4 dans le cas des injections intraveineuses et figure 9 et tableau 5 dans le cas des injections en sous-cutané.
Nous voyons que les mutations S63C, G41S ainsi que leur combinaison, ont pour conséquence une nette amélioration de la demi-vie in vivo de ces variants comparée à celle de l'IFNγ humain recombinant produit en CHO et à celle de FIFNγ humain recombinant produit en bactérie. Après administration en sous-cutanée, le double mutant présente toujours une nette amélioration de ces paramètres pharmacocinétiques comparés à ceux de l'IFNγ humain recombinant produit en CHO.
Tableau 1
Tableau 2
TABLEAU 5

Claims

Revendications
1- Composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'interféron gamma (IFNγ) humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une première substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2, le variant ne portant pas de groupement non-peptidique attaché sur le(s) résidu(s) introduit(s) par la ou les premières substitution(s).
2- Composition pharmaceutique selon la revendication 1, dans laquelle le variant diffère d'un polypeptide présentant une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s), de préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s).
3- Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le variant présente une unique substitution.
4- Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le variant comprend en outre au moins une autre substitution sélectionnée parmi le groupe constitué de M157C, G41S et MlOON, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2.
5- Composition pharmaceutique selon la revendication 4, dans laquelle le variant comprend ou présente une combinaison de deux substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, MlOON, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2.
6- Composition pharmaceutique selon la revendication 5, dans laquelle le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + MlOON, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + El 16C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + MlOON, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C + E116C, F159C + L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C + M100N, F159C + L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C + G41S, D99Y + E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y + S122D, D99Y + M100N, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y + M157C, D99Y + G41S, E116C + L158C, El 16C + S74G, E116C + R162C, E116C + S122D, E116C + M100N, E116C + L126P, E116C + N58R, E116C + T95V, E116C + M157C, E116C + G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C + M100N, L158C + L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C + G41S, S74G + R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S74G + N58R, S74G + T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C + M100N, R162C + L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C + G41S, S122D + L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D + M100N, S122D + G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P + M100N, L126P + G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R + G41S, T95V + M157C, T95V + M100N, T95V + G41S, M157C + M100N et M157C + G41S, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2.
7- Composition pharmaceutique selon la revendication 6, dans laquelle le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + Ml 57C3 S63C + G41S, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2.
8- Composition pharmaceutique selon la revendication 7, dans laquelle le variant comprend ou présente la combinaison S63C + G41S, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2. 9- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le variant ne présente pas de délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C- terminale.
10- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le variant présente une délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale.
11- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le variant ne porte pas de groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de dérivatisation.
12- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le variant porte un groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de dérivatisation.
13- Composition pharmaceutique selon la revendication 11 ou 12, dans laquelle le groupement non-peptidique est une molécule polymère, de préférence un polyéthylène glycol.
14- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle le variant est glycosylé.
15- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle le variant n'est pas glycosylé.
16- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, comprenant en outre au moins un autre principe actif.
17- Composition pharmaceutique selon la revendication 16, dans laquelle l'au moins un autre principe actif est sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleulάne 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo- oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, et un antagoniste du calcium.
18- Composition pharmaceutique selon la revendication 17, dans laquelle l'au moins un autre principe est un interféron alpha ou béta.
19- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 formulée pour une administration orale, parentérale (par exemple sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, ou intradermique), sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, ou intra- auriculaire.
20- Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 en tant que médicament.
21- Produit comprenant une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 15 et un autre principe actif pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée en tant que médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur.
22- Produit selon la revendication 21, dans lequel l'autre principe actif est sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, Pinterleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, et un antagoniste du calcium.
23- Produit selon la revendication 22, dans lequel l'autre principe est un interféron alpha ou béta.
24- Produit selon l'une des revendications 21 à 23, dans lequel les deux principes actifs sont administrés par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes.
25- Produit selon l'une des revendications 21 à 24, dans lequel le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde.
26- Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1-19 pour la préparation d'un médicament anti viral, antiprolifératif ou immunomodulateur.
27- Utilisation selon la revendication 26, dans laquelle le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde.
28- Acide nucléique codant un variant thermostable de PIFNγ tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1-15.
29- Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 28. 30- Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 28 ou une cassette d'expression selon la revendication 29.
31- Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 28, une cassette d'expression selon la revendication 29 ou un vecteur selon la revendication 30.
32- Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 28, une cassette d'expression selon la revendication 29, un vecteur selon la revendication 30 ou d'une cellule selon la revendication 31 pour produire un variant thermostable de l'IFNγ décrit dans l'une quelconque des revendications 1-15.
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