FR2907454A1 - Variants ameliores de l'interferon beta humain - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un variant amélioré de l'interféron bêta humain (IFN-beta), un acide nucléique codant pour celui-ci, une composition pharmaceutique le comprenant, ainsi que son utilisation pour le traitement de la sclérose en plaque, de fibroses, de maladies inflammatoires ou autoimmunes, de cancers, d'hépatites et d'autres infections virales. Ce variant sélectionné sur sa thermostabilité accrue, présente des caractéristiques pharmacocinétiques améliorées permettant une activité in vivo prolongée de l'IFN-beta.

Description

1 Variants améliorés de l'interféron bêta humain Introduction : La

présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines. Elle porte sur l'amélioration de l'interféron bêta humain (IFN-(3), ainsi que des compositions comprenant un IFN-13 amélioré, un acide nucléique codant celui-ci, et leurs utilisations. Les interférons ont été les premières cytokines à être découvertes pour leur activité antivirale et les premières à être utilisées dans le domaine thérapeutique. Ce sont des médiateurs d'activité antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice, sécrétés en réponse à des stimuli variés et en particulier en réponse aux infections virales. Les interférons sont classés en deux grands types : -le type I qui consiste en sept classes différentes d'interférons : IFN-a, IFN-13, IFN-c, IFN-K, IFN-w, IFN-8 et IFN-i ; - le type II contenant l'interféron y. Il existe une seule espèce d'IFN-(3, dont le gène est situé, chez l'homme, sur le bras court du chromosome 9. L'IFN-(3 est une molécule monomérique synthétisée sous forme d'un précurseur de 187 acides aminés dont les 21 premiers résidus constituent un peptide signal qui permet l'adressage et la sécrétion de la molécule d'IFN-13 mature, après clivage. La séquence en acide aminé de l'IFN-(3 a été publiée par Taniguchi et al., (Gene 10 :11-15, 1980). L'IFN-13 est une molécule glycosylée dont le site potentiel de glycosylation se situe au niveau d'un résidu asparagine en position 80 ; sa masse moléculaire est de 23 kDa. La molécule se caractérise également par un pont disulfure entre les cystéines 31 et 141. La synthèse de l'IFN-13 est induite dans les cellules fibroblastiques, principalement en réponse aux infections virales.

La structure secondaire de l'IFN-13 est typique de celles des interférons de classe I et se caractérise par cinq hélices a (A-E) réliées entre elles par une grande boucle (AB) et trois segments plus petits (BC, CD et DE). Quatre des cinq hélices, A, B, C et E sont agencées de manière antiparallèle pour former une structure tertiaire typique. La 2907454 2 structure cristalline de l'IFN-13 a été publiée en 1997 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :11813-11818, 1997). L'action de l'IFN-(3 au niveau cellulaire passe par l'interaction avec au moins deux 5 glycoprotéines (IFN-aRl et IFN-aR2c) qui s'associent en réponse à la liaison du ligand sur l'une d'entre elles pour former le récepteur membranaire des interférons de type I. A la différence de l'IFN-a dont l'unité fonctionnelle est un monomère, celle de l'IFN-13 est un dimère. Cette différence, ainsi que des constantes d'affinité différentes pour chacun des couples interféron-récepteur, seraient fondamentales pour expliquer les 10 activités biologiques différentielles des interférons de type I, notamment celles des IFN-a et IFN-13. La liaison de l'IFN-13 à son récepteur déclenche la mise en route d'une cascade de transduction intracellulaire impliquant principalement des protéines kinases de la 15 famille des Janus kinases (Jakl, Jak2 & Tyk2) chargées d'activer des facteurs de transcription de la famille STAT. Ces derniers activent les gènes contenant un interferon sensitive response element au niveau de leur promoteur. Une stimulation par l'IFN-13 augmente l'expression dans les cellules de plus de 200 protéines ; les effets biologiques sont pléiotropiques : 20 - antiviraux ; - antiprolifératifs ; - stimulateurs de l'activité cytotoxique des lymphocytes T et cellules NK ; - stimulateurs d'autres antigènes de surface tels que les antigènes de classe I du complexe majeur d'histocompatibilité ; 25 - stimulateurs de la production des interleukines 2 et 10 (anti-inflammatoires) ; - antiangiogéniques ; -inhibiteurs de la production des interleukines IL 1-13 et TNFa (pro-inflammatoires) ; - inhibiteurs de la prolifération et de la migration des lymphocytes T ; et - inhibiteurs des molécules d'adhésion. 30 Ce très large spectre d'activité a fait de ces molécules des agents parmi les plus prometteurs pour traiter différentes maladies majeures. 2907454 3 Bien que les interférons aient été découverts par des virologistes, leurs premières utilisations cliniques en 1979 ont été pour combattre des myélomes [Joshua DE et al, Blood Rev. 1997, Déc 11(4) : 191-200]. Les interférons ont depuis démontré leur efficacité sur de nombreuses maladies d'origine virale, tumorale, allergique, 5 inflammatoire ou angiogénique [Tilg H., Gastroenterology, 1997 Mar 112(3) 1017-21]. L'IFN-13 est pressenti pour avoir un intérêt dans de nombreuses maladies inflammatoires, autoimmunes, infections virales et cancers. Sa principale application thérapeutique est le traitement de la sclérose en plaques (SEP) ; à la suite des travaux de l'équipe de L. Jacobs, l'IFN-(3 a été approuvé par la FDA dans le traitement de la forme 10 récurrente-rémittente de cette maladie en 1996. La SEP est la maladie inflammatoire chronique la plus fréquente du système nerveux central et concerne plus d'un million de personnes dans le monde. La majorité des patients déclare leur maladie à l'âge adulte et l'expression clinique des signes 15 pathologiques est très variable. La plupart des patients atteints commencent par manifester des poussées de SEP pendant lesquelles on assiste à une apparition de nouveaux symptômes ou à l'aggravation de symptômes déjà existants. Entre les poussées la maladie semble marquer une pause, on parle de SEP récurrente-rémittente. Chez la moitié environ des patients, l'évolution par poussées laisse la place après de 20 nombreuses années, à un autre stade de la maladie : la SEP rémittente progressive ou secondairement progressive. Seul 10% environ des patients présentent dès le début une évolution sans poussée mais avec une aggravation continue des symptômes. On parle de SEP progressive d'emblée. 25 La SEP est caractérisée par une faible mortalité (au moins à court et moyen termes), mais une morbidité élevée. Malgré des avancées importantes dans la compréhension des phénomènes inflammatoires et dégénératifs qui débouchent sur les déficiences et incapacités dont souffrent les patients, les causes de la maladie restent indéterminées. 30 Trois préparations commerciales d'IFN-13 sont proposées et toutes sont efficaces pour ralentir la progression de la maladie ; il a été montré que ces IFN-(3 induisaient une réduction de près de 30-35% de la vitesse des rechutes de SEP. Cependant, aucun des 2907454 4 produits sur le marché ne constitue un réel traitement de la maladie. Obtenir des molécules d'IFN-13 plus efficaces reste donc une priorité. Les formulations commerciales actuelles concernent deux molécules différentes d'IFN- 5 13: - IFN-(3 la pour Avonex et Rebif -IFN-(3 lb pour Bétaféron / Bétaféron L'IFN-13 la est identique à l'IFN-13 humain ; il est glycosylé et produit à partir de 10 cellules ovariennes de hamster (CHO). L'IFN-(3 lb est un IFN-(3 humain recombinant produit chez E. Coli et donc non glycosylé ; par rapport à la séquence naturelle de l'IFN-(3 humain, sa séquence présente une absence de méthionine en position N-terminale et une substitution d'une cystéine par une sérine introduite par mutagénèse dirigée position 17. 15 Les trois préparations commerciales sont utilisées dans des traitements préventifs dont l'objectif principal est d'empêcher l'apparition de nouvelles poussées, de diminuer leur fréquence et de modifier l'évolution de l'invalidité. Elles sont toutes les trois indiquées dans le traitement de la forme rémittente-récurrente de la SEP avec des spécificités de 20 prescription selon les fréquences et le nombre de poussées du patient. Par ailleurs, Avonex est le seul immodulateur indiqué à ce jour pour les patients ayant fait une seule poussée et Bétaféron le seul à être prescrit dans les formes de SEP secondairement progressives avec poussées. 25 Les trois préparations se distinguent par leur mode d'injection : -intramusculaire une fois par semaine pour Avonex - sous-cutané tous les deux jours pour Bêtaféron et trois fois par semaine pour Rebif L'IFN-13 la glycosylé présente une activité supérieure d'un facteur 10 à celle de l'IFN-13 30 lb produit chez E. Coli. Cependant des études institutionnelles indépendantes (INCOMIN) ont montré qu'une injection journalière d'IFN-13 lb était plus efficace qu'une injection hebdomadaire d'IFN-(3 la. Néanmoins, ces résultats sur une meilleure efficacité de l'IFN-13 lb sur l'IFN-13 la restent controversés. 2907454 5 Ces trois préparations commerciales ont également des capacités de conservation différentes liées à la molécule d'origine, plus faible pour lIFN-13 la qui nécessite une conservation à +4 C que pour IFN-13 lb qui peut supporter des températures ambiantes 5 de conservation apportant un côté pratique d'utilisation. Comme dans toute maladie évoluant sur de nombreuses années et nécessitant un traitement chronique, l'efficacité mais également la tolérance et la simplicité d'utilisation sont des paramètres à prendre en considération dans le choix d'un 10 traitement de fond. Un problème majeur réside dans ces traitements de la SEP : les IFN-13 induisent des effets secondaires sérieux qui réduisent très sensiblement la qualité de la vie des patients. Les deux principaux effets secondaires rencontrés se traduisent par des symptômes 15 semblables à ceux de la grippe et des réactions cutanées au niveau des sites d'injection. Il a été également noté l'augmentation du taux d'enzymes hépatiques circulantes et des anomalies de certaines cellules sanguines. Les pseudo-symptômes grippaux semblent se produire juste après les injections et durent environ 12 heures. Dans beaucoup de cas, ces symptômes diminuent avec le temps, mais quelques patients continuent à les subir 20 sur de longues périodes. Ces symptômes peuvent être atténués en employant une dose nécessitant une injection moins fréquente. Les réactions au niveau des sites d'injection peuvent être atténuées en alternant les emplacements des injections ou en utilisant une des préparations qui nécessitent d'être injectées moins fréquemment. 25 Ces alternatives, assez onéreuses et contraignantes pour le patient, poussent nombre de ceux-ci à arrêter leur traitement après une durée de six mois ou une année. Les effets secondaires consécutifs à l'injection d'IFN-13 peuvent persister même après l'arrêt du traitement. 30 Par ailleurs, la tolérance de l'injection d'IFN-13 peut être limitée dans le temps par l'apparition d'anticorps neutralisants chez 6 à 40 % des patients [Int. Arch. Allergy Immunol. 118 :368-371, (1999)], ce qui réduit grandement l'efficacité du traitement [Neurol. 50 : 1266-1272, (1998)]. 2907454 6 L'amélioration de la stabilité de l'IFN-13 couplée à une potentialisation de son activité constituerait donc une avancée significative dans le traitement de la SEP. 5 Depuis la publication de la séquence de 1' IFN-(3 par Taniguchi et al., [Gene 10 :11-15, (1980)], plusieurs brevets ont eu pour objet la production de molécules d'IFN-(3 plus actives et / ou plus stables : EP 0083069 et EP 0041313 font partie des premiers brevets mentionnant la production 10 de 1' IFN-(3 en bactéries. Depuis, la plus forte problématique inhérente à la production de l'IFN-13 en bactéries est sa capacité à former des dimères et des oligomères qui rendent les étapes de purification et de séparation délicates. Cela nécessite d'introduire des étapes supplémentaires dans les procédures, telle qu'une réduction de la protéine durant sa purification puis sa réoxydation pour restaurer sa conformation originale, 15 augmentant par là même les risques de formation de ponts disulfures incorrects. Plusieurs travaux se sont intéressés à cette thématique : - EP 0260350 mentionne des mutants de l'IFN-13 résistants à l'oxydation, chacune des méthionines de la molécule étant mutée par un autre résidu protégeant ainsi l'IFN-13 de 20 l'oxydation principalement durant sa purification et donc garantissant une meilleure stabilité de son activité. - US 4,588,585 mentionne un IFN-13 déplété en cystéine libre pour éviter les crosslinking intermoléculaires, notamment la cystéine 17 ; ce brevet est l'un de ceux à l'origine de l'IFN-13 lb. 25 - US 6,323,006 présente une démarche inverse avec un IFN-(3 présentant une mutation ponctuelle de la tyrosine 60 en cystéine afin de produire un deuxième pont disulfure avec la cystéine 17 en plus de l'unique pont disulfure naturel entre les cystéines 31 et 141. Plusieurs autres brevets couvrent cette thématique parmi lesquels US 4,518,584 ; US 30 4,738,844 ; US 4,753,795 et US 4,959,314. 2907454 7 US 4,966,843 et US 5,376,567 relatent les premières productions de l'IFN-(3 dans des cellules de mammifères CHO et US 5,814,485 une production dans ces mêmes cellules, récemment améliorée. 5 Plusieurs travaux de Runkel et al. [Pharm. Res. 15 (4) : 641-9 (1998) ; J. Biol. Chem. 273(14) : 8003-8 (1998)] ont analysé les différences structurales et fonctionnelles entre 1' IFN-(3 glycosylé (IFN-(3 la) produit en cellules mammifères et 1' IFN-(3 non glycosylé (IFN-13 lb) produit en bactéries et ont suggéré que l'activité biologique très supérieure de l'IFN-13 la était due à un effet stabilisant de la partie glucidique. 10 De nombreux groupes se sont donc orientés vers la production d'IFN-(3 conjugués et / ou présentant des sites de glycosylation supplémentaires pour tenter d'identifier des molécules d' IFN-13 présentant des qualités supérieures. Plusieurs brevets rapportent des méthodes pour modifier des polypeptides par conjugaison ou glycosylation tels que US 15 4,904,584 et WO 9955377. EP 0287075 et EP 0529300 présentent des méthodes pour produire des IFN-(3 avec des profils de glycosylation particuliers leur conférant théoriquement une stabilité plus grande. US 4,904,584 ; EP 0229108 et US 4,917,888 présentent des méthodes de conjugaison des IFN-(3 avec des polymères tel que le polyéthylène glycol (PEG) permettant une plus grande solubilisation des molécules dans les préparations pharmaceutiques. 25 US2005008616 mentionne la production d'un IFN-(3 recombinant humain pour lequel la composition exacte en groupements glycosyls de la molécule est contrôlée et présente un taux de gangliosides fortement diminué, permettant une activité antivirale de l'IFN-13 très augmentée. 30 Plusieurs brevets présentent de nouveaux IFN-(3 conjugués sur lesquels des polymères tel que le PEG ont été greffés sur des IFN-13 modifiés pour présenter des sites d'attachement de polymères ou de glycosylation supplémentaires. Parmi ces brevets, se trouvent WO 0115736, US 2002169290, WO 02074806, US 2003175240 et US 20 2907454 8 2003175241 de la société Maxygen ou encore WO 0023114 et EP 1656952 de la société Biogen-Idec. Les molécules présentées dans ces brevets présentent des propriétés améliorées telles qu'une demi-vie allongée et une réactivité réduite aux anticorps neutralisants couramment identifiés lors de l'utilisation des IFN-13 classiques. Aucune de ces molécules n'a cependant donné lieu à la production de médicaments pour l'instant et les formes actuelles d'IFN-13 utilisées en thérapeutique sont toujours des formes non conjuguées. 10 En effet, l'utilisation de molécules pégylées en thérapeutique, comme dans le cas des IFNa, présentent au moins deux inconvénients majeurs : - leur activité réduite, qui nécessite l'injection de quantités plus importantes d'IFN pour obtenir le même effet thérapeutique. - leur complexité de production pour assurer une reproductibilité du taux de pégylation 15 et de la stabilité de la molécule conjuguée. Certains groupes ont plutôt orienté leurs stratégies d'amélioration de l'IFN-13 vers la production de molécules de fusion avec des fragments d'anticorps pour améliorer principalement la biodisponibilité et l'efficacité de l'IFN-(3. WO 0023472 présente une 20 molécule d'IFN-(3 pégylée fusionnée à son extrémité C-terminale avec un fragment Fc d'immunoglobulines IgM, IgG, IgD, IgA ou IgE. WO 2006000448 fait état d'une molécule de fusion entre l'IFN-(3 non conjugué et un même fragment Fc placé à son extrémité N-terminale. 25 Relativement peu de variants del' IFN-13, non conjugués, ont été construits : - WO9525170 mentionne un IFN-13 muté ponctuellement sur sa position 101 pour une utilisation thérapeutique de la molécule et deux autres familles de brevets WO 0068387 et US 6,514,729 présentent des mutants ponctuels de l'IFN-(3 sur une quinzaine de résidus. 30 - A ces brevets doivent être ajoutés les brevets EP 0260350, US 4,588,585 et US 6,323,006 déjà mentionnés précédemment et ciblant en particulier les résidus cystéine et méthionine de 1' IFN-(3. 5 2907454 9 Le brevet US 4,588,585 cible particulièrement le résidu cystéine 17 pour déléter 1' IFN- 13 de tout résidu cystéine libre susceptible de former des ponts disulfure intra et intermoléculaires non désirés. La substitution particulièrement décrite est C17S qui permet d'obtenir un variant plus stable lors des étapes de sa purification et non en terme 5 de résistance à la température ; il en résulte une préparation présentant une activité spécifique plus élevée en IFN-13. Plus récemment, WO2004022593 revendique les mutations sur 24 positions de l'IFN-13 pour augmenter sa demi-vie et sa stabilité. Malgré ces différentes approches, aucune des molécules précitées n'a donné lieu au développement de médicaments. Contrairement à d'autres molécules thérapeutiques telles que l'EPO et l'insuline, il n'existe pas de molécules mutantes de l'IFN-13 humain sur le marché. 15 Ainsi, l'obtention d'un IFN-13 ayant une durée de vie prolongée dans l'organisme reste toujours une priorité. Une molécule plus stable (soit parce qu'il s'agit d'un variant, soit parce que des additifs sont ajoutés à la molécule, soit parce que la formulation est améliorée) représenterait une nouvelle génération de molécules susceptibles de 20 supplanter les molécules actuellement sur le marché, principalement pour traiter les patients atteints de SEP mais pouvant également se montrer utile dans le traitement de fibroses, de maladies inflammatoires ou autoimmunes, de cancers, d'hépatites et d'autres infections virales. 25 Elle permettrait un meilleur effet in vivo de l'IFN-13, cet effet in vivo étant la conséquence de la combinaison entre l'activité spécifique de la protéine et sa durée d'action ; elle permettrait également de réduire l'impact des effets secondaires sur les patients. 30 Résumé de l'invention La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-13 humain présentant des caractéristiques pharmacocinétiques améliorées et une activité in vivo prolongée. 10 2907454 10 En particulier, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-[3 humain comprenant au moins une substitution, et de préférence une à dix, sur un des acides aminés du groupe consistant en Y3, F8, R11, N14, C17, L21, L24, Y30, 140, 144, Q51, K52, E53, D54, L57, 159, N65, D73, T82, V84, N86, V91, Y92, H93, T100, V101, F111, G114, S118, H121, 1129, G131, C141, T144, R147, E149, F156, I157, Y163, L164, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-(3 humain comprenant au moins une substitution, et de préférence 10 une à dix, sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, Y3F, F8D, F8W, R11S, N14K, C17W, L21K, L21N, L21R, L24M, Y30H, I40M, I44N, Q51F, K52S, E53F, D54S, L57W, I59S, N65Y, D73T, T82H, V84R, N86Y, V91K, Y92W, H93L, T100H, V101R, F111L, G114Y, S118N, S118T, 111218, I129M, G131V, C141A, CI41G, T144R, R147V, E149D, F156S, I157M, Y163N, Y163S, L164H, L164N, L164Q. 15 Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne en particulier un variant thermostable de l'IFN-(3 humain présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, Y3F, F8D, F8W, R11S, N14K, C17W, L21K, L21N, L21R, L24M, Y30H, I40M, 144N, Q51F, K52S, E53F, 20 D54S, L57W, I59S, N65Y, D73T, T82H, V84R, N86Y, V91K, Y92W, 1193L, T100H, V101R, F111L, G114Y, S118N, S118T, H121R, I129M, G131V, C141A, C141G, T144R, R147V, E149D, F156S,1157M, Y163N, Y163S, LI64H, L164N, et L164Q ; de préférence sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, Y3F, R11S, N14K, C17W, L24M, Y30H, 140M, I44N, K52S, V91K, Tl00H, V101R, F111L, G114Y, H121R, 25 G131V, C141G, R147V, E149D, Y163N, Y163S, L164H, et L164Q. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-13 humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S118N + 30 R147V, I59S + L164N, E53F + 1193L, L21R + VIOIR, 1157M + T82H, Y163N + 1129M, Q51F + Y92W, F8D + L57W, Y3F + D73T + V84R, S118T + T144R + L164Q, F8W + N86Y + C141A + Y163S, L21N + Y301I + D54S + N65Y + FI56S. 2907454 11 La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention, une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné de 5 préférence parmi un plasmide et un vecteur viral. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une 10 cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention. Elle concerne l'utilisation d'une telle cellule pour produire un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule 15 par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention, la mise en culture de la cellule transfectée/transformée et la récolte du variant thermostable de l'IFN-13 humain produit par la cellule. La cellule peut être procaryote ou eucaryote. 20 La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'IFN-(3 humain selon la présente invention ou un acide nucléique codant pour celle-ci. Ainsi, elle concerne en outre un variant thermostable de l'IFN-(3 humain ou une composition pharmaceutique selon la présente invention en tant que médicament. Notamment, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant 25 thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique le comprenant pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. En particulier, le médicament selon la présente invention est destiné au traitement de la sclérose en plaque, de fibroses, de maladies inflammatoires ou autoimmunes, de cancers, d'hépatites et d'autres infections virales. 30 L'IFN-13 humain selon la présente invention peut être utilisé en combinaison avec un autre principe actif, par exemple des corticoïdes, de l'acétate de glatiramer, des immunoglobulines, de la mitoxantrone, du cyclophosphamide, de l'azathioprine, du 2907454 12 mycophénolate Mofétil, du tériflunomide, de la cladribine, de la sulfasalazine, des anticorps monoclonaux (Natalizumab, Alemtuzumab) ou des statines. Le variant thermostable selon la présente invention peut également être conjugué à un 5 polymère de façon covalente ou non, ce polymère pouvant être par exemple un polyéthylène glycol (PEG). Le taux de pégylation et la taille du polymère peuvent être variables. Le variant thermostable selon la présente invention peut être utilisé dans une composition pharmaceutique, telle que décrite ci-dessus, dans sa forme conjuguée. 10 Brève description des tableaux et des figures Tableau 1 : Mutants de l'IFN-13 présentant une thermostabilité accrue identifiés en crible primaire. La numérotation des résidus correspond à celle de la SEQ ID N 3. Pour chacun des mutants, les résidus mutés sont indiqués ainsi que les acides aminés sauvage et mutant 15 selon le code à une lettre des acides aminés. Tableau 2 : Mutants de l'IFN-13 validés en crible secondaire pour leur thermostabilité accrue. La numérotation est la même que celle mentionnée ci-dessus. 20 Tableau 3 : Indices relatifs d'augmentation de thermostabilité des variants de l'IFN-[rapports des activités résiduelles exprimées en % après 30 minutes de dénaturation thermique à 60 C entre les variants de l'IFN-(3 et l'IFN-13 sauvage (IFN-(3 glycosylé) = pORF WT]. 25 Figure 1 : Activité résiduelle de l'IFN-13 sauvage (x3) produit par les cellules COS 7 (IFN13 glycosylé) (WT) comparée à l'activité résiduelle d'un IFN-13 commercial produit par E. Coli (IFN-(3 non glycosylé) (IFNb), après dénaturation thermique de 5, 10 et 30 minutes à 60 C (résultats exprimés en % d'activité par rapport à la molécule non dénaturée). 30 Figures 2: Activités résiduelles de 13 variants de l'IFN-13 comparées à l'activité résiduelle de l'IFN-(3 sauvage, après dénaturation thermique de 5, 10 et 30 minutes à 60 C (résultats exprimés en % d'activité par rapport à la molécule non dénaturée). Fig. 2907454 13 2A : Mutant Y3D ; Fig. 2B : Mutant Y3F ; Fig. 2C : Mutant R11 S ; Fig. 2D : Mutant C17W ; Fig. 2E : Mutant Y30H ; Fig. 2F : Mutant I40M ; Fig. 2G : Mutant T100H ; Fig. 2H : Mutant V101R ; Fig. 2I : Mutant F111L ; Fig. 2J : Mutant R147V ; Fig. 2K : Mutant Y163N ; Fig. 2L : Mutant Y163S ; Fig. 2M : Mutant L164Q. 5 Description détaillée de l'invention La présente invention concerne des variants de l'interféron bêta humain (IFN-13) dont la stabilité, en particulier la stabilité thermique, est accrue par rapport à l'IFN-13 humain sauvage. Cette stabilité face à la dénaturation thermique des candidats améliorés ainsi 10 que la conservation de leur activité ont été validées par des tests biologiques. De plus, ces variants protéiques de l'IFN-13 humain présentent des caractéristiques pharmacocinétiques améliorées et en particulier une demi-vie in vivo allongée. Au moins une étude a montré une corrélation entre thermostabilité améliorée d'une 15 molécule et l'augmentation de ses caractéristiques pharmacocinétiques [Cha et al, Journal of Biological Chemistry,1998, 273 (4), 2153-2160]. Dans de nombreux cas, les molécules ayant une thermostabilité augmentée sont des molécules plus compactes sur certaines zones de leur structure et cette caractéristique permettrait une meilleure résistance de ces variants aux contraintes physico-chimiques extérieures et donc une 20 demi-vie augmentée in vivo. Les variants de cette invention constituent donc des alternatives aux IFN-13 humains recombinants actuellement utilisés dans le domaine thérapeutique, notamment dans le traitement de la sclérose en plaque, de fibroses, de maladies inflammatoires ou 25 autoimmunes, de cancers, d'hépatites et d'autres infections virales. La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-13 humain comprenant au moins une substitution, et de préférence une à dix, sur un des acides aminés du groupe consistant en Y3, F8, R11, N14, C17, L21, L24, Y30, I40, I44, Q51, K52, E53, 30 D54, L57, I59, N65, D73, T82, V84, N86, V91, Y92, H93, T100, V101, F111, G114, S118, H121, I129, G131, C141, T144, R147, E149, F156, I157, Y163, L164, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3. 2907454 14 En particulier, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-13 humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une, deux, trois, quatre ou cinq substitutions décrites dans le tableau 2. 5 La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-13 humain ou un fragment fonctionnel decelui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, Y3F, F8D, F8W, R11S, N14K, C17W, L21K, L21N, L21R, L24M, Y30H, 140M, I44N, Q51F, K52S, E53F, D54S, L57W, I59S, N65Y, D73T, T82H, V84R, N86Y, V91K, Y92W, H93L, T100H, V101R, F111L, 10 G114Y, S118N, S118T, H121R, I129M, G131V, C141A, C141G, T144R, R147V, E149D, F156S, I157M, Y163N, Y163S, L164H, L164N, L164Q et de préférence une combinaison de 1 à 5 substitutions sélectionnées dans ce groupe. Par ailleurs, le variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention peut 15 comprendre d'autres substitutions non décrites dans ce groupe parmi les positions énumérées ci-dessus. Par exemple, ces substitutions peuvent être des substitutions dites conservatives , c'est-à-dire des substitutions à l'intérieur d'un groupe d'acides aminés présentant des caractéristiques similaires, les acides aminés ayant un faible encombrement stérique, les acides aminés acides, basiques, polaires, hydrophobes et 20 aromatiques selon le tableau ci-dessous : Faible encombrement Ala (A) Gly(G) Sér (S) Thr (T) stérique Acides Asp (D) Glu (G) Basiques Arg (R) His (H) Lys (K) Polaires Asn (N) Gln (Q) Hydrophobes Ile (I) Leu (L) Met (M) Val (V) Aromatiques Phe (F) Tyr (Y) Trp (W) Par ailleurs, le variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention peut 25 comprendre d'autres mutations non décrites dans ce groupe, de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. Dans un mode de réalisation particulier, le variant thermostable de l'IFN-13 humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprend au maximum 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substitution par rapport à l'IFN-(3 humain sauvage, notamment par rapport à la séquence SEQ ID No 3. 30 2907454 15 Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-f3 humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, Y3F, F8D, F8W, R11S, N14K, C17W, L21K, L21N, L21R, I,24M, Y30H, I40M, 144N, Q51F, K52S, 5 E53F, D54S, L57W, I59S, N65Y, D73T, T82H, V84R, N86Y, V91K, Y92W, H93L, TIOOH, V101R, F111L, G114Y, S118N, S118T, H121R, I129M, G131V, C141A, CI41G, T144R, R147V, E149D, F156S, I157M, Y163N, Y163S, L16411, L164N, et L 164Q. De préférence, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, R11S, N14K, C17W, L21K, L24M, I40M, I44N, K52S, V91K, T100H, F111I,, 10 G114Y, H121R, G131V, C141G, E149D, et L164H. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-(3 humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S 118N + 15 R147V, I59S + L164N, E53F + H93L, I,21R + V101R, I157M + T821-I, Y163N + I129M, Q51F + Y92W, F8D + L57W, Y3F + D73T + V84R, S 118T + T144R + L164Q, F8W + N86Y + C141A + Y163S, L21N + Y3011+ D54S + N65Y + F156S. La séquence SEQ ID N 1 décrit un exemple de séquence nucléique codant pour l'IFN- 20 (3 humain. Un acide nucléique codant pour un variant selon la présente invention peut facilement être préparé sur la base de ces séquences par les techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par mutagenèse dirigé du codon à modifier pour obtenir la substitution d'acide aminé désirée. 25 Les séquences SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3 décrivent les séquences protéiques de l'IFN-f3 humain précurseur et mature, respectivement. Ainsi, la séquence du variant thermostable de l'IFN-(3 humain selon la présente invention correspond à SEQ ID N 2 ou N 3 incluant la ou les substitutions sélectionnées. 30 Par fragment fonctionnel est entendu un fragment de l'IFN-f3 humain présentant l'activité de l'IFN-j3 humain. Le fragment peut comprendre environ 100, 110, 120, 130 ou 140 acides aminés consécutifs de l'IFN-(3 humain. 2907454 16 Les variants de la présente invention présentent une augmentation de la thermostabilité par rapport à l'IFN-13 humain sauvage. Par thermostabilité , est entendue la capacité de la protéine à conserver son activité après avoir été soumise à l'action de la chaleur. Par exemple, la protéine peut être incubée 10 minutes à 60 C. La thermostabilité du 5 variant est alors estimée par le pourcentage d'activité résiduelle après ce prétraitement. Cette mesure de la thermostabilité d'un variant est alors comparée à la même valeur obtenue en utilisant l'IFN-13 humain sauvage produit dans les mêmes conditions. Un indice de thermostabilité des différents variants par rapport à la molécule sauvage peut donc être donné par le rapport des activités résiduelles obtenues après 30 minutes de 10 dénaturation thermique à 60 C entre ces différents variants et la molécule sauvage. L'augmentation de la thermostabilité des variants de la présente invention, par rapport à l'IFN-13 humain sauvage, est donnée par le rapport des indices de thermostabilité. La thermostabilité des variants de la présente invention est augmentée d'au moins un 15 facteur 1,5 et de préférence d'au moins un facteur 2, 3 ou 4. Un variant qui présente une thermostabilité améliorée mais une activité réduite peut être utilisable. De préférence, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité (condition sans prétraitement) qui correspond à au moins 10 % de l'activité 20 de l'IFN-(3 humain sauvage, et de préférence à au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 % de l'activité de l'IFN-(3 humain sauvage. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité équivalente à celle de l'IFN-13 humain sauvage, voire augmentée. 25 La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention. La présente invention concerne également une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un 30 plasmide et un vecteur viral. L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN ou un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplex ou un mélange des deux. Il 2907454 17 peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, la mutagenèse, etc... 5 La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression 10 comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes 15 préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux 20 techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology). La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d'expression codant pour un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente 25 invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, S. cerevisiae) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une 30 cellule d'insecte, de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS, CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc... Le vecteur peut comprendre de préférence un ou 2907454 18 plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDlO, phagescript, psiXl74, pbluescript SK, 5 pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs 10 viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc... De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral. La séquence codant l'IFN-13 humain selon la présente invention peut comprendre ou ne 15 pas comprendre le peptide signal. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d'insecte ou d'une levure. 20 La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFN-13 humain et son utilisation pour produire un variant thermostable de l'IFN-13 25 humain recombinant selon la présente invention. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFN-(3 humain recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant 30 thermostable de l'IFN-(3 humain produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant thermostable de l'IFN-13 humain recombinant selon la présente invention comprend la fourniture d'une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la 2907454 19 présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFN-(3 humain produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous 5 forme d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446582, Wang et al. [Sci. Sin. B 24:1076-1084, (1994) et Nature 295, page 503] pour une production dans E. coli, et James et al. [Protein Science (1996), 5:331-340] pour une production en cellules 10 mammifères. L'activité in vitro de l'IFN-13 humain peut être déterminée en mesurant son activité antivirale, par la capacité de l'IFN-(3 à réduire l'effet cytopathique de virus sur des lignées cellulaires sensibles à ces virus. Plusieurs couples virus/lignées cellulaires sont 15 disponibles parmi lesquels ECMV (virus de l'encéphalomyocardite)/HuH7 (lignée hépatique humaine), ECMV/Hela, ECMV/WISH, VSV (virus de la stomatite vésiculaire)/HuH7, VV (virus de la vaccine)/Hela, YFV (virus de la fièvre jaune)/HepG2, HIV(virus de l'immunodéficience humaine)/CD4 primaire. 20 L'activité antiproliférative de l'IFN-13 peut également être déterminée grâce à des tests basés sur l'utilisation des lignées cellulaires humaines Daudi. L'activité de l'IFN-13 peut également être testée en utilisant un gène rapporteur, par exemple la luciférase, placée sous le contrôle d'un promoteur sensible à l'IFN-(3 25 contenant des élements ISRE (Interferon Stimulated Response Element). La production du gène rapporteur est ainsi dosée en réponse à une stimulation par l'IFN-13. Le vecteur pISRE/luciférase est disponible commercialement. L'activité de l'IFN-13 peut également être testée en utilisant un kit commercial proposant 30 des cellules reportrices reporter cell désignées PIL5 dérivées de la lignée cellulaire U937 (ATCC#CRL-1593.2). Ces cellules contiennent de façon stable un élément rapporteur de l'activité IFN-13 (contenant des éléments ISRE) couplé à un gène 2907454 20 luciférase. Ce kit Human Type I Interferon Activity Detection Kit est disponible commercialement auprès de la société Neutekbio Ltd. L'augmentation de la thermostabilité de l'IFN-13 tout en conservant son activité 5 biologique permet d'envisager l'élaboration de traitements plus efficaces permettant, à activité biologique égale, une réduction des doses thérapeutiques

utilisées et donc une réduction des effets secondaires indésirables associés au traitement. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un 10 variant de l'IFN-13 humain thermostable selon la présente invention. La présente invention peut également concerner une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant un variant de l'IFN-13 humain thermostable selon la présente invention. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. De tels supports et excipients sont bien 15 connus de l'homme du métier [Remington's Pharmaceutical Sciences, l8th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press(2000)]. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre 20 un autre principe actif. La présente invention concerne également un variant de l'IFN-13 humain thermostable selon la présente invention en tant que médicament.

25 Les IFN-13 de la présente invention peuvent entrer dans des compositions pharmaceutiques appropriées pour les voies d'administration actuelles de l'IFN-13, à savoir, orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration.

30 Il se peut que certaines molécules mutantes de l'IFN-13 de la présente invention, par leurs caractéristiques propres, puissent permettre l'utilisation de voies nouvelles d'administration de 1' IFN-(3, à savoir, orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, 2907454 21 intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration.

5 Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des gels, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales ou injectables, des timbres transdermiques (patch), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou 10 intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est liquide.

15 Les dites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 100 g de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le 20 mode d'administration, le poids et la réponse du patient. Dans un mode de réalisation préféré, l'IFN-13 est administré par la voie parentérale, et préférentiellement par injection sous-cutanée. Par exemple, une dose habituelle de l'IFN-(3 par injection sous-cutanée est comprise entre 1 et 100 g/m2 si la surface corporelle est supérieure à 0,5 m2 et entre 0,01 et 10 g/kg de poids corporel si la surface corporelle est inférieure ou égale 25 à 0,5 m2. L'IFN-13 a été approuvé par la FDA dans le traitement de la forme récurrente-rémittente de cette maladie en 1996. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFN-(3 humain thermostable ou d'une composition pharmaceutique selon la 30 présente invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter, dans un mode de réalisation particulier, la sclérose en plaque.

2907454 22 L'IFN-13 a été également pressenti pour avoir un intérêt dans de nombreuses autres maladies autoimmunes, inflammatoires, infections virales et cancers. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFN-13 humain thermostable ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention pour la préparation d'un 5 médicament immunomodulateur, antiviral ou antiprolifératif destiné au traitement d'autres maladies autoimmunes, de maladies inflammatoires, d'infections telles que des hépatites et d'autres infections virales, de cancers, de fibroses, de troubles osseux, etc... Le variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention peut être utilisé 10 en combinaison avec un autre principe actif, par exemple un principe actif sélectionné parmi un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un bronchodilatateur, un stéroïde, un agent bêta-adrénergique, un agent immunomodulateur, des immunoglobulines, une cytokine, l'hydroxyurée, un agent 15 alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un analogue nucléosidique de la guanosine présentant une activité antivirale (ou un dérivé), un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclooxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, un antagoniste du calcium et une combinaison 20 de ceux-ci. Dans un mode de réalisation particulier ce principe actif peut être de l'acétate de glatiramer, de la mitoxantrone, du cyclophosphamide, de l'azathioprine, du mycophénolate Mofétil, du tériflunomide, de la cladribine, de la sulfasalazine ou des statines.

25 Le principe actif additionnel peut être administré avant, simultanément ou après l'administration d'IFN-13 selon la présente invention. De plus, il peut être administré par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes. Ainsi, la présente invention concerne un produit comprenant un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention et un autre principe actif, de préférence sélectionné 30 dans la liste ci-dessus, pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée pour le traitement d'une des pathologies citées ci-dessus.

2907454 23 Le variant thermostable selon la présente invention peut également être conjugué à un polymère de façon covalente ou non, ce polymère pouvant être par exemple un polyéthylène glycol (PEG). Le taux de pegylation et la taille du polymère peuvent être variables. Le variant thermostable selon la présente invention peut être utilisé sous sa 5 forme conjuguée dans une composition pharmaceutique telle que décrite dans le paragraphe ci-dessus. La présente invention concerne en outre une méthode de traitement antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur chez un patient le nécessitant, comprenant 10 l'administration à ce même patient d'une quantité thérapeutique efficace d'un variant thermostable de l'IFN-13 humain selon la présente invention. De préférence, la méthode de traitement est destinée au traitement d'une pathologie citée ci-dessus. Facultativement, la méthode peut comprendre en outre l'administration d'un autre principe actif, de préférence sélectionné parmi ceux cités ci-dessus.

15 Exemples : Exemple 1 : Identification de mutants thermostables de l'IFN-13. La liste des mutants de l'IFN-13 identifiés par leur thermostabilité améliorée dans un 20 crible primaire de thermostabilité est présentée dans le tableau 1. Les mutations portées par les clones sélectionnés ont été identifiées ; la numérotation des résidus correspond à celle de la SEQ ID N 3. Pour chacun des mutants, les résidus mutés sont indiqués ainsi que les acides aminés sauvage et mutant selon le code à une lettre des acides aminés.

25 Les différents mutants isolés lors de cette sélection primaire ont été transformés à nouveau individuellement et leurs niveaux de thermostabilité comparés à celui de l'IFN-13 sauvage. La liste des mutants de l'IFN-13 confirmés pour leur thermostabilité améliorée dans ce 30 crible secondaire est présentée dans le tableau 2. La numérotation des résidus est la même que celle mentionnée ci-dessus.

2907454 24 Exemple 2 : Analyse fonctionnelle des mutants thermostables de l'IFN-13 Les variants de l'IFN-13 humain ainsi sélectionnés pour leur thermostabilité améliorée ont été exprimés transitoirement en cellules animales COS-7. Ces protéines sont sécrétées dans le surnageant de culture. De façon à évaluer la stabilité et la conservation 5 de l'activité de ces variants, les surnageants de culture de cellules COS-7 ont été soumis ou non à une dénaturation thermique (5, 10 et 30 minutes à 60 C). Ces protéines (dénaturées ou non) ont ensuite été mises en contact avec les cellules PIL5 du kit Human Type I Interferon Activity Detection Kit (Neutekbio Ltd.), contenant la luciférase comme gène rapporteur, celle-ci étant placée sous contrôle d'un promoteur 10 contenant des éléments ISRE sensibles à l'IFN-13. Après une stimulation sur la nuit, pour chaque mutant et pour chaque condition, le signal de la firefly luciférase correspondant à l'activité de l'IFN-13 testé a été mesuré. Chaque mutant testé a été comparé à l'IFN-13 sauvage traité dans les mêmes conditions. Les activités induites par la protéine non dénaturée et par cette même protéine dénaturée 5, 10 et 30 minutes à 15 60 C ont permis de suivre l'évolution de l'activité au cours du temps et d'établir l'activité résiduelle du mutant en comparaison de celle de l'IFN-13 sauvage. Culture cellulaire Tous les réactifs de culture cellulaire concernant les cellules COS-7 (African green 20 monkey SV40 transformed kidney cells) ont été fournis par Invitrogen. Les cellules COS-7 ont été cultivées dans des conditions standards de culture (37 C en atmosphère humide contenant 5% CO2) en utilisant un milieu Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM). Ces milieu de culture contient un analogue de la L-glutamine (le glutamax) et est supplémenté en sérum de veau foetal décomplémenté (10% final) et en 25 antibiotiques à raison de 50 units/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine. Le vecteur pSV-bêtagal TM (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle du promoteur précoce SV40, a été utilisé pour normaliser les efficacités de toutes les transfections réalisées. Les cellules PIL5 du kit Human Type I Interferon Activity Detection Kit (Neutekbio 30 Ltd.) ont été cultivées suivant les conditions préconisées par le kit.

2907454 25 Expression des mutants de l'IFN-(3 humain en cellules de mammifères COS-7 Afin de réaliser les transfections des cellules COS-7 par les constructions pORF/IFN-(3 natif ou muté, ces cellules ont été trypsinées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence. Les cellules COS-7 ont été ré-ensemencées suivant le ratio 1/4 (c'est-à-dire de façon à ce 5 qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une confluence de 25% environ). La transfection des cellules COS-7 a été réalisée en plaque 24 puits avec un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules atteignaient 70-80% confluence. La transfection a été réalisée avec environ 50ng d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEI/ADN de 5 pendant 30 minutes à 10 température ambiante. Après 24 heures de transfection, le milieu (500 L IMDM + SVF + antibiotiques) a été changé. Les surnageants contenant l'IFN-13 ont été récupérés à T=24H post-transfection. Ils ont été aliquotés et conservés à -20 C. Avant le dosage de l'activité des IFN-13, les quantités d'IFN-13 exprimées par chaque surnageant ont été déterminées sur un aliquot par dosage ELISA (kit Biosource). Ce dosage a été effectué 15 en triplicata pour chacun des mutants. Mesure de l'activité résiduelle des variants de l'IFN-13 par gène rapporteur luciférase après dénaturation thermique Avant de déterminer leur activité résiduelle, les différents variants de l'IFN-13 exprimés 20 dans les surnageants de culture de cellules COS-7 ont été dilués dans un milieu contenant 0,25% de sérum de veau foetal décomplémenté et ont été finalement ajustés à 75 IU/ml d'IFN-(3 dans 0,25% de sérum de veau foetal décomplémenté. Ceux-ci ont ensuite été soumis à une dénaturation thermique de 5, 10 et 30 minutes à 60 C. Les différents variants, dénaturés ou non, ont ensuite été mis en contact avec les cellules 25 PIL5 du kit Human Type I Interferon Activity Detection Kit (Neutekbio Ltd.), contenant la luciférase comme gène rapporteur, celle-ci étant placée sous contrôle d'un promoteur contenant des éléments ISRE sensibles à l'IFN-13. Après une stimulation sur la nuit, pour chaque mutant et pour chaque condition, les culots de cellules sont récupérés et congelés. Le test de l'activité luciférase est initialisé par l'ajout de 50 L de 30 Steady Glow (Kit Neutekbio) pour lyser les cellules. La lyse est effectuée pendant 10 min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase produite en réponse à la stimulation spécifique de l'IFN-13 et la quantité de luciférase accumulée est ensuite comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument).

2907454 26 L'une des façons de présenter la fraction d'activité de chaque variant conservée après dénaturation thermique est de calculer l'activité résiduelle conservée de chaque variant définie par le pourcentage de l'activité basale du même variant avant dénaturation. Le 5 calcul de l'activité résiduelle par rapport à une activité totaledéterminée avant dénaturation est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées sur la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m).

10 Les résultats d'activité résiduelle de 13 variants, après dénaturation thermique de 5, 10 et 30 minutes à 60 C, sont décrits dans les figures 1-8. Calcul d'un indice d'amélioration de la thermostabilité des variants de l'IFN-13 15 Cet indice, pour chaque variant de l'IFN-13, a été calculé par le rapport entre le pourcentage d'activité résiduelle de chaque variant déterminée après 30 minutes de dénaturation thermique à 60 C et l'activité résiduelle de l'IFN-13 sauvage déterminée dans les mêmes conditions. Cet indice donne une idée du gain de thermostabilité de chaque variant.

20 Les indices de thermostabilité obtenus sur 13 variants sont décrits dans le tableau 3. Exemple 3 : Validation in vivo de la pharmacocinétique des mutants thermostables Le but de cette étude est de déterminer la demi-vie in vivo des variants de l'IFN-13 et de 25 la comparer à celle de l'IFN-13 sauvage. L'IFN-13 sauvage et les variants thermostables sont produits et purifiés à partir de surnageants de cellules de mammifères en culture (COS-7 ou CHO). Après injection intraveineuse chez la souris, des prélèvements sanguins sont effectués régulièrement pour déterminer l'évolution au cours du temps de la concentration et de l'activité résiduelle in vivo des variants thermostables, comparée à 30 celle de la molécule sauvage. Les concentrations sont déterminées par dosage ELISA de l'IFN-13 et les activités résiduelles par le test pISRE/Luciférase sur cellules HeLa décrit précédemment.

2907454 27 Animaux utilisés Les animaux utilisés pour cette étude sont des souris C57BL/6. Les animaux sont acclimatés pendant une semaine sous une température constante de 24,1 C, une humidité constante de 55% et des cycles repos/sommeil de 12 heures.

5 Après la semaine d'acclimatation, l'expérience est réalisée sur une journée pour chaque animal, suivie par l'euthanasie correspondant au dernier point de la cinétique. Doses injectées et mode d'injection La demi-vie de l'IFN-13 est déterminée par une administration intraveineuse (veine 10 caudale) de 100-200 l par souris, représentant une dose injectée de 3 à 10 g des cytokines à tester. [P. Kurre et al. Experimental Hematology 30 (2002) 1257-1262 ; Rutenfranz et Kirchner, J.Interferon Res., 1988, Oct 8 (5) : 573-80]. Les cytokines à tester sont injectées dans une solution isotonique (20 mM acétate de sodium, 140 mM chlorure de sodium).

15 Prélèvements Les prélèvements de sang sont effectués au niveau du sinus rétro-orbitaire. Chaque animal est prélevé deux fois au maximum. Le volume des prélèvements est de 50 l. La cinétique de chaque molécule comporte les points suivants : 0,5 ; 1h ; 2h ; 4h ; 6h & 12h.

20 Chaque cytokine est testée sur cinq souris. Avant administration intraveineuse, un échantillon sanguin est prélevé dans la veine de la queue pour s'assurer qu'aucune activité basale d'IFN-13 n'était détectable. Les sérums utilisés dans les tests ELISA et tests d'activité sont préparés en laissant coaguler le sang pendant 20 minutes à température ambiante suivi d'une centrifugation 25 à 20 C de 20 minutes à 5000 g. Les sérums sont ensuite isolés et stockés à -80 C. Exemple 4 : Validation ex-vivo de la pharmacocinétique des mutants thermostables Le but de cette étude est de déterminer la résistance à la protéolyse des variants de l'IFN-13 et de la comparer à celle de l'IFN-13 sauvage en mesurant l'activité résiduelle 30 des différentes molécules après incubation dans des plasmas et sérums humains pendant des temps variables. L'IFN-13 sauvage et les variants thermostables sont produits et purifiés à partir de surnageants de cellules de mammifères en culture (COS-7 ou CHO).

2907454 28 Différentes quantités des cytokines à tester (molécule sauvage et variants) sont incubées dans 1 ml de sérum ou plasma humain à 37 C, représentant une gamme de concentrations de cytokines allant de 2 pg/ml à 30 ng/ml. Les temps d'incubation sont de 0 ; 0,5 ; 2 ; 4 ; 24 ; 48 & 72 heures. Aux temps appropriés les différents extraits sont 5 immédiatement congelés jusqu'à leur utilisation dans les tests in vitro. Plusieurs tests in vitro sont réalisés sur les différents échantillons : 1) Mesure de la concentration résiduelle en cytokine par ELISA 2) Tests d'activités par le test pISRE/Luciférase sur cellules HeLa comme décrit précédemment. 10 3) Immunoprécipitation de l'IFN-13 et détermination des quantités résiduelles par western Blot.

2907454 TABLEAU I NOM DU MUTANT MUTATIONS PORTEES S118N R147V E53F H93L L21K B388 F8W N86Y C141A Y163 B388 H121R 3898 i B48B L102C C141R Y155S a2 Y3D e 7 G131V Mi F1111 4 E149S B.42 V1 011 B4.4.3 E5 S B$37 L21R VIOIR B488 E 149D S118T T144R L164Q 2 C17W E:MB i 3484 I59 L 164 N S76T Y163V BB8 3 L32S 14 4R BB8 8 140M 8 3 e5 M T82H B711 Y163N I1 29M B733 L164H W22 R G7I L4 7A N86P A142Y a7B 3 K108 F E7'78 C141G B' S E85 R K136L B783 G162P E 104A M36 E K52E SZav L24 M a7,34 R11S B785 Q51F Y92W B381 K52S Flll L T144R am 9 F8D L57W EU 0 K52S V91K M2 Y3F D73 V84R BU 4 L21N Y3 0H D54 N65 F156S B888 T100H N14K B8.4.

144 N BBSB G114 29 2907454 TABLEAU 2 NOM DU MUTANT MUTATIONS PORTE ES S8 S118N R14 V B93 E53F H9 L 8390 L 1K 8395 F W N86Y C141A Y163S 8399 H121R 13402 Y3D E407 G131V B457 L21R VOIR 58 E149D 60 S118T T144R L1 6 O 82 C17 W 89 15 9 L16 N 8638 14OM B 3 1157M T 2H 8711 Y163N 1129M B73'3 L1 6 H 8778 C141G 8789 L 4 M 8794 R11S B795 Q51F Y9 W Bae! K5 S 8818 F111L 13819 F D L 7W B; 0 V91K B822 Y3F D73 V8 R B824 L21N Y30H D54S N65 F15 S B838 TIOOH B846 N14K B848 14 N Basa G114 30 2907454 31 TABLEAU 3 Mutants Indices relatifs d'augmentation de thermostabilité Y3D 4 Y3F 1,75 R11 S 1,6 C17W 4,15 Y30H 2,6 140M 1,5 T100H 2 V101R 1,9 F111 L 3,65 R147V 2 Y163N 2,1 Y163S 1,5 L164Q 3,1 pORF WT 1

Claims (16)

Revendications

1- Variant thermostable d'un interféron bêta humain (IFN-f3) ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sur un des acides aminés du groupe consistant en Y3, F8, R11, N14, C17, L21, L24, Y30, I40, I44, Q51, K52, E53, D54, L57, 159, N65, D73, T82, V84, N86, V91, Y92, H93, T100, V101, F111, G114, S118, 1-1121, 1129, G131, C141, T144, R147, E149, F156, 1157, Y163, et L164, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3.

2- Variant thermostable d'un IFN-13 selon la revendication 1, dans lequel le variant présente au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, Y3F, F8D, F8W, R11S, N14K, C17W, L21K, L21N, L21R, L24M, Y30H, I40M, I44N, Q51F, K52S, E53F, D54S, L57W, I59S, N65Y, D73T, T82H, V84R, N86Y, V91K, Y92W, H93L, T100H, V101R, FI11L, G114Y, S118N, SI 18T, H121R,1129M, G131V, C141A, C141G, T144R, R147V, E149D, F156S, I157M, Y163N, Y163S, L164H, L164N, L164Q, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3.

3- Variant thermostable d'un IFN-f3 selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le variant présente une unique substitution, de préférence sélectionnée parmi le groupe consistant en Y3D, R11S, N14K, C17W, L21K, L24M, I40M, I44N, K52S, V91K, T1001-1, F111L, G114Y, H121R, G131V, C141G, E149D, L164H, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3.

4- Variant thermostable d'un IFN-(3 selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le variant présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S118N + R147V, I59S + L164N, E53F + H93L, L21R + V101R, I157M + T821-I, Y163N + I129M, Q51F + Y92W, F8D + L57W, Y3F + D73T -1 V84R, S118T + T144R + L164Q, F8W + N86Y + C141A + Y163S, L21N + Y301-I + D54S + N65Y + F156S, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3.

5- Variant thermostable de l'IFN-(3 selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence est SEQ ID N 2 et N 3 avec la ou les substitutions sélectionnées. 32 2907454 33

6- Acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFN-(3 selon l'une quelconque des revendications 1-5. 5

7- Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 6.

8- Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 6 ou une cassette d'expression selon la revendication 7. 10

9- Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 6 ou une cassette d'expression selon la revendication 7 ou un vecteur selon la revendication 8.

10- Composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'IFN-13 selon l'une quelconque des revendications 1-5.

11- Composition pharmaceutique selon la revendication 10, comprenant en outre au moins un autre principe actif.

12- Composition pharmaceutique selon la revendication 10 ou 11, pouvant être 20 administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, infra- auriculaire.

13- Variant thermostable de l'IFN-(3 selon l'une quelconque des revendications 1-5 ou 25 composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 10-12 en tant que médicament.

14- Utilisation d'un variant thermostable de l'IFN-(3 selon l'une quelconque des revendications 1-5 ou d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des 30 revendications 10-12 pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. 15 2907454 34

15- Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle le médicament est destiné au traitement de la sclérose en plaque, de fibroses, de maladies inflammatoires ou autoimmunes, de cancers, d'hépatites et d'autres infections virales. 5

16- Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 6, une cassette d'expression selon la revendication 7, un vecteur selon la revendication 8 ou d'une cellule selon la revendication 10 pour produire un variant thermostable de IFN-13 selon l'une quelconque des revendications 1-5. 10