HU205779B - Process for producing new gene sequences, i-type interferon pepties defined by these sequences and microorganisms producing same - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új I típusú interferonok előállítására, az ilyen peptidek és készítmények előállítását szolgáló rekombináns DNS eljárások kidolgozása, továbbá az ezekhez az eljárásokhoz szükséges génszekvenciák, rekombináns DNS molekulák, expresszxó-hordozók és organizmusok előállítása.

Az interferon egy fogalom, amelyet azért alkottak, hogy segítségével le tudják írni a proteinek egy olyan csoportját, amelyet emberi sejtek állítanak elő és az jellemzi őket, hogyrészben egymást fedő, részben egymástól eltérő biológiai aktivitást fejtenek ki. Ezek a proteinek módosítják a szervezet immunválaszát és feltételezik róluk, hogy a vírusbetegségek elleni hatékony védelem kialakításához hozzájárulnak. Az interferonokat három osztályba sorolják, vannak α-, β- és γ-interferonok. [J.Gen.Virol. 65,699-760 (1984)]

Az emberi, szervezetben a β- és γ-interferonoknak csak egy-egy szubtípusa ismert [például S.Ohno és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 5305-5309 /1981/; Gray és munkatársai, Natúré, 295,5305-508 /1982/; Taya és munkatársai, EMBO Journal, 1/8, 953-958 /1982/]. Ezzel szemben az a-interferonoknál különböző szubtípusokat írtak le [például, Phil. Trans.R.Soc.Lonc. 299,7-28 /1982/]. Az érett α-interferonok egymás közti eltérése maximum 23%-os diverganciát mutat és körülbelül 166 aminosav hosszúságúak. Említésre méltó továbbá az a közlemény, amely szerint egy α-interferon meglepően magas molekulatömegűnek (26.000, SDS-poIiakrilamid-gél elektroforézissel meghatározva) mutatkozott. [P. Goren és munkatársai, Viology, 130, 273-280 /1983/]. EztazinterferontIFN-a26KnéweIjelölték.Megállapították, hogy ez az interferon az, amelyik az eddigi legmagasabb specifikus antivirális és anticelluláris aktivitást fejtiki.

Az ismert interferonok bizonyos betegségek esetében hatásosnak tűnnek, de sok más betegség esetén csekély vagy egyáltalán semmi hatásuk nincs [például Powledge, Bio/Technology, 1984 március, 215-228 old. .Interferon On Trial”]. Az interferonoknak mellékhatásaik is vannak. Rekombináns α-interferon rákellenes hatásának vizsgálatánál például megállapították, hogy 50 millió egységet tartalmazó dózisok, amelyek az I fázisú vizsgálatok eredményei szerint biztonságosnak bizonyultak, akut zavarállapotokat idéztek elő, egészen a munkaképtelenségig vezető ízületi fájdalmakig, továbbá nagyon erős fáradságot, étvágytalanságot, a tájékozódóképesség elvesztését, epilepsziás rohamokatés májkárosodást okoztak. A francia kormányzat 1982-ben megtiltotta az BFN-al való vizsgálatokat, miután rákos betegek, akiket ezzel kezeltek, halálos szívrohamokat kaptak Legalább két kardiális halálesetet közöltek az Amerikában nemrég végzett vizsgálatok folyamán is. Mindinkább kifejezettebbé vált, hogy a mellékhatásoknak legalább egy része -mint a láz és a gyengélkedés -magával az interferon molekulával van közvetlen összefüggésben, és nem vezethető vissza a szennyeződésekre.

Tekintettek azokra a nagy reményekre, amelyeket az interferonok ébresztettek, és attól az óhajtól vezérelve, hogy csökkent mellékhatásokkal rendelkező interferonhoz hasonló molekulákat találjunk, jelen találmány feladatául tűzte ki az ilyen anyagok előállítását.

A találmány tehát b izonyos olyan új I típusú [Natúré 286,110 (1980)] interferonokra (ezeket itt ómegáin terferon vagy IFN-omega névvel jelöljük) és N-glükozilált származékaikra vonatkozik, amelyek egy vezér-peptidet tartalmazhatnak, és amelyek 168-174, előnyösen 172 aminosavat tartalmaznák és 30-50%os eltérést, előnyösen40-48%-os eltérést mutatnak az eddig ismert a-interferon szubsztípusoktól, továbbá körülbelül 70%-os divergenciát mutatnak a β-interferonnal szemben, ugyanakkor ezen ismert anyagok terápiás hátrányaival nem rendelkeznek.

A találmány tárgya tehát eljárás teljesen tiszta interferonoknak, ezek nem glükozilált és glükoziláltformáinak, az őket kódoló génszekvenciáknak, valamint az ezen szekvenciákat tartalmazó rekombináns molekuláknak az előállítására. A találmány további tárgya eljárás a szóbanforgó génszekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok - ilyenek a plazmidok - előállítására, valamint olyan gazdaszervezetek - ilyen a mikroorganizmusok vagy szövettenyészetek - előállítására, amelyek az új interferonok termelését fermentációs úton vagy szövet-tenyésztési módszerek révén teszik lehetővé.

A találmány tárgya elsősorban eljárás ómega-interferonok, valamint a megfelelő alábbi szerkezetű génszekvenciák előállítására:

- A P9A2 klón által kódolt IFN-omega-1 (Gly) aminosavszekvenciája és a megfelelő génszekvencia:

Cys Asp Leu Pro Gin TGT GAT CTG CCT CAG 20

Val Leu Leu His Gin CTG CTT CTG CAC CAA 35

Lys Asp Arg Arg Asp AAG GAC AGA AGA GAC 50

Ser Gin Leu Gin Lys AGC CAG TTG CAG AAG

Ans His Gly Leu Leu AAC CAT GGC CTA CTT 25

Met Arg Arg Ile Ser ATG AGG AGA ATC TCC 40

Phe Arg Phe Pro Gin TTV AGG TTC CCC CAG 55

Alá His Val Met Ser GCC CAT GTC ATG TCT

Ser Arg Asn Thr Leu AGC AGG AAC ACC TTG 30

Pro Phe Leu Cys Leu CCT TTC TTG TGT CTC 45

GluMet Val Lys Gly GAGATGGTAAAAGGG 60

Val LeuHis GluMet GTC CTC CAT GAG ATG

Ηϋ 205 779 Β

Leu Gin Gin Ile Phe CTG CAG CAG ATC ITC 80

Alá Trp Asn Met Thr GCCTGGAACATGACC 95

Gin Gin Leu Gin His 110

Glu Gly Glu Ser Alá GAAGGAGAATCTGCT 125

Arg Arg Tyr Phe Gin AGGAGGTACTTCCAG 140

Tyr Ser Asp Cys Alá TACAGCGACTGTGCC 155

Ser Leu Phe Leu Ser TCC TTG TTC TTA TCA 170

Asp Arg Asp Leu Gly GATAGAGACCTGGGC

Ser Leu Phe His Thr AGC CTC TTC CAC ACA 85

Leu Leu Asp Gin Leu CTC CTA GAC CAA CTC 100

Leu Glu Thr Cys Leu 115

Gly Alá Ile Ser Ser GGG GCA ATT AGC AGC 130

Gly Ile Arg Val Tyr GGA ATC CGT GTC TAC 145

Trp Glu Val Val Arg TGG GAA GTT GTC AGA 160

Glu Arg Ser Ser Alá GAG CGC TCC TCT GCT 90

HisThrGlyLeuHis

CACACTGGACTTCAT

105

LeuValValGly

120

Pro Alá Leu Thr Leu CCT GCA CTG ACC TTG 135

Leu Lys Glu Lys Lys CTG AAA GAG AAG AAA 150

Met Glu Ile Met Lys ATG GAA ATC ATG AAA 165

Thr Asn Met Gin Glu ArgLeuArgSerLys

ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA

Ser Ser TCA TCT

A 111.pozícióban levő GGG szekvencia (a glicint Gly -kódolja) a Gagszekvenciával (a glutaminsavat Glu - kódolja) helyettesíthető. Ezt tartalmazza az IFN-omega-1 (Glu)-t termelő E76E9 klón. Az előnyös molekulák közé tartoznak azok a származékok is, 30 amelyek a78. aminosav pozícióban N-glükoziláltak.

Például mindkét előbb említett omega-interferon a következő képletű vezér-peptidet tartalmazhatja:

Met Alá Leu Leu Phe Pro Leu Leu Alá Alá Leu Val MetThrSer Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly

Az alábbiakban az ábrákat ismertetjük:

1. ábra: azE76E9 klón restrikciós térképe

2. ábra: a P9A2 klón restrikciós térképe

3. ábra: aP9A2klón DNS szekvenciája

4. ábra: azE76E9 klón DNS szekvenciája

5. ábra: Southern biot genom-analízis, ahol a P9A2 klón DNS-e próba-anyagként szerepel

6. ábra: apRHW12expressziós klón szerkesztése

7. ábra: az I típusú interferonok aminosavai és nukleotidjai közti különbséget mutat ja be

8a ábra: azíFN-ct Ágén szinguláris ntíkleotid pozíciót sorolja fel

8b ábra: az IFN-omegal gén szinguláris nukleotid pozícióit sorolja fel

8c ábra: az IFN-aD gén szinguláris nukleotid pozícióitsoroljafel

9. ábra: az mterferon-szubtípus specikus próbaanyagok szintetizálásának sematikus rajza ló. ábra: interferon-szubtípus specifikus mRNS-ek kimutatása 55 . ábra: az IFN-omega-1 gén DNS szekvenciája

12. ábra: az IFN-pszeudo-omega-2 gén DNS szekvenciája

13. ábra: az IFN-pszeudo-omega-3 gén DNS szekvenciája

14. ábra: az IFN-pszeudo-omega-4 gén DNS szekvenciája

15. ábra: IFN-omega génszekvenciák korrigált egymás melletti sorolása

16. ábra: szigul szekvenciák homológiája

17. ábra: az „érett protein szekvenciák homológiája

18. ábra: a négy DNS szekvencia egymáshoz viszonyított homológiája

A találmány szerinti új omega-interferonokat és az őket kódoló DNS szekvenciákat az.alábbiak szerint állítjuk elő:

Egy humán B-lymphoma sejtvonalat, például a Namaiwa sejteket {G-Kelm.ésmuiútatársai,MtJ»Cancer 40 10,44/1972/] vírus kezeléssel - például Sendia vírus kezeléssel - egyidejű a- és^-interferon teranelésre lehet serkenteni. Ha most a stimulált Namalwa -sejtek által termelt mRNS-t izoláljuk, úgy ezt templátként használhatjuk fel a cDNS szintéziséhez. Abból A cél45 ból, hogy az interferon-specifikus szekvenciák kitermelését a klónozási eljárás során növelhessük, a mRNS készítményt szétválaszt juk különböző hosszúságú mRNS molekulákra cukorsűrűségrádiens segítségével. Előnyösen a 12S körüli mRNS-t (a mRNS 50 800-1000 bázis hosszúságú) .gyűjtjük össze. Ebben a tartományban ülepedik az a-^és β-interferoASpepifikus mRNS. Az ebből agrádienstar tománybótkinyert mRNS-t úgy koncentráljuk, hogy kicsapjuk iésA csapadékot vízben oldjuk.

cDNS gyűjteményt lényegében a szakirodalomból ismert módszerekkel létesítünk ;[lásd például: B.E.Dworkin-Ras ti, M.B.DworkinésP.Svetly, Journal of Interferon Research, 2/4, 575-585 /1982/]. A mRNS-hez primer gyanánt oligo-dT-t adunk, majd a 60 cDNS szintetizálását megfelelő pufferben végezzük

HU 205779 Β úgy,hogy hozzáadjukméganégy dezoxinukleozid-trifoszfátot (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), a reverz transzkriptáz enzimet és a keveréket 1 órán át 45 ’Con tartjuk. A kapott cDNS/mRNS hibridet kloroformos kicsapással és gél-kromatográfiával - például Sephadex H50 oszlopon - tisztítjuk. Az RNS-t lúgos kezeléssel (0,3 MNaOH, 50 ’C, 1 óra) hidrolizáljuk, a cDNS-t pedig savanyú nátrium-acetát oldattal semlegesítjük és etanollal csapjuk ki. A kettó'sszál szintézisét úgy végezzük, hogy anyagunkhoz megfelelő' oldatbanhozzáadjukanégydezoxinukleozid-triszfoszfátot és azE.coliDNSpoIűnerázI-et, amikor is a cDNS temIátként, és 3’ végén kialakult hajtúszerkezete révén, egyszersmind primerként is viselkedik. A szintézis 6 órán át 15 ’C-onmegy végbe [AEftratiadis és munkatársai, Cell, 7,279 /1976/]. A DNS-t fenollal extraháljuk, Sephadex G50-en kromatografáljuk, etanollal kicsapjuk és megfeleld oldatban szímpla-szál-specif ikus SÍ endonukleázzal kezeljük. így bontjuk el a hajtűszerkezetet és a duplaszálúvá át nem alakult cDNS-t. Kloroformmal való extrahálás és etanollal történő kicsapás után a duplaszálú DNS-t (dsDNS) cukor-sűrüségrádienshen molekula-nagyság szerintválasztjuk el. A klónozás ezt követő lépéseinél előnyösen csak a 600 bp vagy ennél hosszabb dsDNS-t használjuk, ha növelni óhajtjuk annak lehetőségét, hogy csak az új interferonokat kódoló teljes szekvenciákat tartalmazó kiónokat kapjuk. A gradiensekből a 600 bp-nál hoszszabb dsDNS-t úgy koncentráljuk, hogy alkohollal kicsapjuk ésvízben feldőljük.

Abból a célból, hogy a dsDNS molekulákat felszaporítsuk, ezeket mindenekelőtt megfelelő vektroba, majd E.coli baktériumba kell bevinni. A használt vektor előnyösen a pBR322plazmid [EBoIivar és munkatársai, Gene 2,95 /1977/]. Ez a plazmid lényegében egy replikonból és két olyan markerből áll, amelyek rezisztenciát kölcsönöznek a gazdasejtnek az ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szemben XAp^r, Te¹). A β-Iaktamáz gén (Ap¹) felismerő szekvenciát tartalmaz a PstI restrikciós endonukleáz számára. A pBR322 plazmidot Psű-gyel hasíthatjuk. A keletkezett túllógó 3’-végeket dGTP és terminális dezoxinukleotid-transzferáz (TdT) hozzáadásával, megfelelően pufferolt oldatban, meghosszabbítjuk. Ugyanakkor a dsDNS-t szintén meghosszabbítjuk 3’ végein dCTP és TdT enzim segítségévei. Aplazmid és dsDNS homopoIimer végei komplenterek és egymással hibridizálnak, ha aplazmid DSN-t és a dsDNS-t megfelelő koncentráció viszonyok és alkalmas sók, pufferek és hőmérsékleti körülmények fenntartása mellett keverjük össze [LNelson és munkatársai, Methods in Enzymology, 68,41-50/1980/].

AzE.coli HB 101 törzset [F‘ genotípus, hsd20 (r-B, m-B) rexA13, ara-14, proA2, lacYl, galk2, rpsL20 (Smr),xyl-5,mtl-l,supE44, lambda-] kalcium-klorid oldattal történő mosással készítjük elő a rekombináns vektor dsDNS molekulák felvételéhez. A kompetens

E.coliHB 101 sejteket összekeverjük a DNS-el és 0 ’Con való inkubálás után a kapott plazmid-DNS-t 2 perces 42 ’C-os hősokk alkalmazásával transzformáljuk jMDagert és munkatársai, Gene, 6, 23-28 /1979/]. Végül a transzformált baktériumokat tetraciklin tartalmú (10 ng/ml) agarlemezre szélesztjük Ezen az agaron csak azok az E.coli HB 101 sejtek növekednék, amelyek egy vektor vagy rekombináns vektor molekulát vettek fel (Te/). Arekombináns vektor-dsDNS molekulák a gazdasejtet Ap^sTc^r genotípusává változtatják, mivel a β-Iaktamáz génbe történő dsDNS bevitel, a β-laktamázra vonatkozó információt kioltja. A ldónokat ezután olyan agarlemezre visszük át, amelyek 50 ng/ml ampicillint tartalmaznak Akiónoknak csak 3%-a növekszik, ami azt jelenti, hogya kiónok 97%ába dsDNS molekula épült be. Kiindulva 0,5 jig dsDNS-bőI, több mint 30.000 kiónt kaptunk s ebből 28.600 kiónt egyenként mikrotitráló lemezek tartályaiba vittünk át A tartályokban levő tápoldat 10 jig/ml tetracildint és glicerint tartalmaz. Akiónok elszaporodása után a lemezeket -70 ’C-on tároljuk (cDNS gyűjtemény).

Abból a célból, hogy cDNS gyűjteményünket új interferon-géneket tartalmazó kiónokra vizsgáljuk át a klónokat a felolvasztás után nitrocellulóz szűrőkre visszük fel. A szűrők tetraciklin tartalmú tápagaron vannak. A baktérium telepek megjelenése után a baktériumok DNS-ét a szíírőkrefixáljuk

Próba-anyagként e!őnyösenapER33 klón inszertumát [E.Rastl és munkatársai, Gene 21, 237-248 /1983/; lásd mégaO.115.613 számú, európainyilvánosságrahózott szabadalmi bejelentést] használjuk, amely azIFN-α 2-Arg gént tartalmazza. EDNS darabot nick-transzláció segítségével jelöljük DNS-pohmeráz I, dATP, dGTP, dTTP és a- P-dCTP alkalmazásával. A nitrocelíulőz szűrőket megfelelő, pontosan nem meghatározott feltételek mellett - a jelölt próbaanyag hozzáadása nélkül - először előkezeljük, majd körülbelül 16 órán áta jelöltpróba-anyaghozzáadásával, hibridizáljuk. Ezután a szűrőket ugyancsak határozatlan feltételek mellett mossuk, A hibridizálás és mosás körülményeinek pontatlansága azt eredményezi, hogy nemcsak az interferon-a 2-Arg tartalmú kiónokat fogjuk ki, hanem más olyan interferont tartalmazó kiónokat is, amelyeknek a szekvenciája jelentősen különbözhet az eddig ismert interferon-amolékulák szekvenciájától. Szárítás után a szűrőket röntgenfilmre exponáljuk. Egy feketedés, amely jelentősen felülmúlja a hátterét, olyan klón jelenlétét mutatja, amelynek interferon-specifikus szekvenciája van.

Minthogy a radioaktivitás jelei különböző erösségűek, a pozitív klónokból, illetve azokból, amelyekről gyanítjuk, hogy pozitiven reagálnak, kismennyiségű tenyészetet készítünk. A plazmid-DNS molekulát izoláljuk, PstI restrikciós endonukleázzal megemésztjük és agaróz gél elektroforézissel nagyság szerinti elválasztást végzünk [Bimbóim és munkatársai, Nucl Acid Rés., 7, 1513 /1979/]. Az agaróz gélben levő DNS-t Southern módszere szerint [EM,Southem, J.MoI.Biol., 98,503-517 /1975/] nitrocellulóz szűrőre visszük át. Aszűrőkön levő DNS-t radioaktív, IFN-gént tartalmazó, denaturált próba-anyaggal hibridizáljuk. Pozitív kontrolIkéntazlF7plazmid (letétbehelyezve aDe4

HU 205779 Β utsche Sammlung von Mikroorganismen gyűjteményében DSM-2362 letéti szám alatt) szolgál, amely az interferon-α 2-Arg gént tartalmazza. Az autoradiogramm világosan kimutatja, hogy az E76E9 klón és a P9A2 klón egy olyan szekvenciát tartalmaz, amely pontosan nem meghatározott körülmények között az interferon-α 2-Arg génnel hibridizál. Hogy az E76E9 és P9A2 klón dsDNS inszertuniát közelebbről jellemezhessük, e kiónok plazmidaiból nagyobb mennyiségeket állítunk elő. A DNS-t különböző restrikciós endonukleázokkal emésztjük, így például a következőkkel: Alul, SauSA, BgUI, HinfI, PstI és HaelII. A kapott fragmentumokat agaróz gélben választjuk el. A fragmentumok nagyságát úgy állapítjuk meg, hogy azokat megfelelő nagyság-jelzőkkel, így például olyan fragmentumokkal hasonlítjuk össze, amelyeket a pBR322 plazmid HinfI, illetve HaeHI restrikciós endonukleázzal történő emésztésénél keletkeznek. A Smith és Bimstiel [H-O-Smith és munkatársai, Nucl Acid Rés., 3, 2387-2398 /1976/] féle térképezéssel állapítjuk meg, hogy e fragmentumok hogy kövekteznek egymás után. Az így megállapított restrikciós térképekből (1. és 2. ábra) meglepő módon az vezethető le, hogy az E76E9 és P9A2 kiónok inszertumainál egy eddig ismeretlen interferon génről azaz az omega-interferon génről van szó.

Azomega-interferonről kapott eme információt arra használtuk, hogy a cDNS-ínszertumot megfelelő restrikciós endonukleázokkal emésszük. A kapott fragmentumokat az Ml3 mp9 bakteriofág dsDNSformájához (replikálódó forma) kapcsoljuk [J.Messing és munkatársai, Gene, 19, 269-272 /1982/] és a Sanger féle didezxoi-módszerrel szekventáljuk (F.Sangler és munkatársai, Proc.Natl.Acad.Sci„ 74, 5463-5467 /1977/]. A rekombináns fágok egyszálú DNS-ét izoláljuk. Szintetikus oligomer hozzákapcsolása utána duplaszálak szintézisét négy külön eljárás folyamán végezzük el azExoli DNS-polimeráz I nagy fragmentumának (Klenow fragmens) felhasználásával. A négy részreakció keverékéhez egyet-egyet a négy didezoxínuklezid-trifoszfátból (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) hozzáadunk. Ez statisztikus eloszlású láncszakadásokhoz vezet azokon a helyeken, ahol a templát-DNS-az adott didezoxinukleozid-trifoszfáttal komplementer bázis található. Ezen kívül redioizotóppál jelzett dAIP-t is használunk. A szintézis-reakciók lefolyás után a terméket denaturáljuk és az egyszálú DNS-fragmentumokat nagyságuk alapján denaturáló poliakrilamid-gélben választjuk el [F.Sanger és munkatársai, FEBS Letters, 87,107-111 /1978/]. Ezután a gélt röntgenfilmre exponáljuk. Az autoradiogrammról a rekombináns Ml 3 fágok DNS szekvenciái leolvashatók. A különböző rekombináns-fáginszterumok szekvenciáit alkalmas komputer-program segítségével dolgozzuk fel [R.Staden, Nucl Acid Rés., 10, 4731-4751/1982/].

Az Lés2.ábrán látható a szekvencia-analízis stratégiája. A 3. ábrán bemutatjuk a P9A2 klón inszertumának DNS-szekvenciáját, a 4. ábrán az

E76E9 kiónt ábrázoljuk. A nem kódoló DNS-szálat 5’-* 3’ irányban ábrázoljuk az ebből következő aminosav szekvenciával együtt.

Az E76E9 és a P9A2 klón DNS-ének összehasonlítása azt mutatja, hogy egy helyen különböznek: az E7 6E9 kiónban a 111. aminosavat kódoló triplet GAG és a glutaminsavat kódolja, míg a P9A2 kiónban ugyanez a triplet GGG és a glicint kódolja. A két omega-interferon-protein tehát egy aminosavban különbözik s elnevezésük eszerint omega(Glu)-interferon, illetve omega(Gly)-interferon.

Az ómega (Glu)-interferont meghatározó E76E9 klónból izolált cDNS 858 bázispár bosszú és egy nem transzlatált 3’ régiót tartalmaz. Az a szakasz, amelyik az érett omega(Glu)-interferont kódolja, a 9. nukleotidtól az 524. nukleotidig tart. Az omega(Gty)-mterferont meghatározó P9A2 klónból izolált cDNS 877 bázispár hosszú, amelyben az érett omega-interferont kódoló szekvencia a 8. nukleotidtól az 523, nukleotidig terjed. A nem transzlatált 3’ szakasz a P9A2 esetében a poii-A-szeletig tart.

Az E76E9 és P.9A2 kiónok az érett omega-interferont kódoló teljes DNS szekvenciákat tartalmazzák. Ezek N-terminális végükön a következő aminosavakkal kezdődnek: cisztein-azsparaginsav-leucin. Meglepő, hogy mindkét érett omega-interferon 172 aminosav hosszúságú, ami jelentős eltérést jelent az eddig ismert interferonoktól, például az a-interferonok 166 (illetve 165) aminosavától. Meglepő az is, hogy mindkét omega-interfero egy potenciális N-glü kozilációs helyet tartalmaz a 78. aminosav pozícióban (aszparagin-metionin-treonin).

A két omega-interferonnak és az eddig ismert emberi α-interferon szubtípusoknak az összehasonlítása a következő képet adja:

	ómega	alfa
a protein hossza		166®
aminosavakban	172
potenciális N-glükozilációs hely a megadott pozícióban	78	.(++)

®Az interferon-alfa-A csak 165 aminosavból áll (⁺⁺Az interferon-alfa-H 75-ös pozícióban tartalmaz potenciális N-glükozilációs helyet [D.Goeddel és munkatársai, Natúré, 290,20-26/1981%].

Az E76E9 plazmidot tartalmazó E.coli HB101 törzset és a P9A2 plazmidot tartalmazó E.coli HB101 törzset letétbe helyzetük 1984. július 3-án aa Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DMS, Göttingen) gyűjteményében DSM 3003, illetve DSM 3004 letéti szám alatt.

Annak bizonyítására, hogy az újonnan felfedezett kiónok interferonhoz hasonló aktivitást fejtenek ki, péládul az E76E9 klónból tenyészetet készítünk és növekedés után a baktériumok lizátumát plakk-redukci5

HU 205779 Β ós vizsgálatnak vetjük alá. A baktérium a várakozásnak megfelelően ínterf eronszerű aktivitást fejt ki (lásd a 3. példát).

Ezenkívül annak igazolásául, hogy a két felfedezett interferonnál egy új interferon család tagjairól van szó, Namalwa sejtekből az össz-DNS-t izoláljuk és különböző restrikciós endonukleázokkal megemésztjük. Ezáltal meg tudjuk becsülni azon gének számát, amelyeket a P9A2 és E76E9 kiónok cDNS-ei kódolnak. A kapott DNS fragmentumokat Sotuhem módszere szerint [EAí.Southem és munkatársai, JJvíolJ3iol, 98 503-517 /1975/] agaróz gélben elválasztjuk, nitrocellulózszűrőre visszük és viszonylag pontosan meghatározott feltételek mellett a P9A2 klón radioaktív izotóppal jelzett specifikus DNS-ével hlbridizáljuk.

AP9A2klón DNS-ével és a pER33 plazmid DNSével történő hibridizálás során kapott eredményeket az5a, ábrán mutatjuk be.

Az ábrán a különbözőképpen emésztett DNS-anyagokat jelentő sávokat betűkkel jelöljük: E= EcoRI, H= HíndHI, B= BanHT, S= Sphl, P= PstI, C= Clal. A szűrő baloldali felén az interferon-a-gén próba-anyaggal (”A”), a jobb felén a P9A2 klón cDNS inszterumával f’O”) történt hibridizáció látható. A sávok sora, akár α-ihterferon-gén próba-anyaggal, akár az új interferon-gén próbaanyaggal hibridizálunk, különböző. Ha két különböző próbaanyagnál a megfelelő foltokat kiértékeljük, nem lehet kereszthibridizációt megállapítani.

Az5b.ábrán a P9A2klón cDNS-ét és a hibridizáláshoz használt fragmentumot ábrázoljuk. Néhány restrikciós enzim hasítási helyét megjelöltük: P= PstI, S= Sau3A, A= Álul. A próba-anyag a lehetséges három PstI hely közül csak kettőt foglal magába. A hibridizációs minta csak egy, körülbelül 1.300 bázis pár (bp) nagyságú hibridizáló fragmentumot mutat, ami a homológ génhez tartozik. A kisebb, 120 bp hosszú fragmentum kifutott a gélből. A gén 5’ végének megfelelő koteg nem látható, mivel a próba-anyag ezt a régiót nem tartalmazza. Legalább 6 különböző köteget lehet a PstI sávban felfedezni. Ez azt jelenti, hogy néhány más olyan génnek, amelyek az űj szekvenciákkal rokonok, jelen kell lennie az emberi genomban. Amennyiben ezekben a génekben egy vagy több PstI hasítási hely van jelen, úgy várható, hogy még legalább három más gént is izolálhatunk.

Ezeket a géneket - előnyösen hibrid izálással - egy olyan emberi géngyűjteményből, amelyet plazmidvektor, fág-vektor vagy kozmid-vektor tartalmaz, izolálhatjuk (lásd a 4e példát).

Ezen a helyen kell megemlítenünk, hogy a találmány szerinti omega-interferonok esetében a találmány nemcsaka két érett interferonra vonatkozik, hanem ezen polipeptidek mindenkori módosításaira is, amennyiben amődosítás azIFN-omega aktivitást nem befolyásolja. Az ilyen módosítások közé tartozik például a molekula megrövidítése N- vagy C-terminális végén, az aminosavak helyettesítése más csoportokkal, ha ez az aktivitást lényegesen nem változtatja meg, a molekula kémiai vagy biokémiai úton történő rákapcsolása más olyan molekulára, amelyek vagy inter tek vagy aktívak lehetnek. Az itóbb említett módosítások esetében szó lehet például olyan hibrid molekulákról, amelyek egy vagy több omega-interferonből és/vagy ismert a- vagy β-interferonokbói tevődnek össze.

Hogy összehasonlíthassuk azokat a különbségeket, amelyek az új interferonok, közelebbről az omega(Gly)- és omega(Glu)-interferon aminosav-és nukleotid szekvenciája és az α-interferonokra és a β-ΐηterferonra már publikált aminosav és nukíeotid szekvenciák [C.Wéissmann és munkatársai, Phil-Trans. RSoc. London, 299,7.28 /1982/; AUllrich és munkatársai, JMokBiol., 156,467-486 /1982/; T.Taniguchi és munkatársai, Proc.NatlAcad.Sci., 77,4003-4006 /1980/; K.Tokodoro és munkatársai, EMBO J., 3 669670 /1984/] közt fennáll, a megfelelő szekvenciákat párba rendezzük és a különbségeketaz egyes pozíciókban megszámoljuk.

A 7. ábrán bemutatott eredményekből látható, hogy a P9A2 és az E76E9 kiónok DNS szekvenciáit az I típusú interferonokéival (például a- és β-interferonokkal) rokonok. Másrészt az ábra azt is mutatja, hogy az egyes α-interferonok és az új szekvenciákkÖztaz aminosav szekvenciák különbözősége nagyobb, mint 41,6% és kisebb, mint 47,0%. Az új szekvenciák, valamint az egyes a-interferonokés a β-interferonokszekvenciái különbségének mértéke körülbelül 70%. A

4. példa eredményeire való tekintettel, amelyben egy egész sereg rokon gén jelenlétére van bizonyíték és az interferonok javasolt nomenklatúrájának [LVilceck és munkatársai, J.Gen.Virol., 65, 669-670 /1984%] figyelembevételével állítjuk, hogy a p9A2 és azE76E9 ldónok cDNSinszertumai azltípusúinterferonókegyúj osztályát kódolják, amelyet omegs-iaíerferon névvel jelölünk.

Bebizonyítjuk továbbá, hogy az omega-lnterferon gén expressziója az I típusú interferon gének kifejeződésével analóg módon történik. Erre vonatkozóan vizsgáljuk - az Sl-mapping módszerre alapozva [A JJBerk és munkatársai, Cell, 12 721 /1977/] - az trés omega-interferonokhoz tartozó multigén-családok egyes tagjainak transzkripcióját (lásd a 7. példát) és kimutatjuk, hogy az omega-l-mRNS kifejeződése vírussal indukálható. Mível egy ilyen géncsalád átiratai csak néhány bázissal - körülbelül 1.000 bázissal - különböznek egymástól, a hibridizálás egyedül nem ad elég érzékeny megkülönböztető jelleget ahhoz, hogy a különböző IFN mRNS-eket meg lehessen egymástól különböztetni.

A 8a. b. c ábrákon kilenc α-interferon, azIFN-ome6 ι

HU 205779 Β ga-1- és az β-interferon mRNS szekvenciáit ábrázoljuk. Az ábrákon nagybetűkkel jelöljük azokat a bázisokat, amelyek megfelelő szekvenciára specifikusak. Ilyen specifikus helyeket triviális komputer-program segítségével találhatunk. Egy hibridizációs próbaanyagot, amely egy specifikus helyről indul ki, csak egy meghatározott szibtípus mRNS* ével lehet képletesen hibridizálni. Az összes többi mRNS-t nem lehet a szubtípus specifikus helyén hibridizálni. Ha a hibridizá* ciós próba-anyagot specifikus 5’ Végén radioizotóppal jelöljük, akkor csak azokat a radioaktív jelöléseket védhetjük meg egy egy szálra specifikus nukleázzal (előnyösen SÍ nukleázzal) történő emésztéssel szemben, amelyek azon interferon-szubtípusmRNS-ével hibridizálnak, amelyekhez a próba-anyagot szerkesztettük.

Ez az elv nemcsak interferonokra korlátozódik, hanem sokkal inkább alkalmazható olyan ismert szekvencia csoportokéi, amelyekben a 8. ábrán bemutatott specifikus helyekmegtalálhatók.

Aszubtípusok fent említett specifikus helyei a legtöbb esetben nem restrikciós helyek, így a cDNS-ek hasítása restrikciós endonukleázokkal nem alkalmas arra, hogy szubtípus specifikus hibridizációs próbaanyagokat állítsunk elő. Az ebben a példában használt próba-anyagokat ezért úgy állítjuk elő, hogy egy 5'-végén radiozitóppal jelölt oligonukleotidot - amely az omega-l-interferon mRNS-ével a specifikus hely felett komplementer - meghosszíbbítunk.

A10. ábrából kitűnik, hogy a várakozásnak megfelelően az omega-l-mRNS Namalwa- és NC37 sejtekben indukálható.

A találmány tehát nemcsak olyan génszekvenciák előállítására vonatkozik, amelyek kizárólag az adott omega-interferonokat határozzák meg, hanem olyan » módosítások előállítási eljárásaira is, amelyeket könnyen és ritunszerűen, mutáció, lebontás, transzponálás vagy addicionálás révén érhetünk el. Valameny_r nyi szekvencia, amely a leírt humán omega-interferonokat kódolja (tehát azok, amelyek az itt ismertetett aktivitás spektrummal rendelkeznek) és azok is, amelyek a bemutatottszekvenciával összevetve degeneráltak, szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak; az ezen a területen dolgozó szakemberek jártasak a kódoló régiók DNS szekvenciáit módosító eljárásokban. Ehhez hasonlóan valamennyi szekvencia, amely IFNomega aktivitás spektrumot felmutató polipeptidet kódol és amely a bemutatott szekvenciákkal (vagy ezek részeivel) pontosan meghatározott körülmények között hibridizál (például olyan körülmények mellett, amelyek több mint 85%-os, előnyösen több, mint 90%os homológiával szelektálnak), a találmány tárgyát képezi.

A hibridizációkat óxSSc (5xDenhardt oldat) 0,1% SDS tartalmú reakciókeverékben, 65 ’C-on végezzük. A pontosság fokát a mosatási lépések határozzák meg. így a DNS szekvenciák 85%-os vagy ennél nagyobb homológiával történő szelektálásának feltétele a következő: 0,2 x SSC/0,01% SDS (65 ’C); aDNS szekvenciák 90%-os vagy ennél nagyobb homoíógiával történő szelektálási feltétele a következő; 0,1 . SSC/0,01% SDS/65’C.

Egy kozmidgyűjtemény ilyen feltételek melletti (0,2 xSSC) átvizsgálásakor néhány IFN-omega-1 próbaanyaggal hibridizáló kozmidot nyertünk. Az ezekből izolált restrikciós-enzimfragmentumok szekvencia analízise kimutatta az autentikus IFN-omega-1 gént (lásd all. ábrát), valamint három további rokon gént is, amelyeket a következőkben jelölünk: IFNpszeudo-omega-2, IFN-pszeudo-omega-3 és IFNpszeudo-omega-4 (lásd a 12-14. ábrákat). Ezek ugyancsak a találmány tárgyát képezik, s ezeket a szabadalmi igénypontokban ismertetjük,

A DNS-ek összehasonlítása alapján a pszeudo-gének (lásd 9. példa) kereken 85%-ban homológok az IFN-omega-l-génnel (interferon-omega-egy-gén).

Ezenfelül az IFN-omega-l-gén transzkripciójakor a mRNS egy funkcionális interferon-protein információját is tartalmazza, azaz egy 23 aminosav hosszúságú , alábbi képletű szignálpeptídet is kódol.

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly, amelyet a 172 aminosav hosszúságú IFN-omega-1 követ.

Interferon-omega gének, megfelelő feltételek mellett, minden olyan szervezetbe bevihetők, amelyek jó kitermelést szolgáltatnak. Az alkalmas gazdasejteket és vektorokat igen jól ismerik a szakemberek; példaként azEP-A-0.093,619 számú európai nyilvánosságrahozott szabadalmi bejelentésre utalunk.

Különösen a prokarióták előnyösen a kifejeződés szempontjából. Alkalmas például az E.coli K12 294 törzs (ATCC letéti száma: 31,446). A többi alkalmas törzs közé tartozik az E.coli X1776 (ATTC letétli száma: 31,537). Ugyanúgy, mint az előbb említett törzseket, az E.coli W 3110 (F, Lambda, prototróf, ÁTTC letéti száma: 27,325) törzset is bacillusokat, így a Bacillus subtilist és az Enterobacteriaceaé családtagjait, így a Salmonella typhimurim vagy a Serritia marcescens törzset és a különböző Pseudomonas törzseket szintén fel lehet használni.

Általában azok a plazmid-vektorok használhatók, amelyek replikont és olyan kontroli szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a gazdasejttel kompatibilis fajból származnak, s e gazdasejtekkél összekapcsolva kerülnek felhasználásra. A vektor rendszerint, egy replikaciós kezdőponton kívül, felismerhető szekvenciákat hordoz, amelyek lehetővé teszik a transzformált sejtek fenotípus szerinti szelektálását. Például az E.colit rendszerint pBR322-Vel transzfomálják. Ez a plazmid az E.coli fajból származik [Bolivár és munkatársai,

HU 205 7 Π Β

Gene, 2,95/1977/]. ApBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisztenciagént tartalmaz, s ezzel egyszerű eszközt nyújt a transzformált sejtek identifikálásához. A pBR322 plazmidnak, s a többi plazmidnak is, ezenkívül saját promotereket kell tartalmazniuk vagy úgy kell őket módosítani, hogy olyan promotereket tartalmazzanak, amelyeket a mikroba szervezete a saját proteinjeinek kifejezésére használhat fel. Rekombináns DNS előállításánál leggyakrabban felhasznált promoterek közé tartozik a béta-laktamáz (penícillínáz) és laktózpromoterrendszer [Chang és munkatársai, Natúré, 275,615 /1978/; Itakura és munkatársa, Science, 198, 1056 /1977/; Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 /1979/], valamint a triptofán-(trp) promoter-rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 8,4057 /1980/; 0.036.776 számú európai nyilvánosságrahozott szabadalmi bejelentés]. Az említettek a leghasználatosabb promoterek, azonban más mikroba eredetű promotereket is kifejlesztettek és használtak. Az IFN-omegához szükséges génszekvencia például a lambda baktriofág Ieftward-promoterének (Pj) az irányítása mellett alkalmazható. Ez a promoter egyike a különösen erősnek tartott szabályozható promotereknek. A szabályozást a lambda-represszor teszi lehetővé, amelynek közelében restrikciós hasítási helyek találhatók.

Ennek a represszor génnek egy hőmérséklet-érzékeny alléljét beépíthetjük egy olyan vektorba, amely egy teljes IFN-omega szekvenciát tartalmaz. Ha a hőmérsékletet 42 ’C-ra emeljük, a represszor inaktiválódik és a promoter maximális koncentrációban fejeződik ki. Az ilyen körülmények között termelődött összmRNS elég ahhoz, hogy egy olyan sejtet kapjunk, amelyben az új szintetikus ribonukleinsavak körülbelül 10%-a a P_L promoterből származik. Ilyen módon egy új klónbank megteremtése válik lehetővé, ahol a funkcionális IFN-omega szekvencia egy riboszőma kötőhely szomszédságában van, a Iambda-P_L-promotertől különböző távolságokban. Ezeket a kiónokat azután átvizsgálhatjuk és a legnagyobb kitermelést adókatkiválasztjuk.

Egy IFN-omega szekvencia expressziója és transzlációja végbemehet más olyan szabályozó rendszerek ellenőrzése alatt is, amelyek az organizmus transzformálatlan formájában is ,jiomológ”-nak számítanak, így például a laktóz-függő Exoli kromoszóma DNS-e laktóz-, illetve lac-operont tartalmaz, amely a béta-galaktozidáz enzim létrehozása révén lehetővé teszi a laktóz lebontását.

Alac-szabályozó elemeket, azExoIira nézve fertőző lambda-plac5 baktriofágból nyerhetjük. A fág-operonja transzdukció révén ugyanezen baktériumfalból származhat. Azokat a szabályozó rendszereket, amelyek a találmány szerinti eljárás bán nyernek alkalmazást, az organizmusra jellemző pélazmid DNS-ből származhatnak. A lac-promoteroperátor-rendszertlPTG-vel indukálhatjuk.

Más promoter-operátor rendszerek és ezek részei ugyanilyen jól használhatók, üyenek például a következők; arabinóz-operátor, Kolicin Ej -operátor, galak: íz-operátor, alkalikus-foszfatáz-operátor, írp-oper itor, xilóz-A-operátor, tac-promoter stb.

A prokariótákon kívül eukariőta mikroogranizmusokat is használhatunk, így élesztő tenyészeteket is. A : Saccharomyces cerevisiae a leggyakrabban használt eukariőta mikroorganizmus, jóllehet számos más faj is hozzáférhető. Saccharomycesben történőkifejezésre például rendszerint az YRp7 plazmidot [Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282,39 /1979/; KingsI J mán és munkatársai, Gene, 7,141 /1979/; Tschumper és munkatársai, Gene, 10 157 /1980/] és azYEp 13 plazmidot [Bwach és munkatársai, Gene, 8,121-133 /1979/] alkalmazzák. Az YRp7 plazmid a IRPl gént tartalmazza, s ez egy olyen élesztő mutánsnál (például

ATTC letéti szám: 44,076), amely triptofán tartalmú táptalajon nem képes növekedni, ismertetőjegyet szolgáltat a szelektáláshoz.

Amikor az élesztő gazdasejt genomjában TRP1 károsodás van, akkor ez a jellemző hatásos segédeszközt nyújt ahhoz, hogy kimutathassunk transzformációt, ha a sejteket triptofán nélkül tenyésztjük. Hasonló a helyzet azYEpl3 plazmidnál, amely aLEU 2 élesztőgént tartalmazza, s amelyet egy LEU-2-minus mutánssal együtt alkalmazhatunk. Élesztő vektorok szá25 mára alkalmas promoter szekvenciák a következők: az ADH-I-gén 5’-határoló szakasza [GAmmerer, Methods of Enzymology, 101,192-201 /1983/], a 3-foszfoglicerát-kinát [Hitzman és munkatársai, J£iol.Chem., 255 2073 /1980/] vagy más glükolitikus en30 zimek [Kawasaki és Fraenkel, BBRC, 108,1107-1112 /1982/], mint az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, píruvát-dekarboxiláz, foszfofrukto-kináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz. Megfelelő expressziós plazmid koncentrációnál az ezekkel a génekkel asszociált terminációs szekvenciákat az expressziós vektorban ugyancsak a kifejezendő szekvencia 3’-végére lehet beépíteni, hogy a mRNS poliadenüációjáról és terminációjáról gondoskodjunk.

Vannak más promoterek, amelyeknek még az az előnyük, hogy transzkripciójukat növekedési körülmények szabályozzák. Uyen promoter régiói vannakakövetkező enzimeknek: alkoholdehidrogenáz-2, izocitoróm C, savanyú foszfatáz-bontóenzimek, amelyek a nitrogén anyagcserével vannak összefüggésben, a fent említett gUceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz és azok az enzimek, amelyek a maltóz és galaktóz lebontásáért felelősek. Azokat a promotereket, amelyeket az élesztő mating type lókusza szabályoz, például a BAKI,

MF 7, STE2, STE3, STE5 gének promotereit, hőmérséklettel szabályozott rendszerekben -hőmérsékletfüggő siv mutációk segítsége révén -használhatunk fel. [RhinePH.D. Tézisek, Universityof Oregon, Eugene, Oregon /1979/; Herskowith és Oshima, TheMole55 cular Biology of the Yeast Saccharomyces, I.rész 181209. oldal /1981/ Cold Spring Harbor Laboratory]. Ezek a mutációkbefolyásoljákazélesztőknyugvómating type kazettáit és ezáltal indirekt módon a mating type függő promotereket. Általában azonban minden olyan plazmid vektor megfelelő, amely egy élesztő8

HU 205779 Β <» kompatíbilis promotert és eredeti replikációs és terminációs szekvenciákat tartalmaz.

A mikroorganizmusokon kívül a többsejtű organizmusok tenyészetei is megfelelő gazdaszervezetek. Elvileg minden ilyen tenyészet felhasználható, akár gerinces, akár gerinctelen állat sejttenyészetéről van szó, A legelőnyösebbek mégis a gerinces állatok sejttenyészeíei, s a gerinces állatok sejtjeinek szaporítása szövet-tenyészetben az utóbbi években rutin módszerré vált [Tissiie, Culture, Academic Press, Kruse és Petíerson /1973/]. Példák az alkalmazott gazdasejt-vonalakra: VERŐ- és HeLa-sejtek, aranyhörcsög-petefészek (CH0)-sejtek, valamint W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. Az ezekhez a sejtekhez használható expressziós vektorok rendszerint (ha szükséges) egy replikációs helyet, egy a kifejezendő gén előtt elhelyezkedő promotert, az összes szükséges riboszómakötő hellyel együtt, RNS-spíicing helyet, pl iádén iláci ós helyet és transzkripció terminátor szekvenciákat tartalmaznak.

Emlősállat sejtek alkalmazása esetén gyakran vírus-anyagból biztosítják az expressziós vaktorokra ható kontroll funkciókat. Például a leggyakrabban használt promoterek polyoma adenovírus 2-ből származnak és különösen gyakran a Simian vírus 40-ből (SV40). AzSV40 korai és késői végpromoterei különösen hasznosak, mivel a vírusból mindkettőt könnyen megkaphatjuk olyan fragmentum formájában, amely még az SV40 virális replikációs helyét is tartalmazza (Fires és munkatársai, Natúré, 273, 113 /1978/]. Az SV4ö-nek még kisebb és nagyobb fragmentumai is felhasználhatok, amennyiben ezek azt a megközelítőleg 250 bp hosszú szekvenciát tartalmazzák, amely a Hindin hasítási helytől a virális replikációs helyen belül levő BglI hasítási helyig terjed. Ezenkívül ugyancsak lehetséges és gyakran ajánlatos is olyan promotervagy kontrollszekvenciákat alkalmazni, amelyek rendszerint a kívánt génszekvenciákhoz kapcsolódnak, feltéve, ha ezek a kontroll szekvenciák a gazdasejt rendszerrel kompatibilisek.

A replikációs helyről vagy egy megfelelő vektorszerkezet révén gondoskodhatunk - úgy, hogy egy exogén helyet beépítünk, például az SV40-ből vagy más vírusból (például: polyoma, adeno, VSV, PBV stb.) - vagy a gazdasejt krómoszómális replikációs mechanizmusa biztosítja azt. Ha a vektor a gazdasejt kromoszómájába van integrálva, akkor legtöbbször az utóbbi említett módszer is megfelel.

A géneket mégis előnyösen a pÉR103 expressziós plazmidban [E.Rastl-Dworkin és munkatársai, Gene, 21,237-248 /1983/ és aO.l 15.6Í3 számú európainyilvánosságrahozott szabadalmi bejelentés - letétbe he10 lyezve a Deutsche Sammlung für Mikroorganísmea gyűjteményében, 1983. december 20-án, DSM 2.773 letéti szám alatt] fejezzük ki, minthogy ez a vektor minden olyan szabályozó elemet tartalmaz, amelyek a klónozott gének igen magas expressziós rát ját biztosí15 tják. A találmány szerint tehát a pBR322 plazmidban, a plazmid rövidebb EcoRI/BamHI fragmentumát a

EcoRISau3A gaattcacgctGATCGCTAAAAACATTGTGCAA

AAAGAGGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA59 mRNA-SíartMet

ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGG CAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116

Cys Asp RBS Hindii!

TGTGATC-IFN-omega-gén-*·

Sau3A képletű DNS szekvenciával helyettesítjük.

Hogy a találmány szerinti célt elérjük a 6. ábra szerint például a következőképpen járunk el:

I. Az itt megkövetelt egyes DNS fragmentumok előállítása

Az a) fragmentum

Az a) fragmentum előállítása érdekében egy IFNomega gént tartalmazó plazmidot, például a P9A2 plazmidot az AvaU restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott cDNS inszertumot kromatografaljuk és tisztítjuk, majd az Ncol és Alul restrikciós endonukleázzal kétszer tovább emésztjük, végül kromatográfiával és elektroelucióval izoláljuk. Ez a fragmentum tartalmazza a megfelelő omega-interferon gén nagy részét. Például a P9A2 klón omega(Gly)-interferon génje a következő szerkezetű:

»

His Gly Leu Leu c CAT GGC CTA CTT

Ser Arg Asn Thr Leu AGC AGG AAC ACC TTG

Ncol

Val Leu His Gin GTG CTT CTG CAC CAA 35

Lys Asp Arg Arg Asp AAG GAC AGA AGA GAC 50

Ser Gin Leu Gin Lys AGC CAG TTG CAG AAG

Met Arg Arg Ile Ser ATG AGG AGA ATC TCC 40

Phe Arg Phe Pro Gin TTC AGG TTC CCC CAG 55

Ala His Val Met Ser GCC CAT GTC ATG TCT

ProPheLeu Cys Leu CCT TITC TTG TGT CTC 45

Glu Met Val Lys Gly GAG ATG GTA AAA GGG 60

Val Leu His Glu Met GTC CTC CAT GAG ATG

118

163

HU 2)5779 Β

65	1 70	75
Leu Gin Gin Ile Phe	Ser Leu?heHis Thr	GluArgSerSerAla
CTGCAGCAGATCTTC	AGC CTC TTC CAC ACA	GAGCGCTCCTCTGCT	208
80	85	90
AlaTrpAsnMetThr	Leu Leu i\sp Gin Leu	His Thr Gly Leu His
GCCTQGAACATGACC	CTC CTA G? 12 CAA CTC	CACACTGGACTTCAT	253
95	100	105
Gin GlnLeu Gin His	Leu G1 j Thr CysLeu	Leu Gin Val Val Gly
CAGCAACTGCAACAC	CTGGAGACCTGCTTG	CTGCAGGTAGTGGGA	298
110	115	120
Glu Gly Glu Ser Ala	Gly Alá Ile Ser Ser	Pro Ala Leu Thr Leu
GAAGGAGAATCT GCT	GGGCGAATTAGCAGC	CCTGCACTGACCTTG	343
125	130	135
Arg Arg Tyr Phe Gin	Gly Ile Arg Val Tyr	Leu Lys Glu Lys Lys
TACAGCGACTGTGCC	TGG GAA GTT GTC AGA	ATGGAAATCATGAAA	433
155	160	165
SerLeu Phe Leu Ser	Thr Asn Met Gin Glu	Arg Leu Arg Ser Lys
TCCTTGTTCTTATCA 1*7Π	ACA AAC ATG CAA GAA	AGACTGAGAAGTAAA	478
i /U Asp Arg Asp Leu Gly	SerSer

GATAGAGACCTGGGCTCATCTTGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530

TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTAITCGGCTTTAATCAC 589

ACAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648

AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCT?\AGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707

TrATTCITACATrTTATCATATrTATACTATTrATATTCTTATATAACAAATGITTGCC 765

TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802 ' Aiur

A b) fragmentum

A b) fragmentum előállítása céljából a P9A2 plazmidot AcaH restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott cDNS inszertumot kromatografáljuk és tisztít5

Ásp Leu Pro Gin GATCTGCCTCAG Sau3A 20

Val Leu Leu His Gin GTGCTTCTGCACCAA 35

Lys Asp Arg Arg Asp AAGGACAGAAGAGAC 50

Ser Gin Leu Gin Lys ACGCAGTTCCAGAAG Leu Gin Gin Ile CTG CAG CAg atc Sau3A

Asn His Gly Leu AAC CAT GGC CTA CTT Ncol 25

MetArgArglIeSer ATG AGG AGA ATC TCC 40

Phe Arg Phe Pro Gin TTC AGG TTC CCC CAG 55

Ala His Val Met Ser GGC CATGTC ATGTCT juk, majd Sau3A restrikciós endonukleázzal tovább emésztjük. Akívánt 189 bp bosszú fragmentumot kromatográfia és elektroelúció segítségével izoláljuk. A fragmentum képleteakövetkező:

Ser Arg Asn Thr Leu AGCAGGAACACCTTG 42

Pro Phe Leu CysLeu CCTTTCITGTGTCTC 87 45

Glu Met Val Lys Gly GAGATGGTAAAAGGG 132 60

ValLeuHisGluMet GTCCTCCATGAGATG 117

189 jí .fc

A c) fragmentum

Ac) fragmentum előállítása céljából a pER33 plazmidot [ERastl-Dworkin és munkatársai, Gene 21, 237-248 /1983/ és a 0.115.613 számű európai nyilvánosságrahozott szabadalmi bejelentés] az EcoRi és PvuH restrikciós enzimmel kötszerre megemésztjük. 60

Agaróz gélben való frakcionálás és tisztítás után egy 389 bp hosszú fragmentumotkapunk, amely a trp-promotert, a robszóma kötőhelyet és a startkodont tartalmazza. A fragmentumot ezután Sau3A-val emésztjük, s a kívánt 108 bp hosszú fragmentumot agaróz gél elektroforézis, elektroelúció és Elutip-oszlopon törté10

HU 205779 Β

nő tisztítás után kap juk. Ennek képlete a következő:
EcoRI Sau3A gaattcacgctGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA	Met	59
|mRNA-start	116
ACCAGTTAACTAGTÁCACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAÁAG RBS	ATG Hindin
Cys Asp TGT gat c Sau3A		123

Ab) és c) fragmentum összekapcsolása HíndEH-mal hasítjuk a molekulát. Az összekapcsolt

A b) és c) fragmentumot T4-ligáz enzim segítségé- fragmentum képlete:

yel kapcsoljuk össze, majd az enzim elbontása után

Hindin Sau3A Ncol a AGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50

ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100

CTCAAGGACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCAGGAGATGGTAAAAGGGAG 150

CCAGTTGCAGÁAGGCCCATGTCATGTCTGTCCTCCATGAGATGCTGCAGC 200

AGATCACACATCTTTAagct t

Sau3A Hindin

Ezt a pRHWiO plazmid előállításához szükséges DNS fragmentumot más módon, két szintetikus úton előállított oligonukleotid felhasználásával is elkészíthetjük. Az

5-AGCTTAAAGÁTGTGT-3’ képletű oligonukleotid 5’-vége defoszforilált állapotban marad. Az

5’-GATCACACATCTTTA-3’ képletű oligonukleotid 5’ végét a T4-polinukleotidkináz és ÁTP segítségével foszforiláljuk.

A két oligonukleitod hibridizálásakor a következő rövid DNS fragmentumot kapjuk:

5’-AGCTTAAAGATGTGT 3’

3’-ATTTCTACACACTAGp 5’

Ilyen módon ez a fragmentum egyik végén egy HindHI-ra jellemző túllógó részt és a másik végén a Sau3A-ra jellemző túllógó részt tartalmaz.

Ab) fragmentumot borjúbél-foszfatázzal defoszforiláljuk. Ab) fragmentumot és a fent leírt fragmentumot összehozzuk és T4-ligáz segítségével egymással összekapcsoljuk.

Minthogy a ligáz részére legalább egy 5’-foszfát vég szükséges, csak a szintetikus DNS-darab képes a b) fragmentummal kötődni, vagypedig két szintetikus fragmentum képes Sau3A végeik révén egymáshoz kötődni. Minthogy az így keletkező két fragmentum hossza különböző lesz, szelektív izopropanolos kicsapással választjuk el őket. A tisztított fragmentumot T4-polinukleotid-kináz és ATP segítségével foszforiláljuk.

H. Az expressziós plazmidok előállítása a) A pRHWiO plazmid előállítása

A pER103 expressziós plazmidot [E.Rastl-Dworkin és munkatársai, Gene, 21, 237-284 /1983/ és a 0.1115.613 számú európai nyilvánosságrahozott szabadalmi bejelentés - letétbe helyezve a Deutsche Sammiung für Mikroorganismen gyűjteményében DSM 2.773 letéti szám alatt] linearizáljuk, ΗϊπάΠΙmal emésztjük, végül borjúbél-foszfatázzal kezeljük.

Az így kapott DNS-t izolálás és tisztítás utándefoszforiláljuk, majd ezután az összekapcsolt b + c fragmentumhoz (ennek HindQI-mal való emésztése után) kötjük ligáz reakcióval. Ezután a kapott ligázos reakciókeverékkel E.coli HB 101 sejteket transzformálunk, s a sejteket 50 pg/ml ampicillin tartalmú LB-agaron tenyésztjük. A kívánt szerkezetet mutató plazmidnak pRHWiO nevet adtunk (lásd a 6. ábrát), s replikációja után, mint közti terméket, további plazmidok előállítására használjuk.

b)A pRHW2 plazmid előállítása

A BamHI-el hasított pRHWiO plazmidhoz hozzáadjuk a NDS-polimeráz I Klenow-fragmentjét és a négy dezoxinuldeozid-trifoszfátot. Az inkubálás után kapott linearizált tompa végekkel ellátott plazmidot tisztítjuk, majd Ncol-el hasítjuk. A nagyobb fragmentumot, amelyet agaróz-gélelektroforézis, elektroelúció és Elutip-tisztítás után kapunk, ligázzal az a fragmentumhoz kapcsoljuk. Végül a ligáz reakció-keverékkel E.coli HB 101 sejteket transzformálunk és a sejteket 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agaron tenyésztjük. A kívánt szerkezetet mutató plazmidot pRHW12 jelzéssel láttuk el (lásd a 6. ábrát), s ez a plazmid fejezi ki a kívánt omega(Gly)-interferont.

Például az így kapott baktérium tenyészet 1 litere (OD = 0,6; 600 nm) 1 x 10⁶ NE (nemzetközi egység) interferont tartalmaz.

c)A pRHWll plazmid előállítása

A BamHI-gyel hasított pRHWIO plazmidhoz hozzáadjuk a DNS polimeráz I Klenow-fragmentjét és a 60 négy dezoxinukleozid-trifoszfátót. Az inkubálás után

HU 205779 Β kapott linearizált, tompa végekkel ellátott plazmidot tisztítjuk, majd Ncol-gyel hasítjuk. A nagyobb fragmentumot, amelyet agaróz-gélelektroforézis, elektroelúció és Elutip-tisztítás révén kapunk, az E79E9 plazmidból analóg módon készített a fragmentummal - amelyben a 111. aminosavat (Gly) kódoló GGG kodont a GAG (Glu) kodon helyettesíti - kapcsoljuk osszeligázreakcióval. Ezután a ligáz reakció-keverékkel E.CO1ÍHB 101 sejteket transzformálunk és a sejteket LB-agaron tenyésztjük. A kívánt szerkezettel rendelkező' plazmidot pRHWl 1-nek neveztük (lásd a 6. ábrát), seza plazmid fejezi ki a kívánt omega(Glu)-interferont.

A sejteknek hordozókkal történő transzformálása számos eljárással vihető végbe. Például használhatunk kalciumot, amikor vagy a sejteket mossuk magnéziumban és a DNS-t adjuk a kalciumban szuszpendált sejtekhez vagy a sejteket adjuk DNS és kalcium-foszfátkoprecipitátumához. Az ezt követőgén expresszióhoz a sejteket olyan táptalajokra visszük, amelyek szelektáljáka transzformált sejteket.

A gazdasejt transzformációja után a gén kifejezése fermentáció, azaz sejt-tenyésztés segítségével történik, olyan feltételek mellett, hogy végbemenjen az IFN-omega kifejeződése. A terméket rendszerint ismertkromatográfiás elválasztási módszerekkel izolálhatjuk, amikor is kapott anyag az IFN-omegát vezérés farok-szekvenciával vagy ezek nélkül tartalmazza. Az IFN-omega kifejeződhet úgy is, hogy N-terminálisán vezér-szekvencia van (pre-IFN-omega), amelyet néhány gazdasejt esetén el lehet távolítani. Ha nem, akkor szükségessé válik a vezér-polipeptid Iehasítása (amennyiben jelen van), hogy megkapjuk az érettlENomegát Egyébként az IEN-omega kiónt úgy is módosíthatjuk, hogy a mikroorganizmus az érett proteint termelje a pre-IFN-omega helyett. Ez esetben az élesztőmating-faktor(MF-alfa-l) prekurzor szekvenciáját használhatjuk, hogy a fuzionált protein tökéletes „érését”, s a terméknek a táptalajba vagy a sejtek közti térbe történő kiválasztódását biztosítsuk. A funkcionális vagy érett IFN-omegát meghatározó DNS szekvencia azMF-alfa-l-gyel egy vélt katepszinszerű hasítási helyen (aLys-Argután) - azATG iniciációs kodontól számított 256. pozícióban [Kurjan, Herskowitz, Cell, 30, 933-943 /1982/] - lehet összekötve.

Az új, találmány szerinti interferonok biológiai hatás-spektrumuk alapján minden olyan kezelésnél felhasználhatók, amelyeknél az ismert interferonokat alherpesz, Rhinovírüs, szerzett AIDS fertőzések, a rák különböző fajtái és hasonlók. Az új interferonokat egymagukhan vagy más ismert interferonokkal vagy biológiailag aktív termékekkel együtt lehet alkalmazni, például IEN-alfával, IL-2-vel, más immunmodulánsokkal és hasonlóanyagokkal.

AzIEN-omega parenterálisan adható olyan esetekben, amikor tumor-vágy vírusellenes kezelésre van szükség, és olyan esetekben is, amikor immunszppresszív tulajdonságok mutatkoznak. Az adagolás és az adagolási ráta azonos lehet azzal, ami a klinikai vizsgálatok alapján jelenleg az IFN-α készítményekre vonatkozik, például körülbelül (1-10) x 10⁶ egység naponta, de olyan készítményeknél, amelyeknél a tisztaság nagyobb, mint 1%, elérheti például a napi 5 χ 10⁷ egységet is.

Például egy lényegében homogén, baktériumokban termelt IFN-omega célszerű adagolási formája parenterális alkalmazás esetén: 3 mg IFN-omega 25 ml 5%os humán szérum alhuminhan feloldva. Ezt az oldatot baktériumszűrőre visszük és a szűrt oldatot aszeptikusán 100 ml-es üvegekbe osztjuk el úgy, hogy minden üveg 6 χ 10⁶ egység tiszta, parenterálisan alkalmazható IFN-omegát tartalmazzon. Előnyös, ha az üvegeket felhasználásig hűtve (-20 °Q tároljuk. A találmány szerinti anyagokból olyan receptorát szerkeszthetünk - amikor is a találmány szerinti polipeptid a gyógyszergyártásban elfogadott hordozóval van keverve hogy abból gyógyszerként alkalmazható szert kapunk. A használatos hordozó anyagok és receptoraik leírása a Remington’as Pharmaceutical Science (E.W. Martin) kiadványban - kifejezetten erre hivatkozunk-találhatók. Az IFN-omega alkalmas mennyiségi hordozó anyaggal van keverve annak érdekében, hogy a betegek számára jól alkalmazható, hatásos gyógyszerként jöjjön számításba. Előnyös a parenterális alkalmazás.

A következő példákban részleteiben tárgyaljuk a találmány szerinti eljárást, anélkül azonban, hogy a példákra korlátoznánk a találmány oltalmi körét A restrikciós enzimekkel végzett hasítások a gyártók előírásai vagy a kézikönyvekleírásai szerint történtek.

7. példa

IFN-specifikus klánok felkutatása

a) cDNS gyűjtemény előállítása

Kiindulási anyagként Sendai vírussal stimulált Namalwa-sejtekből származó mRNS-t használunk a szakirodalomból ismert módszerek szerint JEDworkin-Rastl és munkatársai, Journal of IhterferonResearch, 2,575-58571982/JcDNS gyűjtemény előállítására. A gyűjtött 30.000 kiónt egyenként mikrotitráló lemezek tartályaiba visszük át. A telepek növekedéséhez és lefagyasztásához a következő tápoldatot használjuk:

lOgTiypton

5gélesztőkivonat

5g nátrium-klorid

0,51 g nátrium-citrát. 2H₂O

7,5 g dikálium-hidrogén-foszfát. 2H₂O

1,8 g kálium-dihidrogén-foszfát

0,09 g magnézium-szulfát. 7H₂O

0,9 g ammónium-szulfát

44gglicerin

0,01 g tetraciklin. HC1 liter vízzelkiegészítve.

Az inviduális kiónokat tartalmazó mikrotitráló lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd -70’C-on tároljuk.

b) Hibridizációs próbaanyag előállítása

A hibridizációs próbaanyag előállításához kiindui?

HU 205779 Β lási anyagként a pER33 rekombináns plazmid szolgál (EJDworkin-Rastl és munkatársai, Gene, 21 237-248 /1983/]. Ez a plazmid tartalmazza az érett IFN-α 2arg interferon kódoló szakaszát és a 3’ nem transzlatált régió 190 bázisát. 20 jig pER33 plazmidot 30 egység Hindin restrikciós endonukleázzal inkubálunk 1 órán át 37 ’C-on 200 jil olyan reakció keverékben, amely 10 mM trísz-sósavat (pH = 7,5), 10 mM magnéziumkloridot, 1 mM ditiotreitolt (DTT) és 50 mM nátriumkloridot tartalmaz. A reakciót 1/25 térfogat 0,5 mólos EDTA hozzáadásával és 10 perc 70 ’C-on történő hevítéssel állítjuk le. A reakciókeverékhez 1/4 térfogat 5 x puffért adunk, amelynek összetétele a következő: 80% glicerin, 40 mM trisz-ecetsav (pH = 7,8), 50 mM EDTA, 0,05% SDS, 0,1 % brómfenolkék; majd a kapott fragmentumokat nagyságuk szerint 1%-os agróz gél elektroforézissel választjuk el. Gél- és futtató puffer (TBE): 10,8 g/i trisz-bázis, 5,5 g/1 bórsav, 0,93 gl EDTA A gélt 10,8 g/1 trisz-bázis, 5,5 g/1 bórsav, 0,93 g/1 EDTA A gélt 0,5 ng/ml etidium-bromid oldatban inkubáljuk, majd a DNS sávokat UV fényben tesszük láthatóvá és azt a gél-részletet, amely az IFN-gén tartalmú DNS darabot (körülbelül 800 bp hosszú) tartalmazza, kivágjuk. A DNS-t 1/10 x TBE-pufferben, feszültség rákapcsolásával, elektroeluáljuk. A DNS oldatot egyszer fenollal és négyszer éterrel extraháljuk, majd a DNS-t 1/10 térfogat 3 mólos nátrium-acetát (NaAC; pH=5,8) és 2,5 térfogat etanol (EtOH) hozzáadásával kicsapjuk a vizes oldatból -20 ’C-on, Centrifugálás után a DNS-t 70%-os etanollal egyszer mossuk és 5 percig vákuumban szárítjuk. A DNS-t 50 ni vízben vesszük fel (kb. 50 ng/nl). A DNS-t nick-transzlácló segítségével jelöljük (módosítva TManiatis és munkatársai szerint, Moleculat CIoning, CSH kiadvány); az 50 ni inkubációs oldat tartalma a következő: 50 mM trisz (pH=7,8), 5 mM magnézium-klorid, 10 mM mérkapto-etanol, 100 ng DNS-inszertum a pER33 plazmidból, 16 pg DNáz I, 25 nmól dATP, 25 nmól dGTP, 25 nmól dTTP, 20 nCi a-³²P-dCTP ( 3.000 Ci=mM), 3 egység DNS polímeráz I (E.coli), A reakcióelegyet 45 percig 14 ’C-on inkubáljuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy a keverékhez hozzáadunk 1 térfogat 50 mM EDTA-t, 2% SDS-t és 10 mM trisz (pH»7,6) tartalmú tartalmú oldatot és 10 percig 70 ’Con tartjuk. ADNS-tTE-pufferben (10 mM trisz-sósav /pH=8,0/, 1 mM EDTA) Sephadex G-100 oszlopon kromatografáljuk, így választjuk el a be nem épült radioaktív anyagoktól, A jelzett próba-anyag specifikus aktivitása körülbelül 4,10⁷ cpm/ng.

c)A kiónok szűrése IFN-gén tartalmú inszertumokra

A mikrotitráló lemezeken az a) pontban lefagyasztott baktériumtenyészeteket felolvasztjuk (Schleicher-Schüll, BA85,0,45 nm pórus-nagyság) LB-agarra helyezünk (LB-agar: 10 g/1 Trypton, 5 g/I élesztőkivonat, 5 g/1 nátrium-klorid, 15 g/1 Bacto agar, 20 mg/l tetraciklin . HCI). Egy, a mikrotitráló lemezhez való nyomófejjeí az inviduális kiónokat átvisszük a nitrocellulóz szűrőre. A baktériumokat egy éjszakán át 37 ’C-on tenyésztjük és ekkor körülbelül 5 mm átmérőjű telepeket kapunk. A baktériumok elbontása és a DNS denaturálása céljából a nitrocellulóz szűrőlapokat sorjában a következő oldatokkal átitatott Whatman 3MM szűrőpapír rakatra helyezzük; 1) 0,5 mólos NaOH, 8 perc; 2) 1 mólos trisz (pH-7,4), 2 perc; 3) 1 mólos trisz (pH=7,4), 2 perc; 4) i ,5 mólos NaCl, 0,5 mólos trisz (pH=7,4), 4 perc. A szűrőmembránokat levegőn szárítjuk, majd ezután 2 órán át 80 ’C-on tartjuk. A szűrők előkezelését 4 órán át 65 ’C-on végezzük a hibridizáló oldatban, amelynek összetétele a következő: 6 . SSC (1 x SSC: 0,15 mól NaCl, 0,015 mól trinátriumcitrát; pH=7,0), 5 x Denhardt oldat (1 xDenhardt oldat: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll (móltömeg 40.000 D), 0,02% BSA és 0,1% SDS). A b) pont szerint előállított próba-anyagot főzéssel denaturáljuk és ebből a hlbridizáló oldathoz szűrőnként körülbelül 1 x 10® cpm mennyiséget adunk. A hibridizálás 16 órán át történik 65 ’C-on. A szűrőmembránókat 65 ’C-on mossuk négyszer 1 óránát3xSSC/0,l%SDSoldattal.Aszűrőket levegőn szárítjuk, Sárán Wrap segítségével és Kodak X-OmatS filmre exponáljuk.

2. példa

IFN-gént tartalmazó rekombináns plazmidok kimutatása Southern átvitellel

A pozitiven vagy pozitív gyanúsan reagáló telepeket egy éjszakán át 37 ’C-on tenyésztjük 5 ml L-Broth táptalajban (10 g/1 Trypton, 5 g/1 élesztőkivonat, 5 g/1 nátrium-klorid, 20 mg/l tetraciklin. HCI), A plazmidDNS-t Bimbóim és Doly módosított eljárása szerint (Nucl. Acid Rés., 7,1513 /1979/) ízleljük. A sejt szuszpenziókból 1,5 ml-t centrifugálunk (Eppendorf centrifuga), majd a sejteket 0 ’C-on 100 jd lizozim oldatban, amely 50 mM glükózt, 10 mM EDTA-t, 25 mM tríszsósavat (pH=8,Ö) és 4 mg/ml lizozimot tartalmaz, reszuszpendál juk. A szuszpenziőt szobahőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd hozzáadunk 2 térfogatrész jéghideg 0,2 mólos NaOH és 1% SDS tartalmú oldatot és további 5 percig inkubáljuk. Ezután 150 jd jéghideg kálium-acetát oldatot (pH=4,8) adunk hozzá és még 5 percig inkubáljuk. A sejt-törmelékeket centrifugáljuk. A DNS oldatot 1 térfogatrész fenol-kloroform (1:1) eleggyel extraháljuk és a DNS-t 2 térfogatrész etanollal csapjuk ki. Centrifugálás után az üledéket egyszer mossuk 70%-os etanollal, majd 5 percig vákuumban szárítjuk. A DNS-t 50 rd TE-pufferben oldjuk, s ebből 10 ni reagens-oldatban (10 mM trisz-HCl (pH7,5), 10 mM MgCl₂,50 mM NaCl, 1 mM DTT) 10 egység PstI restrikciós endonukleázzal emésztünk 1 órán át 37 ’C-on. Az oldathoz ezután 1/25 térfogatrész 0,5 M EDTA-t és 1/4 térfogat 5 x puffért (lásd az l.b) példát) adunk, majd 10 percig 70 ’C-on tartjuk, s ezután aDNS-t 1%-os agarózgél (TBE-pufferben) elektroforézissel választjuk el. Az agarózgélben levőDNS-t Southern módszerrel [E.M.Southem, J.M0IJEH0I., 98, 503-517 /1975/] nitrocellulóz szűrőmembránra viszszük át. A gélben levő DNS-t úgy denaturáljuk, hogy a gélt 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH tartalmú oldatban 1 órán át inkubáljuk, s ezután 1 M trisz x HCI (pH-8)1,5 M NaCl oldatban 1 órán át semlegesítjük. ADNS-t

HU 205779 Β

10xSSCpufferrel(l,5MNaCI,0,15Mnátriura-citrát /pH®7,0/) visszük át a nitroceliulóz szűrőre. Miután az átvitel (transzfer) megtörtént (körülbelül 16 óra), a szűrőt 6 x SSC pufferrel kissé leöblítjük, levegőn szárítjuk, végül 2 órán át 80 °C-on hevítjük. A szűrőt 4 óránátőxSSCZ 5xDenhardtoldat/0,l% SDS (Lásd az

1. c) példát) tartalmú oldatban, 65 °C-on elŐkezljük. A hibridizációs próba-anyagból (lásd az l.b) példát) körülbelül 2 x 10⁶ cpm. értékű mennyiséget 100 °C-ra való hevítéssel denaturálunk, majd hozzáadjuk a hibridizálő oldathoz. Ahibridizálás 16 órán át tart 65 ’Con. Ezután a szűrőt 65 'C-on 3 xSSC/0,1% SDS tartalmú oldattal mossuk 4x1 óra hosszat. A szűrőt levegőn szárítjuk, majd Sárán Wrap segítségével fedjük és KodakX-OmatS filmre exponáljuk.

3. példa

Interferon aktivitás kimutatása az E75E9 klánban

AzE76E9 kiónt DSM 3003 100 ml L-Broth (10 g/1 Trypton, 5 g/1 élesztő kivonat, 5 g/1 NaCl, 5 g/1 glükóz, 20 mg/I tetraciklín , HCl) táptalajban tenyésztjük 37 ’C-on, míg sűrűsége az OD₆₀₀ = 0,8 értéket el nem érLAbakíériumokat lOpercig 7.000 ford/percmellett lecentrifugáljuk, egyszer mossuk 50 mM trisz.HCl (pH=8,0) és 30 mM NaCl tartalmú oldatban, majd

1,5 liter mosóoldatban reszuszpendáljuk. A baktérium szuszpenziőt 1 mg/ml lizozimmel 0 ’C-on fél órán át inkubáljuk, majd ötször lefagyasztjuk és felolvasztjuk. A sejttörmeíékeket 40.000 ford/perc melletti egy óra hosszat tartó centrifugálással ülepítjük. A felülúszót szűréssel sterilizáljuk és interferon aktivitásra vizsgáljuk. Aplakk-redukciós tesztet alkalmazzuk V3 sejtek és vezikuláris stomatitis vírus [GRAdolf és munkatársai, Arch.Viro., 72,169-178 /1982/] felhasználásával. Akión meglepő módon 9.000 NE (nemzetközi egység) értékű interferont termel minden 1 liternyi tenyészetében.

4. példa

Az új szekvenciáknak megfelelő gének számának meghatározása a genomban Southern biot analízissel a.) DNS izolálása Namalwa sejtekből

400 ml Namalwa sejttenyészetet [J.Interferon Rés.

2, 575-585 (1982)] centrifugálunk 1.000 ford/perc mellett JA21 centrifugában, hogy a sejteket leülepítsük. Az üledéket óvatosan mossuk NP40 pufferben (140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM trisz.HCl /pH=7,4/) reszuszpendáljuk, majd 1.000 ford/perc melletti centrifugálással újra ülepítjük. A kapott üledéket újból szuszpendáljuk 20 ml NP40 pufferben, majd a sejtfalak felbontása céljából 1 ml 10%-os NP40 oldatot adunk hozzá. A szuszpenziót 5 percre jégfürdőbe tesszük, majd az érintetlen sejtmagokat 1.000 ford/percmelletti centrifugálással ülepítjük és a felülúszót eldobjuk. A sejtmagokat 10 ml 50 mM triszHCl (pH=8,0), 10 mM EDTA és 200 mM NaCl tartalmú oldatban reszuszpendáljuk, s ezután 1 ml 20%-os SDS-t adunk hozzá a proteinek eltávolítása céljából. A keletkezett viszkózus oldatot kétszer ugyanazon mennyiségű fenollal 10 mM triszJlCl-el telítve (pH=8,0) és kétszer kloroformmal extraháljuk. A DNS-t etanol hozzáadásával kicsapjuk, centrifugálással választjuk le, majd a kapott DNS üledéket egyszer mossuk 70%-os etanollal, 5 percig vákuumban szárítjuk és 6 ml TE-pufferben (TE puffer: 10 mM trisz.HCl/pH=8,0), 1 mMEDTA) oldjuk. A DNS koncentrációja 0,8 mg/ml.

b) A Namalwa sejtekből izolált DNS emésztése restrikciós endonukleázokkal

A restrikciós endonukleázokkal történő emésztéseket minden esetben az előállító cég (NewEnglandBiolabs) által megadott feltételek mellett végezzük. 1 jig DNS-t 2 egység megfelelő restrikciós endonukleázzal emésztünk 10 ni térfogatban, 37 ’C-onkétórahosszat vagy tovább. Az EcoRI, Hindin, BamHI, Sphl, PstI és Clal restrikciós endonukleázokat használjuk. Minden emésztéshez 20 ng DNS-t veszünk. Hogy az emésztés teljességét ellenőrizhessük, areakció indításakor minden esetben 10 jil-t (alikvot részt) leveszünk és hozzáadunk 0,4 ng lamhda-fág DNS-t. Két órás inkubáció u tán az alikvot részeket agaróz-gélelektroforézissel ellenőrizzük és az emésztés megfelelő voltát a festett lambda-fág DNS-fragmentumok - melyek mintául szolgálnak - segítségével határozzukmeg.

Ezen ellenőrző vizsgálatok elvégzése után a reakciókat EDTA hozzáadásával -20 mM végkoncentrációig - és az oldat 70 ’C-ra való melegítésével állítjuk le. A DNS-t 0,3 mM nátrium-acetát (pH=5,6) és 2,5 térfogat etanol hozzáadásával csapjuk ki. Az anyagot 30 percig -70 ’C-on inkubáljuk, majd aDNS-tEppendorf centrifugában ülepítjük, az üledéket egyszer mossuk 70%-os etanollal és szárítjuk. A kapott DNS-t 30 ni TE-pufferben vesszükfel.

c) Gélelekiroforézis és Southern átvitel

Az emésztett DNS-mintáknál nagyság szerinti frakcionálási végzünk 0,8%-os agaróz gélben, TBEpufferben (10,8 g/1 írisz-bázis, 5,5 g/1 bórsav, 0,93 g/I EDTA). A15 nl-es DNS mintákat 4 ni vivő-pufferrel (0,2% SDS, 5. TBE-puffer, 50 mM EDTA 50% glicerin, 0,1% brómfenolkék) keverjük, hirtelen 70 ’C-ra hevítjük, és felvisszük a gélben előkészített vályúba. Az EcoRI-gyel és HindHI-mal hasított lambda DNS-t szintén felviszünk a megfelelő vályúkba és ez szolgál majd a DNS nagyságának mintájaként. A gélelektroforézist 24 óra hosszat folytatjuk körülbelül 1 V/cm mellett. Ezután a DNS-t Southern módszerével nitrocellulóz szűrőmembránra (Schlelcher-Schüll, BA85) visszük át, amikor is transzfer pufferként a 10 x SSC puffért (1 x SSC: 150 mM trinátrium-citrát, 15 mM NaCl /pH=7,0/) használjuk. A szűrőket szobahőmérsékleten szárítjuk, majd 2 órán át 80 ’C-on tartjuk, hogy a DNS-t megkösse.

d) Hibridizációs próbaanyag előállítása

A P9A2 DSM 3004 plazmid 20 ng-ját Avaü-vel hasítjuk. Ekkor egy körülbelül 1.100 bp hosszú fragmentum szabadul fel, amely az egész cDNS inszertumot tartalmazza. Ezt a DNS darabot újra hasítjuk Sau3Aval és Alul-gyel és a legnagyobb darabot agaróz-gélelektroforézissel (lásd az 5b. ábrát) elektroelucióval és

HU 205 779 Β

Elutip-oszlopkromatográfiával izoláljuk. Az így kapott DNS-t (1,5 ng) 15 ni vízben oldjuk.

A pER33 plazmid 20 n g-ját HindlH-mal hasítjuk, amikoris ez az IFN-α 2-Arg expressziós-plazmid [ERastl-Dworkin és munkatársai, Gene, 21,237-248 /1983/] két helyen hasad. A kisebb DNS fragmentum tartalmazza az Interferon-α 2-Arg génjét, amelyet a p9A2 plazmidnál leírt módon izolálunk.

Mindkét DNS-t a P.WJ.Rigby és munkatársai [JMoLBiol., 113,237-251 /1977/] által ajánlott módszerrel nick-transzlatáljuk. A nick-transzlációkat. 0,2 ng DNS-el végezzük, 50 ni olyan oldatban, amely a következő anyagokat tartalmazza: 1 x nick- puffer (1 x nick-puffer: 50 mM trisz.Hcl (pH=7,2), 10 mM MgSO₄,0,1 mMDTT, 50 ng/ml BSA), 100-100 nmól dATP, dGTP ésDTTP, 150 nCi a-³²P-dCTP (Amersham, 3.000 Ci/mmól) és 5 egység DNS polimerázl (Boehringer-Mannheim, nick-transzlációhoz való minőségű). Két órás 14 ’C-on történő inkubáció után a reakciót azonos mennyiségű EDTA oldat (40 mM hozzáadásával állítjuk le és a reagálatlan radioaktív anyagot G50 oszlopkromatográfia segítségével - TE-pufferben - választjuk le. A megmaradt specifikus radioaktivitás körülbelül 100 x 10^{6 DNS}·

e) Hibridizálás és autoradiográfia

Anitrocellulóz szűrőket kétfelé vágjuk. Mindkét fél azonos mennyiségben tartalmaz Namalwa-DNS nyomokat, ezeket kezeltük a 4.a) példában említett restrikciós enzimekkel. A szűrőket 2 órán át 65 ’C-on a következő összetételű oldatban előhibridizáljuk: 6 x SSC, 5 x Denhardt oldat 1 x Denhardt oldat: 0,02% BSA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll 400, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml denaturált borjú-timusz-DNS és 10 mM EDTA. A hibridizálást 16 órán át 65 ’C-on a következő összetételű oldatban végezzük: 6 x SSC, 5 x Denhardt oldat, 10 mM EDTA, 0,5% SDS és körülbelül 10 x 10⁶ cpm értékű nick-transzlatált DNS. A szűrőmembrán egyik felét interferon-a2-arg DNS-el, a másik felét a P9A2 plazmidból izolált interferon DNS-el hibridizáljuk. Hibridizálás után mindkét szűrőt mossuk: négyszer 2x SSC és 0,01% SDS tartalmú oldattal szobahőmérsékleten és ezután kétszer 0,2 x SSC és 0,01% SDS tartalmú oldattal 65 ’C-on 45 percig. Végül szárítjuk a szűrőket és Kodak X-OmatS filmre exponáljuk.

5. példa

A pRHW12 és pRHWll plazmid előállítása

Megjegyzés

Az expressziós plazmidok előállítását a 6. ábrán mutatjuk be (nem mérethűen); a restrikciós enzimes emésztéseket az enzimeket előállító cég előírásai szerint végezzük.

a) A pRHWIQ plazmid előállítása

A p9A2 plazmid 100 ng-ját 100 egység Avall restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs) emésztjük. Emésztés után az enzimet 70 ’C-ra való hevítéssel inaktiváljuk és a kapott fragmentumokat 1,4%-os agaróz gélben TBE-pufferben (TBE-puffer:

10,8 g/1 trisz-bázis, 5,5 g/1 bórsav, 0,93 g/1 EDTA) nagyság szerint frakcionáljuk. Azokat a sávokat, amelyek az egész cDNS inszertumot tartalmazzák, elektroeluál juk és Elutip-oszlopon (Schleicher-Schüll) tisztítjuk. Akapott 20 ng anyagból 6 ng-ot Sau3Arestrik5 ciós endonukleázzal (20 egység összesen 100.nl oldatban) tovább emésztünk. A fragmentumokat 2%-os agaróz gélben - TBE pufferben - választjuk el. Etidium-bromiddal (EtBr) való festés után a 189 bp hosszú DNS darabot elektroeluáljuk és a fent elírt módon tisztítjuk (= ab) fragmentum a 6. ábrában).

Abból a célból, hogy az interferon gént promoterrel, riboszóma-kötőhellyel és start-kodonnal kapcsolhassuk össze, a pER33 expressziós plazmidból a megfelelő DNS darabot [E.Rastl-Dworkin és munkatársai,

Gene 21, 237-248 /1983/] izoláljuk. Ezért 50 ng pER33 plazmidot EcoRI és PvuII restrikciós enzimmel kétszerre megemésztünk és a kapott fragmentumokat 1,48%-os agaróz-gélben - TBE pufferben nagyságuk szerint frakcionáljuk. A 389 bp hosszú

DNS darabot, amely a trp-promotert, a riboszóma-kötőhelyet és a start-kodont tartalmazza, elektroeluáljuk és Elutip oszlopon tisztítjuk. Az így kapott fragmentumot ezután Sau3A-val emésztjük és a kívánt 108 bp hosszú fragmentumot agaróz-gélelektroforé25 zis, elektroelúció és Elutip oszlopon való tisztítás segítségével kapjuk meg. A kitermelés körülbelül 100 ng (= c) fragmentum a 6. ábrában).

A b fragmentumot a c fragmentummal ligáz reakcióval kapcsoljuk össze a következőképpen: 20 ng bfrag30 mentumot és 20 ng c fragmentumot 40 ni 10 egység T4-ligáz, 50 mM trisZ.HCl (pB=7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DDT és 1 mM ATP tartalmú oldatban reagáltatunk 14 ’C-on 18 órán át. Ezután az enzimet 70 ’C-ra való hevítéssel bontjuk el és a kapott DNS-t Hindin enzimmel hasítjuk 50 jilössztérfogátban.

A pERl03 expressziós plazmid [ERastl-Dworkin és munkatársai, Gene, 21,237-248 /1983/] 10 ng-ját Hindlü-mal linearizáljuk 100 ni össztéforgatban. A keveréket 37 ’C-on tartjuk 2 órán át és ekkor hozzá40 adunk 1 térfogat 2 x foszfatáz puffért (20 mM trisz.HCl (pH=9,2), 0,2 mM EDTA) és egy egység borjúbél-foszfatázt (CEP). A reakció elegyet 45 ’C-on tartjuk 30 percet inkubáljuk. Az így kapottDNS-t kétszer fenollal és egyszer kloroformmal extraháljuk, 45 majd 0,3 mólos nátrium-acetát (pH=5,5) és 2,5 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. ADNS-t végül def oszf orilál juk, hogy a következő ligázreakciónál a vektorok újbóli összekapcsolódását megakadályozzuk.

AlinearizáltpER 103-ból 100ng-otésazösszekap50 csőit b és c fragmentumot (HindUf-mal való emésztés után) 100 ni ligáz-pufferben 14 ’C-on 18 órán át T4DNS-ligázzal inkubálunk.

200 ni kompetens E.coli HB 101 sejtet [EDworkin és munkatársai, Dev. Bioi., 76,435-448 /1980/] 20 ni 55 ligáz-reakció-keverékkel keverünk össze és 45 percig jégen inkubáljuk. A DNS-felvételt ezután hősokk behatással - 2 perc, 42 ’C - teljessé tesszük A sejtszuszpenziót további 10 percig jégen inkubáljuk, majd 50 mg/1 ampicillint tartalmazó LB-agarra (10 g/1 60 Trypton, 5 g/1 élesztőkivonat, 5 g/1 NaCl, 1,5% agar)

HU 205779 Β visszük A plazmidokat, amelyeket a kapott 24 telep tartalmazott, Bimbóim és Doly [Nucl. Acid, Rés., 7, 1513-1523 /1979/1 módszerével izoláljuk. Különböző' restrikciós enzimekkel végzett emésztések szerint egy plazmid rendelkezett a kívánt szerkezetet, ezt pRHIO 5 jelzésselláttuk el (lásd a 6. ábrát).

b)A pKHW12 plazmid előállítása

ApRHWlO plazmid körülbelül 10 ng-ját BamHIgyel hasítjuk Ezután hozzáadjuk a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjét, a négy dezoxinukleozid-trif ősz- 10 fátot és 20 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk A kapott linearizált és tompa végű plazmidot fenolos extrahálással és kicsapással tisztítjuk, majd 100 ni térfogatban Ncolrestrikciós endonukleázzal hasítjuk.

A nagyobbik fragmentumot agaróz-gélelektroforézis, 15 elektroelúció és Elutip-tisztítás révén kapjuk meg. Az a fragmentumot (lásd a 6. ábrát) úgy kapjuk, hogy 4 ng AvaU fragmentumot, amely a P9A2-cDNS-inszerumot tartalmazza (lásd fent), Ncol-gyel és Alul-gyel emésztjük amikor is körülbelül 2 ng a fragmentumot 20 nyerünk

Az utolsó lépésben - 10 ni térfogatban - az a fragmentumot lígáz segítségével összekapcsoljuk a hozzáadott és BamHI/NcoI-gyel kétszeresen emésztett pRHWIO-gyel. Areakcíóban mindkét DNS-ből 10 ng- 25 ot használunk fel. Egy betöltött BamHI hasítási helynek egy Alul-gyel hasított DNS-hez való kapcsolása újból egy BamHI hasítási helyet eredményez.

Akapott ligáz-reakció keverékkel kompetens E.colí HB101 sejteket transzformálunk, ahogy azt fent leír- 30 tűk Akapott 40 telepből egyet kiválasztunk és ez kapjaapRHW12nevet.

A plazmidot izoláljuk és az EcoRÍ/BamHI inszertum szekvencia analízisét Sanger módszerével [F.Sanger és munkatársai, Proe. Natl. Acad. Sci., 74,5463- 35 5467/1979/jvégezzükel.Aplazmíd a várt szekvenciát tartalmazza.

e) ApRHWl 1 plazmid előállítása

Az eljárás az5.b) példával analóg módon történik. ApRHWlO plazmid 1 ng-ját BamHI-gyel emésztjük 40 A kapott DNS ragadós (sticky) végeit a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentje és a négy dezoxinukleozidtrifoszfát segítségével tompa végűvé alakítjuk, majd a linearizált DNS-t Ncol-gyel hasítjuk. A nagyobb fragmentumot agaróz gél elektroforézis, elektroelúció és 45 Elutip-oszlopkromatográf ía alkalmazásával izoláljuk.

AzNcoI-Alulfragmentumot azE76E9 kiónból izoláljuk az5.b) példával analóg módon. Ezután a vektorrész 10 ng-ját a cDNS-rész 10 ng-jával 10 ni térfogatban, megfelelő' feltételek mellett és 1 egység Τ4-Π- 50 gáz hozzáadásával reagáltatjuk. A kapott DNS keverékkel E.coliHB 101 sejteket transzformálunk, majd az ampicillin tartalmú LB-agar lemezeken kapott 45 telep szelektálása után kiválasztunk egy klőnt, s ez a pRHWl 1 jelzést kapja. A megfelelő klón tenyésztése 55 után izoláljuk a plazmid-DNS-t. Ennek szerkezetét több specifikus restrikciós endonukleáz hasítási hely (Alul, EcoRI, Hindin, Ncol, PstI) jelenlétével igazoljuk.

d)X pKHW12 plazmidot tartalmazó E.coli HB 101 60 sejtekben kifejeződő interferon aktivitás

100 ml E.coli HB101 baktériumtenyészetet addig inkubálunk, amíg sűrűsége az OD₆₀₀ = 0,6 értéket el nem éri. A táptalaj M9 minimál médium, amely triptofánon kívül az összes aminosavat (aminosavanként 20 ng/ml), 1 ng/ml tiamint, 0,2% glükózt és 20 ng/ml mdól-(3)-akrilsavat (IAA = a triptofán operon induktora) tartalmaz. Ezután a baktériumokat centrifugálással (10 perc; 7.000 ford/perc) ülepítjük, egyszer mossuk 50 mM trisz.HCl (pH«8) és 30 mM NaCl tartalmú oldattal, végül ugyanezen puffer 1,5 ml-ében szuszpendáljuk, A szuszpenziót 1 mg/ml lizozimmel * percig jégen inkubáljuk, majd ötször lefagyasztjuk és felolvasztjuk. A sejttörmelékeket egy órán át tartó 40.000 ford/perc melletti centrifugálással távolítjuk el. A felülúszót sterilre szűrjük és interferon aktivitását píakk-redukeiós módszerrel vizsgáljuk, A549 sejtek és encephalo-myocarditis vírus alkalmazásával.

Eredmény. 1 liter baktérium tenyészet 1 x 10⁶ NE interferont tartalmaz [AJBilliau, AntiviralRes. 4,7589/1984/].

6. példa

Az I típusú interferonok aminosav- és nukleotidszekvenciái köti különbségek a) Az aminosav-szekvenciák összehasonlítása

Az aminosav szekvenciák páronkénti összehasonlításakor az érett α-interferon első cisztein csoportjához soroljuk a P9A2 és E76E9 plazmidok cDNS inszertumai által kódolt aminosav szekvenciák első cisztein csoportját. Mindkét szekvenciát úgy mutatjuk be a 7. ábrán, mintlFN-omegát, ugyanis akapott értékek alapján nem lehetett különbséget megállapítani a P9A2, vagy E76E9 klőnok specifikus szekvenciái között. Az egyetlen javítás az volt, hogy az interferon-a A 45. pozíciójába egy üres helyet iktattunk be, amit mint hibahelyet vettünk számításba. Ha az omega-mterferon szekvenciája a partner, akkor az összehasonlítást a szokásos 166 aminosav figyelembe vételével végezzük el. Ezt az értékeket mutatja a 7. ábra azzal a 6 többlet aminosawal együtt, amelyeket a P9A2 és az E76E9 klón kódol. A százalékos különbségeket ügy kapjuk meg, hogy a megállapított különbözetet 1,66-al osztjuk. Egy többlet aminosav eszerint 0,6 százalék arányszámnák felei meg. Ez 3,6-ot tesz ki az IFNomega 6 többlet aminosavánál, amelyeket már tártál- » máz a százalék-arányszám.

A β-interferonnal való-összehasonlítások úgy történnek, hogy az érett β-interferon harmadik aminosavához soroljuk az érett α-interferon első aminosavat, vagy a P9A2 és azE76E9 plazmid által meghatározott első aminsoavakat. Egy α-interferonnak a β-interferonnal való Összehasonlításánál a leghosszabb szerkezet eszerint 162 aminosavat tesz ki, amely mindenkor 2 többlet aminosavat jelent az α-interferonnál és a βinterferonnál. Ezeket hibahelyeknek számítjuk és a 7. ábrán külön tüntetjük fel, bár a százalékos arányszámban benne foglaltatnak. A β-interferonnak a P9A2 vagy E76E9 kiónok aminosav szekvenciáival való felsorolását hasonló módon végezzükel. Ez azon16

HU 205779 Β bán összesen 10 többlet aminosavat jelent. b)4 nukleotid szekvenciák összehasonlítása

Az összehasonlítandó szekvenciák sorolása a ó.a) példával analóg módon történik. Az érett a-interferon első nukleotidja az érett α-interferon ciszteinjét kódoló triplet első nukleotidja. A P9A2 vagy E76E9 plazmid DNS-ének első nukleotid ja ugyancsak a cisztein-1 kodon első nukleotidja. A β-interferon DNSének első nukleotidja a harmadik triplet első nukleotldja. A P9A2 vagy E76E9 plazmid DNS-ének első nukleotidja ugyancsak a cisztein-l kodon első nukleotidja. A β-interferon DNS-ének első nukleotidja a harmadik triplet első nukleotidja. Ha az a-interferonok egyes DNS-eit a β-interferonéival hasonlítjuk össze, akkor az összehasonlítás összesen 498 nukleotid mentén történik és 516 nukleotid mentén, ha az összehasonlítás az egyes α-interferonok vagy a β-interferon DNS szekvenciája és a P9A2 és E76E9 plazmidok DNS szekvenciái közt történik. A A hibahelyek abszolút számát a 7. ábrán levő táblázat baloldali részén adjuk meg és azután zárójelben a megfelelő százalékokat.

7. példa

NC37-sejtekben (ATCC CCL 214) vírussal indukálható omega-l-mRNS kifejeződése

a) Ómega-interferon specifikus hibridizációs próbaanyag szintetizálása

A d(TGCAGGGCTGCTAA) oligonukleotid 10 pmólját l2pmól gamma-³²P-ATP-val (specifikus aktivitás: 5.000 Ci(mmól) és 10 egység polinukleotidkinázzal keverjük össze 10 ni össztérfogatban, 70 mM trisz.HCl (pH=7,6), 10 mM MgCl₂ és 50 mM DTT tartalmú oldatban. A keveréket egy órán át 37 °C-on állni hagyjuk. A reakciót ezután 10 percig tartó 70 ’C-on történő hevítéssel állítjuk le. A kapott jelzett oligonukleotidot az M13pRHW12 ssDNS-ének (szimplaszálöDNS; lásd a 9. ábrát) pmólnyi mennyiségével hibridizáljuk 35 ni Össztérfogatban, 10 mM NaCl tartalmú oldatban, egy órán át 50 ’C-on.

A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hű tjük, majd hozzáadunk 50 n 1 összmennyiségig nick-transzlációs puffért, a négy dezoxinukleozid-trifoszfátot és 10 egység Klenow polimerázt (50 mM trisz-HCl (pH=7,2), 10 mMMgCl₂,50 mg/ml BSA és 1-1 mM nukleozid). Apolűnerizációt egy órán át szobahőmérsékleten végezzük, majd a reakciót 5 percig 70 ’C-ra való hevítéssel állítjuk le.

A reakció eredményeként egy részben kétszálú cirkuláris DNS-t kapunk. Ezt ezután 500 ni össztérfogatban 25 egység AvaH-vel hasítjuk, s az előállító cég által javasolt puffért alkalmazzuk. Ekkor a kétszálú szakaszok egyforma nagyságú szakaszokra hasadnak. Ezután a reakciót úgy állítjuk meg, hogy a keveréket 5 percig 70 ’C-on hevítjük.

b) ríz RNS előállítása a vírussal fertőzött sejtekből

100xlö⁶sejtet(0,5.10⁶)ml lOOnMdezametazonnal kezelünk 48-72 órán át - a kontrollok nem tartalmaznak dexametazont. Az interferon indukcióhoz az expressziós sejteket szérummentes tápoldatban szuszpendáljuk 5 x 10⁶/ml koncentrációban és 2¹⁰ egység/ml Sandai vírussal fertőzzük. A sejt tenyészet felülúszójából alikvot részeket veszünk ki, s ezeket plakk-redukciós vizsgálattal (3. példa) teszteljük EFNaktivitásra. A vírussal történő fertőzés után 6 órával a sejteket centrifugálással (100 g, 10 perc) gyűjtjük össze, 50 ml NP40 pufferrel (4.a/példa) mossuk, 9,5 ml jéghideg NP40 pufferben reszuszpendáljuk, majd 0,5 ml 10%-os NP40 puffer hozzáadásával 5 percen át jégen lizáljuk. A sejtmagokat centrifugálással (1.000 g, lOperc) távolítjuk el, majd a felülúszó pH-ját

8-ra állítjuk be 50 mM triszHCl, 0,5% szarkozin és 5 mM EDTA hozzáadásával. A felülúszót -20 ’C-on tároljuk. A felülúszó össz-RNS tartalmát egyszer fenollal, egyszer fenoWdoroform/izomilalkohol elegyével és egyszer kloroform/izomilalkohol elegyével extrahálva izoláljuk. A vizes fázist 4 ml 5,7 mólos céziumldoriddal keverjük és SW40 rotorban centrifugáljuk (35.000 ford/perc, 20 óra), hogy az extraktumot a DNS-tőI és a maradék proteinektől megszabadítsuk. A kapott RNS üledéket 2 ml TE-pufferben (pH==8,0) feloldjuk, és etanollal csapjuk ki. Az RNS csapadékot ezután 5 mg/ml koncentrációban, vízben oldjuk, c) Ómega-interferon mRNS kimutatása

A 7.a) példa szerint előállított hibridizációs próbaanyag 0,2 nl-ét 20-50 ng 7.b) példa szerint előállított RNS-sel együtt etanol hozzáadásával kicsapjuk. A kontroli-kísérletben a sejtes RNS helyett a pRHW12 plazmiddal (5.pída) transzformált E.coliból származó transzfer RNS-t (tRNS) vagy RNS-t használjuk.

A kapott üledéket 70%-os etanollal való mosással sótalanítjuk, szárítjuk és 25 ni 80%-os förmamidban (100 mMPIPES (pH=6,8), 400 mMNaCl, 10 mM EDTA) oldjuk. Ezután a mintákat 5 percig 100 ’C-on tartjuk, hogy a hibridizációs próba-anyagot denaturáljuk, majd 52 ’C-ra állítjuk be és ezen a hőmérsékleten inkubáljuk 24 óra hosszat. Hibridizálás után a mintákat jégre tesszük és 475 ni Sl-reakció-keveréket (4 mM cink-acetát, 30 mM nátrium-acetát, 250 mM nátrium-klorid, 5% glicerin, 20 ng szimpla-szálú borjú tímusz DNS, 100 egység Sl-nuldeáz) adunk hozzájuk. Egy órán át 37 ’C-on tartó emésztés után a reakciót alkoholos kicsapással állítjuk meg.

Az ül edéket 6 η 1 formamid-pufferben oldjuk és 8 M karbamidot tartalmazó 6%-os akriiamid gélben választjuk el, lényegében úgy, hogy a DNS szekvencia analízisek mitáinál tesszük. [F.Sanger és munkatársai, Proc.NatlAcad.Sci., 74,5463-5467/1979/],

A szárított gél autoradiográfiás vizsgálatát -70 ’Con végezzük, DuPont Cronex röntgen filmet és Kodak Lanex Regular Intensivator-t használunk.

A 10. ábra magyarázata

Az A. B, C jelű sávok a kontrollokat jelentik.

A sáv: 20 jig tRNS

B sáv: 10 ng RNS a pER.33 plazmidból (E.coli - az interferon-a2-Arg expressziós törzse)

C sáv: 1 ng RNS a pRHW12-ből (E.coli - az interferon-omega expressziós törzse)

D sáv: 50 ng RNS kezeletlen Namalwa sejtekből

E sáv: 50 ng RNS a vírussal fertőzött Namalwa sej17

HU 205779 Β tekből

F sáv: 50 jig RNS dexametazonnal előkezelt és vírussalfertőzöttNamalwa sejtekből

Gsáv: 20 jigRNS kezeletlen NC37 sejtekből

H sáv: 20 ngRNS a vírussal fertőzött NC37 sejtekből

I sáv: 20 ng RNS dexametazonnal előkezel t és vírussalfertőzöttNC37 sejtekből

M sáv: molekulanagyság jelzése (pBR322 Hinflgyelhasítva)

AB és C sáv azt mutatja, hogy a várt jel csak akkor jelenik meg, ha az RNS molekulák közt egy omega-lspecifikus RNS van. Kimutatjuk továbbá, hogy más RNS-ből mégmaga a nagy többlet sem idéz elő háttérjelzést (lásd a B sávot).Ezenkívül a hibridizációs pár tnerkénthasználttRNS sem ad jelet (lásd az Asávot).

A G-től I-ig levő sávok a vírussal fertőzött NC37 sejtekben, az omega-l-specifikus RNS indukálódását mutatják. A dexametazonnal való előkezelés erősíti az effektust.

AD-től F-ig terjedő sávok alapjában véve azonos eredményt adnak azzal, amit aNamalwa sejteknél kapunk. Azonban itt az omegal-sepcif ikus RNS indukciója nem olyan erős, mint az NC37 sejtek esetében. Ez az eredmény parallel azokkal az interferon titerekkel, amelyeket a megfelelő sej t felülúszókban mértünk.

Az iníerferon-omega-l-gén expressziójának viselkedése tehát olyan, mint amit egy I típusú interferon géntől elvárunk.

8. példa

Az IFN-omega-l-et meghatározó gén, illetve a vele rokon géek izolálása á) Kozmid szűrés

Egy pcos2 EMBL kozmid-vektorba [A.Pontska, HRJRockwiíz, AM.Frischauf, B.Hohn, HLehrach, ProcNatíAcad.Sci., 81,4129-4133 /1984/] klónozott (2xí0⁶ komplexitással) kozmid bankot (emberi DNS Hóm/) átvizsgálunk IFN-omega, illetve vele rokon génekre. E.coli DH1 (rK-, MK+-, recA: gyrA96, sup.E) sejteket használunk gazdaként. Ezután Mg⁺⁺-sej teket (”platingbacteria”) állítunk elő. AzE.coli DH1 törzset egy éjszakán át 2% maltőzzal kiegészített L-Broth táptalajon (10 g/l Trypton, 5 g/l élesztőkivonat, 5 g/l NaCl) tenyésztjük. A baktériumokat centrifugáljuk és 10 mM MgSO4-ot tartalmazó oldatban vesszük fel úgy, hogy sűrűsége ODg₀₀ = 2 értékű legyen. E sejtszuszpenziót 12,5 x 10°cfu/colony forming units telepképző egység; aktivitású kozmiddal együtt inkubáljuk 20 percig 37 ’C-on. Ezután 10 térfogat L-Broth táptalajt adunk a szuszpenzióhoz, majd 1 órán át 37 ’C-on tartjuk, hogy a kozmid által közvetített kanamicin rezisztencia kifejezésre jusson. Ezután a baktériumokat centrifugáljuk, 5 ml L-Broth táptalajban reszuszpendáljuk és a szuszpenziő 200 nl-es alikvot mennyiségeit nitrocellulóz szűrőmembránra (Schleicher-Schüll,BA85,132mm átm.) szélesztjük, amelyet azután 30 ng/ml kanamicin tartalmú LB-agarra (1,5% agar, L-Broth táplevesben) helyezünk. Szűrőlaponként körülbelül 10.000-20.000 telep nő ki. A telepeket további nitrocellulóz szűrőlapokra szélesztjük és lemezre visszük, amelyeket 4 ’C-on tárolunk. A telepeket tartalmazó szűrők egy adagját úgy dolgozzuk fd, ahogy azt az l.c) példában leírtuk azaz a baktériumokat denaturáljuk és a szimplaszálú DNS-t a nitrocellulóz lapra fixáljuk. A szűrőket 4 órán át 65 ’C-on 50 mM triszJÍCI (pH=8,0), 1 MNaCl, 1 mM EDTA és 0,1% SDS tartalmú oldatban előmossuk. Ezután a szűrőket 2 órán át 65 ’C-on 5x Denhardt oldat (lásd az l.c) példát), 6x SSC oldat és 0,1% SDS tartalmú oldatban inkubáljuk, majd körülbelül50x10⁶ cpmníck-transzlatált, denaturált IFN-omega-1 DNS-el (a pRHW12 klón HindlH-BamHI inszertuma; lásd a 6. ábrát) hibridizáljuk 24 órán át 65 ’C-on ugyanebben az oldatban. A hibridizáció megtörténte után a szűrőlapokat először szobahőmérsékleten 3 x 10 percig 2xSSC, 0,01% SDS oldatban, majd 65 ’C-on 3x45 percig 0,2x SSC, 0,01% SDS oldatban mossuk. A szűrőmembránokat szárítjuk, majd -70 ’C-on Kodak X-OmatS filmre exponáljuk, erősítő fólia alkalmazása mellett. A pozitív reakciót adó telepeket a szűró'lapon lokalizáljuk, lekaparjuk és30 ng/ml kanamicin tartalmú L-Broth táplevesben reszuszpendáljuk Ebből a szuszpenzióból néhány nl-t 30 ng/ml kanamicint tartalmazó LB-agar lemezre szétosztunk. A kapott telepeket újra nitrocellulóz lemezre visszük és ahogy fent toírtük ³²P-veI jelölt IFN-omega- 1-DNS-sel hibridizáljuk Ahibridizáló telepekből Bimbóim és Doly [NuclAcidR.es., 7, 1512/1979/] módszere szerint izoláljuk a kozmidot. A kozmid DNS-el E.coli DH1 sejteket transzformálunk és a transzformált sejteket 30 ng/ml kanamicin tartalmú LB-agaron szelektáljuk. A transzformált sejteket újra vizsgáljuk pozitívan reagáló kiónokra ³²P-vel jelölt IFN-omega-1 -DNS segítségével. Az eredetileg izolált klőnból egyet kiválasztunk, és ebből nagyobb mennyiségű kozmidot állítunk elő JDE.ClewelI és D.RHelinski, Biochemistry, 9,4428 /1970/]. Az izolált kozmidok közül hárman a következő neveket viselik: cos9, coslO és cosB.

h) Hibridizáló fragmentumok szubklőnozása pUC8 plazmidba

A cos9, coslO és cosB kozmidok 1-1 ng-ját HindlΠ-al - az előállító NewEngland Biolabs cél által ajánlott feltételek mellett - hasítjuk. A fragmentumokat 1%-os agaróz gél elektroforézissel - TBE pufferben választjuk el és Southern szerint (JMolEiol., 98,503517 /1975/) nitrocellulóz szűrőmembránokra visszük át (4.c) példa). Mindkét szűrőt - ahol a f.d) példában leírtuk - nick-transzlatált omege-l-DNS-sel hibridizáljuk és exponáljuk Mindegyik kozmidból mintegy 20 ng-ot HindHI-mal hasítunk és a keletkezett fragmentumokat gél elektroforézissel választjuk el. Az előkísérletben omega-l-DNS-sel hibridizáló fragmentumokat elektroeluáljuk és Elutip oszlopon (Schtoicher-SchüIl) tisztítjuk Ezeket a fragmentumokat Hindül-mal linearizált, defoszforilált pUC8 plazmiddal [IMessing, J.Vieira, Gene, 19,269-276 /1982/] kapcsoljuk össze ligázzal. E ligáz-reakciókeverékkel E.coli JM101 sejteket (supE, thi, (Iac-proAB), F’, traD36, pro AB, Iacq zM15; P-L. Biochemicals) transzformá1

HU 205779 Β lünk A baktériumokat 50 ng/ml am ;illin, 250 ng/ml

5-bróm-4-klór-3-indolil-p-D-gaIak S: oiranozid (BCIG; Sigma) tartalmú LB-agam s télesztjük. A kifejlődő telepek kékre színeződése ? { mutatja, hogy a pUC8-ból hiányzik az inszertum. I hány fehér kiónból kisebb mennyiségű plazmid 1 j ^rS-t állítunk elő, HindHI-malhasítjuk és 1%-os agar /: gélben elválasztjuk A DNS fragmentumokat ni! >cellulóz szűrőkre visszük és mint fent, ³²P-omega-l - )NS-el hibridizáljuk Kiválasztottunka cos9-ből és é rs 10-ből származó egy-egy szubklónt és pRHW22- ί i, illetve pRH57-eI jelöltük Az omega-l-próbaany;, ;gal jól hibridizáló, cosB-ből származó két DNS fngmentumot szubklónoztukéspRH51-gyel, illetve pRH52-vel jelöltük.

c) Szekvencia-analízis

Á pUC8-ba beépített DNS-t HindlII-mal hasítjuk, majd gélelektroforézlssel elválasztjuk a vektor résztől. Ezt a DNS-t -körülbelül 10 ng-50 ni reakciókeverékben T4 DNS-ligázzal kezeljük, a térfogatot nicktranszláeiós pufferrel 250 nl-re növeljük (4.d) példa), majd jéggel való hűtés mellett ultrahanggal (MSE, 100 Watt Ultrasonic Disintegrator, maximális teljesítmény 20 kHz-nél ötször 30 másodperc) roncsoljuk. A DNS töredékek végeit 1/100 térfogat 0,5-0,5 mM dATP, dGTP, dCTP és dTTP, valamint 10 egység Klenow-fragment (DNS-polimeráz I) hozzáadásával 2 órán át 14 ’C-on reagáltatva, kiegészítjük. A kapott tompa végű fragmentumokat nagyságuk szerint 1%-os agaróz gélben választjuk el. Az 500-1.000 bp nagyságú fragmentumokat izoláljuk és a Smal-gyel hasított, defoszforilált M13 mp8 fág-vektorba szubklónozzuk. A rekombináns fágok egyes-szálú DNS-ét izoláljuk és Sanger módszerével [RSanger és munkatársai, Proc.NatlAcad.Sci., 74, 5463-5467 /1976/] elvégezzük a szekvencia analízist. Az egyes szekvenciák alapján komputerrel határozzuk meg a teljes szekvenciák összetételét (EStaden, NuclAcid Rés., 10, 47314751/1982%].

d) Á pKH57 (IFN-omega-1) szubklón szekvenciája

A szekvenciát all. ábra mutatja be. Ez az 1933 bp hosszú fragmentum tartalmazza az interfron-omega1-et meghatározó gén t. A protein t kód ol ó régi ó az 576. nukleotidtól az 1163. nukleotidig tart. Ez a szekvencia teljesen azonos a P9A2 klón cDNS-ének szekvenciájával. Az 576-674 nukleotid rész egy 23 aminosav hosszú szignál peptidet kódol. A TATA-box az I típusú interferon génekre jellemző távolságra van az ATG start kodon előtt (476-482 pozíció). A génben néhány szignál szekvencia található, ezek a transzkripciónál történő poliadenilációt határozzák meg (ATTAAA az 1497-1502, illetve 1764-17696 pozícióban; AATAAA az 1729-1734, illetve 1798-1803 pozícióban) és ezek közül azelsőt aP9A2 kiónban alkalmazzuk.

e) Á pRHW22 (IFN-pszeudo-omega-2) szubklón szekvenciája

A12. ábra a cos9 kozmidból származó azon HindDI fragmentum szekvenciáját ábrázolja, amely az ómega-1-DNS próbaanyaggal hibridizál. A 905-tŐI az 1366. nukleotidig terjedően nyitott leolvasási szerkezetű. Az ebből levezetett aminosav szekvenciát is bemutatjuk. Az első 23 amiosav egy I típusú interferonra jellemző szugnál pepiidhez hasonló. Az ezt követő 131 aminosav a 65.

aminosavig hasonló az omega-l-interferon aminosavaihoz, ahol a tirozin, mint az érett protein első aminosava, figyelemreméltó.

A 66. aminosav pozíciót követően egy potenciális N-glükozilációt meghatározó szekvencia (Asn-Phe10 Ser) következik. Ettől a helytől kezdve eltér az aminosav szekvencia az I típusú interferonokétől. Azonban megfelelő beépítések révén a protein leolvasási szerkezetnek ebből adódó eltolódása helyreállíthatja az IFN-ómega-1 -hez Való hasonlóságot (lásd a 9. példát). 15 Az I típusú interferonok oldaláról nézve tehát ez az izolált gén egy peszudo-gén; IFN-pseudo-omega-2.

f) A pRH51 (IFN-pszeudo-omega-3) szubklón szekvenciája

Elvégeztük a B kozmidból származó egyik, mintegy 20 3.500 bp hosszú és az omega-l-próba anyaggal hibridízáló HindlH fragmentum részleges szekvencia analizését (13. ábra). A 92-tŐI a 394. nuídeotid pozícióig terjedően nyílt leolvasási szerkezet található. Az első 23 aminosav egy szignál pepiidre utaló jeleket visel, 25 Az ezt követő szekvencia triptofánnaí kezdődik és hasonlóságot mutat az IFN-omega-l-hez, egészen a 42. aminosavig. Az ezután levezetett szekvencia eltér az IFN-omegal-étől és a 78. aminosav után véget ér. A szekvencia inszer tumok beépítésével úgy váitoztatha30 tó, hogy ez követően az IFN-oméga-t-hez nagymértékű homológiát mutasson (9. példa). Ágén azIFN-pseudo-omega-3 elnevezést kapta.

g) A p'RH52 (lFN-pszeudo-oméga-4)'szubklón szekvenciája

AB kozmidból izolált 3.659 bp hosszú és az ómega 1-DNS-sel hibridizáló Hindin fragmentum szekvenciáját a 14. ábra mutatja be. Nyílt leolvasási szerkezet található a 2951. és 3250. nukleotid pozíció közt, amelynek a transzlációs terméke részleges ho40 mológiát mutat az BFN-omega-l-hez. Egy 23 aminosav hosszúságú szignál peptíd után a további aminosav szekvencia fenilalaninnal kezdődik. Az IFN-omega-lhez való homológja már a 16. aminosavtól megszakad és a 22,-nél folytatódik, majd a 41. aminosawal befe45 jeződík. Adott esetben lehetséges lenne egy transzláció a 77. aminosavig. A 8,f) és 8.g) példával analóg módon itt is jó homológiát lehet teremteni azIEN-omega1 -hez, inszertumok bevezetésével (9. példa). Az izolált pszeudo-gént EFN-pszeudo-ömega-4 elnevezéssel 1160 lettűk.

9. példa

Az IFN-omega család négy tagját meghatározó gének kiértékelése a 15. ábra bemutatja egymás mellett az IFN-omegal-től az EFN-pszeudo-omega-4-ig a géneket, aminosav Összetételükkel együtt. A jobb megegyezés kedvéért az egyes génekbe üres helyeket iktattunk be, amelyeket pontozással jelöltünk. Bázisokat nem <

HU 205779 Β hagytunk ki. A bázisok sorszámában az üres helyek is benne vannak. Az IFN-omega-1 aminosavakra történő átfordítását megtartottuk (például a 352-355 pozícióban: a CAC a hisztídint kódolja). A pszeu- 5 dogéneknél csak ott végeztük el az aminosavra való átfordítást, ahol az egyértelműenlehetséges volt. Az egymás meUetti sorolás alapján azonnal felismerhető, hogy a négy izolált gén egmással rokonságban van. 10 Például a potenciális N-glükozilációs hely (a 301-309 nukleotid pozíció) mind a négy génben megtalálható.

Kivéve az IFN-pszeudo-omega-4 gént, ahol a 611614 nukleotid pozícióban szintén vagy egy triplet, 15 amely stopkodon szerepet tölt be és amely az IFNomega-l-nél egy 172 aminosav hosszúságú érett proteint fejez be. Mindazonáltal ebben az elrendezésben, azIFN-pszeudo-omega-2-nél (497-499 nukleotid pozíció) és az IFN-pszeudo-omega-4-nél (512-514 nuk- 20 Ieotid pozíció) is léteznek korai stopkodonok.

A gének között, illetve a transzlatált aminosavak közöttmeglevőrokonságifokota 15. ábrában szereplő elrendezésből ki lehet számítani. A16. ábrán az IFNomega-család tagjai közti bomológiát mutatjuk be. Itt 25 a páronként! összehasonlításnál azokat a pozíciókat, ahol a partnerok közül az egyiknél vagy mindkettőnél üres hely található, kihagyjuk a számításból. Az összehasonlítás kereken 85%-os homológiát mutat az IFNomega-l-DNS és a pszeudogének szekvenciái között. 30 (Pszeudogénen egy a genomban levő funkcionális génhez hasonló olyan szekvenciát értünk, amelyből nem fejeződik ki terméket, mert a) a promoter hatástalan, b) olyan átirat, amely egy stopkodon miatt nem fordítható proteinné, vagy c) az eredeti protein leolvasóke- 35 retet mutációk zavarják (mint, az IFN-omega esetében fennáll.). Az IFN-pszeudo-omega-2-DNS m in tégy 82%-banhomológazIFN-pszeudo-omega-3, illetve az IFN-pszeudo-omega-4 DNS-ével. A17. ábra a szignál szekvenciák Összehasonlításnál kapott eredményeket, 40 a 18. ábra az „érett” proteinek összehasonlításánál kapott eredményeket mutatja be. Az utóbbiak 72-88%ban homológok. Azonban ez a homológia lényegesen nagyobb, mint ami az IFN-omega-1 és az IFN-a-k és az IFN-β között fenáll (6. példa). Az a körülmény, 45 hogy azIFN-omega-család egy§s tagjai egymástól távolabb vannak, mint az IFN-alfa-család tagjai egymástól, azzal magyarázható, hogy a négy izolált IFNomega gén közül három pszeudogén, és ezek nyilvánvalóan nincsenek már olyan szelekciós nyomás alatt, 50 mint a funkcionális gének.

10. példa

Fermentáció

Törzsfenntartás 55

LB-agaron (25 mg/ml ampicillinnel kiegészítve) fenntartott HBI01/pRH12 törzsből egy telepet átoltunk 25 mg/ml ampicillin tartalmú Trypton-SoyaBrotb (Oxoid, CM129) táplevesbe és rázott tenyésztést végzünk (250 ford/perc) 37 °C-on, amíg a tényé- 60 szét sűrűsége az OD_{546 nra} - 5 értéket (logaritmikus növekedési fázis) élném éri. Ekkor 10 tömegszázalék steril glicerint adunk a tenyészethez, majd 1,5 ml-enként steril ampullákba töltjük és -70 °C-ra lefagyasztjuk.

Elönytenyészet

A táptalaj összetétele:

15g/lNa₂HPO₄xl2H₂O

0,5g/lNaCl

I, 0g/lNH₄Cl

3,0g/lKH₂PO₄

0,25 g/1 MgSO₄x7H₂O

0,011 g/1 CaCl₂ g/I kazein hidrolizátum (Merck, 2238)

6,6g/lglükózmonobidrát *

0,1 g/1 ampicillin

20mg/lciszteín lmg/ltiamin.HCl

A táptalajt 1.000 ml-es Erlenmeyer lombikokba osztjuk 200 ml-enként. A HB101/pRHW14 törzs.tenyészetének 1-1 ml-ével beoltunk4x200ml táptalajt és 16-18 órahosszat37 ’C-on rázzuk (250 ford/perc).

Fótenyészet

A fennen tor táptalaj összetétele:

10g/l(NH₄/₂HPO₄

4,6g/lK₂HPO₄x3H₂O

0,5 g/1 NaCl

0,25 g/1 MgSO₄x7H₂O

0,011 g/lCaCl₂ g=l glükóz monohidrát g/1 kazein hidrolizátum (Merck, 2238)

20mg/lciszteinn mg/1 tiaminHCl mg/ϊ 3-béta-indol-akrilsav

A 14 liter össztérfogatú fermentorban (magasságsugár = 3:1) levő 8 liter steril táptalajt 800 ml előtenyészettel oltjuk be.

A fermentálást 28 ’C-on végezzük. Keverő: Effigas turbina, 1.000 ford/perc; Levegőztetés: 1 wm (tf/tf/perc); start-pH - 6,0. Afermentálás folyamán a pH-érték csökken: 3 n NaOH adagolással pH - 6,0 konstans értéken tartjuk a tenyészetet a továbbiakban. Ha a tenyészet eléri az OD_{546 lim}-18-20 értéket (általában 8,5-9 órás fermentálás után), 20 ’C-ra hűtjük - egyébként azonos körülmények mellett - majd 6 n H₂SÓ₄ adagolással (levegőztetés nélkül) a pH-érté- s két 2,2-re állítjuk be, s ezután 1 órán át 20 ’C-on keverjük (800 ford/perc) levegőztetés nélkül. Az ily módon inaktivált biomasszát ezután CEPA GLE típusú ₉ laboratóriumi centrifugában, 30.000 ford/perc mellett centrifugáljuk és -20 ’C-ra lefagyasztva tároljuk.

II. példa

Az interferon-omega-Gly tisztítása a) Részleges tisztítás

Minden tisztítási lépést 4 °C-onhajtjukvégre. 140 g biomasszát (pRHW12 expressziós kiónnal transzformáltE.coliHB 101/1.150ml(4’C-onelőhűtött) 1%-os ecetsavban reszuszpendálunk és 30 percigkeverjük. A szuszpenziót 5 mólos NaOH-val pH-10,0-re állítjuk

HU 205779 Β

Λ' be és további 2 órát keverjük, majd 5 mólos HCL-el pH=7,5-re állítjuk be és még 15 percig keverjük. Végül centrifugáljuk (4 ’C; 1 óra; 10.000 ford/perc; Beckman J21 centrifuga, JA10 rotor).

A tiszta felűlúszót 150 ml-es CPG-oszlopra visszük fel (CPG-/controlled pórus glass; CPG 10-350, mesh size: 120/200) 50 ml/óra sebességgel. Az oszlopot ezután 1.000 ml 25 mM trisz/1 M KCNS/50%-etilénglikol (pH=7,5) oldattal eluáljuk (50 ml/óra).

Az interferon aktivitást mutató protein csúcsot levesszük, 0,1 mólos nátrium-foszfát (pH=6,0) és 10% polietilénglikol 40.000 tartalmú oldattal szemben egy éjszakán át dializáljuk, s a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk (4 ’C; 1 óra 10.000 ford/perc; J21 centrifuga, JA20 rotor; lásd az 1. táblázatot).

b) Továbbtisztítás

A dializált és koncentrált CPG-eluátumot az Apufferrel (0,1 mólos nátrium-foszfát (pH=6,25) 25% 1,2propilén-glikol) 1:5 arányban hígítjuk és egy „Super5 loop”-in jekciós készülék (Pharmacia) segítségével 0,5 ml/perc mellett felvisszük az A pufferrel kiegyensúlyozott MonoS 5/5 oszlopra (Pharmacia; kation-cserélő). A lineáris gradiens elúciót 20 ml Á pufferrel végezzük, 0-1 mólos NaCl koncentrációval, 0,5 ml/perc 10 átfolyási sebesség mellett. Az átfolyt előfrakciót és az 1 ml-es frakciókat leszedjük és interferon aktivitásukat CPE-redukciós-teszttel (Igen. Virol, 68, 16691676 /1978/) vizsgáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük.

1. táblázat

	Térfogat ml	Biológiai vizsgálat E/ml+E.össz.	Protein összes mennyiség,	E/mg	Kitermelés, %
mg/ml	mg/ml
nyers termék	1150	15000 17,3,106	3,6	4140	4180	100
előfrakció	2200	600 1,3.106	0,74	1628	600	5
eluátum	124,3	1700021,0.106	16,8	2088	10000	121
dialízis után	41	3000012,3.106	12,6	516,6	23800	71

⁺CPR-redukciós teszt: A549 sejtek, EMC vírus ^Eaz egységeket az interferon-α 2-re, mint standardra vonatkoztatjuk (lásd az Ep-A-0.115.613 számú európai szabadalmi bejelentés 2. példáját: pER33 plazmiddal transzformált E.coli HB 101).

fe

12. példa

A HuíFN-omega-1 jellemzői AHumán sejtekre kifejtett vírusellenes hatás B. Majom sejtekre kifejtett vírusellenes hatás CHumán Burkitt-lymphoma sejtekre (Duadi sejtvonal) gyakorolt antiproliferatív hatás

D. Humán cervÍx karcÍnoma sejtekre (HeLa sejtvonal) gyakorolt antiproliferatív hatás

E. Stabilitás savakkal szemben

F. Szerológiai jellemzők.

kJBumán sejtekre kifejtett vírusellenes hatás

Sejtvonal: Humán A 549 tüdőkarcinóma sejtvonal (ATCCCCL 185)

Vírus: Egér encephalo-myiocarditis vírus (EMCV).

Teszt-rendszer: citopátiás effektus gátlás (minden titrálást négyszerisméteiünk).

Egy 9,4 mg=ml proteint tartalmazó, részlegesen tisztított HuIFN-omega-1 készítményt, megfelelően hígítva, a nevezett teszt-rendszerben titrálunk, A készítmény 8.300 ΙΕ/mg specifikus aktivitású vírusellenes hatást mutatott a Go-23-901 -527 jelzésű referen cia standardhoz viszonyítva.

B, Majom sejtekre kifejtett vírusellenes hatás

Sejtvonal: G1-V3 majom vese sejtek [G.J.Christofinis, J.Med.Microbiol., 3,251-258/1970/].

Vírus: vesicularis stomatitis vírus (VSV).

Teszt-rendszer: plakk-redukciós teszt (minden titrálást négyszer végeztünk el).

A12 A példa szerinti készítmény 580 E/mg specifikus antivirális aktivitást fejtett ki az említet tesztrendszerben.

C.Humán Burkitt-lymphoma sejtekre (Daudi sejtvonal) gyakorolt antiproliferatív hatás Humán Burkitt-lymphoma sejtvonalat (ATCC CCL

213) (Daudi) különböző koncentrációjú HuIFN-omagal jelenlétében tenyésztünk 37 ’C-on. Kettő, négy és hat napig tartó inkubáció után meghatározzuk a sejtvastagságot; kontrollként kezeletlen tenyészetek szolgálnak. Minden tenyésztést három párhuzamos kísér40 leiben végeztünk. A19. ábrából kitűnik, hogy az IFNomega -100 antivirális egység (HÉ, lásd a 12 A példát) koncentrációban - kifejezetten gátolja a sejtek proliferációját; 10 ΙΕ/mI koncentrációnál részleges, tranziens gátlás volt megfigyelhető.

A19.ábrában a következő jelöléseket használjuk: Önkontroll o=l IE/ml ó = lODE/ml t = 100 IE/ml

D.Humán méhnyak-karcinoma sejtekre (HeLa sejtvonal) gyakorolt antiproliferatív hatás Humán méhnyak-karcinóma sejtvonalat (HeLa) tenyésztünk a következő proteinek, illetve protein-keverékek jelenlétében:

HuíFN-omegal (lásd a 12A példát) 100 IE/ml, HuÍFN-gamma (lásd a 12.a. példát) 100 IE/ml,

Humán tumor-nekrózis-faktor (HuÍNF/98% tisztaságú, előállítja a Genetech Inc., San,Francisco, USA [D,Pennica és munkatársai, Natúré, 312, 724-739 /1984/] 100 ng/ml.

HU 205779 Β

Az említett proteinek binér kombinációi fenti koncentrációkkal.

Műanyag szövettenyésztő edényekben (3 cm-es) 22 tenyészetet (50.000 sejt/edény) inkubálunk 6 napig 37 'C-on, s ekkor meghatározzuk a sejt-sűrűséget. A sejtek HuIFN-omega-1-gyel vagy HuTNF-el való kezelése csak csekély befolyást gyakorol a sejt növekedésre, míg a HuIFN-gammával történő kezelés kifejezett citosztatikus effektust mutatott. Az IFN-gamma és az IFN-omega kombinációi szinergetikus citosztatikus/citotoxikus hatástfejtenek ki.

Akísérlet eredményt a 20. ábrán mutatjuk be.

A 20. ábrában a következő jelöléseket használjuk:

C - kezeletlen kontrollok

T=HuTNF

O =HuDFN-omega-l

G -HuIFN-ganima E. Stabilitás savakkal szemben

AHuIFN-omgal savérzékenységének vizsgálatához a 12A. példában említett készítmény egy hígítását sejt tenyésztésre szolgáló tápoldatban (11640 10% fetális borjú szérummal) sósav segítségével pH-2 értékre állítjuk be és 24 órán át 4 ’C-on inkubáljuk, majd nátrium-hidroxiddal semlegesítjük.Ezt az anyagot az antivirális-teszt alkalmazásával (lásd a 12A. példát) titráljukjakészítményaneutrálispH-ninkubáltkontroll aktivitásának 75%-át fejtette ki. Az EFN-omega-l ezek szerint savakkal szemben stabil.

F. Szerológiai jellemzők

Annak érdekében, hogy a HuIFN-omega-1 szerológiai tulajdonságait a HuIFN-a-2-vel összehasonlítva meghatározzuk, 100 ffi/ml-re hígított mintákat monoklonális vagy poliklonális antiszérumok azonos térfogatú oldataival előinkubáltunk 37 ’C-on 90 percig; ezután meghatároztuk a minták vírusellenes aktivitását. Az alábbi táblázatból kitűnik, hogy aHuIFN-omegal-et csak egy viszonylag magas koncentrációjú leukocita-interferon elleni antiszérum képes neutralízálni, de a HuIFN-a-2 vagy a HúDFN-β ellen termelt ellenanyag nem. Tehát a HuIFN-omega-1 sem a HuIFN-a-2-vel, sem a ΗυΙΕΝ-β-val nincs szerológiai rokonságban.

Antiszérum (monoklonális antitestek)	Hígítás ng/ml	HiUFN-a-2	Neutralizálás HuEFN-omega-1
EBI-11)	1	+	-
	10	+++	-
	100	+++	-
	1000	-	0
EBI-31)	1	+++	-
	10	+++	-
	100	+++	-
	1000	+++	0
L3B72>	100	+++	0 0
Birka-anti-leukocita-IFN3/	1000	+++	0
1:50000	+++	-
	1:5000	+++	0
	1:500	+++	+
	1:50	-	+++
Nyűl-anti-HuIFN-a-2	1:1000	+++	-
	1:100	+++	0
birka-anti-HuIFN-p4!	1:10	-	0
1:50	-	0

’^Lásd aO.119.476számú európai szabadalmi bejelentést

AHerthold és munkatásai, Arzneimittelforschung, 35,364-369 /1985/ ^Kísérleti referencia reagensek katalógusa: katalógus szám: G-026-502-568 ^Kísérleti referencia reagensek katalógusa: katalógus szám: G-028-501-568

Research Resources Branch, National ínsti tu te of AHergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, USA. Jelölése: -=nem vizsgáltuk

0=nincs neutralizáció +=részlegesneutralizáció +++=teljes neutralizáció

13. példa

IFN-omega-l-et kifejező élesztővektor szerkesztése

Megjegyezések:

Az IEN-omega-1 élesztő-expressziós vektor szerkesztésének vázlatos rajza (lásd a 21. ábrát) nem mérethelyes.

Az enzimreakciókat az előállító cégek előírásai szerint folytatjuk le, az egyéb módszerek stndard módszerek, amelyek megtalálhatók T. Maniatis: „Molecular cloning - a laboratory manual” (Cold Spring Harbor, 1982) című könyvében.

Az élesztő transzformálásánál a következő táptala60 jókat használjuk:

Hü ÍV5779 B ξ

YNB+CAA táptalaj (1 liter):

6,7 g YNB táptalaj aminosavak nélkül (Difco KatAfr. 0919-15) g kazein-aminosavak (CAA.) (Difco Kat.Nr. 023101-0)

YPD táptalaj (1 liter):

g élesztő kivonat (Difco Kat-Nr. 0127-01-07) g Bacto pepton (Difco Kat.Nr. 0118-01-8)

Víz x mínusz Leu drop-out oldat (100 ml):

0,25gtriptofán

0,20 g arginin

0,10ghisztidin

0,60 g izoleucin

0,40 g lizin

O.lOgmetionin

0,60gfenilalanin

0,50 g treonín

0,12gadenin

0,24guracil

Víz

Steril szűrés

Táptalaj élesztő tenyésztéshez:

100 ml autoklávozott YNB + CAA táptalaj vagy

YPD táptalaj 4 ml 50%-os glükóz ml 50 x mínusz Leu drop-out oldat Szorbitos lemezk táptalaja (600 ml):

109,2gszorbit

12gglükóz 4,02gYNB 15 g agar Víz

Autoklávozás után 45 ’C-ra hű tjük le, hozzáadjuk a drop-out oldatot és lemezre öntjük,

Top-agar(l liter):

182 g szorbit 20 g glükóz

6,7 g YNB 25 g agar Víz

Autoklávozás ED-oldat(25ml):

12,5 ml 2 mólos szorvit

1.25 ml 0,5 mólos EDTA

11.25 ml desztillált víz

192.75 mg ditioptreitol (DTT)

Sterilszűrés SCE oldat (25 ml):

12,5 2 mólos szorbit ml 0,5 mólos trinátium-citrát 0,5 ml 0,5 mólos EDTA 7 ml steril desztillált víz CAS oldat (25 ml):

12.5 ml 2 mólos szorbi t

2.5 ml 100 mólos kalcium-klorid 0,25 ml 1 mólos írisz; pH=7,5

9.75 ml steril desztillált víz PEG oldat (20 ml):

gPEG 4,000 (polietilénglikol, Serva) ml 100 mólos kalcium-klorid

0,2 ml 1 mólos írisz; pH=7,5

17,8 ml 1 mólos trisz; pH »7,5

17,8 ml desztillált víz .5 Sterilszűrés

SOGoldat(5ml):

2,5 ml 2 mólos szorbit

1,7πύΥΡΟ

0,3 ml 100 mmólos kalcium-klorid í 0 12,5 jil 50xmínuszLeu drop-out oldat

0,5 ml desztillált víz

Sterilszűrés

a) Éleszfő-ADHI-promoter fragmentum előállítása

A pES 103 plazmid (a budapesti egyezmény alapján letétbe helyezve 1987. február 27-én E.coli HB101 sejtben a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen intézménynél DSM 4013 letéti szám alatt) 80 jig-ját 500 nl oldatban BamHI-gyel és Xhol-gyel duplán megemésztjük. A kapott mintegy 1,450 bázispár (bp) hosszú promoter fragmentumot 1%-os agaróz gélben a vektortól elválasztjuk, a gélből elektroelűcióval izoláljuk és kicsapjuk. A fragmentumot 40 nl TE-pufferben (10 mM trisz, 1 mM EDTA, pH » 8) vesszük fel.

b) ,4 pJDB207 vektor előkészítése

A pJDB207 10 ng-ját 100 n oldatban BamHI-gyel hasítjuk, s ezzel linearizáljuk. Hogy összekapcsolódás ezután ne jöhessen létre, az 5’-terminális foszfátcsoportokat borjúbélfoszfatáz (calf-intestíne phosphatase = CIP) kezeléssel távolítjuk el. A lineáris formát az esetleg el nem hasadt plazmidoktól 1%-os agaróz gélben választjuk el, a gélből elektroelűcióval izoláljuk és kicsapjuk. A vektor-DNS-t 20 nl TE-pufferben oldjuk fel.

c) IFN-omega-1 expressziós vektor

50 ng pRHW12 plazmidot linearizálunk HindlHmal 600 nl oldatban. Az oldathoz hozzáadunk 10 egységet a DNS-polimeráz I Klenow fragment jéből és 2525 nmólt a négy dezoxinukleozid-trifoszfátból, s szobahőmérsékleten való inkubálás után az 5’-túllógÓ vé40 gek tompa végekké alakulnak. A plazmid lineáris alakját agaróz-elektroforézis után izoláljuk, s így tisztítjuk. A fragmentumot 50 η 1 TE-pufferben oldjuk.

Hogy a promoter-fragmentummal kompatibilis végeket készíthessünk, Xhol linkereket kell a lineáris 45 pRHW12 végeihez kötni. 3 nl Xhol linkért (0,05 OD_250nm; Pharmacia P-L; 27-7758-01, képlet:d/CCTCGAGG/) 20 nl oldatban 5 egység T4-polinukleotid kináz és rATP segítségével foszforilálunk. Az enzim inaktiválása után -10 perces 70 'C-on való 50 hevítés - az oldat 5 hl-ét 10 nl lineáris pRHW12 oldattal keverjük össze és az összesen 20 nl reakcióelegyben T4-DNS ligázzal kapcsoljuk Össze a két fragmentumot (16 óra; 14 ’C). A ligázt 10 percig tartó 70 ’C-on való hevítéssel inaktiváljuk, majd a reakcióe55 légy térfogatát 150 nl-re egészítjük ki, 1 x mediumpufferrel (10 mmól trisz (pH-7,5), 50 mmól NaQ, mmólMgCl^.

Az Xhol specifikus 5’-túllógó végeket 100 egység Xhol-el való kezelés révén szabadítjuk fel. Az Xhol 60 végekkel ellátott, lineáris pRHWl 2 plazmidot agaróz23

HU 205779 Β gél elektroforézissel tisztítjuk, a gélből elektroeluáljuk, s kicsapás előtt 5 ni promoter fragmentumot (a/pont) adunk hozzá. Kicsapás után a DNS molekulákat 14(5 ni TE-pufferben vesszük fel, majd ligáz-puffer és 5 egység T4-DNS liga hozzáadásával 16 órán át 14 *C-on végezzük a ligáz-reakciót. Az enzim hőinaktivifálasa után az oldat térfogatát 1 x medium-pufferrel200nl-reemeljük és aDNS-tBamHI-gyel hasítjuk. A kívánt DNS-t agarózgélben tisztítjuk, majd 20 ni TE-pufferben oldjuk.

d) A fragmentumok összekapcsolása

A kész expressziós vektor úgy jön létre, hogy 5 ni BamíTT fragmentumot (promoter és EFN-omega-1 gén) 1 ni linearizált pJDB207 vektorral (élesztő 2 n terminátor és élesztő 2 n replikációs origó, LEU2 marker, E.coli replikációs origó, ampicíllin rezisztencia gén) kapcsolunk össze - összesen 10 ni oldatban 1 egység T4-DNS-ligáz jelenlétében.

e) Transzformálás

Kalcium-kloridos kezeléssel előkészített E.coli HB1Ö1 sejtek 10 nl-ét5nl ligáz-reakcióeiegy hozzáadása révén transzformálunk és a sejteket 100 ng/ml ampicülin tartalmú LB^:agar lemezekre szélesztjük.

A. keletkezett kiónok közül tetszés szerint 12 klónt kiválasztunk és a bennük levő plazmidot mini-technikával (1,5ml tenyészet) izoláljuk.

A plazmidokat különböző restrikciós enzimekkel hasítottuk, agarózgélben elválasztást végeztünk, majd kiválasztottuk a kívánt szerkezettel rendelkező plazmidot, melyet pY-JDB-HuIEN-omegal-nek neveztünk eL f> Élesztő transzformálás

Az előtenyészetet úgy készítjük, hogy 25 ml YPD+mmusz Leu drop-out oldatot beoltunk egy élesztő teleppel (GM3-C2 törzs). A tenyészetet egy éjszakán át 30 ’C-on hagyjuk növekedni. 100 ml YPD + mínusz Leu drop-out oldatot 190 ni előtenyészettel oltunk be és a sejteket 30 ’C-on OD₆₀₀ = 1 sűrűségig hagyjuk növekedni (körülbelül 4.10' sejt/ml). Az élesztő sejteket Iecenírifügáljuk (5 perc; 5.000 ford/perc).

Az üledéket 10 ml SÉD oldatban reszuszpendáljuk és 10 percig 30 ’C-on inkubáljuk. A sejteket mégegyszer lecentrifugáljuk (6 perc; 2.500 ford/perc), majd 10 mlSCE oldatbanreszuszpendáljuk.

Aszuszpenzióhoz 100 ni Glusulase-t (β-glukuronídáz, aril-szulfatáz; Boehringer-Mannheim) adunk és 30 percig 30 ’C-on inkubáljuk, amikoris szferoblasztok jönnek létre. A szferoblasztokat lecentrifugáljuk (5perc;2.000ford/perc), s az üledéket egyszer mossuk CAS oldattal, majd 500 ni CAS oldatban reszuszpendáljuk.

120 ni szferobalszthoz 6 ng plazmid-DNS-t (pYJOB-HuIFN-omegal) adunk és 15 percig szobahőmérsékelten inkubáljuk. Ezután a sejtekhez 1 ml PEG oldatot adunk és további 15 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd lecentrifugáljuk (5 perc; 2.000 ford/perc).

Azüledéket 150 ni SDG oldatban reszuszpendáljuk és 30 percig 30 ’C-on inkubáljuk. A szuszpenzióhoz ezután hozzáadunk 5 ml top-agart, 250 ni 50xmínusz

Len drop-out oldatot, majd a sejteket szorbitos lemezekre öntjük. A telepek 2-4 nap 30 ’C-on való inkubálás után fejlődnekki.

g) Élesztő sejtlizátum ml YNB + CAA táptalajt +1 ml 50%-os glükózt, í mi 50 x mínusz Lendrop-out oldatottartalmazó táptalajt beoltunk egy transzformált élesztő teleppel. Az inkubációs idő 30 ’C-on legalább 40 óra. Ebből a tenyészetből 13 ml-t 5 percig 4.500 ford/perc mellett íecentrifugálunk. Az üledéket Vortex keverő segítségével 0,5 ml 2 mólos guanidinium-hidrokloridban reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz ekkor 2 ml-nyi üveggolyót (átmérő: 0,4-0,5 mm) adunk és 10 percig 4 ’C-on erősen rázzuk. Afelülúszót ezután áttöítjükegy Eppendorf-tartályba és 0 ’C-on inkubáljuk. Az üveggolyókat egyszer mossuk 0,5ml 7 mólos guanidiniumhidroldoriddal és a mosóoídatot az első felülúszóval egyesítjük. Az oldatot Eppendorf centrifugában 12.000 ford/perc mellett 1 percig centrifugáljuk. A feiülúszó interferon aktivitását CPE redukciós módszerrel (Igen. Virol,, 68,1669-1676 /1987/) határozzuk meg.

Kitermelés: 1x10⁸ egység EFN-omega-11 élesztőtenyészet.

Claims (28)

1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK

   1. Eljárás 168-174 aminosav hosszúságú új I típusú interferon proteineket vagy interferon-pszeudo-omege-2-t (12. ábra), interferon-pszeudo-omega-3-at (13. ábra), interferon-pszeudo-omega-4-et (14.ábra) kódoló, azE.coli HB 101-ben levő É76E9 plazmid (DSM 3003) vagy az E.coli HB 101-ben levő P9A2 plazmid (DSM 3004) PstI hasítási helyére beépített inszertumokkal csak a 85%-osnál nagyobb hcmológia felismerését megengedő körülmények között hibridizálő szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy vírus kezeléssel egyidejű a- és β-interferon termelésre serkentett sejtekből izolált mRNS-t templátként használva cDNS-t szintetizálunk, amelyet tisztítunk, és ezt templátként használva komplementer szál szintézisével kettős szálúvá alakítunk, és ezt elkülönítés után tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás csak a 90%-osnál nagyobb homológja felismerését megengedő körülmények között hibridizáló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a műveletekkel a megfelelő anyagokbólkiindülva végezzük el. (Elsőbbsége: 19S4.08.01.)
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás az E.cc!i HB 101-ben levő E76E9 plazmid (DSM3003) PstI hasítási helyére vagy az E.eoli HB 101-ben levő P9A2 plazmid (DSM 3004) PstI hasítási helyére inszertumként beépített kódoló szekvenciát vagy ennek degenerált változatát tartalmazó DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a műveletekkel a megfelelő anyagokból kiindulva végezzük eL (Elsőbbsége: 1984.08.01.)

   HU 205779 Γ,
4. 4. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti eljárása

   TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 45

   GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 90

   AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 135

   AGCCAGTTGCAGAAGGCCCATGTCATGTCTGTCCTCCATGAGATG 180

   CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 225

   GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 270

   CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 315

   GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 360

   AGGAGGTACTTCCAGGGAATCCGTGTCTACCTGAAAGAGAAGAÁA 405

   TACAGC GACTGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 450

   TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 495

   GATAGAGACCTGGGCTCATCT 516 szekvenciát tartalmazó DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a műveleteket a megfelelő anyagokból kiindulva végezzük el. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás a szekvencia 322 helyzetében G helyett A nukleotidot tartalmazó DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a műveleteket a megfelelő anyagokból kiindulva végezzük el. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
6. 6. A 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 4.

   vagy 5. igénypontban megadott szekvencián kívül a vezérpeptidet kódoló, a

   ATG GCC CTC CTG TTC CCT CTA CTG GCA 20 GCC CTA GTG ATG ACC AGC TAT AGC CCT GTT

   GGA TCT CTG GGC képletű DNS szekvenciát is tartalmazó DNS molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a műveteket a megfelelő anyagokból kiindulva végezzük el. (Elsőbb25 sége: 1984.08.01.)
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás a

   GATCTGGTAAACCTGAA 17

   GCAAATATAGAAACCTATAGGGCCTGACTTCCTACATAAAGTAAGGAGGGTAAAAATGG 76

   AGGCTAGAATAAGGGTTAAAATTTTGVTTCTAGAACAGAGAAAATGATTTTTTTCATAT 135

   ATATATGAATATATATTATATATACACATATATACATATATTCACTATAGTGTGTATAC 194

   ATAAATATATAATATATATATTGTTAGTGTAGTGTGTGTCTGATTATTTACATGCATAT 253

   AGTATATACACTTATGACTTTAGTACCCAGACGTTTTTCATTTGATrAAGCATTCATTT 312

   GTATTGACACAGCTGAAGTTTACTGGAGTTTAGCTGAAGTCTAATGCAAAATTAATAGA 371

   TTGTTGTCATCCTCTTAAGGTCATAGGGAGÁACACACAAATGAAAACAGTAAAAGAAAC 430 TGAAAGTACAGAGAAATGTTCAGAAAATGAAAACCATGTGTTTCCTATTAAAAGCCATG 489

   CATACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATATCCCAGCTCAG 548 ' TAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCA ATG GCC CTC CTG TTC CCT CTA CTG 599

   GCA GCC CTA GTG ATG ACC AGC TAT AGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC 644

   TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 689

   GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 734

   AAGGAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 779

   AGCCAGTTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 824

   CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTCTTC CAC ACA GAG CGCTCCTCTGCT 869

   GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 914

   CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 959

   GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 1004

   AGGAGGTACTTCCAGGGAATCCGTGTCTACCTGAAAGAGAAGAAA 1045

   TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 1094

   TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 1139

   GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGA AATGATTCTCATTGATTAATTTGCCAT 1190

   ATAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCA 1249

   CAGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTT 1308

   AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTrATTnTACrCATTTÁ 1367

   TTTATrCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGC 1426

   ClTrACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGCTTTCCATTTGGTTÁAATATTGTA 1485

   TTTTGTTATTTATTAAATTATTTTCAAACAAAACTTCTTGAAGTTATTTATTCGAAAAC 1544

   CAAAATCCAAACACTAGTTTTCTGAACCAAATCAAGGAATGGACGGTAATATACACTTA 1603

   CCTATTCATTCATTCCATTTACATAATATGTATAAAGTGAGTATCAAAGTGGCATATTT 1662

   HU 205779 Β

   TGGAATTGATGTCAAGCAATGCAGGTGTACTCATTGCATGACTGTATCAAAATATCTCA 1721 TGTAAGCAATAAATATATACACTTACTATGTATCCCACAAAAATTAAAAAGTTATTrrA 1780 AAAAAGAAATACAGGTGAATAAACACAGTTTC - CCGTGTTGAAGAGCTTTCATTCTT 1839 ACAGGAAAAGAAACAGTAAAGATGTACCAATTICGCTTATATGAAACACTACAAAGATA 1898 AGTAAAAGAAAATGATGTTCTCATACTAGAAGCTT 1933 szekvenciájú interferon-omega-1 gén előállítására, 1985.07.31.) azzal jellemezve, hogy a műveleteket a megfelelő 8.Azl.igénypontszerintieljárása anyagokból kiindulva végezzük el. (Elsőbbsége:

   AAGCTTGAGCCCCAGGGAAGCATAACCACATGAACCTGAATGAATATATT 51

   CrAGAAGGAGGGAAGCACCAGAGAAGTTCTTTCACTAATAACCATCAACGTCTTCTGTG 110

   AATCAAATATCAAACAAAGATAGTCCTAAAAAGxxTAATTrCCAGAGATAGGTAATnC 169

   CTAACTGAATACAGAAACCCATAGGGCCCAGGGATCCTGATTTCCTATGCAAAATGGAG 228

   GGTAAAACTGGAGGCTAGGATCTGGGCTAAAAGTATATACTTCTAACAGTAGCACAAAG 287

   ATGTTTCTCATCTGATTGATCAATATTCATTTGGaTTGATATATCTTAAGTTTACTGGG 346

   AATATTGAACATCCATTGCAAAAATCAAGAGTGTAGAGTGATGACCTCCnTTAGGTCA 405

   TATAGAACAAGGTTTTTCAACCCCCATCCATGGACCGGGGTACTGGTCCTGGCCTGGTA 464

   GGAACAGGGCCGCACAGCAGGAGGCAAGCAGGCCAACCAACAAGCATTAACGCCTGAGC 523.

   TCTGCCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTGGATTCTCAAAAGAGCAGGAACCCTATTG 582

   TGAAGTGCAGATGCGAAGGATCTAGGTTGTGGTCTCCTAATGAGAATCTAATGCCTCTG 641

   AAAGCATrGGCTCCCTGACCCCATmTCGTGGAAAAATTATCTTCCACCAAACTGGTG 700

   GCCAAAAGGTTGTGGATGCTGATATAGAAGACATGTAAATGAAAACAATAAATGGAATT 759

   AAAAATTTAGAGAAATGCTCAGAAAAATGAAACTATTTGTGCTCCAATTAAAGCCATGC 818

   ATAGATAGAATGTCTTCATAGAACCTACGATCCAÁGGTTCTATGAAGACCTCAGCTCAA 877

   CCAGGCCAAAAGCATCCTGATTTCTCAATGGCCCTCCTCTTCCCTCTACTG 928

   GGAGCCCTAGAGGTGTGCAGCTGTGGCTCTTCTGGATCTCTAGGA 973

   TATAACCTGCCTCAGAACCATGGCCTGCTAGGCAGGAACACCTGG 1018

   GTGCTTTTGGGCCAAATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTTGTGTCTA 1063

   AAGGACAGAAGTGACTTCAGATTCCCCCAGGAGAAGGTGGAAGTC 1108

   AGCCAGTTGCAGAAGGCCCAGGVTATGTCTTTCCTCTATGATGTG 1153

   TTACAGCAGGTCTTCAACTTCTCACACAAAGCGCTCCTCTGCTGC 1198

   ATGGAACATGACCTTCCTGGACCAACTCCACACTTTACGTCATCA 1243

   GCAGCTGGAACACCTGGAGACCTGCITGGTGCAGGAGATGGGAGA 1288

   AGGAGAAGCTGGGGGCAGTGGGTGATT GAG GGC TCT ACA CTG GCC 1333

   TTGAGGAGGTATTTCCAGGAATCCATCTCTACCTGAAAGAGAAGAA 1380

   TAAAGATTGTGCCTGGGAAGTTGTCAGAGTGGáAATCATGAGÁTCCTTITCATCCACAA 1439

   GTTTGCAAGAAAGATTGAGAAGTAAGGATGAAGACCTGGGCTCATCATGAAATGATTCT 1498

   CATTGACTAATCTGCCATATCACACTTGTACATGTGACTTTGGATATTCAAAAAGCrCA 1557

   TTrCTGTrTCATCAGAAATTATTGAATTAGTTrrAGCAAATACTTTATTAATAGCATAA 1619

   AGCAAGTTTATGTCAAAAACATTCAGCTCCTGGGGCATCCGTAACTCAGAGATAACTGC 1675

   TATATTTTATATTTTCATCTTCACATCGTATTAAAATTTATAAAACATTCACTTTTTGA 1793

   TATTAAGTTTGCATTITGTTTTATTAAATTCATATCAAAGAAAACTCTGTAAATGTTTC 1852

   TATTCTAAAAACAATGTCTACTTTCTCTTTTTGTAAACCAAATTGAAAATATGGTAAAA 1911

   TGTATTAACTCATTCATTTCATTCCTATTATATGTATAAATTGAGTAAATGGCAAAATG 1970

   TGGGGTnTCITAAAGAAATACAGGTGAATAAAGCAAACACAGTTTCTCTCAGTCTAAG 2029

   AGGGAAAGAGACGTAAAAACAGGACAAATATTTATATTATTTCAATTATGTTAAATGVT 2088

   ACAAAGAGAAGTAAAGAAAAGTGATGTTCTCACATCAGAAGCTT 2132 szekvenciájú interferon-pszeudo-omega-2 gén elő- 1985.07.31.) állítására,azzűí/e/Zemezve, hogy aműveleteket a meg- 9.Azl, igénypont szerinti eljárás a felélő anyagokból kiindulva végziik el. (Elsőbbsége:

   CCATG 5

   CATAGCAGGAATGCCTTCAGAGAACCTGAAGTCCAAGGTTCATCCAGACCCCAGCTCAG 64

   CTAGGCCAGCAGCACCCTCGTTTCCCA ATG GTC CTC CTG CTT CCT CTA CTC 115

   HU 205 779 Β

   GTG GCC CTG CCG CTT TGC CAC TGT GGC CCT GTT GGA TCT CTG AGC 160

   TGG GAC CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 205

   GCA CIT CTG GGC CAA ATG TGC AGA ATC TCC ACT TTC TTG TGT CTC 250

   AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CTG GAG ATG TGG ATG GCA 295

   GTC AGTTGC AGA AGG CCC CGG CCC TGT CTG TCCTCC ATG AGATGC 340

   TTCAGCAGATCTTCAGCCTCTTCCCCACAGAGTGCTCCTCTGCTG 385

   CCTGGAACATGACCCTCCTGGACCAACTCCACACTGGACTTCATCTGCAGCTGGA 440 *·

   ATGCCTGGATGCTTGCTTAGGGCAGACAAAAAGAGAGGAAGAATCTGTGGGGGTGATTG 499 GGGCCCTACACTGGCCTTGAGGACGTACTTTCAGGGAATGCATGGGAATCCAGGGAATC 558 TACCTGGAGGAGAAGAAATACAGTGACTGTGCTTGGGAGGTTGTCAGAGTGGAATCGTG 617 AAATCCTTCTCTTCATCATCAACAAACTTGCAAGAAGGACTGÁGAAGTAAGGATGAAGA 676 CCTGGGTTCATCCTGAAATTATTCTCATTGATTAATCTGCCATATCACACTTGCACATG 735 TGTCTTTGGTCATTTCAATAGGTTCTTATTTCTGCAG 772 szekvenciájú Ínterf eron-pszeudo-omega-3 gén elő- 1985.07.31.) állítására, özzö/ jellemezve, hogy a műveleteket a meg- ΙΟ.Αζ 1. igénypont szerinti eljárás a felelő anyagokból kiindulva végezzük el. (Elsőbbsége:

   AAGCTTTGGGCATGACCTAGTAGGTGACTCTT 32 AGTTGGAGTGGTCAGTTGTAAGGCTCTTGCTCAGTCACGTGGCTCCCCTGTATTTCCC 91

   ACGÍTTGCAGCCGTGCTCCTTCTCAATGCTATGAAAGTGTGGGCTCCTCTCCCACTGGA 150 GTGCTGACTGTAGCTTGTATCTTGGCACTCCCAGGCTGTACATAACAGCTCTGAGGTGA 209 TCTCAGGGTTAATGTTTTCTCTCCGACTTGGAGGCCATTGAAGGAAGGGACCTTAGTAG 268 TAGTTGTAACTGAGGGTCTTTTGCTTGTCTCCTGGGGGCTCCACCCCAGAGATGCAGGT 327 GAGCAATCACTCAGTGCATTCAGCTTGGGATGGGGGTGTCTGTGCTGTGGGCCCAAGAC 386 AGGGGTTCCCTGCCTGGTGATGTGAGGGGTGGGTGGTTGACCAATGGCAGACAGACTGG 445 CCTCCTCTCTTGGGTTGACAGCAGCTTGTTGGAGGTATGCATAAGGCACTTGGGGTCTT 504 GCTCCTTCATTAGTTCCAAGGTAGCTGGGGTAGTACCACTGCAGAGGCAGTGTTAGACA 563 GGCTTTCTGTTACCCCTGGGGTCTCCACCTCCTAGAAATGTGAAGTCATGTTAATGGGA 622 GTGTTTAGCCAGAGGAGTGGGGTGGCTGCATGCTGGTGTAAGTATGGGACTTCACTTCT 681 TGGGAAACAGGGAGGTGGAATCTTACCAGCAGGAGACTGTTCTCCTCACGATGTGTAAC 740 CTGCAGTGTGCTGGAAGTTTAGGTGACTGTGGCATGATGTTAGCTTGTAAACAAAGAGC 799 TTCAGACTCTTTGTCTCTTCCCCAGACCCAAGGCAGCAAGGATAÁAAGCTGCTGCTGTG 858 GGAGTGGCAGAGGTAGGATGGTTGTGGGAGCCCTCTCCCCAGGAAACTCTAGTCAACTA 917 CCAGTGGATATATGCTCAGCCATGGGTAGGGTGACTGTTCTGCAGTCATGGGCAGGGCC 976 TGCTCCTGAAGAATAGGGACAGGGATTCTCAGGGAAGAGGGGCTGGACTCCTCTTCATA 1035 TAGTGGCGATGATGTGCTGGAGGTGCCAGTGTAGTGAATAGGGCTTTGTTCCTTCCCCA 1094 GCCáGAGGGCTGCTGGGGCTGTCCCACTGCAACGGTCATGGTGGATGGGTTATGGGTTG 1153 ACTGTGGGATTTCTTTCTTGGAGAAATGCTGGACTGCCTGATTGAGGAGACGAGGCAáG 1212 GGAAGAATGCCTGTGCTGGAGTCTCTGGTCAGGTGGCTCTGCCACAGAGGAGAGGTGAC 1271 CACCAGGAACTGCGTGGAGAACAGTGTAGCCACTCTTCTGTGAGGCAGTTGCTCTGTTT 1330 TGGGGATCTGGAGCAGCCGCTATTCeTTACAGATTCCCAGAGCCTGGAGACAGCAAGGG 1389 CAAGAGCTGTGAGAAAGCAAAGATAGCAACCACCCTTCTCTCACTGGAGCTCTGTTCCA 1448 GGGAGATGCAGAGCTGCCATTGCTCAATAGCCCCAGCTGGTAGCTGCAGACCCAGGCCT 1507 GGCAGACCCACCCAGTGAGCAGATAGGGGATTAGGGACCCACATAACACACAGTCTGGC 1566 CACmTCCATAGGGCTGCTGAATATGCTGGGGGTCCAATCCAGACCATAGTCACCTCA 1625 CATTTTTCAGTACCTGAAGATATCAACAGTGAAGGCTATGAAACAGTGAAGATGGGGAC 1684 CTGCCCCTGCCTCTGGACCTCTGTTCCAGAGAGGTACAACCTGTTGCCTCCGACATACA 1743 TGCAGGAGGTGGCTGGAGACCCGGTGGATATCCCTCCCACTGAGGAGAAGCAGCATCAG 1802 GGAATCAGGTGAAGAAACAGTCTGGCCACTTTTTGGTAGAGCAGCTGCTGCTTGCTGGG 1861 GTCTGCTACCACCCCCAGCAAAAAGAATGGCA'nTGCAAGAATGGCTAAGGCTGCTAAA 1920 CAGCAACAATGGCAACCTACCATTCCCTTTGGAÖCGCCATCCCAGGGATATTCGAAACT 1979 GCTGTCCACTAGAAAACAGTGGTGGAGGTGACTGGAGACCCCAGTGGAGAGTTTCACCT 2038 GGTGAAAAGAAACAGGATTTGGGATCGACATGAATAACCAATCTGACTGCTTGCCCGTA 2097 GAGCTGCTGGACTGTGCTGGGTGGCTGCTCCAGTCCCTAGCTGCCTTGGACTCCCGAGA 2156 ACCCAAÁGGCTCCAATAGCTAAGATTGTGAAAGAGCAAAGATGGCAGCCCACCCCCTGC 2215 CACAGGGAGCTCCATGTCAGGGAGGTATGAGGCTGCTACCAGTGTCTGGCTGGATTCCC 2274 AAGTCGAGTGGGTCTTACCCTGAGACAGGCCATGGAAGGTGGGCCTGTCATTGTCACTG 2333

   HU 205 779 Β

   CCCAGCGCCCTGGATGAAACCCCTTTCCTAGGGOTATGTATAGGGGTCTAGCGTCCTGC 2392 TTGGCIGGAGTTATAGCTTCTTTTGTGGGGAGGCCTGGGTATCTAAGGCTCCAGGGTAC 2451 CCATGCATGCGAGAGCGCTGCTCTGCTGAACCCTA CGTAGCCCTGCATGTGCAGACTAA 2510 ATGCCCTGGTAGAGTGGGTTCACrAGGAGATCTcCFGACCTGAGGATTGCAAAGATCTG 2569 TGGGAGAAGCTGTGGGTCCCCAGGGCTGCTCACTTACTCACCACTTCCCTGGCAGGAGA 2628 GGCrCCCCTGGCTCTGTGTCATCCTGGGGGGGCAGTTGTCCTGCCTTACTrTGCTTTAT 2687 TCTCCATGGGTCAAGTTGTnTCTTGAGTCTCAATG rGTGCACCTGGTmTTCAGTTG 2746 AAGGTGCTGTATTTACrTGCCCCTTCCATTrCTCTCCATGAGAGTGGCACACACTAGCA 2805 GGTTCCAGTCGGCCATCTTGCAACCCCTGAAAAvAATTTGTTTCCAGCTATAAGCCATT 2864 GAGAGAACCTGGAGTGGCATAAAAAGAATGCCTCGGGGGTTCATCCCACCCCAGCTCAG 2923 CTAGGCCAGCACCACCCTCGTTTCCCA ATG GTC CTA CTG CTT GTT CTA CTG 2974

   GTG GCCCTGCTG CTT TGC CAA TGT GGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC 3019

   TrrGACCTGCCTCAGAACCGTGGCCTACTTAGCAGGAACACCTTG 3064

   GCATTCTGGGCCAAATGCAGAATCTCCACTTTCTTGTGTCTCAAG 3109

   GACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCTGGAGATGTGGATGGCAGTC 3154

   ATTTGCAGA AGGCCCAGG CTG TGT CTG TCC TCC ATG AGATGCTTC 3199

   AGCAGATCTTCAGCCTCTTCCCCACAGAGCGCTCCTCTGCTGCCT 3244

   GGAACATGACCCTCCTGGACCAGCTCCACACTGGATTTCATCAGCAGCTCGAATAG 3300

   CCrGGAGTCITGCTTAGGGCAGGCAACAGGAGAGGAAGAATCTGTGGGGGTGATrGGGA 3359 CCCTACACrGGCCTrGAGGAGGTACTTCCAGGGAATCCATGGGAATCCAGAGAATCTAC 3418. CTGAAAGAGAAGAAATACAGTGACTGTGCTTAGGAGGTTGTCAGAATGGAATCATGAAA 3477 TCCrTCTCTTCATCAACAGACTTGCAAGGACTGAGAAGTAAGGATGAAGACCTGGGGTC 3536 TGCTITACTCTnCTrATnTCITCCTCTTCCTTACTATGTGTTTAITTCTrCTTTTTC 3595

   TAGTTCCrTAACTTGTAAGTAGTTCACTTGGTTTGAGGTCTTrCTTCTmTTAATATA 3654

   AGCTT 3659 szekvenciája míerferon-pszeudo-omega-4 gén előállítására, azzaljellemezve, hogy a műveteket a megfelelő anyagokból kiindulva végezzük el. (Elsőbbsége: 1985.0731.)
8. 11. Eljárás pBR322 plazmidból származó, interferon-omega-1 kifejezésére szolgáló expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezye, hogy a pBR322 plazmidba az eredeti plazmidra jellemző rövidebb EcoRI/Baml-fragmentum helyett a

   EcoRI Sau3A qaattcacgctGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA 59 mRNA-Start Met accagttaactagtacacaagttcacggcaacggtaaggaggtttaagcttaaag atg 116

   RBS HindIH

   Cys Asp

   TGTGATC-IEN-omega-Gen ->

   Sau3A szerkezetűDNS szekvenciát inszertáljuk. (Elsőbbsé-
9. 12. A11. igénypont szerinti eljárás a pRHW12expge: 1985.02.14.) resszíós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a

   TGTGATCTGCCTCAGAACCAT GGC CTA CTT AGCAGG AAC ACCTTG 28

   NCOI

   GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73

   AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118

   AGCCAGTTGCAGAAGGCCCATGTCATGTCTGTCCTCCATGAGATG 163

   CTGCAGCAGATCTTCAGCCTCTTCCACACA GAG GCGC TCC TCT GCT 208

   GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253

   CAGCAACTGCAACACCTGGAGACCTGCTTGCTG CAGGTAGTGGGA 298

   GAAGGAGAATCTGCT GGG GCA ATT AGC AGCCCT GCA CTG ACCTTG 343

   AGGAGGTACTTCCAGGGAATCCGTGTCTACCTGAAAGAGAAGAAA 388

   TACAGCGACTGTGCCTGGGAAGTTGTCAGAATGGAAATCATGAAA 433

   TCCTTGTTCTTATCAACAAAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478

   GAT AGAGAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530

   HU 205779 Β

   TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589

   AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648

   AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATmTACTCATITAT 707

   TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766

   TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802

   Alul képletű interferon-omega gént tartalmazó DNS
10. 13. A 11. igénypont szerinti eljárás a pRHWIl expszekvenciát inszertáljuk a pBR322 plazmidba. (El- ressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy sőbbsége: 1985.02.14.)

    TGTGATVTGCCTCAGAACCATGGCCTA CTT AGCAGGAACACCTTG 28

    Ncol

    GTGCTTCTGCACCAAATGAGGAGAATCTCCCCTTTCTTGTGTCTC 73

    AAGGACAGAAGAGAC TTC AGG TTC CCC CAG GAGATGGTAAAAGGG 118

    AGC CAG TTGCAGAAG GCC CAT GTCATGTCT GTC CTC CAT GAG ATG 163

    CTG CAG CAG ATC TTCAGC CTC TTC CAC ACA GAG GCGC TCC TCT GCT 208

    GCCTGGAACATGACCCTCCTAGAC CAA CTC CACACTGGACTTCAT 253

    CAGCAACTGCAACACCTGGAGACCTGCTTGCTGCAGGTAGTGGGA 298

    GAAGGA GAA TCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCTGCACTGACCTTG 343

    AGG AGGTAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388

    TACAGCGACTGTGCCTGGGAAGTTGTCAGAATGGAAATCATGAAA 433

    TCCTTGTTCTTATCAACAAACATGCAAGAAAGACTGAGAAGTAAA 478

    GATAGAGACCTGGGCTCATCTTGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530

    TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCnTAATCAC 589

    AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648

    AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707

    TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 .

    TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802

    Alul képletű interferon-omega gént inszertáljuk a pBR322 plazmidba. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
11. 14. Eljárás a pBR 322 plazmidból származó pRHWIO plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pER103 plazmidba (DSM 2773) aHindlUhasítási helyre a

    Hindin Sai3A Ncol aAGCTTAAAG ATGTGTGATCTGCCTCAGAACCATGGCCTACTTAGCAGGA 50

    ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100

    CTCAAGGACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCAGGAGATGGTAAÁAGGGAG 150

    CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200

    AGATCACACÁ TCTTTAagctt Sau3A HindlII képletű DNS-fragmentumot inszertáljuk és az így kapott plazmidot replikációra E.col i HB 101 -be transzformáljuk, és szaporítjuk. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
12. 15. Eljárás a pRHW 12 expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pRHWIO plazmid BamHI-gyel végzett restrikciós endonukleázos emésztésével, a hasítási helyeknek a DNS-polimeráz I Klenow-fragmense és a 4 dezoxinukleozid-trifoszfát segítségével végzett feltöltésével, valamint ezt követően Ncol-gyel végzett hasításával kapott nagyobbik fragmensbe, amely a pER103 plazmid (DSM 27773) Hindffl hasítási helyén a

    Hindin Saí3A Ncol aAGCTTAAAGATGTGTGATCTGCCTCAGAACCATGGCCTACTTAGCAGGA 50

    ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100

    CTCAAGGACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCAGGAGATGGTAAAAGGGAG 150

    CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200

    AGATCACACA TCTTTAagct t

    Sau3A Hindin

    HU 205779 Β képletű DNS-fragmenst tartalmazza, ligáz reakció- túrnának Ncol-gyel és Alul-gyél végzett emésztésével ValbeépítjükaP9A2klón (DSM 3004) Avall-fragmen- kapott cCATGGCCTACTTAGCAGGAACACCTTG 28

    Ncol

    GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73

    AAGGACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCAG GAG ATGGTAAAAGGG 118

    AGCCAGTTGCAGAAGGCC CAT GTCATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163

    CTGCAGCAGATCTTCAGCCTCTTCCACACAGAGCGCTCCTCTGCT 208

    GCCTGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253

    CAG CAACTG GAACAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTAGTG GGA 298

    GAAGGAGAATCTGTCGGGGCAATTAGCAGCCCTGCACTGACCTTG 343

    AGGAGGTACTTCCAGGGAATCCGTGTCTACCTGAAAGAGAAGAAA 388

    TACAGCGACTGTGCCTGGGAAGTTGTCAGAATGGAAATCATGAAA 433

    TCCTTGTTCTTATCAACAAACATGCAAGAAAGACTGAGAAGTAAA 478

    GATAGAGACCTGGGCTCATCTTGAAATGATTCTCATTGAITAATTTGCCATA 530

    TAACACrrGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAANGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589

    AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAVTACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGITA 648

    AAAAGACrrAGGITCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTrATmTACTCATTTAT 707

    TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766.

    TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802

    Alul képletű fragmentumot, és az így kapott plazmidot replifcációra E.coliHB I01-be transzformáljuk, és szaporítjuk. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
13. 16. Eljárás a pRHW 11 expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pRHW 10 plazmid BamHI-gyel végzett restrikciós endonukleázos emésztésével, a hasítási helyeknek a DNS-plimerázIKlenowfragmense és a 4 dezoxinuklozid-trifoszfátsegítségével végzett feltöltésével, valamint ezt követően Ncol-gyel végzett hasításával kapott nagyobbik fragmensbe, amely a pER103 plazmid (DSM 2773) HindUI hasítási helyén a

    HindUI Sau3A Ncol aAGCTTAAAG ATGTGTGATCTGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA ACACCTTGGTGCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCCTTTCTTGTGT CTCAAGGACAGAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG CCAGTTGCAGAAGGCCCATGTCATGTCTGTCCTCCATGAGATGCTGCAGC AGATCACACA TCTTTAagctt

    Sau3A Hindin

    100

    150

    200 képietőDNS-fragmentumottartalmazza, ligáz reak- fragmentumának Ncol-gyel végzett emésztésével kacióval 'beépítjük az E76E9 (DSM 3003) klón AvaU- pott cCATGÖCCTACTTAGCAGGAACACCTTG 28

    Ncol

    GTGCTTCTGCACCAAATGAGGAGAATCTCCCCTTTCTTGTGTCTC 73

    AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTAAAAGGG 118

    AGCCAGTTGCAGAAGGCCCATGTCATGTCTGTCCTCCATGAGATG 163

    CTGCAGCAGATCTTCAGCCTCTTCCACACAGAGCGCTCCTCTGCT 208

    GCCTGGAACATG ACCCTCCTAGACCAA CTCCAC ACT GGA CTT CAT 253

    CAGCAACTGCAACACCTGGAGACCTGCTTGCTGCAGGTAGTGGGA 298

    GAAGGA GAATCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343

    AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388

    TACAGCGACTGTGCCTGGGAAGTTGTC AGAATG GAAATC ATGAAA 433

    TCCTTGTTCTTATCAACAAACATGCAAGAAAGACTGAGAAGTAAA 478

    GATAGAGACCTGGGCTCATCTTGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530

    TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTGGGCTTTAATCAC 589

    AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTrA 648

    AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTAmTTACTCATTTAT 707

    HU 205779 Β 2

    TTATTCITACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTrGCC 766

    TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802

    Alul képletű Fragmentumot, és az így kapott plazmidot replikációraE.collHB 101-be transzformáljuk, és szaporítjuk. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
14. 17. Eljárás expressziós vektor előállítására, amely valamely az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-molekulát egy mikroorganizmusokban vagy emlős sejtekben replikálható plazmidba építjük be. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
15. 18. A17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekulát egy prokarlótákban vagy ekuariótákban replikálható plazmidba építjük be. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
16. 19. Eljárás transzformáit gazdaszervezel előállítására, amely valamely az 1 -10. igénypontok bármelyike 20 szerint előállított DNS-molekula által kódolt genetikai információ kifejezésére képes, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő gazdaszervezetet, valamely az 1-10. igéynpontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmazó, a gazdaszervezetben replikálódó plazmiddal 25 transzformálunk. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
17. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás transzformált gazdaszervet előállítására, azzal jellemezve, hogy E.colit vagy egy emlős Sejtvonalat transzformálunk. (Elsőbbsége: 1984.08.01.) 30
18. 21. A19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy EcoliHB 101 -et transzformálunk. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
19. 22. A19. igénypont szerinti eljárás, azzal jeli emezve, hogyE.coliHB 101-etapRHW 12vagyapRHWll expressziós plazmiddal transzformálunk. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
20. 23. A19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez10 ve, hogy a transzformációt egy az expresszióhoz szükséges replikon- és kontrollszekvenciákat is tartalmazó plazmiddal végezzük. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
21. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformációt a pER 103 plazmid (DSM

    15 2773) replikon- és kontrollszekvenciáit tartalmazó plazmiddal végezzük. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
22. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy EcoliHB 101-eta 11-13. igénypontokbármelyike szerint előállított plazmiddal transzformálunk, (Elsőbbsége: 1985.02.14.)
23. 26. Eljárás humán I típusú interferon proteinek előállítására, emyleket valamely az 1-10 igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula kódol, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdaszervezetet az 1—10. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-molekula által kódolt genetikai információt hordozó expressziós plazmiddal transzformálunk, az információt a gazdaszervezettel kifejeztetjük, és a termelt polipeptidet kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
24. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kifejezést a 19-25. igénypontok valamelyike szerint előállított gazdaszervezettel végeztetjük. (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
25. 28. A 26. iugénypont szerinti eljárás a

    5 10 15 Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leü 20 25 30 Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu CysLeu 35 40 45 Ser Gin Leu Gin Lys Alá His Val Met Ser Val Leu His Glu Met 65 70 75 Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Alá 80 85 90 Alá Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu HisThrGlyLeuHis 95 100 105 Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Gly 110 115 120 Glu Gly Glu Ser Alá Gly Alá Ile Ser Ser Pro Alá Leu Thr Leu 125 130 135 Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys 140 145 150 Tyr Ser Asp Cys Alá Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys 155 160 165 Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys 170 Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser

    HU 205779 Β aminosavszekvenciájú vagy a 111. helyzetben glicin helyettglutaminsavat tartalmazó interferon vagy ezeknek a 78. helyzetű aszparagin N-gllkozilezett származékai vagy azN-terminálison a

    Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val 5 Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly aminosavszekvenciájú vezérpeptidet is tartalmazó származékaik előállítására, azzal jellemezve, hogy a kifejezést a 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárással előállított expressziós plazmiddal vagy a 6. igénypont 10 szerint előállított DNS-molekulát tartalmazó expreszsziós plazmiddal transzformált gazdaszervezettel végeztetjük (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
26. 29. A 26. igénypontszerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kifejezést a 11„ 12. vagy 13. igénypontok 15 bármelyike szerint előállított plazmiddal transzformáit E.coli HB 101-gyel végeztetjük (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
27. 30. Eljárás hatóanyagként humán I típusú interferon proteineket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzaljellemezve, hogya 26-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított hatóanyagot a gyógyszertechnológiában szokásos hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal keverve gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk (Elsőbbsége: 1984.08.01.)
28. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorellenes vagy vírusellenes kezelésre alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő. (Elsőbbsége: 1985.02.14.)