NO175487B - Rekombinante plasmider for bruk ved fremstilling av derivat av humant interferon--polypeptid samt fremgangsmåte for fremstilling derav - Google Patents

Rekombinante plasmider for bruk ved fremstilling av derivat av humant interferon--polypeptid samt fremgangsmåte for fremstilling derav

Info

Publication number
NO175487B
NO175487B NO852776A NO852776A NO175487B NO 175487 B NO175487 B NO 175487B NO 852776 A NO852776 A NO 852776A NO 852776 A NO852776 A NO 852776A NO 175487 B NO175487 B NO 175487B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
ifn
dna
escherichia coli
polypeptide
cys
Prior art date
Application number
NO852776A
Other languages
English (en)
Other versions
NO175487C (no
NO852776L (no
Inventor
Seiga Itoh
Yasutoshi Takeichi
Moriyuki Sato
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=15350817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO175487(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Kk filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Kk
Publication of NO852776L publication Critical patent/NO852776L/no
Publication of NO175487B publication Critical patent/NO175487B/no
Publication of NO175487C publication Critical patent/NO175487C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante plasmider for bruk ved fremstilling av derivat av humant interferon-^-polyptid samt fremgangsmåte for fremstilling derav.
Interferoner (i det følgende betegnet IFN) kan såvidt vites klassifiseres i tre grupper, nemlig IFN-cx, IFN-p og IFN-7. IFN-a produseres hovedsakelig fra leukocytter (IFN-p fra fibroblaster og IFN-*y fra T-lymfocytter. Disse IFN'er er blitt beskrevet som biologisk aktive stoffer med antiviral aktivitet, aktiverende aktivitet på naturlige killerceller og makrofager, antitumoraktivitet og lignende.
Hva angår IFN-7 er det rapportert at det har en sterkere celleinhiberende aktivitet enn andre IFN'er basert på det forsøk som gjør bruk av dyreceller ]B.Y. Rubin og S.L. Gupta: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77, 5928-5932
(1980)§. Videre er kloning av en IFN-7 cDNA og bestemmelse av dens basesekvens nylig rapportert [P.W. Gray, et al.,: Nature 295, 503 (1982), R. Devos, et al.: Nucleic Acids Research 10, 2487 (1982)].
I foreliggende sammenheng har man uavhengig klonet en cDNA som koder for et hittil ukjent IFN-7, hvori, som det fremgår av basesekvensen som vist i tabell 1, den 9. aminosyre av det modne IFN-7 rapportert av Devos et al., lysin (Lys) (AAA) er erstattet med glutamin (Gin) (CAA). Videre ble IFN-7 cDNA inkorporert i vektor pKYP-10 med en tryptofanpromotor (JP publisert, ikke undersøkt JP-patentsøknad nr. 110600/83), og masseproduksjon av IFN-"y er oppnådd i Escherichia coli.
Videre har produksjonen av derivater av IFN-7 polypeptid blitt studert under anvendelse av den IFN-7 cDNA som er vist i tabell 1, som utgangsmateriale.
Det ble rapportert at utsletting av 11 aminosyrer fra C-terminalen i IFN-a, nedsatte den spesifikke aktivitet til en tredjedel [A.E. Franke, et al.; DNA 1, 223-230 (1982)] mens addisjon av 18 aminosyrer til N-terminalen i IFN-a ikke forandret den spesifikke aktivitet (R.M. King, et al.: Virol. 64, 1815-1818 (1983)§.
Man har i forbindelse med foreliggende oppfinnelse funnet at utslettelse av 5 aminosyrer fra N-terminalen i IFN-p nedsatte den spesifikke aktivitet til ca. 1/100 [T. Nishi, et al.: DNA 2, 265-273 (1983)], og addisjon av 7 aminosyrer til N-terminalen i IFN-p nedsatte den spesifikke aktivitet til 1/10 [S. Itoh, et al.: DNA 3, 157-165 (1984)].
Man har videre konstruert et derivat av IFN-7 hvori den tredje aminosyren i IFN--y som vist i tabell 1, cystein (Cys), var erstattet med tyrosin (Tyr) (i det følgende betegnet 3-Tyr-IFN-i-) og funnet at den spesifikke aktivitet var 2 til 4 ganger så sterk som aktiviteten til stam-IFN-*Y. Videre ble de derivater hvori Cys i stilling 1 var erstattet med serin (Ser) (l-Ser-IFN-7), Cys i stilling 3 var erstattet med Ser (3-Ser-IFN--Y ), og N-terminale aminosyrer i IFN--y vist i tabell 1 var utslettet, konstruert. Ekvivalent eller større interferonaktivitet ble detektert for alle derivatene sammenlignet med utgangs-IFN-7.
Det har vært kjent at murint modent IFN-^ består av 136 aminosyrer, hvilket antall er 10 mindre enn antallet av aminosyrer i humant IFN-^y, og det er mer varmestabilt enn humant IFN-7. Murint IFN-t har Cys i stilling 136 så vel som i stilling 1 og 3, og disse Cys danner de sulfidbindinger i molekylet, hvilke anses for å bidra til stabilisering av IFN [S. Goeddel, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 5842-584-6)].
Man har i forbindelse med foreliggende oppfinnelse fremstilt molekylmodellen av IFN--Y og antatt at dannelsen av disulfid-binding i molekylet for humant IFN--y var mulig ved innføring av Cys mellom stilling 135 og 138 fra N-terminalen, fortrinnsvis ved stilling 137. Flere derivater av IFN-^ hvori C-terminale aminosyrer var utslettet, og Met i stilling 137 erstattet med Cys, har vist seg å ha forøket varmestabilitet og spesifikk aktivitet.
Foreliggende rekombinante plasmid kan anvendes for å uttrykke et hittil ukjent derivat av humant IFN-7 polypeptid, hvori visse aminosyrer fra humant IFN-7 polypeptid er fjernet, og visse aminosyrer forskjellige fra nevnte aminosyrer er erstattet med andre aminosyrer. De hittil ukjente derivater har høy IFN-7 aktivitet og forventes å bli nyttige som legemidler, slik som antivirale midler og antitumormidler.
De medfølgende tegninger viser:
Fig. 1 et flytskjema for konstruksjon av plasmid pGVT137. Som setene for Hinfl og Taql er kun de som anvendes for konstruksjon angitt. Fig. 2 er et flytskjema for konstruksjon av plasmid pGNC5. Som seter for Taql er kun angitt de som anvendes for konstruksjonen. Fig. 3 er et flytskjema for konstruksjon av plasmid pGNB4. Som seter for Taql er kun angitt de som anvendes for konstruksj onen.
Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et rekombinant plasmid, hvori en DNA som koder for et hittil ukjent derivat av humant IFN-7 er inkorporert, og en fremgangsmåte for fremstilling av et hittil ukjent derivat av humant IFN-"Y polypeptid under anvendelse av mikroorganismen.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et rekombinant plasmid, som bærer et inkorporert DNA-fragment som koder for og som kan uttrykke et nytt derivat av humant interferon-^ polypeptid, hvor visse aminosyrer av humant interferon-^ polypeptid er fjernet, og visse aminosyrer forskjellige fra nevnte aminosyrer er erstattet med andre aminosyrer, kjennetegnet ved at det er valgt blant pGVT137 (fig. 1, 137-Cys-IFN--Y (A138-146)), og som bæres av Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547),
pGNC5 (fig. 2, l-Ser-137-Cys-IFN--y (M38-146)), og som bæres av Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) og
pGNB4 (fig. 3, 3-Ser-137-Cys-IFN--y (A138-146)), og som bæres av Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et derivat av humant interferon-"Y polypeptid, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man i et medium dyrker en mikroorganisme transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 1, akkumulerer derivatet av humant interferon-^ polypeptid i dyrkningsmediet og utvinner derivatet av humant interferon-^ polypeptid derfra, hvilken mikroorganisme velges blant Escerichia coli IGVT137 (FERM BP-547), Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) og Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
Konstruksjon av det rekombinante plasmid utføres under anvendelse av cDNA oppnådd fra mRNA som koder for IFN-7 ved rekombinant DNA-teknologi eller kromosomal DNA som koder for IFN-"y som utgangsmateriale.
I foreliggende oppfinnelse kan en vilkårlig human IFN-^ cDNA anvendes, og pIFN--y-G4 er særlig foretrukket. Escherichia coli inneholdende pIFN-G4 er deponert i American Type Culture Collection, USA, under betegnelsen ATCC 39123.
DNA-sekvensen IFN-7 DNA i pIFN-G4 ble bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert [Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560
(1977)] og er vist i tabell 1.
Sammenligning mellom den humane IFN-7 cDNA i pIFN-G4 og den kjente IFN-7 cDNA [R. Devos, et al.: Nucleic Acids Research, 10 2487 (1982)] viser følgende. Den første basen i tri-pletten, som koder for den 9. aminosyren fra N-terminalen i det modne, humane IFN-^ polypeptidlysin, i den kjente cDNA, er adenin (A) [R. Davos, et al.: Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)]. På den annen side, når den tilsvarende basen i PIFN-7-G4 cDNA er cytosin (C), er den 9. aminosyren fra N-terminalen i det humane IFN-^ polypeptid kodet av PIFN--Y-G4 cDNA, glutamin og ikke lysin. Det er derfor innlysende at pIFN--Y-G4 koder for et hittil ukjent humant IFN-7 polypeptid.
Derivater av IFN-7 oppnådd ved utslettelse eller utskifting av aminosyrer i IFN-7 vist i tabell 1, er også hittil ukjente IFN-^-derivater.
Som det plasmid som skal inkorporere en DNA som koder for IFN-7 derivat, kan et vilkårlig plasmid anvendes så lenge den deri inkorporerte DNA kan uttrykkes i Escherichia coli. Fortrinnsvis kan et plasmid hvori en fremmed DNA kan innsettes nedstrøms fra en egnet promotor slik som tryptofanpromotor (Ptrp), lac-promotor eller Pj^-promotor av X-fag, og lengden mellom Shine-Dalgarno-sekvens (i det følgende benevnt SD-sekvens) og initieringskodon (ATG) inn-stilles, f.eks. til 6-18 basepar, benyttes. Foretrukne eksempler er pKYPlO, pKYPll og pKYP12, som ble konstruert av oppfinnerne i foreliggende oppfinnelse (publisert, ikke-undersøkt JP-patentsøknad nr. 110600/83).
Som vist på fig. 1 spaltes pGBDl (referanseeksempel 1) med BamEI og Taql, og nedbrytningsproduktet renses ved poly-akrylamidgel-elektroforese [A.M. Maxam, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 560(1977)] for oppnåelse av et DNA-fragment på ca. 310 basepar (i det følgende betegnet bp). Deretter spaltes pGKA2 (referanseeksempel 2) med Hindlll og HinfI, og et DNA-fragment på ca. 400 bp inneholdende en stor del av IFN-7 strukturgenet oppnås ved polyakrylamidgelelektroforese.
pKYPlO (publisert, ikke undersøkt JP-patentsøknad nr. 110600/83) spaltes med Hindlll og BamHI for oppnåelse av DNA-fragment på ca. 4,3 kb inneholdende en tryptofanpromotor. For å oppnå et IFN-7 derivat hvori aminosyren i stilling 137 av det modne, humane IFN-7 polypeptid, Met, er erstattet med Cys, og aminosyrene i stilling 138 til 146 er utslettet, syntetiseres DNA-linkeren som vist i det følgende, på separat måte.
De rensede DNA-fragmenter og den syntetiske DNA-linker ligeres med T4 DNA-ligase for oppnåelse av det rekombinante plasmid pGVT137, som er vist på fig. 1. Plasmidet koder for IFN-X derivatet (137-Cys-IFN-X-(Al38-146 )§, som har Cys som aminosyren i stilling 137, og som ikke har aminosyrene i stilling 138-146.
For å konstruere den rekombinante pGNC5 som koder for derivatet [l-Ser-137-Cys-IFN-7(A138-146 )] , spaltes pGVLlO deretter (referanseeksempel 4) med Hindlll og Taql, og et DNA-fragment på ca. 300 bp oppnås. pGVT137 DNA oppnådd i eksempel 1 spaltes separat med Bglll og Taql henholdsvis Hindlll og Bglll for oppnåelse av DNA-fragmenter på ca. 130 bp og 4,6 kb. DNA-fragmentene ligeres med T4 DNA ligase for oppnåelse av det rekombinante plasmid pGNC5, som er vist på fig. 2.
Det rekombinante plasmid pGNB4 som koder for 3-Ser-137-Cys-IFN-G(A138-146), konstrueres etter samme metode som beskrevet i det foregående med den unntagelse at plasmidet pGVMlOl (fig. 3) anvendes som kilde for DNA som koder for den N-terminale del av IFN-7.
De reaksjonsbetingelser som er nødvendig for den rekombinante DNA-teknologi som beskrevet ovenfor, er vanligvis som følger: Nedbrytning av DNA med restriksjonsenzymer utføres vanligvis ved omsetning av 0,1-20 pg DNA med 0,1-100 enheter, fortrinnsvis 1-3 enheter restriksjonsenzym pr. 1 pg DNA i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-40 mM Tris-HCl (pH 6,0-9,5, fortrinnsvis 7,0-8,0), 0-200 mM NaCl og 2-20 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2 ved 20-70°C (optimal temperatur avhenger av benyttede restriksjonsenzymer) i fra 15 min. til 24 timer. Reaksjonen stanses vanligvis ved oppvarming til 55-75°C i 5-30 min., eller alternativt ved inaktivering av restriksjonsenzymet med en reagens slik som fenol eller dietylpyrokarbonat.
Rensing av DNA-fragmentene dannet ved nedbrytning med restriksjonsenzymer utføres ved lav-geleringstemperatur-agarosegel-elektroforese [L. Wieslander: Analytical Bio-chemistry 98, 305 (1979), i det følgende betegnet LGT-metoden] eller polyakrylamid-gelelektroforese.
Ligering av DNA-fragmentene utføres med 0,3-10 enheter T4 DNA ligase i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-40 mM, Tris-HCl (pH 6,1-9,5, fortrinnsvis 7,0-8,0), 2-20 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2> 0,1-10 mp, fortrinnsvis 0,5-2,0 mM ATP og 1-50 mM, fortrinnsvis 5-10 mM ditriotreitol ved 1-37°C, fortrinnsvis 3-20°C i fra 15 min. til 72 timer, fortrinnsvis 2-20 timer. Den rekombinante plasmid DNA dannet ved ligeringsreaksjonen innføres i Escherichia coli ved transformasjonsmetoden ifølge Cohen et al. [S.N. Cohen, et al.: Proe.Nati. Acad. Sei. USA 69, 2110(1972)], om nødvendig. Insulasjon av den rekombinante plasmid DNA fra Escherichia coli som bærer DNA'en, utføres ved den metode som er beskrevet i eksempel 1, eller metoden ifølge Birnboim, et al. [H.C. Birnboim, et al.: Nucleic Acids Res. 7, 1513
(1979)]. Plasmid DNA nedbrytes med 1-10 typer restriksjonsendonukleaser, og spaltningssetene undersøkes ved agarosegel-elektroforese eller polyakrylamidgelelektroforese. Om nødvendig, undersøkes DNA-sekvensen i DNA-materialet ytterligere ved metoden ifølge Maxam-Gilbert [Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560 (1977)].
De rekombinante plasmider kan fremstilles ved de ovenfor beskrevne betingelser.
Derivatet av IFN-7 polypeptid fremstilles ved følgende metode: Escherichia coli K-12 HB101 transformeres med et plasmid, slik som pGVA4 og en Escherichia coli stamme som bærer pGVA4 utvelges fra de ampicillinresistente (i det følgende betegnet Ap^) kolonier. Escherichia coli stammen som bærer pGVA4, dyrkes i et medium for fremstilling av et derivat av IFN-^ polypeptid i mediet.
Som medium kan det enten benyttes et syntetisk medium eller et naturlig medium så lenge det er egnet til dyrking av Escherichia coli og produksjonen av derivatet av IFN-7 polypeptid.
Som karbonkilde kan det f.eks. benyttes glukose, fruktose, laktose glycerol, mannitol og sorbitol.
Som nitrogenkilde kan det f.eks. benyttes NH4CI, (NH^gSC^, kasaminosyre, gjærekstrakt, polypepton, kjøttekstrakt, "baktotrypton" og maisstøpevæske.
Dessuten kan det benyttes næringsstoffer som K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgS04, vitamin Bj og MgCl^.
Dyrkingen utføres ved pH 5,5-8,5 og ved 18-40oC med lufting og omrøring.
Etter dyrking i 5-90 timer akkumereles derivatet av humant IFN-^ polypeptid i dyrkede celler. De samlede celler behandles med lysozym, knuses ved gjentatt frysing og opptining og underkastes sentrifugering. Den således oppnådde supernatantvæske underkastes ekstraksjon etter en konvensjonell metode for ekstrahering av polypeptider for å utvinne polypeptidet.
Bestemmelse av den humane IFN-7 aktivitet utføres etter metoden ifølge Armstrong [J. A. Armstrong, et al.; Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)].
Visse spesifikke utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er illustrert i følgende eksempler.
Eksempel 1
Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVT137 som koder for en 137- Cvs- IFN-^( A138- 146) :
10 pg pGBDl DNA oppnådd i referanseeksempel 3, ble oppløst i 50 pl (totalvolum) av en oppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 10 mM NaCl (i det følgende betegnet "Y-100 bufferoppløsning". Deretter ble 20 enheter restriksjonsenzym BamHI (produkt fra Takara Shuzo Co., slik som alle restriksjonsenzymer i det følgende er produkter fra Takara Shuzo Co. med mindre annet er angitt) tilsatt, og nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble det tilsatt 20 enheter restriksjonsenzym Taql, og nedbrytningsreaksjonen foregikk ved 65°C i 2 timer. Ca. 0,5 pg av et DNA-fragment på ca. 310 bp inneholdende 3'-ikke-translatert område ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved polyakrylgelelektroforese.
Separat ble 10 pg pGKA2 DNA oppnådd i referanseeksempel 2 oppløst i 50 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende Y-100-bufferoppløsning, og 20 enheter av hvert av restrik-sjonene Hindlll og Hinfl ble tilsatt til oppløsningen. Nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 3 timer. Et DNA-fragment på ca. 400 bp inneholdende en stor del av IFN-G strukturgenet ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved polyaktylamidgelelektroforese. 3 pg pKYPlO fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i publisert, ikke-undersøkt JP-patentsøknad nr. 110600/83 ble oppløst i 40 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende Y-100-bufferoppløsning, og 6 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll og BamHI ble tilsatt til oppløsningen. Nedbrytningsreaksjonen ble ut-ført ved 37°C i 3 timer. 1,8 pg av et DNA-fragment på ca. 4,3 kb inneholdende en tryptofan-promotor (Ptrp) ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden. Separat ble følgende DNA-linker syntetisert for å endre 137-aminosyren (Met) i det modne, humane IFN--Y polypeptid til Cys og for å gi et terminalt kodon (TAA) nødvendig for terminering av ekspresjonen umiddelbart etter aminosyre nr. 137, Cys.
To enkeltkjedede DNA'er av 18-mer og 17-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75 5765 (1978)]. Derpå ble 2 pg av så vel den 18-mere som den 17-mere DNA oppløst i 40 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotidkinase (produkt fra Takara Shuzo Co.) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjonen ble ut-ført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,5 pg av Taql-BamHI-fragmentet på ca. 310 bp avledet fra pGBDl, 0,5 pg av Hindlll-HinfI-fragmentet på ca. 400 bp avledet fra pGKA2 og 1,0 pg av HindiII-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb av ekspresjonsvektoren pKYPlO, som oppnådd i det foregående, oppløst i 25 pl T4-ligasebufferoppløsning. Ca. 0,1 pg av DNA-linkeren som nevnt i det foregående, ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 17 timer.
Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den resulterende rekombinante plasmidblanding for oppnåelse av en Ap<R->koloni. Plasmid pGVT137 vist på fig. 1 ble isolert fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen til pGVT137 ble bekreftet ved nedbrytning med EcoRI, Clal, Bglll og BamHI, og agarosegelelektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert [A.M. Maxam, et al.:Proc. Nati. Acad. Sei., USA 74, 560 (1977)], at DNA-sekvensen omkring Hindl-Taql i plasmidet pGVT137 var som følger.
Det humane IFN-^ polypeptidderivat som pGVT137 koder for [derivatet betegnes 137-Cys-IFN-"Y (A138-146)] , er klart forskjellig fra det kjente humane IFN-7 polypeptid ved at den 137. aminosyre (Met) i det modne, humane IFN-7 er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra N-terminalen, aminosyre nr. 138 (Leu) til 146 (Gin) er utslettet.
Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGVT137, er blitt deponert hos Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Tecknology, (i det følgende betegnet FRI) som Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547).
Eksempel 2
Konstruksjon av rekombinant plasmid pGNC5 som koder for 1- Ser- 137- Cvs- IFN-^( A138- 146) : 10 pg pGVLlO DNA oppnådd i referanseeksempel 4 ble oppløst i 50 pl Y-100-bufferoppløsning. 20 enheter restriksjonsenzym Hindlll ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble foretatt ved 37°C i 3 timer. Deretter ble det tilsatt 20 enheter restriksjonsenzym Taql, og nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 65°C i 2 timer. Det ble oppnådd ca. 0,5 pg av et DNA-fragment på ca. 300 bp inneholdende det 5'-terminale området av IFN-"y strukturgenet fra reaksjonsoppløsningen ved polyakrylgelelektroforese.
Separat ble 10 pg pGVT137 DNA oppnådd i eksempel 1 oppløst i 50 pl Y-100-bufferoppløsning og 20 enheter restriksjonsenzym Bglll ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble 20 enheter restriksjonsenzym Taql tilsatt og nedbrytningsreaksjonen ble utført vced 65°C i 2 timer. Det ble oppnådd ca. 0,4 pg av et DNA-fragment på ca. 130 bp inneholdende det 3'-terminale området av IFN-"Y strukturgenet fra reaksjonsoppløsningen ved polyakrylamidgelelektroforese. Separat ble 5 pg plasmid pGVT137 DNA oppløst i 50 pl Y-100-bufferoppløsning, 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll og Bglll ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjonen ble foretatt ved 37°C i 3 timer.
Ca. 2,0 pg av et DNA-fragment på ca. 4,6 kb inneholdende det 3'-ikke-translaterte området og Ptrp ble oppnådd fra reak-sjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Deretter ble 0,4 pg av HindIII-TaqI-fragmentet (ca. 300 bp) avledet fra pGV119, 0,5 pg av Bglll-Taql-fragmentet (ca. 130 bp) avledet fra pGVT 137 og 1,0 pg av Hindlll-Bglll-fragmentet (ca. 4,6 kb) avledet fra det samme plasmid, som var oppnådd i det foregående, oppløst i 25 pl T4-ligase-bufferoppløsning. 6 enheter DNA-ligase ble tilsatt, og 1igeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 17 timer.
Escherichia coli HB101 stamme ble transformert med den resulterende rekombinante plasmidblanding for oppnåelse av en Ap<R> koloni.
Plasmid pGNC5, som er vist på fig. 2, ble isolert fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen til pGNC5 ble bekreftet ved nedbrytning med Hindlll, EcoRI, Bglll, Clal og BamHI og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at DNA-sekvensen omkring Hindlll-Sinl var som følger: og at DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger:
Det humane IFN-"Y polypeptidderivat som pGNC5 koder for [derivatet betegnes 1-Ser-137-Cys-IFN--Y(A138-146)] er klart forskjellig fra det kjente humane IFN-7 polypeptid ved at den første aminosyre (Cys) i det modne, humane IFN.G er erstattet med Ser, aminosyre nr. 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra C-terminalen, aminosyre nr. 138 (Leu) til aminosyre nr. 146 (Gin), er utslettet. Escherichia coli stamme som bærer plasmid (pGNC5, er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli IGCN5 (FERM BP-550).
Eksempel 3
Konstruksjon av rekombinant plasmid pGNB4 som koder for 3- Ser- 137- Cvs- IFN- 7( Al38- 146) : 10 pg pGVMlOl DNA oppnådd i referanseeksempel 5 ble oppløst 1 50 pl Y-100-bufferoppløsning. 20 enheter restriksjonsenzym Hindlll ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37° i 3 timer. Deretter ble det tilsatt 20 enheter restriksjonsenzym Taql, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 65°C i 2 timer. Det ble oppnådd ca. 0,5 pg av et DNA-fragment på ca. 300 bp inneholdende det 5'-terminale området av IFN-7 strukturgenet fra reaksjonsoppløsningen ved polyakrylgelelektroforese.
Separat ble 10 pg pGVT137 DNA oppnådd i eksempel 1 oppløst i 50 pl Y-100-bufferoppløsning og 20 enheter av restriksjonsenzymet BG1II ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble 20 enheter restriksjonsenzym Taql tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 65°C i 2 timer. Ca. 0,4 pg av et DNA-fragment på ca. 130 bp inneholdende det 3'-terminale området av IFN-7 strukturgenet ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved polyakrylamidgelelektroforese.
Separat ble 5 pg plasmid pGVT137 oppløst i 50 pl Y-100-bufferoppløsning, og 10 enheter av hvert av restriksjonsenzymene Hindlll og BG1II ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer.
Ca. 2, pg avet DNA-fragment på ca. 4,6 kb inneholdende det 3'-ikke-translaterte området og Ptrp ble oppnådd fra reak-sjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Deretter ble 0,4 pg av HindIII-TaqI-fragmentet (ca. 300 bp) avledet fra pGVMlOl, 0,5 pg av Bglll-Taql-fragmentet (ca. 130 bp) avledet fra pGVT137, og 1,0 pg av Hindlll-Bglll-fragmentet (ca. 4,6 kb) avledet fra det samme plasmidet som ble oppnådd i det foregående, oppløst i 25 pl T4-ligase-bufferoppløsning. 6 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt, og ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 17 timer.
Escherichia coli HB101 stamme ble transformert med den resulterende rekombinante plasmidblanding for oppnåelse av en Ap^-koloni.
Plasmid pGNB4 vist på fig. 3 ble isolert fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen til pGNB4 ble bekreftet ved nedbrytning med Hindlll, EcoRI, Bglll, Clal og BamHi og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at DNA-sekvensen omkring Hindlll-Sinl i pGNB4 var som følger: og DNA-sekvensen omkring Hinfl-Taql var som følger:
Humant IFN-7 polypept idderivat kodet av pGNB4 (derivatet betegnes 3-Ser-137-Cys-IFN--Y(A138-146 ), er klart forskjellig fra det kjente humane IFN-^y polypeptid ved at den tedje aminosyre (Cys) i det modne, humane IFN-7 er erstattet med Ser, amninosyre nr. 137 (Met) er erstattet med Cys, og de 9 aminosyrer fra C-terminalen, aminosyre nr. 138 (Leu) til aminosyre nr. 146 (Gin), er utslettet. Escherichia coli stamme som bærer plasmid plamid pGNB4 er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
Eksempel 4
Produks. ion av IFN-" Y derivater med Escherichia coli stammer som bærer PGVT137. pGNC5 og PGNB4: Escherichia coli HB101 stammer som bærer rekombinante plasmider pGVT137, pGNC5 og pGNB4 oppnådd i eksempel 1-3, som betegnes IGVT137, IGNC5 og IGNB4, ble dyrket ved 37°C i 18 timer i LG-medium (10 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl, 2 g glukose, 1 liter vann, innstilt til pH 7,0 med NaOH. 0,2 ml av dyrkningsbuljongen ble inokulert i 10 ml MCG-medium ( 0, 6% Na Na2HP04, 03$ KH2P04, 0,5$ NaCl, 0, 1% NH4CI, 0,5$ glukose, 0, 5% kasaminosyre, 1 mM MgSo4, 4 pg/ml vitamin Blt pH 7,2) og dyrking ble utført ved 30°C i 4-8 timer. Deretter ble 10 pg/ml indolylakrylsyre (i det følgende betegnet IAA), som er en induser for tryptofan, tilsatt, og dyrking ble fortsatt i 2-12 timer. Dyrkningsbuljongen ble sentrifugert ved 8000 omdr./min. i 10 min. og de høstede celler ble vasket med en bufferoppløsning inneholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl (pH 7,5). Vaskede celler ble suspendert i 1 ml av bufferoppløsningen som beskrevet i det foregående, og 5 pl av en oppløsning inneholdende 200 pg lysozym og 0,25 M EDTÅ (etylendiamin-tetraeddiksyre) ble tilsatt. Blandingen ble hensatt ved 0°C i 30 min. og frysing og opptining ble gjentatt tre ganger for knusing av cellene. De knuste celler ble sentrifugert ved 15.000 omdr./min. for oppnåelse av en supernatantvæske. Mengden av interferon i supernatantvæsken ble bestemt etter metoden ifølge Armstrong [J.A. Armstrong, et al.: Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)], hvori Sindvis-virus ble benyttet som virus, og FL-celler avledet fra humane amnion-celler ble benyttet som dyrecellene. Resultatene er vist i tabell 2.
Eksempel 5
Forsøk vedrørende varmestabilitet til IFN-" y derivater. 137- Cvs- IFN-- v( Al38- 146). l- Ser- 137- Cys- IFN-^( A138- 146) og. 3- Ser- 137- Cvs- IFN-^( Al38- 146): Escherichia coli HB101 stammer som bærer rekombinante plasmider pGVT137, pGNC5 og pGNB4 oppnådd i eksempel 1-3, som betegnes IGNB4, ble dyrket ved 37°C i 18 timer i LG-medium. 0,2 ml av dyrkningsbuljongen ble inokulert i 10 ml MCG-medium, og det ble foretatt dyrking ved 30°C i 4-8 timer. Deretter ble 10 pg/ml IAA tilsatt, og dyrkingen ble fortsatt i 2-12 timer. Dyrkningsbuljongen ble sentrifugert ved 8000 omdr./min. i 10 min, og de høstede cellene ble vasket med 30 mM Tris-Hcl (pH 7,5) bufferoppløsning inneholdende 30 mM NaCl. Vaskede celler ble suspendert i 1 ml bufferopp-løsning som beskrevet i det ovenstående, og 5 pl av en oppløsning inneholdende 200 Mg lysozym og 0,25 M EDTA ble tilsatt. Blandingen ble hensatt ved 0°C i 30 min., og frysing og opptining ble gjentatt tre ganger for å knuse cellene. De knuste celler ble sentrifugert ved 15.000 omdr./min. i 30 min. for oppnåelse av en supernatantvaeske. Supernatantvæsken ble oppvarmet ved 50°C i 1 time og den antivirale aktivitet til interferon ble bestemt etter metoden ifølge Armstrong for måling av restaktiviteten {%).
Resultatene er angitt i tabell 3.
Referanseeksempel 1
Innsetning av human IFN-~ y DNA i ekspresjonsvektoren pKYPll: I dette eksempel ble 6 pg plasmid pIFN--Y-G4 (3,6 kb) oppløst i 50 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditIotreitol og 50 mM NaCl. Deretter ble 12 enheter av hvert av restriksjonsenzymene PvuII og Hindlll tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 2 timer. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 7 min. for å inaktivere enzymene og underkastet rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av 1,2 pg av et DNA-fragment på 1,3 kb inneholdende human IFN-7 DNA.
Separat ble 4 pg pKYPll oppløst i 40 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 50 ml mM NaCl. 8 enheter BamHI ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble tilsatt og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 5 min. for å inaktivere enzymet. Deretter ble 30 pm av hvert av stoffene dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsatt, og 8 enheter Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow-fragment, 1 pl) ble tilsatt. Ifyllingsreaksjon ble utført ved 15°C i 1 time, og reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 68°C i 15 min. for å inaktivere DNA-polymerase I. 10 enheter Hindlll ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer etterfulgt av oppvarming ved 65°C i 5 min. for å inaktivere Hindlll. Nedbrytningsreak-sjonsreaksjonsoppløsningen av plasmid pKYPll ble underkastet rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av 2,5 pg av et DNA-fragment på ca. 4,7 kb inneholdende Ptrp.
Deretter ble 0,5 pg av DNA-fragmentet på 1,3 kb inneholdende human IFN-"Y DNA og 1,0 pg av DNA-f ragmentet på ca. 4,7 kb inneholdende Ptrp, som var oppnådd fra plasmid pKYPll, oppløst i 20 pl av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol og 500 pm ATP, og 4 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 18 timer, og Escherichia coli HB101 ble transformert med den resulterende rekombinante plasmidblanding ved konvensjonell teknikk for oppnåelse av en Ap<R >koloni. Plasmid pGC7 ble skilt fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen til pGC7 ble bekreftet ved nedbrytning med Hindlll, Hpal, Sali, EcoRI og Clal og agarosegelelektroforese. Escherichia coli stamme inneholdende pGC7 er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli ICG7(FERM BP-497).
Referanseeksempel 2
Konstruksjon av rekombinant plasmid pGKA2;
I dette eksempel ble 6 pg av den pGC7 DNA som ble oppnådd i referanseeksempel 1, oppløst i 50 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2» 10 mM ditiotreitol og 10 mM NaCl og 12 enheter BstNI ble tilsatt. Det ble utført reaksjon ved 60°C i 3 timer, og reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 5 min. for å inaktivere BstNI. Deretter ble NaCl tilsatt til en endelig konsentrasjon på 150 mM, og 8 enheter Sali ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Reak-sjonsoppløsningen ble igjen oppvarmet ved 65°Ci 5 min. for å inaktivere Sali og underkaste det rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av ca. 0,8 pg av et DNA-fragment på ca. 1125 bp inneholdende en stor del av den humane IFN-*y DNA.
Separat ble 3 pg pKYPlO oppløst i 40 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 100 mM NaCl. 6 enheter av Hindlll og Sali ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 5 min. for å inaktivere Hindlll og Sali og underkastet rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av 1,8 pg av et DNA-fragment på ca. 4,1 kb inneholdende Ptrp.
Den N-terminale aminosyren i det modne humane IFN-7 polypeptid er Cys. For å uttrykke moden IFN--y DNA er det nødvendig å tilveiebringe et initieringskodon (ATG) like før det 5'-terminale kodon TGT (Cys) og videre å justere lengden mellom SD-sekvens etter Ptrp og ATG til en passende lengde på 6-18 bp. Derfor ble følgende DNA-linker syntetisert.
To enkeltkjedede DNA'er av 18-mer og 15-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode. Deretter ble 2 pg av såvel den 18-mere som den 15-mere DNA oppløst i 20 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotidkinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon ble utført ved 37°C i 6 min.
Deretter ble 2 pg av den fosforylerte 18-mere DNA og den fosforylerte 15-mere DNA blandet, og blandingen ble oppvarmet ved 70°C i 5 min. og ble hensatt ved romtemperatur for utligning for oppnåelse av DNA-linkeren med den i det ovenstående angitte struktur.
0,4 pg av BstNI-Sall-fragmentet på 1125 bp oppnådd i det ovenstående og avledet fra PGC7 og 1,0 pg av DNA-f ragmentet på 4,7 kb oppnådd ved nedbrytning av ekspresjonsvektoren pKYPlO med Hindlll og Sali ble oppløst i 25 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol og 500 pm ATP. Ca. 0,1 pg av DNA-linkeren som nevnt i det ovenstående ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase. Ligeringsreaksjonen ble utført ved 4°C i 17 timer. Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den resulterende rekombinante plasmidblanding ved konvensjonell teknikk for oppnåelse av en Ap<R> koloni. Et plasmid pGKA2 som vist på fig. 1, ble isolert fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen for pKGA2 ble bekreftet ved
nedbryning med EcoRI, Clal, Hindlll, BstNI og Sali og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at DNA-sekvensen fra SD-sekvensen (AAGG) til initieringskodonet (ATG) i plasmidet pGKA2 var
"AAGGGTATCGATAAGCTTATG".
Escherichia coli stamme inneholdende pGKA2 er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-496).
Referanseeksempel 3
Konstruksjon av plasmid pGBDl som har BamHI- spaltningssete nedstrøms fra IFN-~ y genet: I dette eksempel ble 2 pg plasmid pIFN"Y-G4 (3,6 kb) oppløst i 50 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 50 mM NaCl (i det følgende betegnet "Y-50 bufferoppløsning"). Deretter ble 4 enheter av restriksjonsenzym PvuII tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 2 timer. Nedbrytningsproduktet ble underkastet rensing ved LGTmetoden for oppnåelse av 1 pg av et DNA-fragment (3,6 kb) av pIFN-G4. 0,1 pg av DNA-fragmentet og 5 pmol 5'-fosforylert BamHI-linker (5'-pCCGGATCCGG-3' : produkt fra Collaborative Research, Inc. ble ligert ved 4°C i 18 timer med 2 enheter T4-ligase i 20 pl T4-ligasebufferoppløsning.
Escherichia coli HB101 [Boliver, et al.: Gene 2, 75 (1977)] ble transformert under anvendelse av den således oppnådde rekombinante plasmid DNA ved metoden ifølge Cohen et al.
[S.N. Cohen, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 69, 2110
(1972)] for oppnåelse av en Ap<R> koloni. Plasmid DNA ble isolert fra transformanten ved den kjente metode [H.C. Birnboim, et al.: Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)]. DNA ble nedbrutt med restriksjonsendonukleaser, slik som BamHI, dens struktur ble analysert for å konstatere at rekombinant plasmid pGBDl, hvori BamHI-linker var innsatt i PvuII-setet i pIFN-G4, var oppnådd. Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGBDl er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli IGBD1 (FERM BP-394 ).
Referanseeksempel 4
Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVLlO som koder for 1- Ser- IFN-- Y:
I dette eksempel ble 6 pg pGBDl oppnådd i referanseeksempel 3 oppløst i 50 pl bufferoppløsning. 10 enheter Sinl ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble det tilsatt NaCl til en sluttkonsentrasjon på 100 mM og 10 enheter BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. 0,8 pg av et DNA-fragment på ca. 85 0 bp inneholdende en stor del av den humane IFN-^ DNA ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Separat ble 3 pg pKYPlO DNA fremstilt ved metoden som beskrevet i publisert, ikke-undersøkt JP-patentsøknad nr. 11060083 oppløst i 40 pl (totalvolum) Y-50-bufferoppløsning, og 5 enheter Hindlll og BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det oppnådd ca. 1,8 pg av et DNA-fragment på ca. 4,3 kb inneholdende tryptofan-promotor (Ptrp) ved LGT-metoden.
Modent humant IFN--Y polypeptid har den N-terminale strukturen Cys-Tyr-Cys-. For å endre den første Cys til Ser og for å tilveiebringe et initieringskodon ATG som er nødvendig for ekspresjon like før første Ser, ble følgende DNA-linker syntetisert.
To enkeltkjedede DNA'er av 20-mer og 19-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode. Deretter ble 2 pg av såvel den 20-mere som den 19-mere DNA oppløst i 40 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotidkinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon ble utført ved 37°C i 60 min.
0,5 pg av Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp avledet fra pGBDl og 1,0 pg av Hindi 11-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb i ekspresjonsvektoren pKYPlO, som ble oppnådd som angitt ovenfor, ble oppløst i 25 pl T4-ligasebufferoppløsning. Ca. 0,1 pg av DNA-linkeren nevnt i det ovenstående, ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter Ta DNA-ligase. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 17 timer.
Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den resulterende rekombinante plasmidblanding for oppnåelse av en ApE koloni. Et plasmid, pGVLlO som vist på fig. 2, ble isolert fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen til pGVLlO ble bekreftet ved nedbrytning med EcoRI, Clal, Hindlll og BamHI og agarosegelelektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at DNA-sekvensen fra Hindlll-setet til Sinl-setet i plasmidet pGVLlO var som følger.
Det humane IFN-7 polypeptid, som pGVLlO koder for (derivatet betegnes l-Ser-IFN-^), er klart forskjellig fra den kjente humane IFN-"y polypeptid ved at den første Cys i den modne humane IFN-"y er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGVLlO, er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli IGVL10 (FERM BP-544).
Referanseeksempel 5
Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVMlOl som koder for 3- Ser- IFN-- y: 6 pg pGBDl DNA oppnådd i referanseeksempel 3 ble oppløst i 50 pl Y-50-bufferoppløsning. 10 enheter Sinl ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 mM og 10 enheter BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ved utført ved 37°C i 3 timer. 0,8 pg av et DNA-fragment på ca. 850 bp inneholdende en stor del av den humane IFN-7 DNA ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Separat ble 3 pg pKYPlO DNA fremstilt ved metoden beskrevet i publisert ikke-undersøkt JP-patentsøknad nr. 110600/83 oppløst i 40 pl (totalvolum) Y-50-bufferoppløsning, og 5 enheter Hindlll og 5 enheter BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det oppnådd ca. 1,8 pg av et DNA-fragment på ca. 4,3 kb inneholdende tryptofan-promotor (Ptrp) ved LGT-metoden.
Modent humant IFN--y polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For å endre den tredje aminosyren (Cys) til Ser og inkorporere et initieringskodon (ATG) som er nødven-dig for ekspresjon, like før den første Cys, ble følgende DNA-linker syntetisert.
To enkeltkjedede DNA<*>er av 20-mer og 19-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode. Deretter ble 2 pg av såvel den 20-mere som den 19-mere DNA oppløst i 40 pl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotidkinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon ble utført ved 37°C i 60 min.
0,5 pg av Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp avledet fra pGBDl og 1,0 pg av Hindi 11-BamHI-f ragmentet på ca. 4.3 kb i ekspresjonsvektoren pKYPlO, som ble oppnådd i det ovenstående, ble oppløst i 25 pl T4-ligase-bufferoppløsning. Ca. 0,1 pg av ovennevnte DNA-linker ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4 DNA-ligase. Ligeringsreaksjonen ble utført ved 4°C i 17 timer.
Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den resulterende rekombinante plasmidblanding for oppnåelse av en Ap<R> koloni. Et plasmid pGVMlOl som vist på fig. 3, ble isolert fra dyrkningsbuljongen for kolonien. Strukturen av pGVMlOl ble bekreftet ved nedbrytning med EcoRI, Clal, Hindlll og BamHI og agarosegelelektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at DNA-sekvensen fra Hindlll-setet til Sinl-setet i plasmid pGVMlOl var som følger.
Det humane IFN--y polypeptid som pGVMlOl koder for (derivatet betegnes 3-Ser-IFN-"Y) er klart forskjellig fra det kjente, humane IFN--y polypeptid ved at den tredje aminosyre (Cys) i det modne humane IFN-7 er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGVMlOl er blitt deponert hos FRI som Escherichia coli IGMV101 (FERM BP-545).

Claims (2)

1. Rekombinant plasmid, som bærer et inkorporert DNA-fragment som koder for og som kan uttrykke et nytt derivat av humant interferon-^ polypeptid, hvor visse aminosyrer av humant interf eron-"Y polypeptid er fjernet, og visse aminosyrer forskjellige fra nevnte aminosyrer er erstattet med andre aminosyrer, karakterisert ved at det er valgt blant pGVT137 (fig. 1, 137-Cys-IFN-7 (A138-146)), og som bæres av Escherichia coli IGVT137 (FERM BP-547), pGNC5 (fig. 2, 1-Ser-137-Cys-IFN--Y (A138-146)), og som bæres av Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) og pGNB4 (fig. 3, -3-Ser-137-Cys-IFN--Y (A138-146)), og som bæres av Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
2. Fremgangsmåte for fremstilling av et derivat av humant interferon-^ polypeptid, karakterisert ved at man i et medium dyrker en mikroorganisme transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 1, akkumulerer derivatet av humant interferon-^ polypeptid i dyrkningsmediet og utvinner derivatet av humant interferon-^y polypeptid derfra, hvilken mikroorganisme velges blant Escerichia coli IGVT137 (FERM BP-547), Escherichia coli IGNC5 (FERM BP-550) og Escherichia coli IGNB4 (FERM BP-549).
NO852776A 1984-07-11 1985-07-10 Rekombinante plasmider for bruk ved fremstilling av derivat av humant interferon--polypeptid samt fremgangsmåte for fremstilling derav NO175487C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14395084A JPS6124599A (ja) 1984-07-11 1984-07-11 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO852776L NO852776L (no) 1986-01-13
NO175487B true NO175487B (no) 1994-07-11
NO175487C NO175487C (no) 1994-10-19

Family

ID=15350817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO852776A NO175487C (no) 1984-07-11 1985-07-10 Rekombinante plasmider for bruk ved fremstilling av derivat av humant interferon--polypeptid samt fremgangsmåte for fremstilling derav

Country Status (11)

Country Link
US (1) US4898931A (no)
EP (1) EP0170917B1 (no)
JP (1) JPS6124599A (no)
AT (1) ATE63923T1 (no)
AU (1) AU586822B2 (no)
CA (1) CA1303529C (no)
DE (2) DE170917T1 (no)
DK (1) DK164108C (no)
ES (1) ES8609484A1 (no)
IL (1) IL75738A (no)
NO (1) NO175487C (no)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8334102D0 (en) * 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
CA1340265C (en) * 1985-01-18 1998-12-15 Kirston E. Koths Oxidation resistant muteins
GB8619725D0 (en) * 1986-08-13 1986-09-24 Hoffmann La Roche Homogenous interferon fragments
JP2653061B2 (ja) * 1986-12-27 1997-09-10 武田薬品工業株式会社 新規ポリペプチドおよびその製造法
AT393690B (de) * 1987-10-08 1991-11-25 Hoffmann La Roche Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente
DE3829180A1 (de) * 1988-08-29 1990-03-08 Boehringer Ingelheim Int Neues arzneimittel zur vorbeugung und behandlung von durch primaere immundefekte verursachte krankheiten
DE4036856C1 (no) * 1990-11-19 1992-05-27 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De
EE04453B1 (et) * 1995-01-26 2005-04-15 Biogen, Incorporated Lümfotoksiin-a/ß kompleksid ja antilümfotoksiin-ßretseptori antikehad kasvajavastaste agensitena
DE19535853C2 (de) * 1995-09-18 1999-04-01 Fraunhofer Ges Forschung Varianten des rekombinanten humanen Interferon-gamma, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
YU32402A (sh) 1999-11-12 2005-03-15 Maxygen Holdings Ltd. Konjugati gama interferona
AU782635B2 (en) * 1999-11-12 2005-08-18 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates
JP2003513681A (ja) * 1999-11-12 2003-04-15 マキシゲン・ホールディングス・リミテッド インターフェロンガンマ・コンジュゲート
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
AU2003239774A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
JP4889505B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 被修飾されたヒト成長ホルモンポリペプチドおよびこれらの使用
WO2009100255A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
CA2609205A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
CA2644127A1 (fr) * 2006-03-08 2007-09-13 Biomethodes Variants ameliores de l'interferon-gamma humain (ifny)
FR2898359B1 (fr) * 2006-03-08 2011-07-15 Biomethodes Variants ameliores de l'interferon-gamma humain (ifn gamma)
EP3830115A4 (en) * 2018-07-30 2022-08-10 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University INTERFERON GAMMA POLARIZED AGONISTS

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
US4681848A (en) * 1982-09-22 1987-07-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel peptide and use thereof
IL69851A0 (en) * 1982-09-30 1983-12-30 Japan Found Cancer Novel dna and recombinant plasmid containing the same
US4758656A (en) * 1983-12-26 1988-07-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel human interferon-gamma polypeptide derivative
AU582574B2 (en) * 1984-04-19 1989-04-06 Hoechst Aktiengesellschaft The preparation of polypeptides having human gamma interferon activity
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DK164108B (da) 1992-05-11
JPS6124599A (ja) 1986-02-03
ES8609484A1 (es) 1986-09-01
DK314485D0 (da) 1985-07-10
ATE63923T1 (de) 1991-06-15
IL75738A0 (en) 1985-11-29
EP0170917A1 (en) 1986-02-12
CA1303529C (en) 1992-06-16
AU4474985A (en) 1986-01-16
DE170917T1 (de) 1986-09-04
DK314485A (da) 1986-01-12
ES545052A0 (es) 1986-09-01
US4898931A (en) 1990-02-06
DK164108C (da) 1992-10-12
EP0170917B1 (en) 1991-05-29
IL75738A (en) 1995-06-29
NO175487C (no) 1994-10-19
NO852776L (no) 1986-01-13
DE3582973D1 (de) 1991-07-04
AU586822B2 (en) 1989-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO175487B (no) Rekombinante plasmider for bruk ved fremstilling av derivat av humant interferon--polypeptid samt fremgangsmåte for fremstilling derav
EP0041313B1 (en) Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon
DK174905B1 (da) DNA-sekvens og fremgangsmåde til den fremstilling, gærhybridvektorer og Saccharomyces cerevisiae indeholdende sekvensen henholdsvis vektoren og fremgangsmåder til deres fremstilling samt deres anvendelse ved fremstilling af polypeptider
DK168016B1 (da) Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid
EP0128467A1 (en) Polypeptides having interferon activity
EP0390252B1 (en) Purification of recombinant human interleukin-3
EP0104061B1 (en) Improved expression vectors
US5059530A (en) Expression vector for human TNF
EP0121157B1 (en) Novel human interferon-gamma polypeptide
EP0220482B1 (en) Novel plasmid and use thereof
WO2001057217A9 (en) Expression and secretion vector for human interferon alpha and process for producing human interferon alpha by employing same
AU594950B2 (en) Production of human somatomedin c
EP0121569B1 (en) Novel vector
US5654177A (en) Production of human somatomedin C
US4851512A (en) Novel human interleukin-2 polypeptide derivative
Jiang et al. Translation initiation region plays an important role in the expression of human thrombopoietin in Escherichia coli
IL71232A (en) A recombinant plasmid encoding the human itferron-C polypeptide, the process for its preparation, and microorganisms containing it
NZ231443A (en) Improved production of a specific polypeptide in a transformed host