BG60445B2 - Нови генетични последователности,кодиращи интерферонови пептиди от тип i,и продуциращите ги организми - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до интерферони от тип i, както и до рекомбинантните методи за получаване натези пептиди, а също така и до различни генетичнипоследователности, рекомбинантни днк-молекули, средства за експресия и организми-гостоприемници.

Description

Предмет на настоящото изобретение са нови интерферони от тип I, както и рекомбинантни ДНК-методи за получаване на тези пептиди и продукти, които са необходими при този процес, например генни последователности, рекомбинантни ДНК-молекули , средства за експресия и организми.

Интерферон е понятие, което се употребява за описание на избрани протеини, които са ендогенни за човешките клетки и които се характеризират с това, че проявяват отчасти припокриващи се и отчасти раздалечаващи се биологични активности. Тези протеини видоизменят цялостния имунен отговор и се приема, че допринасят за значителна защита срещу вирусни заболявания.

Интерфероните се разделят примерно на три класа , а именно на алфа, бета , и гама интерферони. От бета и гама интерфероните в човешкия организъм е познат досега само един субтип (np.S. Ohno et al.,Proc. Natl. Acad.Sci. 78. 5305- 5309 (1981) ; Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982); Taya et al., EMBO Journal 1/8, 953-958 (1982). Обратно на това от алфа интерфероните са описани различни субтипове (Phil. Trans. R. Soc. Lond. , 299, 7-28 (1982)). Зрелите алфа интерферони се различават при това помежду си с максимално 23% дивергенция и са дълги около 166 аминокиселини. Забележително е освен това едно съобщение за алфа интерферон , имащ изненадващо високо молекулно тегло (26 000, определено чрез натриев додецилсулфат полиакриламид гел електрофореза / SDS-PAGE/ (Goren, Р. et al. Virology 130, 273-280 (1983).Този интерферон е наречен Интерферон алфа 26 К. За него е констатирано, че той проявява досега най-високата специфична антивирусна и антиклетъчна активност.

Познатите интерферони, действуващи при различните заболявания, показват обаче незначително или даже съвсем никакво действие при много други болести ( Powledge, Bio/Technology, March 1984, 215-228 'Interferon On Trial'). Интерфероните проявяват при това странични действия. Например при изпитване на антираковото действие на рекомбинантен οό -интерферон е установено, че дози от около 50 млн. единици, които след изследвания във фаза 1 се приемат за сигурни, предизвикват акутни вирусни състояния , болки в ставите, водещи до неработоспособност, много силна умора, безапетитие и загуба на ориентационна способност, епилептични пристъпи и чернодробна интоксикация. През 1982 г. френското правителство забранява опитите с интерферон0^., заради пациенти болни от рак, които третирани с него са претърпяли смъртоносни сърдечни пристъпи. За два смъртоносни сърдечни пристъпи е съобщено и при краткотрайно проведени опити в Америка. При това става ясно, че най-малко една част от страничните явления, като напр. треската и неразположението са в непосредствена взаимозависимост със самата интерферонова молекула и не могат да се припишат на онечиствания.

ό

Задачата на настоящото изследване е да се намерят и ПРОИЗВЕДАТ ТАкИВА НОВИ СУбСТАНЦИИ, които ДА СА с близкл НА ИНТЕРфЕРОНА МОЛЕкУЛА, НО С НАМАЛЕНИ СТРАНИЧНИ ЕфЕкТИ.

Настоящото изобретение засяга следователно определени нови интерферони от Тип I, които могат да съдържат водещ пептид и техните N-гликозилирани деривати ( тук означени като омегаинтерферон или интерферон-омега), които съдържат 168 до 174 ( предимно 172) аминокиселини и показват дивергенция от 30 - 50% ( предимно 40 - 48%) спрямо досега познатите субтипове на^^, интерферона и една дивергенция от приблизително 70% спрямо β интерферона.От една страна те показват сходно действие с обинтерфероните, а от друга - не притежават много терапевтични недостатъци на тези познати субстанции.

Предмет на настоящото изобретение са както нови интерферони в напълно чиста форма, техните негликозилирани и гликозилирани форми, кодиращите ги генни последователности (секвенции), както и рекомбинантни молекули, съдържащи тези последователности. Предмет на изобретението по-нататък са средства за експресия, като плазмидите, съдържащи гореспоменатите последователност^ както и различни организми гостоприемници, като микроорганизми или тъканни култури , които подпомагат произвеждането на новите интерферони по време на ферментацията или тъканното култивиране.

Предмет с предимство на това изобретение са омегаинтерфероните, както и съответните генни последователности на следната формула:

5

10

15

5

Cys

Asp

Leu

Pro

Gin

Asn

His

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Asn

Thr

Leu

TGT

GAT

CTG

CCT

CAG

AAC

CAT

GGC

CTA

CTT

AGC

AGG

AAC

ACC

TTG

20

25

30

10

Vai

Leu

Leu

His

Gin

Met

Arg

Arg

lie

Ser

Pro

Phe

Leu

Cys

Leu

GTG

CTT

CTG

. CAC

CAA

ATG

AGG

AGA

ATC

TCC

CCT

TTC

TTG

TGT

CTC

35

40

45

Lys

Asp

Arg

Arg

Asp

Phe

Arg

Phe

Pro

Gin

Glu

Met

Vai

Lys

Gly

15

AAG

GAC

AGA

AGA

GAC

TTC

AGG

TTC

CCC

CAG

GAG

ATG

GTA

AAA

GGG

50

•

55

60

Ser

Gin

Leu

Gin

Lys

Ala

His

Vai

Met

Ser

Vai

Leu

His

Glu

Met

20

AGC

CAG

TTG

CAG

AAG

GCC

CAT

GTC

ATG

TCT

GTC

CTC

CAT

GAG

ATG

65

•

70

75

Leu

Gin

Gin

lie

Phe

Ser

Leu

Phe

His

Thr

Glu

Arg

Ser

Ser

Ala

25

CTG

CAG

CAG

ATC

TTC

AGC

CTC

TTC

CAC

ACA

GAG

CGC

TCC

TCT

GCT

80

85

90

Ala

Trp

Asn

Met

Thr

Leu

Leu

Asp

Gin

Leu

His

Thr

Gly

Leu

His

GCC

TGG

AAC

ATG

ACC

CTC

CTA

GAC

CAA

CTC

CAC

ACT

GGA

CTT

CAT

30

95

100

105

Gin

Gin

Leu

Gin

His

Leu

Glu

Thr

Cys

Leu

Leu

Gin

Vai

Vai

Gly

CAG

CAA

CTG

CAA

CAC

CTG

GAG

ACC

TGC

TTG

CTG

CAG

GTA

GTG

GGA

35

.--

110

115

120

Glu

Gly

Glu

Ser

Ala

Gly

Ala

He

Ser

Ser

Pro

Ala

Leu

Thr

Leu

GAA

GGA

GAA

TCT

GCT

GGG

GCA

ATT

AGC

AGC

CCT

GCA

CTG

ACC

TTG

40

125

130

135

Arg

Arg

Tyr

Phe

Gin

Gly

He

Arg

Vai

Tyr

Leu

Lys

Glu

Lys

Lys

AGG

AGG

TAC

TTC

CAG

GGA

ATC

CGT

GTC

TAC

CTG

AAA

GAG

AAG

AAA

140

145

150

45

Tyr

Ser

Asp

Cys

Ala

Trp

Glu

Vai

Vai

Arg

Met

Glu

lie

Met

Lys

TAC

AGC

GAC

TGT

GCC

^?GG

GAA

GTT

GTC

AGA

ATG

GAA

ATC

ATG

AAA

155

•

160

165

50

Ser

Leu

Phe

Leu

Ser

Thr

Asn

Met

Gin

Glu

Arg

Leu

Arg.

Ser

Lys

TCC

TTG

TTC

TTA

tca'

ACA

AAC;

ATG

CAA

GAA

AGA

CTG

AGA

AGT

AAA

170

•

-

55

Asp

Arg

Asp

Leu

Gly

Ser

Ser

-

GAT

AGA

GAC

CTG

GGC

TCA

TCT

В позиция 111 секвенцията GGG ( кодираща Gly) може да се замести с GAG ( кодираща Glu). Предпочитаните молекули съдържат също така деривати, които при аминокиселина 78 са Nгликозилирани. Например двата споменати омега- интерферони съдържат водещ пептид с формулата

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Vai Met Thr Ser Tyr Ser Pro Vai Gly Ser Leu Gly

Легенда към изображенията:

Фигура 1:	Рестрикционна карта на клон Е76Е9;
Фигура 2:	Рестрикционна карта на клон Р9А2',
Фигура 3:	DNA- последователност на клон Р9А2'
Фигура 4:	DNA-последователност на клон Е76Е9;
Фигура 5:	Геномен Southern blot анализ при използуване на

клон Р9А2 като сонда;

Фигура 6:	Конструкция на експресионния клон pRHW12 ·
Фигура 7:	Аминокиселинни и нуклеотидни разлики между

интерфероните от тип I·

Фигура 8 а: Изброяване на единичните нуклеотидни позиции на гена за интерферон- А ·

Фигура 8 Ь: Изброяване на единичните нуклеотидни позиции на гена за интерферон-омега·,

Фигура 8 с: Изброяване на единичните нуклеотидни позиции на гена за интерферон- D-

Фигура 9:

Схематично представяне на синтеза на специфични

сонди за подтиповете на интерферона^

Фигура 10: Документиране на специфични м РНК за подтипове на интерферона*

Фигура 11:

ДНК-последователност на гена за интерферон -

омега 1;

Фигура 12: ДНК-последователност на гена за интерферонпсевдо-омега 2^

Фигура 13: ДНК-последователност на гена за интерферонпсевдо-омега 3;

Фигура 14: ДНК-последователност на гена за интерферонпсевдо-омега 4;

Фигура 15: Коригирано изброяване на последователностите на гена за интерферон-омега;

Фигура 16: Хомоложност на сигналните последователности*

Фигура 17: Хомоложност на зрелите протеинови последователности;

Фигура 18: Хомоложност на 4 ДНК последователности заедно,

Съгласно изобретението, новите омега интерферони и техните кодиращи ДНК-последователности ( секвенции) се получават както следва:

Човешка В-лимфомна клетъчна линия ( пр. Namalwaклетки)(вж. G.Klein et al.,Int.J.Cancer 10, 44 ( 1972), се предизвиква за едновременно произвеждане на аб-и/З-интерферон чрез третиране с вирус, пр. Sendai вирус.Изолираната от стимулираните Namalwa клетки мРНК може да служи като матрица за синтез на кДНК. За да се повиши използуването на интерферон-специфичните секвенции при процеса, мРНК-препаратът се разделя чрез захарозни градиенти, отговарящи на различните дължини на отделните РНК -молекули. Изгодно е да се съберат мРНК с обхват 12 S ( приблизително 800-1000 бази дължина на м РНК). В този обхват се утаяват специфичните за<* и/1-интерферони м РНК. м РНК от този обхват се концентрират чрез преципитация и ресзтваряне във вода. Приготвянето на кДНК-библиотека следва в основата си известните от литературата методи ( E.Dworkin-Rastl,

Μ.B. Dworkin and P.Swetly, J. of Interferon Research 2/4, 575-585 (1982)). Към мРНК се прибавя зачатък от олиго-dT ( primer). Най-накрая, чрез прибавяне на дезоксинуклеотидтрифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) и ензима обратна транскриптаза в един съответно буфериран разтвор се синтезира кДНК за един час при 45° С. Хибрида кДНК/мРНК се пречиства чрез екстракция с хлороформ и хроматография през колона с гел ( напр. Sephadex G 50). РНК се хидролизира чрез алкално третиране (0,3 Mol NaOH, 50° С, 1час) и кДНК след неутрализиране с кисел разтвор на натриев ацетат се преципитира с етанол. След прибавяне на четирите дезоксинуклеозидтрифосфати и ДНК-полимераза I от E.coli в съответен разтвор се провежда синтеза на двойната верига, където кДНК служи като матрица и зачатък чрез вилкообразуване при 3' края си (6 часа, 15° С) (Eftratiadis et al.,Cell 7,279 (1976)). След фенолна екстракция, хроматография през Sephadex G 50 и преципитация с етанол, ДНК в подходящ разтвор се третира със специфична за единични вериги ендонуклеаза SI. При това се разграждат вилкообразните структури, както и недвойноверижните кДНК. След екстракция с хлороформ и преципитация с етанол, двойноверижната ДНК ( dsDNA ) се разделя по големина върху захарен градиент. За следващата стъпка на клонирането се предпочита само dsDNA с големина 600 чифта бази (Ьр) или повече, за да се засили вероятността да се получат само клонове, които имат пълната кодираща секвенция за новите интерферони. Двойноверижната ДНК с дължина по-голяма от 600 Ьр се концентрира от градиентите чрез преципитация и разтваряне във вода. За да се увеличат получените двойноверижни ДНК-молекули, те след това трябва да се вмъкнат в съответен вектор и накрая в бактерия E.coli. Използуваният вектор е предимно плазмидпг pBR322 (F.Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977). Този плазмид се състои основно от един репликон и два селективни маркера. Те придават на гостоприемника резистентност срещу антибиотиците ампицилин и тетрациклин (Ap^h ,Тс ^). Генът за р -лактамаза (Ар ) съдържа разпознаваща секвенция за рестрикционната ендонуклеаза PstI. pBR322 може да къса веригата с PstI. Висящите 3' краища се удължават чрез ензима дезоксинуклеотид-трансфераза (TdT) при прилагането на dGTP в съответно буфериран разтвор. Същевременно двойноверижната ДНК също така се удължава с прилагане на dCTP откъм 3' края. Хомополимерите от плазмида и dsДHK са комплементарни и хибридизират , като плазмидната ДНК и ds ДНК са смесени в съответствуващи концентрации и при благоприятни солеви, буферни и температурни условия ( T.Nelson et al., Methods in Enzymology 68, 41-50 (1980).

E.coli от щам HB 101 ( генотип F^:, hsdS20, (r-B,m-B) recA13, ara14, pro-A2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-1, supE44, lambda-) се приготвя за приемане на рекомбинантната вектор^ДНК молекула чрез измиване с разтвор на СаС12. Компетентните E.coli НВ 101 се смесват с ДНК и след инкубация при 0”С така получения плазмид-ДНК се трансформира с термичен шок при 42* С за 2 минути ( M.Dagert et al.,Gene 6,23-28 (1979)). Накрая трансформираните бактерии се посяват върху тетрациклинсъдържащи агарови блюда (10 мкг/мл). Върху този агар могат да растат само E.coli НВ 101, които са приели вектор или рекомбинантна векторна молекула (Тсг). Рекомбинантните векторДНК-молекули придават на гостоприемника генотип Ар^ ТсГ тъй като чрез набавянето на двойноверижна ДНК в бета-лактамазния ген, информацията за бета-лактамаза е разрушена. Клоновете се пренасят върху агарови петрита, които съдържат 50 мкг/мл ампицилин. Порастват само 3%, което означава, че 97% от клоновете съдържат инсерцията на една ds ДНК молекула. Изхождайки от 0,5 мкг ds ДНК се получават повече от 30 000 клона. 28600 от тях се пренасят индивидуално върху гнезда в микротитрационни плаки, които съдържат хранителна среда, 10 мкг тетрациклин и глицерин. След като клоновете се развият, плаките се съхраняват при -70^вС ( кДНК библиотека).

За претърсване на кДНК-библиотеката за нови, съдържащи гени за интерферона клонове, последните се пренасят след размразяването им върху нитроцелулозни филтри. Тези филтри лежат върху тетрациклин-съдържащ агар. След израстването на бактериалните колонии, ДНК на бактериите се фиксира върху филтъра.

Като сонда служи предимно инсерта на клона pER33 (E.Rastl et al., Gene 21, 231-248 (1983) - вж. също и ЕР-А-0.115.613), който съдържа гена за интерферон -oC2-Arg. При накъсано превеждане (nick translation) този участък се маркира радиоактивно, при което се използува ДНК-полимераза I, dATP, dGTP, dTTP и 32P-dCTP. Нитроцелулозните филтри най-напред се обработват предварително за хибридизиране при меки, не строги условия, без прибавяне на радиоактивна сонда и после, след прибавяне на последната се хибридизират в продължение на 16 часа. След това филтрите се измиват при не-строги условия. Ниската строгост на хибридизацията и измиването позволява улавянето не само на интерферон-сС2-А^-клонове, но и на други интерферон-съдържащи клонове, чиито последователности могат да се различават значително от досега познатите оС -интерферони. След изсушаване филтрите се експонират върху рентгенов филм.Почерняване, което рязко се отличава от фона, показва наличието на клон с интерферон-специфични секвенции.

Тъй като радиоактивните сигнали са със различно качество, позитивните и съмнително позитивните клонове се отглеждат в малък мащаб. Плазмид-ДНК-молекулите се изолират,разграждат се с рестрикционна ендонуклеаза PstI и се разделят според молекулното тегло електрофоретично, върху агарозен гел.(В1гпЬо1т et al., Nucl.Acid. Res. 7, 1513 (1979)). ДНК от агарозния гел се пренася върху нитроцелулозен филтър по метода на Southern (E.M.Southern, J. Mol.Biol., 98, 503-517 (1975)).ДНК от тези филтри се хибридизира с радиоактивна, денатурирана сонда, съдържаща ген за интерферон. Като положителна контрола служи плазмид 1F7 ( депозиран в немската микробна колекция под номер DSM 2362), който съдържа гена за интерферон оС -2-Arg. Авторадиографията изяснява, че клона Е76Е9 и клона Р9А2 съдържат секвенция, която при не-строги условия се хибридизира с гена на интерферонх*2-А^. За да може двойноверижните ДНК-участъци на клоновете Е76Е9 и Р9А2 да се охарактеризират по-добре, техните плазмиди се произвеждат в голямо количество. ДНК се разгражда с различни рестрикционни ендонуклеази например с Alul, Sau3a, BgHI, Hinfl, PstI и Haelll. Възникналите фрагменти се разделят в агарозен гел. При сравнение със съответните маркери за големина се определя обемШГ на тези фрагменти. (Напр. се определя големината на фрагментите, коита се получават при разграждане на pBR322 с рестрикционна ендонуклеаза Hinfl или НаеЗ. При картиране по Smith и Birnstiel ( H.O.Smith et al., Nucl.Acid. Res. 3, 2387-2398 (1967)). се определя последователността на фрагментите. От така получените рестрикцион-ензимни карти (фиг.1 и 2 ) следва изненадващо, че при инсертите на клонове Е76Е9 и Р9А2 се касае за съдържание на досега непознати гени за интерферон, а именно за гени на омега-интерферон.

Тази информация за омега-интерфероните се използува за разграждане на кДНК участък с подходящи рестрикционни нуклеази. Получените фрагменти се лигират в двойноверижната (репликативна) форма на бактериофага М13 mp9 ( J.Messing et al., Gene 19, 269-276 (1982)) и се секвенират по дидеокси метода на Sanger ( F.Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467 (1967)).Едноверижната ДНК на рекомбинантния фаг се изолира. След свързване на един синтетичен олигомер, в четири различни посоки протича синтез на двойна верига с помощта на голям фрагмент ДНК-полимераза1 от E.coli (Klenow фрагмент ). Към всяка от четирите частични реакции се прибавя един от четирите дезоксирибонуклеотид-трифосфати ( ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Това води до статистически разделени прекъсвания на веригата на онова място, на което в матричната ДНК се намира комплементарната база на дадения дезоксирибонуклеотидтрифосфат.Освен това се употребява радиоактивно маркиран dATP. След завършване на синтеза продуктите се денатурират и едноверижните ДНК фрагменти се разделят по големина в денатуриран полиакриламиден гел (F.Sanger et al.,FEBS Letters 87, 107-111 (1978)). След това гелът се експонира върху рентгенов филм. От авторадиограмата се подбира ДНК-секвенцията на рекомбинантния фаг М13. Секвенциите на инсертите на различните рекомбинантни фаги се обработват с подходяща компютърна програма ( R.Staden, Nucl.Acid.Res. 10, 4731-4751 (1982)). Фиг. 1 и 2 показват стратегията на секвенирането.Фиг. 3 показва последователността на клона Р9А2, фиг. 4 - тази на клон Е76Е9. Некодираната ДНК-верига е показана в посока 5'—>3' заедно с производната аминокиселинна секвенция.

Изолираната кДНК на клон Е76Е9 за омега (О1и)-интерферон е дълга 858 чифта бази и съдържа една 3' непреведена област.

Областта, която кодира зрелия омега (Glu) интерферон се простира от нуклеотид 9 до нуклеотид 524. Изолираната к ДНК на клон Р9А2 за омега (Gly)-интерферон е дълга 877 чифта бази, от които за кодиране на зрелия омега-интерферон е достатъчна секвенцията от нуклеотид 8 до нуклеотид 523. 3'- нетранслираната област стига в случая с Р9А2 до сегмент поли-А. ДНК секвенциите, кодиращи зрели интерферони, се съдържат изцяло в клоновете Е76Е9 и Р9А2. Те започват в N-края с цистеин-аспарагинова киселина- левцин. Изненадващо двата омега-интерферони са дълги 172 аминокиселини, с което ясно се отклоняват от досега известните интерферони: напр. 166 (165) аминокиселини при<Х,интерфероните. Също така двата омега-интерферони имат по едно потенциално за N-гликозилиране място при аминокиселинна позиция 78 (аспарагин-метионин-треонин).

Сравнението на клонове Е76Е9 и Р9А2 показва една разлика. Кодиращиягтриплет за аминокиселина 111 в Е76Е9 е GAG и кодира глутаминова киселина, докато триплетаг в Р9А2 е GGG и кодира глицин. Двата омега-интерферон-протеини се различават по една аминокиселина и се обозначават като омега (О1и)-интерферон (Е76Е9)и омега (Gly)-интерферон (Р9А2) съответно.

Сравнението на двата омега -интерферони с досега познатите подтипове човешки алфа-интерферони дава следната картина.

омега алфа

Дължина на протеините в аминокиселини

172 166 (*)

Потенциални N-гликозилируеми 78 -(♦♦) места

*) Интерферон алфа-А се състои само от 165 аминокиселини **) Интерферон алфа-Н съдържа едно потенциално N гликозилируемо място при позиция 75 (D.Goeddel et al., Nature 290, 20-26 (1981)).

E.coli HB 101, c плазмид E76E9 и E.coli 101 c плазмид P9A2 са депозирани в германската микробна колекция (DSM- Гьотинген) под номер DSM 3003 , респ. DSM 3004 на 3 юли 1984 г.

За доказателство, че новоизобретените клонове продуцират интерферон-сходна активност, клон Е76Е9 примерно се култивира и лизата на бактериите се изпитва след растежа в плако-редуциращ тест. Бактериите произвеждат очакваната интерферон-сходна активност. (Вж. пример 3)

По-нататък за доказателство, че при новооткритите интерферони се касае за ново семейство такива, цялата ДНК от Namalwa клетките се изолира и се разгражда с различни рестрикционни ендонуклеази. Чрез това може да се прецени количеството на гените, които се кодират от кДНК на клоновете

Е76Е9 и Р9А2. При това ДНК-съдържащите фрагменти се разделят в агарозен гел по метода на Southern (E.;.Southern et al., J.Mol.Biol. 98, 503-517 (1975)), пренасят се върху нитроцелулозни филтри и при относително строги условия се хибридизират с радиоактивно-маркирана специфична ДНК за клон Р9А2.

Получените след хибиридизирането с ДНК , съдържаща плазмид Р9А2 и рЕИЗЗ^резултати са представени на фиг. 5а:

Тук има единични следи, указани с букви, които показват различните разградени ДНК сонди (Е =EcoRI, H=Hindlll, B=BamHI, S=Sphl, P=Pstl, C=Clal). Лявата половина на филтъра се хибридизира със сонда на ген от интерферон-алфа ('А'), а дясната с кДНК-инсерт на клона Р9А2 ('0'). Асортимента на лентите, които са хибридизирани със сонда от интерферон-алфа и с тази на новия интерферон е различен. Между двете различни сонди не може да се осъществи кръстосана хибридизация, ако съдим от съответните им следи.

На фиг. 5Ь са показани кДНК на клон Р9А2 и използувания за хибридизация фрагмент.

Показани са местата на действие на отделни рестрикционни ензими (P=Pstl, S=Sau3a, A=Alul). Сондите обхващат само два от възможните три PstI фрагмента. Хибридизираният образец показва само един хибридизиращ фрагмент с дължина приблизително 1300 чифта бази, който принадлежи на хомоложния ген. По-малкият

120 вр фрагмент е изтекъл от гела. Принадлежащата към 5'края на гена верига не може да се открие, защото сондата не съдържа тази област. Най-малко 6 различни вида вериги могат да се открият в тези следи от PstI. Това означава, че отделни други гени, които са родствени с новите последователности трябва да присъствуват в човешкия геном. Тъй като в тези гени са представени един или повече участъци, които се късат от PstI, то би lb могло да се очаква, че могат да се изолират най-малко три допълнителни гени.

Тез гени могат да се изолират предимно чрез хибридизиране от човешка генна библиотека, която се съдържа в плазмиден, фаген или козмиден вектор. (Вж фиг. 4е).

На това място трябва да се припомни, че съобразно изобретението, омега интерфероните не са само два зрели интерферона, които са описани поотделно, а всички модификации на тези полипептиди, които съдържат активността на интерферономега непроменена. Тези модификации включват например съкращения на молекулата от С и N края, смяна на аминокиселини с други остатъци, при които активността не се променя значително, химични или биохимични свързвания на молекулата към други молекули, които биват инертни или активни. Така наречените модификации могат например да касаят хибридни молекули с един или повече омега интерферони или такива със познати алфа и бета интерферони.

За да може да се съпоставят разликите в аминокиселинните и нуклеотидните последователности на новите интерферони, вкл. омега Glu и Gly интерфероните, по отношение на алфа и бета интерфероните, съответствуващите секвенции се разполагат по чифтове и се преброяват разликите в единичните позиции. ( С. Weiss;dk et al., Phil.Trans.R.Soc. London 299, 7-28 (1982); A.Ulrich et al., J.Mol.Biol. 156,467-486 (1982); T.Taniguchi et al., Proc.Nat.Acad.Sci 77,4003-4006 (1980); K.Tokodoro et al., EMBO J. 3, 669-670 (1984)).

От представените на фиг. 7 резултати следва, че ДНК секвенциите на клоновете Р9А2 и Е76Е9 са родствени със секвенциите на интерфероните от тип I ( алфа и бета интерфероните). От друга страна е представено, че разликата в аминокиселинните последователности между единични алфа 16 интерферони и новите секвенции е по-голяма от 41,6% и помалка от 47,0%. Разликите между новите секвенции, както и тези на единични алфа-интерферони и тези на бета-интерфероните са в повечето случаи около 70%. При разглеждане на резултатите от пример 4, при който е доказано наличието на цяла поредица родствени гени и при разглеждането на предложената номенклатура за интерферони (J.Vilcek et al., J.Gen. Vir. 65,669-670 (1984), се приема че инсертите на клонове Е76Е9 и Р9А2 кодират нов клас интерферони от тип1 , които се обозначават като омегаинтерферони.

По- нататък се доказва, че експресията на гена за интерферон омега е аналогична на тази на интерфероните от типТПри това са изпитани отделни членове на мултигенното семейство на алфа- и омега- интерфероните, базирайки се на SI картиращите методи (A.J.Berk et al., Cell 12, 721 (1977)) и е показано, че експресията на омега-1-мРНК е вирус-индуцируема. Тъй като транскриптите на такова генно семейство се различават по брой бази (около 1000), хибридизирането само не е достатъчно чувствителен признак за различаване на отделните м РНК на интерфероните.

Към това са представени м РНК последователностите от 9 алфа-интерферони, от интерферон-омега 1 и от бета-интерферон. С главни букви са указани тези бази, които са специфични за горните последователности. Тези специфични позиции се намират лесно с помощта на една тривиална компютърна програма. Една хибридизираща сонда, която произхожда от специфична позиция, може да се хибридизира перфектно само с м РНК на определен субтип. Всички останали мРНК не могат да се хибридизират на специфичното за субтипа място. Когато хибридизиращата сонда е радиоактивно маркирана на специфичния си 5' край, тогава само маркираните места, които са хибридизирани със сонда, конструирана специално за дадения субтип мРНК, остават защитени срещу разграждане със специфична за единични вериги нуклеаза (предимно SI нуклеаза).

Този принцип не се ограничава само за интерферона, той се прилага многократно за всяка група познати секвенции, които притежават описаните във фиг.8 специфични позиции.

Гореспоменатите специфични места в повечето случаи не са позиции за рестрикция (разкъсване), така че рязането на к ДНК с рестрикционни ендонуклеази не е годно за произвеждането на субтип-специфични хибридизиращи сонди. Затова използуваните в този пример сонди са удължени с радиоактивно маркиран (на 5' края ) олигонуклеозид, който е комплементарен за м РНК на интерферон-омега.

От фигура 10 произлиза, че се очаква омега-1-мРНК да е индуцируема в Namalwa и NC37 клетки.Предмет на изобретението затова са не само гениите последователности, специфично кодиращи омега-интерферони, но също така и модификации, които могат да се получат леко и рутинно чрез мут^ации, разграждане, транспозиция или допълване. Всяка последователност, която кодира тук описаните човешки омега-интерферони (т.е. има спектър на биологична активност какъвто е описан тук) и която дегенерира в сравнение с показаното, следователно се включва тук. Работещите в тази област са в състояние да дегенерират ДНКсеквенциите на кодиращите области. Тук спада също така всяка секвенция, която кодира полипептид със спектър на активност като този на омега-интерфероните и хибридизира с показаните секвенции ( или с част от тях) при строги условия на избирателност със повече от 85%, а за предпочитание с повече от 90% хомоложност.

lb

Хибридизациите се провеждат в 6 х SSC/5 х Denhardt разтвор / 0,1% SDS при 65^сС.Степента на строгост се определя в стъпката на миенето. За едно селекциониране върху ДНК секвенция със ок. 85% хомоложност условията са 0,2 х SSC/0,01% SDS,65^β С, а за хомоложност 90 % или повече - 0,1 х SSC/0,01% SDS/ 65^eC.

При изследването на една козмидна библиотека при тези условия ( 0,2 х SSC) се получават няколко хибридизирани със сонда на интерферон-омега 1 козмиди. Анализът на последователностите от така изолираните рестрикцион-ензимни фрагменти дава автентичния ген за интерферон омега 1 (вж фиг 11), както и три родствени . гени, обозначени като интерферон-псевдо-омега-2, интерферон-псевдо-омега-3 и интерферон-псевдо-омега-4. (вж фиг. 12-14). Те са по-нататъшен предмет на настоящото изобретение, както и кодираните от тях пептиди. Те са характеризирани в претенции 43-47.

Сравнението на ДНК дава кръгло 85% хомоложност спрямо интерферон-омега-1 гена.

По- нататък интерферон-омега-1 генът показва, че при транскрипция се получава м РНК, която съдържа информация за функционален интерферонен протеин, т.е. кодира се сигнален пептцд с формулата Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly, който е следван от зрелия, съдържащ 172 аминокиселини белтък на интерферон-омега.

Интерферон-омега гените могат при определени условия да бъдат вкарани във всеки организъм , което води до високи добиви. На специалистите са познати подходящи гостоприемници и вектори напр. указаните в ЕР-А-0.093.619.

Особено предпочитани за експресията са прокариотите. Напр. подходящ е щам 294 (АТСС No 31446) от Е. coli К12. Също така се използуват щамовете E.coli W 3110( F,Lambda,прототроф, АТСС

No 27325), бацили като Bacillus subtilis и други от

Enterobacteriaceae като Salmonella typhimurium , Serratia marcensens и различни псевдомонади.

Въобще плазмидите-вектори, които включват репликона и контролната секвенция и са съвместими с клетките на гостоприемника се употребяват въе взаимовръзка с този гостоприемник. Вектора носи обикновено освен репликационната позиция разпознаващи секвенции, които дават възможност трансформираните клетки да бъдат селекционирани фенотипно. Напр. E.coli обикновено се трансформира с pBR 322 - плазмид, който произхожда от вид Е. coli ( Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 съдържа гени за резистентност спрямо ампицилин и тетрациклин и стова предлага просто средство за идентификация на трансформираните клетки. pBR322 и другите плазмиди трябва освен това да съдържат промотори или да се модифицират така че да съдържат промотори, които да могат да се използуват от микробния организъм за експресия на неговите собствени протеини. Промоторите, които най-често се използуват при получаване на рекомбинантна ДНК включват бета-лактамаза (пеницилиназа) и лактозната промоторна система (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goedel et al., Nature 281, 544 (1979)) и триптофановата (trp) промоторна система (Goeddel et al., Nucl. Acids Res .,8, 4057 (1980); EP-A0.036.776). Докато изброените са най-често използуваните промотори, то има отгледани и се използуват също други микробни промотори. Генната последователност за интерферон омега може напр. да се постави под контрола на Leftwardпромотор за бактериофага Ламбда. Този промотор е един от особено добре познатите промотори, който може да бъде направляван. Направляването е възможно чрез ламбда-репресор, при когото са познати граничещите места за рестрикционно разграждане.

Един чувствителен на температура алел от този репресор може да се вмъкне във вектор, който съдържа пълна интерферон-омега секвенция. Ако температурата се повиши до 42 °C, репресора се инактивира промотора се запусква до максималната си концентрация. Количеството м РНК, която се продуцира при тези условия трябва да бъде достатъчно, зада се получи клетка, която между новите синтетични аминокиселини съдържа около 10% такива, които произхождат от PL -промотора. По този начин е възможно да се учреди клонова банка, в която функциониращата интерферон-омега последователност ще е разположена в съседство с мястото за свързване на рибозомата и на вариращи разстояния от ламбда-РЬ-промотора.Тези клонове след това се изпитват и се селекционират с най-висок добив. Експресията и транслацията на една секвенция за интерферон-омега може да протече също и под контрола на друга регулационна система, която може да служи като хомолог на организма в неговата нетрансформирана форма. Така например хромозомната ДНК на една лактозо-зависима E.coli съдържа лактозен или Lac-оперон, който чрез синтезиране на ензима бета-галактозидаза осигурява разграждането на лактозата.

Lac-контролните елементи могат да се получат от бактериофага Lambda-plac 5, който е инфекциозен за E.coli. LacоперонВГна фага може да се пренесе чрез трансдукция от същия вид бактерии. Регулационните системи, които се установяват емпирично, могат да произхождат от плазмидна ДНК, която е собствена за организма. Lac-промотор-операторната система може да се индуцира с IPTG.

Други промотор-операторни системи или части от тях, които могат да се използуват със същия успех са: арабинозен оператор, колхицин Е1-оператор, алкално фосфатазен оператор, триптофанов оператор, ксилоза-А-оператор, tac-промотор и др.

Освен прокариотни, могат да се използуват и еукариотни микроорганизми, като плесени - напр. Saccharomyces cerevisiae е най-използуваниягмежду еукариотните микроорганизми, при все че могат да се намерят и много други такива. За експресия в Saccharomyces cerevisiae се използуват обикновено плазмид YRp7 (Stinthcomb et al. „ Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141(1979); Tschumper et al.„ Gene 10,157 (1980)) и плазмид YEpl3 ( Bwach et al-., Gene 8, 121-133 (1979)). Плазмид YRp7 съдържа TRP1ген, който представлява селекциониращ белег за плесенен мутант , който не може да расте в триптофан-съдържаща среда - пр. АТСС No 44076.

Наличието на TRP-1 дефект като характеристика на генома на плесента-гостоприемник предоставя ефикасна помощ за доказване на трансформацията, тъй като може да се култивира без триптофан. Подобно при плазмид YEp 13 се съдържа плесенният ген LEU-2 , който може да се използува за допълване на един LEU-2отрицателен мутант. Подходящите промоторни последователности за плесенни вектори (Hitzeman et al., J.Biol.Chem. 255 2073(1980)) или други гликолитични ензими (Kawaski and Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) като енолаза, глицерин-алдехид-3-фосфатдехидрогеназа, хексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, фосфоглюкоизомераза, и глюкокиназа. Подходящите експресионни плазмиди могат при концентрирането да бъдат включени заедно с асоциираните към тези гени терминационни секвенции към 3'-края на експресионния вектор. Така може да се предвиди полиаденилирането и края (терминирането) на м РНК.

Други промотори, които имат предимство да контролират транскрипцията чрез условията на растеж са промоторните области на гена за алкохол-дехидрогеназа-2 , изоцитохром-6кисела фосфатаза, разграждащи ензими, които са свързани с азотния метаболизъм, по-горе споменатата глицерин-алдехид-3фосфатдехидрогеназа и ензимите, отговорни за преработката на малтоза и галактоза. Промоторите, които се регулират чрез локуси от типа Hefe-Mating (придружаваща плесен), напр. промоторите на гена BAR I, MF alpha-1, STE 2,STE 3, STE 5, могат при температурно-регулирани системи да се вмъкнат чрез използуване на температурно-зависими siv мутации (Rhine PhD Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979) , Herskovitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part 1 , 181-209 (1981), Ccld Spring Harbor Laboratory). Тези мутации повлияват експресията на почиващите Mating-тип касети на плесените и чрез това индиректно зависимите промотори от Mating-тип. Като цяло, подходящ е всеки плазмиден вектор, който съдържа плесенно-съвместим промотор, оригинални терминационни и репликационни секвенции.

Освен микроорганизмите, културите от многоклетъчни организми също са подходящи госториемници. По принцип, приложима е всяка една култура, независимо дали произхожда от безгръбначни или гръбначни животни. Все пак най-голям интерес представляват животинските клетки от гръбначни животни, тъй че размножаването им в тъканни култури в последните години е един рутинен метод (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson Editors (1973). Примери на такива използувани клетъчни линии са

- 23 VERO и He La- клетките, яйчникови клетки от златен хамстер (СНО), W138, ВНК, COS-7 и MDCK .Експресионните вектори за тези клетки съдържат обикновено репликационно място, промотор, който е локализиран преди гена, който ще се експресира, съвместно с необходимия участък за свързване с рибозомите, участък за PHK-splicing, полиаденилиран участък и завършващи транскрипцията (терминационни) последователности. При използуването на клетки от бозайници контролните функции върху експресионните вектори обикновено биват от вирусен материал. Напр. често използуваните промотори произлизат от полиомен аденовирус-2 и много често от Simianвирус 40 (SV 40) , Ранните и късни крайни промотори на SV 40 са особено използувани, тъй като лесно се получават от вируса като фрагмент, който съдържа и вирусния репликационен участък на SV 40 (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)).Също така по-големи или по-малки фрагменти от SV 40могат да се използуват при условие, че съдържат една приблизително 250 Ьр дълга секвенция, която е достатъчна от мястото на скъсване на Hind 111 до това на Bgl 1 във вирусното репликационно място. Освен това е възможно и често се препоръчва да се използуват промоторни или контролни секвенции, които нормално са свързани с желаните генни последователности, при положение че тези контролни секвенции са съвместими с клетъчната система на гостоприемника. Репликационно място може да се подсигури или екзогенно, чрез съответната векторна конструкция, напр. от SV 40 или друг вирусен източник (Polyoma, Adeno, VSV, PBV и др.) или чрез хромозомните репликационни механизми на гостоприемника. Ако вектораг се интегрира в хромозомата на гостоприемника, в повечето случаи това е достатъчно. Гените могат преимуществено да се 'примират' в експресионен плазмид pER103 (E.Rastl-Dworkin et al., Gene 21,

237-248 (1983) и ЕР-А-0.115-613 - приложено в DSM под номер DSM 2773 на 20. декември 1983), тъй като този вектор съдържа всички регулационни елементи, водещи до висока степен на експресията на клонирания ген. Съгласно изобретението в плазмид pBR322 собственият къс EcoRi/BamHl фрагмент се замества с ДНК последователност с формулата:

EcoRI Sau3a gaattcacgctGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTT GACTTTGCCTTCGCGA 59 мРНК СТАРТ

ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAA

Met

GGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116

RBS Hindlll

Cys Asp

TGT GAT C Интерферон-омега ген

Sau3a

За да се постигне целта на изобретението, това, съгласно фиг.6 се провежда така:

I. Получаване на необходимите единични ДНК-фрагменти: Фрагмент а:

За получаване на фрагмент а), плазмид, съдържащ ген за интерферон омега напр. Р9А2,. се смила с рестрикционна ендонуклеаза Avail. След хроматография и пречистване на получените к ДНК -инсерти, последните се обработват двукратно с рестрикционните ендонуклеази

Ncol nAlul и се изолират чрез хроматография и елсктроелюиране. Този фрагмент съдържа наи-голямата част от съответния ген за омега интерферон. Така OMera-(Gly)интерферон генът на клон Р9А2 показва следната структура:

20

c

His Gly 1 CAT GGC ... Ncol

Leu CTA

Leu CTT 25

Ser AGC

Arg AGG

Asn AAC

Thr ACC

Leu

TTG 30

28

Vai

Leu

Leu

His

Gin

Met

Arg

Arg

lie

Ser

Pro

Phe

Leu

Cys

Leu

GTG

CTT

CTG

CAC

CAA

ATG

AGG

AGA

ATC

TCC

CCT

TTC.

TTG

TGT

CTC

73

35

40

45

Lys

Asp

Arg

Arg

Asp

Phe

Arg

Phe

Pro

Gin

Glu

Met

Vai

Lys

Gly

AAG

GAC

AGA

AGA

GAC

TTC

AGG

TTC

CCC

CAG

GAG

ATG

GTA

AAA

GGG

118

50

55

60

Ser

Gin

Leu

Gin

Lys

Ala

His

Vai

Met

Ser

Vai'

Leu

His

Glu

Met

AGC

CAG

TTG

CAG

AAG

GCC

CAT

GTC

ATG

TCT

GTC

CTC

CAT

GAG

ATG

163

65

70

75

Leu

Gin

Gin

He

Phe

Ser

Leu

Phe

His

Thr

Glu

Arg

Ser

Ser

Ala

CTG

CAG

CAG

ATC

TTC

AGC

CTC

TTC

CAC

AC A

GAG

CGC

TCC

TCT

GCT

208

80

85

90

Ala

Trp

Asn

Met

Thr

Leu

Leu

Asp

Gin

Leu

His

Thr

Gly

Leu

His

GCC

TGG

AAC

ATG

ACC

CTC

CTA

GAC

CAA

CTC

CAC

ACT

GGA

CTT

CAT

253

95

*

100

105

Gin

Gin

Leu

Gin

His

Leu

Glu

Thr

Cys

Leu

Leu

Gin

Vai

Vai

Gly

CAG

CAA

CTG

CAA

CAC

CTG

GAG

ACC

TGC

TTG

CTG

CAG

GTA

GTG

GGA

298

Glu

Gly

G1U

110 Ser Ala

Gly

Ala

lie

Ser

115 Ser

Pro Ala

Leu Thr

120 Leu

GAA

GGA

GAA

TCT

GCT

GGG

GCA

ATT

AGC

AGC

CCT

GCA

CTG

ACC

TTG

343

125.

130

135

Arg

Arg

Tyr

Phe

Gin

Gly

He

Arg

Vai

Tyr

Leu

Lys

Glu

Lys

Lys

AGG

AGG

TAC

TTC

CAG

GGA

ATC

CGT

GTC

TAC

CTG

AAA

GAG

AAG

AAA

388

140

145

150

Tyr

Ser

Asp

Cys

Ala

Trp

Glu

Vai

Vai

Arg

Met

Glu

He

Met

Lys

TAC

AGC

GAC

TGT

GCC

TGG

GAA

GTT

GTC

AGA

ATG

GAA

ATC

ATG

AAA

433

155

160

165

Ser

Leu

Phe

Leu

Ser

Thr

Asn

Met

Gin

Glu

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

TCC

TTG

TTC

-TTA

TCA

ACA

AAC

ATG

CAA

GAA

AGA

CTG

AGA

AGT

AAA

478

170 го Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser

GAT AGA GAC CTG GGC ТСА TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530

TAAC AC TTGC AC ATGTG AC TC TGG TCAATTCAAAAGAC TC TTATTTCGGC TTTAATC AC 589 ²⁵ AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707

ТТATTC TTAC ATTTTATC ATATTTATAC TATTTATATTC TTATATAAC AAATGTTTGCC 766

TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGfct 802

Alul

- фрагмент b:

За получаване на фрагмент Ь) плазмидаг Р9А2 се смила с рестриктаза Avail. След хроматография и пречистване на получения кДНК- отрязък, той се обработва по-нататък с рестриктаза Sau3A и желаният фрагмент, дълъг 189Ьр_;се изолира чрез хроматография и електроелюиране. Той показва следната структура:

s 1

Asp Leu |GAT CTG БаиЗд)

Pro CCT

5 Gin CAG

Asn AAC

His Gly -Leu

10 Leu CTT

Ser AGC

Arg AGG

Asn AAC

15

Thr ACC

Leu

CAT GGC

CTA

TTG

42

NCOI

20

25

30

JO

Val

Leu

Leu

His

Gin

Met

Arg

Arg

lie

Ser

Pro

Phe

Leu

Cys

Leu

GTG

CTT

CTG

CAC

CAA

ATG

AGG

AGA

ATC

TCC

CCT

TTC

TTG

TGT

CTC

87

15

35.

40

45

*

Lys

Asp

Arg

Arg

Asp

Phe

Arg

Phe

Pro

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Gly

AAG

GAC

AGA

AGA

GAC

TTC

AGG

TTC

CCC

CAG

GAG

ATG

GTA

AAA

GGG

132

20

50

55

60

5er

Gin

Leu

Gin

Lys

Ala

His

Val

Met

Ser

Val

Leu

His

Glu

Met

ACG

CAG

TTG

CAG

AAG

GGC

CAT

GTC

ATG

TCT

GTC

CTC

CAT

GAG

ATG

177

Leu Gin Gin lie

CTG CAG C/jg ate 1θθ

Sau3A

- ‘2Ь Фрагмент c:

За получаване на фрагмент с) плазмид» pER33 (вж E.RastlDworkin et al., Gene 21 (1983) и EP-A-0.115.613) се смила двукратно с рестриктази EcoRI и Pvull. След фракциониране в агарозен гел и пречистване, полученият фрагмент дълъг 389 Ьр, който съдържа Тгр-промотор, мястото за свързване с рибозомата и стартовия кодон, се обработва с Sau3a. Полученият фрагмент, дълъг 108Ьр, се получава чрез електрофореза в агарозен гел, електроелюиране и пречистване в колона Elutip. Той показва следната структура:

EcoRI Sau3a gaattcacgctGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTT GACTTTGCCTTCGCGA 59 мРНК СТАРТ

ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAA

Met

GGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116

RBS Hindlll

Cys Asp

TGT gat c

Sau3a

Фрагментите b и c се лигират c Т4-лигаза и след разрушаването на ензима се зашиват с Hindlll. Тези лигирани фрагменти показват следната структура:

Hindlll aAGCTTAAAG CCATGGCCTA

Sau3a

ATGTGTGATC

Ncol

TGCCTCAGAA

CTTAGCAGGA 50

ACACCTTGGT

GAATCTCCCC

GCTTCTGCAC

CAAATGAGGA

TTTCTTGTGT 100

CTCAAGGACA CAGGAGATGG

GAAGAGACTT

CAGGTTCCCC

TAAAAGGGAG 150

CCAGTTGCAG

CCTCCATGAG

AAGGCCCATG

TCATGTCTGT

ATGCTGCAGC 200

AGATCACACA TCTTTAagct t Sau3a Hindlll

Алтернативно, за производството на плазмида pRHWIO необходимите ДНК фрагменти могат да се получат чрез приложението на два синтетично синтезирани олигонуклеотиди:

Олигонуклеотид с формулата

5-AGCTTAAAGATGTGT-3' който остава дефосфорилиран на 5'края си.

Олигонуклеотид с формулата

5'-GATCACACATCTTTA-3' който посредством Т4-полинуклеотидкиназа и АТф се фосфорилира на 5'-края

При хибридизиране на двата олигонуклеотида се получава следния къс ДНК-фрагмент:

5'-AGCTTAAAGATGTGT 3’

3'- ATTTCTACACACTAGp 5'

Той съдържа в единия си край типичен участък за Hindlll, а в другия - за Sau3a.

Фрагмент Ь) се дефосфорилира с помощта на фосфатаза от телешко черво. Фрагмент Ь) и по-горе описаният фрагмент се смесват и се свързват посредством Т4 лигаза.

Тъй като лигазата изисква поне един 5'-фосфатсъдържащ край, то могат да се свържат само синтетичен фрагмент с фрагмент Ь) или два синтетични фрагмента при техните Sau3a краища. Тъй като получените в резултат два фрагмента се различават по дължина, те могат да се разделят чрез утаяване с изопропанол. Тока пречистените фрагменти се фосфорилират с Т4-полинуклеотидкиназа и АТф.

II. Получаване на експресионните плазмиди

а) Получаване на плазмид pRHWIO:

Линеаризира се експресионен плазмид pER103 (Е. RastlDvorkin et a!., Gene 21,237-284(1983) и EP-A-0.115.613 регистриран в DSM под No DSM 2773) c Hindlll и се третира накрая с фосфатаза от телешко черво. След изолиране и пречистване на така получената ДНК, тя се дефосфорилира и лигира със свързаните фрагменти b и с ( след тяхното смилане с Hindlll). Накрая, получената лигирана смес се трансформира с E.coli 101 и се култивира върху LB агар плюс 50 мкг/мл ампицилин. Проявяващият желаната структура плазмид е получил обозначението pRHWIO (вж фиг. 6) и служи след репликацията си като междинен продукт за получаването на следващите плазмиди.

Ь) Получаване на плазмид pRHW12 :

Към срязания с ВАМ HI плазмид pRHWIO се прибавя Klenow-фрагмент на ДНК-полимераза I и четирите дезоксинуклеозидтрифосфата. Полученият след инкубацията линеаризиран и снабден с изравнени краища плазмид се пречиства и срязва с Ncol. По-големият фрагмент, който се получава след електрофореза в агарозен гел , електроелюиране и пречистване през Elutyp-колона, се лигира с фрагмент а). Найнакрая лигираната смес се трансформира с E.coli НВ101 и се култивира върху LB-arap плюс 50 мкг/мл ампицилин. Полученият с желаната структура плазмид е означен като pRHW12 ( вж фиг. 6) и експримира желания OMera-(Gly)интерферон.

1 от така получената бактериална култура ( оптична плътност : 0,6 при 600 nm) съдържа примерно 1x10^ интернационални единици интерферон.

Получаване на плазмид pRHWll:

Към срязания с BamHI плазмид pRHWIO се прибавя Klenowфрагмент от ДНК-полимераза I и четирите дезоксинуклеозидтрифосфати.Полученият след инкубацията линеаризиран и снабден с изравнени краища плазмид, се пречиства И срязва с Ncol.По-големият фрагмент, който се получава след електрофореза в агарозен гел , електроелюиране и пречистване през Elutyp-колона, се лигира с аналогично получения от плазмидЕ79Е9 фрагмент а) в който изключително е заменен кодиращия 111 аминокиселина (Glu) GGG кодон cGAG кодон, кодиращ глицин. Накрая, получената лигирана смес се трансформира с E.coli НВ101 и се култивира върху LB-arap. Притежаващиягжеланата структура плазмид се обозначава като pRHWll (вж фиг.6), който експримира желания OMera-(Glu)интерферон.

Трансформацията на клетките с различни средства може да се постигне с много методи. Например с калций, където или клетките се отглеждат в присъствие на магнезий и после се суспендират в среда, съдържаща калций и се прибавя ДНК, или на клетките се предоставя копреципитат от ДНК калциев фосфат. При последвалата експресия клетките се пренасят върху среди, които са селекциониращи за трансформираните от тях.

След успешна трансформация на гостоприемника, експресия на гена и ферментация или клетъчно култивиране,при условия, при които се експримира интерферон-омега, продукт»· обикновено се екстрахира чрез познатите хроматографски разделителни методи, за да се получи материал, който съдържа интерферон-омега със или без водещи и крайни последователности. Интерферон-омега може да се експримира с една водеща секвенция при N-края (пре-интерферон-омега), която да е отнета от гостоприемника. Когато това става, то се изисква отцепване на водещия полипептид (ако е налице), за да се получи зрял интерферон-омега. Алтернативно клонът за интерферон-омега може така да се модифицира, че зрелият протеин да се продуцира директно в микроорганизма, вместо пре-интерферон-омега. В този случай се използува прекурсорната последователност на плесенния Mating

- ό3 феромон MF-alpha-1, за да се получи коректно зреене и да се обезпечи изрязване на продуктите в миещата среда или в периплазматичното пространство. ДНК секвенцията за функциониращия или зрял интерферон-омега може да бъде свързана чрез MF-alpha-Ι към предполагаемия катепсиноподобен участък за срязване ( след Lys Arg) при позиция 256 от иницииращия кодон ATG (Kurjan,Herskowitz, Cell 30,933-943 (1982).

Базирайки се на спектъра на биологичната си активност, новоизобретените интерферони, могат да заместят във всяко отношение при лечение познатите интерферони. Това включва херпес, риновирус, опортюнистични инфекции на СПИН, различни видове рак и подобни. Новите интерферони могат да се използуват самостоятелно или в комбинация с други познати интерферони или биологично активни продукти, например интерферон-алфа, интерлевкин-2, други имуномодулатори и подобни.

Интерферон-омега може да се прилага парентерално в случаите, когато се изисква антитуморно или антивирусно лечение или имуносупресивни свойства. Дозирането може да бъде сходно на това, което е получено при клиничните изследвания за интерферон-алфа ( напр. (1-10)х 106 единици/дневно и при препарати по-чисти от 1% - до 5x107 единици/дневно.

Примерно целесъобразна доза при един основен, хомогенен интерферон-омега с бактериален произход, при парентерално приложение е 3 мг интерферон-омега в 25 мл 5%-ен човешки серумен албумин. Този разтвор се прекарва през бактериологичен филтър и се разделя асептично в 100 шишенца, от които всяко съдържа 6x1 Об единици интерферон-омега за парентерално приложние. Шишенцата се съхраняват предимно при -20 °C.

Субстанциите, получени при изобретението могат да се формулират по познат начин, за да се получи фармацевтично приложимо средство, при което полипептид»· се смесва с приемлива, фармацевтична носеща субстанция. Използуваните носещи субтанции и тяхната формулировка са описани от E.W.Martin в Remington's Pharmaceutical Sciences, от където е взет отпечатък. Интерферон-омега се смесва с определено количество носител, за да се получи желаното фармацевтично средство, което е подходящо за ефективно приложение при пациенти. Обикновено се приема парентерална форма на приложение Следващите примери, които изобретението не ограничава, го описват детайлно.

Пример 1

Намиране на специфични клонове за секвенциите на интерферона.

а) Получаване на к ДНК-библиотека кДНК от клетки, стимулирани със Sendai-вирус, се използуват като изходно средство в познатите от литературата методи, за получаването на к ДНК-библиотека. (E.Dworkin-Rastl et dl., J. Interferon Res., Vol. 2/4, 575-585 (1982)).Получените 30 000 клона се пренасят в кладенчетата на микротитърни плаки. Следната среда се използува за растежа и замразяването на колониите:

3b

10	g	Trypton
5	g	Екстракт от дрожди
5	g	NaCl
0,51	g	Na-Citrat x 2 H2O
7,5	g	K2HPO4 x 2 H2O
1,8	g	KH2PO4
0,09	g	MgSO4 x 7 H2O
0,9	g	(NH4)2SO4
44	g	Глицерин
0,01	g	Тетрациклин x HC1
ad 1	1	H2O

Микротитрационните плаки с индивидуалните клонове се инкубират, пренощувайки при 37 С и след това се съхраняват при -70 С.

Ь) Хибридизираща сонда

Като изходен материал за хибридизираща сонда служи рекомбинантният плазмид pER33 (Е.Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983)). Плазмидът съдържа кодираща област за зрелия интерферон IFN-alpha-2 arg плюс 190 бази от 3' нетранслируема оласт. 20 мкг pER33 се инкубира с 30 единици рестриктаза Hind 111 в 200 мкл реакционен разтвор ( ЮтМ TrisHCL pH 7,5, 10 тМ MgC12, 1 тМ Dithiotreitol (DTT), 50 тМ NaCl) за 1 час при 37 С. Реакцията се прекъсва с прибавяне на 1/25 об. 0,5 М и загряване при 70^сС за 10 мин. След прибавяне на 1/4 об. 5 х буфер ( 80% глицерин, 40 тМ Трис-оцетна киселина рН=7,8, 50 mM EDTA, 0,05% SDS, 0,1% бромфенолблау) получените фрагменти се разделят по големина в

1% агарозен гел чрез електрофореза ( гел- и електролитен буфер (ТВЕ): 10,8 г/л Трис-хидроксиметиламинометан (Трисбаза), 5,5 г/л борна киселина, 0,93 г/л EDTA). След инкубация на теловете в разтвор на етидиумбромид, където веригите на ДНК стават видими при ултравиолетова светлина, областта на гела, която съдържа ДНК на интерфероновия ген се изрязва (ок 800 Ьр дължина). Чрез прилагане на напрежение ДНК се електроелюира в 1/10 х ТВЕ-буфер. Разтворът на ДНК се екстрахира веднъж с фенол и 4 пъти с етер. ДНК преципитира из миещия разтвор с прибавянето на 1/10 обем ЗМ натриев ацетат (NaAc), pH 5,8 и 2,5 об. EtOH при -20° С . След центрофугиране ДНК се измива със 70% етанол и се суши 5 мин. във вакуум. ДНК се разтваря в 50 мкл Н₂О (ок. 50 мкг/мл). Тази ДНК се маркира радиоактивно по метода на Maniatis et al., Molecular cloning, ed. CSH чрез Nick-транслация. 50 мкл инкубационен разтвор съдържа: 50 mM Tris рН=7,5, 5 тМ MgCl_2> 10 тМ меркаптоетанол, 100 нг отрязък ДНК от pER33, 16 пкг дезоксирибонуклеаза I, 25 мкмол dATP, 25 мкмол dGTP, 25 мкмол dTTP, 20 mkCi алфа 32 p-dCTP (>3000 С1/тМо1)и 3 единици ДНК-полимераза I(E.coli). Инкубацията се извършва при - 14°С за 45 мин. Реакцията се спира с прибавяне на 1 об. 50 mM EDTA, 2% SDS, 10mM Tris pH=7,6 и загряване при 70°С за 10 мин. Несвързаната радиоактивност се отделя чрез хроматография през Sephadex G100 в ТЕ-буфер (10 mM Tris рН=8,0, 1 тМ EDTA). Радиоактивно маркираната сонда показва специфична активност ок. 4 х 10⁷ срт/мкг.

с) Скриниране на клоновете върху инсерти, съдържащи гени за интерферон

Замразените в микротитърни плаки бактериални култури се размразяват (а). Лист нитроцелулозен филтър със съответна големина (Schleichter and Schull, BA 85, 0,45 мкм големина на порите се поставя върху LB-агар (LB агар: 10g/l Tripton, 5g/l дрожден екстракт, 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Bacto arap, 20 mg/1 тетрациклин HCI). C многоканално устройство, пасващо на микротитърната плака, отделните клонове се пренасят върху нитроцелулозния филтър. Бактериите пренощуват при 37°С докато се образуват колонии с диаметър ок. 5 мм. За разрушаване на бактериите и денатуриране на ДНК, нитроцелулозните филтри се поставят поред върху купчинка филтри Whatman Змм, напоени със следните разтвори: 1) 8 мин. върху 0,5 М NaOH; 2 мин IM Tris рН=7,4; 2 мин IM Tris рН=7,4; 4 мин 1,5 М NaCl; 0,5 М Tris рН=7,4.филтрите се изсушават на въздуха и се държат при 80°С. Предварителната обработка на филтрите е 4 часа в хибридизиращ разтвор, състоящ се от 6 х SSC ( 1 х SSC отговаря на 0,15 М NaCl; 0,015 М тринатриев цитрат; рН=7,0), 5 х разтвор на Denhardt ( lx р-р на Denhardt отговаря на 0,02% PVP( поливинилпиролидон); 0,02% Ficoll( М.т. 40 000Д); 0,02% BSA (говежди серумен албумин) и 0,1% SDS (натриев додецил сулфат). Около 1 х10⁶ срм /филтър от произведената съгласно т. Ь) сонда се денатурират при варене и се прибавят към хибридизиращия разтвор. Хибридизирането продължава 16 часа при 65°С. Измиването на филтрите става при 65оС с .< 3 х SSC/ 0,1% SDS четирикратно, филтрите се изсушават на въздуха, покриват се със Saran Wrap и се експонират върху филм Kodak X-OmatS.

Пример 2

Потвърждаване на рекомбинантните плазмиди, съдържащи гени за интерферон чрез пренасяне по метода на Southern

- 3d От позитивно и съмнително позитивно реагиращите колонии се отглеждат култури, които се оставят да пренощуват във 5 мл L-бульон (10g/l Trypton, 5g/l дрождев екстракт, 5 g/1 NaCl, 20 mg/1 тетрациклин x НС1) при 37°С. Плазмидната ДНК се модифицира по Birnboim и Doly (Nucl.Acid Res. 7, 1513 (1979)). Клетките от 1,5 мл суспенсия се центрофугират (Eppendorf центрофуга) и се ресуспендират при ОоС в 100 мкл р-р на лизозим, съдържащ 50 тМ глюкоза, 10 тМ EDTA, 25 тМ TrisНС1 рН=8,0 и 4 mg/ml Lysozym . След 5 мин инкубация при стайна температура се прибавят 2 обемни части леденостудена 0,2 М NaOH, 1% SDS и се инкубира още 5 мин. После се прибавят 150 мкл р-р на калиев ацетат рН=4,8 и се инкубира още 5 мин.Утаената, съдържаща части от клетката фракция се центрофугира. ДНК-разтвора се екстрахира с равен обем фенол/хлороформ (1:1) и ДНК се утаява с прибавяне на 2 обемни части етанол.След центрофугиране утайката се измива веднъж с етанол и се изсушава 5 мин. на вакуум. ДНК се разтваря в 50 мкл ТЕ-буфер. 10 мкл от него се разтварят в реакционен р-р (10 мМ Tris-HCl рН=7,5, 10 mM MgCl₂, 50 тМ NaCl, 1 тМ DTT) и се смилат с 10 единици Pstl-рестриктаза в продължение на 1 час при 37°С. След прибавянето на 1/25 об. части 0,5 М EDTA и 1/4 об. части 5 х буфер (вж. пример 1Ь)сместа се загрява 10 мин при 70оС и накрая се разделя в 1%-ен агарозен гел (ТВЕ -буфер) чрез електрофореза. ДНК се пренася от гела върху нитроцелулозен филтър по метода на Southern (Е.М.Southern, J.Mol.Biol., 98, 503-517 (1975)). ДНК в гела се денатурира с р-р, съдържащ 1,5 М NaCl/0,5M NaOH. Накрая се неутрализира 1 час с IM Tris х НС1 рН=8/1,5М NaCl. ДНК се пренася върху нитроцелулозния филтър с 10 х SSC (1,5 М NaCl, 0,15М натриев цитрат рН=7,0. След приключване на трансфера (ок. 16 часа)филтъра се изплаква за кратко в 6 х SSC буфер, изсушава се на въздух и престоява 2 часа при 80°С. филтър» се обработва предварително с 6 х SSC/Denhardt рp/0,l%SDS (вж. пример 1 с) при 65°С . Около 2 х 106 срт на хибридизиращата сонда ( вж. пр. lb) се денатурират със загряване при 100°С и се прибавят в хибридизиращия разтвор.Хибридизирането продължава 16 часа при 65°С. Накрая филтър®· се измива 4 пъти при 65оС с 3 х SSC/0,1% SDS. филтрите се изсушават на въздуха, покриват се със Saran Wrap и се експонират върху филм Kodak X-OmatS.

Пример 3

Доказване на интерферонна активност в клон Е76Е9

ЮОмл от клон Е76Е9 се отглежда върху L-бульон (10 g/1 Trypton, 5 g/1 екстракт от дрожди, 5 g/1 NaCl, 5 g/1 глюкоза, 20 mg тетрациклин х НС1 за 1) при 37°С до оптична плътност A^oq=O,8. Бактериите се центрофугират при 7000rpm за 10 мин, измиват се с р-р, съдържащ 50 mM Tris х НС1 рН=8, 30 mM NaCl и се ресуспендират в 1,5 мл миещ разтвор. След инкубация с 1 мг/мл разтвор на лизозим за половин час бактериалната суспенсия се замразява и размразява 5 пъти. Останките от клетките се отделят чрез центрофугиране при 40 OOOrpm за 1 час. Супернатантата се филтрира стерилно и се изпитва за интерферонна активност. Използува се плакоредуциращ тест с УЗ-клетки и везикуларно-стоматитен вирус (G.R.Adolf et al., Arch.Virol, 72, 169-178 (1982). Изненадващо клонат продуцира до 9000 единици интерферон за литър изходна култура.

Пример 4

Геномен Southern блот за определяне броя на гените, които са причислени към новите секвенции.

а) Изолиране на ДНК от Namalwa-клетки

400 мл от Namalwa-клетъчна култура се центрофугират при 1000 об. в JA21-центрофуга. Получената утайка се измива внимателно и се ресуспендира в NP40 буфер (140mM NaCl, 1,5 тМ MgCl2, 10 тМ Tris-Cl рН=7,4) и отново се утаява при 1000 об. Получената утайка се разтваря 0 20 мл КР40-буфер и за разрушаване на клетъчните стени се прибавя 1 мл 10% разтвор на NP40. След 5-минутен престой в ледена водна баня интактните клетъчни ядра се утаяват с центрофугиране при 1000 об, а надутайката се изхвърля. Клетъчните ядра се разтварят в 10 мл разтвор състоящ се от 50 mM Tris/Cl рН=8,0, 10 тМ EDTA и 200 тМ NaCl и накрая се прибавя 1 мл 20% SDS за да се отстранят протеините. Полученият вискозен разтвор се екстрахира двукратно с равно количество фенол (наситен с 10 mM Tris/Cl рН=8) и двукратно с хлороформ. ДНК се утаява с прибавяне на етанол, отделя се чрез центрофугиране и получената ДНК-утайка се измива еднократно с 70% етанол. Суши се 5 мин във вакуум и се разтваря в 6 мл ТЕ-буфер. Концентрацията на ДНК възлиза на 0,8 мг/мл.

Ь) Смилане на ДНК от Namalwa-клетки с рестрикционни ендонуклеази.

Смилането с рестриктази се провежда според дадените от производителя (New England Biolabs) условия. 1 мкг ДНК се смила с 2 единици подходяща рестрикционна ендонуклеаза в обем от 10 мкл при 37°С за 2 часа или по-дълго време. Като рестриктази се използуват EcoRI, Hindlll, BamHI, Sphl, PstI и Clal. При всяко смилане се поставят 20 мкг ДНК. За контролиране пълнотата на смилането при старта на реакцията 10 мкл (аликвотни части) се отделят и се смесват с 0,4 мкг ДНК от Ламбда-фаг. След двучасова инкубация аликвотните части се контролират чрез електрофореза в агарозен гел и пълнотата на смилането се определя с помощта на свидетел от оцветени ДНК фрогменти от Ламбда-фаг.След провеждане на контрола, реакцията се спира с прибавяне на EDTA до крайна концентрация 20 mM и 10 минути нагряване на разтвора при 70°С. ДНК се утаява с прибавяне на 0,3 mM NaAc рН=5,6 и 2,5 обемни части етанол. След 30-минутна инкубация при -70°С ДНК се утаява в Eppendorf-центрофуга, измива се еднократно с 70% етанол и се изсушава. Полученото количество ДНК се разтваря в ТЕ-буфер.

с)Гел електрофореза и Southern-пренасяне

Разградените ДНК-сонди се разделят по големина в 0,8% агарозен гел в ТВЕ-буфер (10,8 g/1 TrisBase, 5,5 g/1 борна киселина, 0,93 g/1 EDTA). При това 15 мкл от ДНК-сондата се смесва с 4 мкл натоварващ буфер (0,02% SDS, 5 х ТВЕ-буфер, 50mM EDTA, 50% глицерин, 0,1% бромфенолблау), нагрява се кратко при 70°С и се поставя в предвидените кладенчета на гела. Ламбда-ДНК, която ще бъде срязана с EcoRI и Hindlll се поставя в съответното кладенче и служи като маркер за големината на ДНК. Гел-електрофорезата се провежда 24 часа при 1 V/см. Накрая ДНК се пренася по метода на Southern върху нитроцелулозен филтър (Schleicher & Schuell, ВА85), като за пренасящ буфер се използува 10 х SSC (1 х SSC: 150 mM тринатриев цитрат, 15mM NaCl, рН=7,0). След изсушаване на филтъра на стайна температура, той се нагрява 2 часа при

80°С за да се свърже към него ДНК.

d) Хибридизираща сонда мкг от плазмид Р9А2 се третират с Avail при което се освобождава фрагмент, дълъг 1100 Ьр, който съдържа целия кДНК-отрязък. Този участък ДНК отново се разрязва със Sau3a и Alul и най-голямото парче ДНК се изолира чрез електрофореза в агарозен гел (вж. фиг. 5Ь), електроелюиране и колонна хроматография в Elutip-колона. Така получената ДНК (1,5 мкг) се разтваря в 15 мкл вода.

мкл от плазмида pER33 се разрязва с HindIII,npM което този експресионен плазмид за интерферон-алфа2-а^ се разкъсва на 2 пъти (E.Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983)). По малкият ДНК-фрагмент съдържа гена за интерферон-алфа-2-arg и се изолира по същия начин като плазмид Р9А2.

Двете ДНК се превеждат накъсано по предоставения метод на P.W.J.Rigby et al., (J.Mol.Biol. 113,237-251 (1977)). Nickтранслацията се провежда с 0,2 мкг ДНК в 50 мкл разтвор, който съдържа 1 х Nick-буфер (1 х Nick-буфер: 50 mM Tris/Cl рН=7,2, 10 mM MgSO^ 0,1 mM DTT, 50 мкг/мл BSA), по 100 мкМол/мл dATP, dGTP,dTTP, 150 mkCi алфа-3²Р-бСТР (Amersham,3000 Ci/mMol) и 5 единици ДНК-полимераза I (Boehringer-Mannheim, Nick-Translation Quality). След 2 часа при 14°С, реакцията се спира с прибавяне на същото количество ЕДТА разтвор (40mMol) и свободният радиоактивен материал се отделя чрез Sephadex G50 колонна хроматография в ТЕ буфер. Останалата специфична активност носи около 100 х 10^{6 С}Р^М /^мкг ДНК.

e) Хибридизиране и авторадиография

Целулозният филтър се разрязва на две половини. Всяка половина съдържа ид^ичен набор следи с Namalwa-ДНК, които са третирани с гореспоменатите рестриктази (вж. пример 4а). филтър»се прехибридизира в разтвор, съдържащ 6 х SSC, 5 х Denhardt (lx Denhardt: 0,02% говежди серумен албумин (BSA), 0,02% поливинилпиролидон, (PVP), 0,02% Ficoll 400),0,5% SDS, 0,1 мг/мл денатурирана ДНК от телешки тимус и 10 mM EDTA, 2 часа при 65°С. Хибридизирането се провежда в р-р, съдържащ 6 х SSC, 5 х Denhardt, 10 mM EDTA, 0,5% SDS и около 10 х 10 срт Nick-транслирана ДНК, в продължение на 16 часа при 65°С. Едната половина хибридизира с интерферон-алфа-2а^ ДНК, а другата -с интерферонна ДНК, изолирана от плазмида Р9А2. След хибридизирането двата филтъра се измиват при стайна температура четирикратно с разтвор, съдържащ 2 х SSC и 0,1% SDS, и двукратно 45 мин при 65°С с разтвор, състоящ се от 0,2 х SSC и 0р01% SDS. Накрая филтрите се изсушават и се експонират на Kodac X-Omat S филм.

Пример 5

Получаване на експресионни плазмиди pRHW 12 и р RHW 11

Предварително обяснение:

Получаването на експресионни плазмиди е представено на фиг 6 (несъобразено с мащаба), по-нататък всички разграждания с рестриктази са проведени съгласно указанията на производителите на ензимите.

Получаване на плазмид pRHWIO

100 мкг от плазмид Р9А2 се разграждат със 100 единици от рестрикционния ензим Avail (New England Biolabs). След разграждането ензимйтсе инактивира при 70^еС и получените фрагменти се фракционират по големина в 1,4% агарозен гел с ТВЕ-буфер (ТВЕ-буфер: 10,8 g/1 Tris-база, 5,5 g/1 борна киселина,

0,93 g/1 EDTA). Получените ленти, които съдържат целия кДНК-инсерт се електроелюират и се пречистват през Elutypколона. От получените 20 мкг, 6 мкг се разграждат по-нататък с рестриктаза Sau3a- 20 единици в общо 100 мкл разтвор. Фрагментите се разделят с 2% агарозен гел в ТВЕ-буфер. След оцветяването с етидиумбромид(Е1Вг), 189 Ьр дългият участък ДНК се електроелюира и пречиства, както е описано погоре. (= фрагмент b на фиг 6)

За да се снабди гена за интерферон с промотор, място за свързване на рибозомата и стартов кодон, се изолира съответния участък ДНК от експресионния плазмид pER33 (E.Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983). При това 50 мкг pER33 се смила двукратно с EcoRI и Pvull и получените фрагменти се разделят по големина в 1,4% агарозен гел и ТВЕ-буфер. Дългият 389 Ьр участък ДНК, чийто Тгр-промотор съдържа участък за свързване с рибозомата и стартов кодон, се електроелюира и се пречиства през колона Elutyp. Така пречистеният фрагмент се обработва с Sau3a и желаният 108 Ьр фрагмент се получава чрез елетрофореза в агарозен гел, електроелюиране и пречистване в колона Elutyp с добив около 100 ng (=фрагмент с от фиг.6).

ng от фрагмент Ь се лигира с 20 ng от фрагмент с в обем от 40 мкл чрез прилагането на 10 единици Т4-лигаза в разтвор, съдържащ 50mM Tris/Cl рН=7,5, 10 тМ MgC12, 1 тМ DTT и 1 тМ , 18 часа при 14°С. Накрая ензимкгсе разрушава с нагряване при 70°С и получената ДНК се разкъсва с Hindlll в общ обем 50 мкл.

мкг от експресионния плазмид pER193 (E.Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) линеаризират c Hindlll в общ обем от 100 мкл. След два часа при 37°С се прибавя 1 обем 2 х фосфатазен буфер (20 mMTris/Cl рН=9,2, 0,2 mM EDTA) заедно с една единица фосфатаза от телешко черво (CIP). След 30 мин

4b при 45°C се прибавя следваща единица CIP и се инкубира още 30 мин. Така получената ДНК се пречиства с двукратна фенолна екстракция, еднократна екстракция с хлороформ и се утаява с прибавяне на 0,ЗМ натриев ацетат (рН=5,5) и 2,5 обема етанол. Накрая се дефосфорилира, за да се попречи на религирането на вектора при следващите стъпки.

100 ng от линеаризирания pER103 и лигираните фрагменти b и с (след смилане с Hindlll) се пренасят в 100 мкл р-р, съдържащ лигазен буфер и се лигират при 14°С 18 часа с Т4 ДНК лигаза.

200 мкл компетентна E.coli НВ 101 (E.Dworkin et al., Dev. Biol. 76,435-448 (1980) се смесват c 20 мкл от лигиращата смес и се инкубират 45 мин върху лед. Приемането на ДНК се прекъсва с топлинен шок за 2 мин при 42°С. Клетъчната суспенсия се инкубира още 10 мин върху лед и се пренася върху LB-агар (10g/l Trypton, 5 g/1 дрожден екстракт, 5 g/1 NaCl , 1,5% агар), който съдържа 50 мг/мл ампицилин. Плазмидът, който се съдържа в получените 24 колонии се изолира по метода на Birnboim и Doly (Nucl.Acid.Res.7, 1513-1523 (1979)). След смилане с различни рестриктази, плазмидът получава желаната структура. Последната се обозначава с pRHWIO (вж. фиг. 6).

Ь) Получаване на плазмид pRHW12

Около 10 мкг плазмид pRHWIO се разрязват с BamHI. Накрая се прибавят Кленов-фрагмент от ДНК-полимераза1 и четирите дезоксинуклеотидтрифосфата и се инкубира 20 мин при стайна температура. Полученият линеаризиран и с прави краища плазмид се пречиства с фенолна екстракция и утаяване и накрая се третира с рестриктаза Ncol в обем 100 мкл. Фрагмент а) (вж. фиг 6)се получава чрез смилане от 4 мкг Avall-фрагмент, който съдържа инсерт на Р9А2-кДНК (вж. по-горе) с Ncol и Alul, при което се получават около 2 мкг фрагмент а).

В последната стъпка на лигирането, фрагмент а) и прибавеният двукратно обработен с BamHI и Ncol pRHWIO, се свързват в обем 10 мкл и се прибавя 10 ng ДНК. При лиги рането на едно изпълнено място за срязване от BamHI и срязаната от Alul ДНК се получава отново място за срязване с BamHI.

Получената лигираща смес се трансформира с компетентна E.coli НВ101 както е описано по-горе. От получените 40 колонии се избира тази, която съдържа обозначението pRHW12.

Плазмиднг се изолира и инсертъг EcoRI/BamHI се секвенира по метода на Sanger (F.Sanger et al., Proc.Nat.Acad.Sci 74, 54635467 (1979)). Той притежава очакваната секвенция.

с) Получаване на плазмид pRHW 11

Следва се аналогично пример 5 b). 1 мкг плазмид pRHW се смила с BamHI. Лепнещите краища на получената ДНК се изравняват посредством Кленов-фрагмент от ДНК полимераза I и четирите дезоксинуклеотидтрифосфата. Накрая линеаризираната ДНК се срязва с Ncol. По-големият фрагмент се получава чрез електрофореза в агарозен гел, електроелюиране и пречистване в колона Elutyp .

Ncol/Alul фрагментът се изолира от Е76Е9 аналогично на пример 5Ь. Накрая лигират 10 ng от векторните краища с 10 ngjDT краищата на кДНК в обем 10 мкл при подходящи условия и използуването на 1 единица Т4-лигаза. След трансформиране на получената ДНК-смес в E.coli НВ 101 и селекциониране на получените 45 колонии върху ампицилин-съдържащи LBпетрита, се избира един клон, който съдържа обозначението pRHW 11. След отглеждането на съответния клон се изолира плазмидна ДНК. Нейната структура се доказва с присъствието на множество специфични места за действието на рестриктази (Alul, EcoRi,Hindlll, Ncol, PstI).

d) Експресия на интерферонна активност чрез E.coli НВ101, съдържаща плазмида pRHW 12.

100 мл от бактериалната култура се довеждат до оптична плътност 0,6 при 600 nm в М9 минимална среда, която съдържа всички аминокиселини, с изключение на триптофан (20 мкг/мл за аминокиселина), 1 мкг/мл тиамин, 0,2% глюкоза и 20 мкг/мл индол (З)акрилова киселина (IAA), индуктор за триптофановия оперон и се инкубира. Накрая бактериите се утаяват с центрофугиране (10 мин/ 7000 об.), измиват се веднъж с 50 шМ Tris/Cl рН=8, 30 mM NaCl и се ресуспендира в 1,5 мл от същия буфер. След 30 минути инкубация с 1 мг/мл лизозим върху лед, бактериите се замразяват и размразяват 5 пъти. Клетъчните остатъци се отделят с едночасово центрофугиране при 40 000 об/мин. Супернатантата се филтрира стерилно и интерфероновата активност се изпитва в тест за редукция на плаките, при използуване на човешки А549-клетки и енцефаломиокардитен вирус.

Резултат: 1 л от произведената бактериална култура съдържа 1 х 106 интернационални единици интерферон (А. Biliau, Antiviral Res, 4, 75-98 (1984)).

Пример 6

Съпоставяне на разликите в аминокиселинните и нуклеотидни секвенции на интерфероните от тип I.

а) Сравняване на аминокиселините

Сравняването по чифтове на аминокиселинните последователности се състои в съпоставяне на първия цистеинов остатък от зрелия алфа-интерферон с първия аминокиселинов остатък от аминокиселинната последователност, която се кодира от кДНК-инсерта от плазмидите Р9А2 и Е76Е9. Двете секвенции са представени на фиг. 7 като интерферон-омега, тъй като при дадените стойности не можа да се намери разлика между специфичните секвенции на Р9А2 и Е76Е9. Единствената проведена коректура е вмъкването на празнина при позиция 45 на интерферон алфа-А, което се смята за дефект. Когато партньор е последователност на омега-интерфероните, сравнението се провежда, като се имат предвид обикновените 166 аминокиселини. Това значение се представя на фиг 7 заедно с допълнителните аминокиселини, които се кодират от клоновете Р9А2 и Е76Е9. Процентните разлики се получават като се раздели изброеното число на 1,66. Допълнителните аминокиселини се представят с коефициент 0,6, което дава 3,6% за шестте допълнителни аминокиселини на интерферон-омега, когато се смята общо процента. Сравняването с бета-интерферона започва от третата аминокиселина на бета-интерферона и първата аминокиселина на зрелия алфа- интерферон, която се кодира от плазмидите Р9А2 и Е76Е9. Най-дългата сравнена структура на един алфаинтерферон с един бета-интерферон е 162 аминокиселини, което дава по 2 допълнителни аминокиселини за алфа и бета интерфероните. Те се отчитат като дефекти и са представени отделно на фиг.7, но са включени в процента. Листинга на бетаинтерфероните с аминокиселинните секвенции на клоновеР9А2 и Е76Е9 се провежда по същия начин. Това дава общо 10 допълнителни аминокиселини.

Ь) Сравняване на нуклеотидните последователности

Изброяването на сравняваните последователности следва аналогично пример 6а. Първият нуклеотид от зрелия алфаинтерферон е първият нуклеотид от цистеин-кодиращия триплет на зрелия алфа-интерферон. Първият нуклеотид от ДНК на плазмида Р9А2 или Е76Е9 е също така първият нуклеотид на кодона за цистеин-1. Първият нуклеотид от ДНК на бетаинтерфероните е първият нуклеотид на третия триплет. Сравнението следва общо 498 нуклеотиди, когато се равняват единичните ДНК на алфа-интерфероните с бета-интерферони и повече от 516 нуклеотиди, когато се сравняват ДНКпоследователностити на единични алфа или бета интерферони с тези на плазмидите Р9А2 и Е76Е9. Абсолютният брой на грешките е даден в лявата част на фиг.7, а в скоби са съответните проценти.

Пример 7

Вирусиндуцируема експресия на омега-l-мРНК и NC37клетки

а) Синтез на хибридизираща, специфична за омегаинтерферон сонда pMol от олигонуклеотида d(TGCAGGGCTGCTAA) се смесват с 12 pMol гама-^²Р АТР ( специфична активност :> 5000 Ci/mMol) и 10 единици полинуклеотид-киназа в общ обем 10 мкл (70 mM Tris/Cl рН=7,6, 10 mM MgC12, 50 mM DTT) и се оставят един час при 37°С. Накрая заместването се спира с нагряване при 70°С ЗА 10 мин. Полученият радиоактивно маркиран олигонуклеотид хибридизира при 50°С за един час с 5 pMol M13pRHW 12 ssflHK (вж. фиг.9) в общ обем 35 мкл ( ЮОтМ NaCl).

След охлаждане при стайна температура се прибавят буфер

- ЬО за накъсано превеждане, четирите нуклеозид-трифосфата и 10 единици Кленов-полимераза до общ обем 50 мкл ( 50тМ Tris/Cl рН=7,2, 10 mM MgCl₂, 50 мкг/мл BSA, 1тМ за нуклеотид). Полимеризацията се провежда един час при стайна температура и се спира с петминутно нагряване при 70°С.

При синтеза се получава отчасти двойноверижна циркулираща ДНК.Тя се разгражда с 25 единици Avail в общ обем 500 мкл, като се използува описаният от производителя буфер. При това двойноверижните области се разграждат до еднородна големина. Синтез»· се спира с 5-минутно нагряване при 70°С.

Ь) Получаване на РНК от клетки, инфектирани с вирус

100 х 10б клетки (0,5 х 10⁶/мл) се третират със 100 мкМол дексаметазон 48 до 72 часа - контролата не съдържа дексаметазон. За индукция на интерферона експресионните клетки се суспендират в свободна от серум среда в концентрация 5 х 10⁶/мл и се инфектират с 21° единици Sendai-вирус. Аликвотни части от клетъчните култури се изпитват в плакоредуциращ тест за интерферонна активност (пример 5Ь). Клетките се събират 6 часа след инфектирането с вирус посредством центрофугиране (lOOOg/Юмин), измиват се в 50 мл ИР40-буфер (пример 4а), разтварят се в леденостуден NP40 буфер и се лизират с прибавяне на 10% NP40 за 5 мин. върху лед. След отстраняване на ядрата чрез центрофугиране (1000g,10MHH) супернатантата се довежда до рН=8,0 с 50mM Tris/Cl, 0,5% Sarkosin и 5 mM EDTA. Цялата РНК от супернатантата се екстрахира веднъж с фенол, веднъж с хлороформ/фенол/изоамилов алкохол и веднъж с хлороформ/изоамилов алкохол. Водната фаза се натоварва върху bl мл 5,7 моларен градиент на CsCl и се центрофугира с SW 40 ротор. (35krpm, 20 часа) за да се освободи екстракта на ДНКот останалите протеини. Получената утайка от РНК се ресуспендира в 2 мл ТЕ рН=8 и се утаява с етанол. Утаената ЛНК се разтваря във вода при концентрация 5 мг/мл.

с) Доказване на мРНК за интерферон-омега.

0,2мл от получената съгласно пример 7Ь хибридизираща сонда се утаяват с 20-50 мкг от получената съгласно 7с РНК чрез прибавяне на етанол. В контролния експеримент вместо клетъчна РНК се прибавя трансферна РНК (т РНК) или РНК от трансформирана с pRHW 13 E.coli.

Получената утайка се обезсолява чрез измиване със 70% етанол, изсушава се и се разтваря в 25 мкл 80% формамид ( 100 mM PIPES рН=6,8, 400 тМ NaCl, 10 тМ EDTA). Накрая се нагрява 5 мин при 100°С за да се денатурира хибридизиращата сонда, непосредствено след това се охлажда до 52°С и при тази температура се инкубира 24 часа. След хибридизирането пробите се поставят върху лед и се прибавят 475 мкл реакционна смес ( 4mM Zn(Ac)2, 30 mM NaAc, 250 mM NaCl, 5% глицерин, 20 мкг двойноверижна ДНК от телешки тимус, 100 единици SIнуклеаза).След едночасов престой при 37°С, реакцията се спира чрез утаяване с етанол. Утайката се разтваря в 6 мкл формамидбуфер и аналогично на сондите, получени от ДНК секвенирането се разделя в 6% акриламиден гел, съдържащ 8М урея (F.Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1979)).

За авторадиография изсушеният гел се пренася в-у DuPont Cronex X-ray филм с помощта на интензификатор Kodak Lanex Regular при -70°С.

- Ь2 Легенда към фиг 10

Следите от А до С представят контролите

Следа А: 20 мкг тРНК

Следа В: 10 мкг РНК от pER33 (E.coli-експресиращ щам за интерферон алфа-2-arg)

Следа С: 1 ng РНК от pRHW 12(Е.со11-експресиращ щам за интерферон омега 1)

Следа D: 50 мкг РНК от нетретирани Namalwa-клетки

Следа Е: 50 мкг РНК от инфектирани с вирус Namalwaклетки

Следа F: 50 мкг от третирани с дексаметазон и инфектирани с вирус Namalwa-клетки

Следа G: 20 мкг от нетретирани NC 37-клетки.

Следа Н: 20 мкг от третирани с вирус NC 37 клетки

Следа I: 20 мкт от третирани с дексаметазон и инфектирани с вир^с NC 37-клетки

Следа М: Маркер за големината (pBR 322третиран с Hinfl).

Следи В и С показват, че очакваният сигнал се установява само тогава ,когато омега-специфична РНК е под формата РНКмолекула. По- нататък е показано, че излишък от фалшива киселина не предизвиква фонов сигнал (следаВ). Използуваната като хибридизиращ партньор тРНК също не дава сигнал (следа А).

Следи от G до I показват индукцията на омега-специфична РНК в инфектираните с вирус NC 37-клетки. Предварителната подготовка с дексаметазон усилва този ефект.

Следи D до F показват същия ефект, получен с Namalwaклетки. Индукцията на омега-специфичната РНК не е толкова силна, колкото при NC 37-клетките. Този резултат е паралелен с титъра на интерферона, измерен в надклетъчната течност.

- 33 Това отнасяне на експресията на гена за интерферон-омега е такова, каквото се очаква от ген за интерферон от тип I.

Пример 8

Изолиране на гените, кодиращи интерферон-омега, както и родствените гени.

а)Козмиден скрининг

Човешка козмидна банка (човешка ДНК(мъжка)) клонирана в козмиден вектор pcos2 EMBL (A.Ponstka, Н.R.Rockwitz, A.-M.Frischauf, L.Horn, H.Lerach, Proc. Natl.Acad.Sci 81, 4129-4133(1984) c комплексност 2 x 10⁶ се претърсва за интерферон-омега- или родствени гени. Като гостоприемник се използува E.coli DHI (r^-, m +, rec. A, gyrA96, sup.E).Непосредствено се произвеждат Mg++- клетки 'planting bacteria' . E.coli DHI се развива през нащта в L-бульон (10 г/л Trypton, 5 г/л дрожден екстракт, 5 г/л NaCl) снабдена с 0,2% малтоза.Бактериите се центрофугират и се довеждат до OD6oo⁼2 с 10 тМ р-р на MgSO4. 5 мл от тази клетъчна суспенсия се инкубират с козмид, опаковащ 12,5 х 106 колонии-формиращи единици. Накрая се прибавят 10 об. LB и суспенсията се оставя 1 час при 37°С за експресия на обусловената чрез козмида резизстентност към Канамицин. След това бактериите се центрофугират, ресуспендират се в 5 мл LB и се нанасят на порции от 200 мкл върху нитроцелулозен филтър (ВА85, Schleicher & Schuell, диаметър 132 мм), който е поставен върху LB-arap (1,5% агар в L-бульон ) плюс 30 мкг/мл канамицин. За филтър порастват ок 10000-20000 колонии. Колониите се пренасят върху друг целулозен филтър и се съхраняват при 4°С. Една партида от филтрите, съдържащи колонии се обработва както е описано в пример 1 с), т.е. бактериите се денатурират и едноверижната ДНК се фиксира върху целулозата, филтрите са измити предварително при 65°С, 4 часа в 50 mM Tris/Cl, рН=8,0, 1 М NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS. Накрая филтрите се инкубират в разтвор 5 х Denhardt (вж.пример 1с), 6 х SSC, 0,l%SDS два часа при 65°С и се хибридизират в същия разтвор с 5 х 106 с Nickтранслирана, денатурирана ДНК от интерферон-омега 1 (Hindlll-BamHI- инсерт на клона pRHW12, вж. фиг.6) 24 часа при 65°С. След хибридизирането филтъра се измива 3 пъти х 10 мин. при стайна температура в 0,2 х SSC, 0,01% SDS разтвор и 3 пъти х 45 мин при 65°С, в 0,2 х SSC, 0,01% SDS разтвор, филтрите се изсушават и се експонират на Kodak X-Omat S филм с използването на усилващо фолио при -70°С. Позитивно реагиращите колонии се локализират върху репликационния филтър, изстъргват се и се ресуспендират в L-бульон + канамицин (30 мкг/мл). От тази суспензия няколко мкл. се препасяват върху LB-arap + 30 мкг/мл. Резултантните колонии отново се прухвърлят върху нитроцелулозен филтър за репликация. Тези филтри се хибридизират както е описано погоре с 32Р -маркирана ДНК за интерферон омега I. От така хибридизираната колония се изолира козмидяг по метода на Birnboim и Doly (Nucl.Acid.Res. 7, 1513 (1979)). С този козмиден ДНК- препарат E.coli DHI се трансформира и трансформантите се селекционират върху LB-arap + 30 мкг/мл канамицин. Избира се един клон произлизащ от изходния изолат и се произвежда в по-голям мащаб.(Clewell, D.B. & Helinski, D.R., Biochemistry 9, 4428 (1970)). Три от изолираните козмиди носят имената cos9,cosl0 и cosB.

Ь)Субклониране на хибридизираните фрагменти в PUC8

По_1мкг от козмидите cos9, cos 10 и cosB се обработват с Hindlll при условия, препоръчани от производителя (New England Biolabs). Фрагментите се разделят чрез електрофореза в 1% агарозен гел в ТВЕ-буфер и се пренасят по Southern върху

- bb нитроцелулозен филтър (пример 4с). Двата филтъра се хибридизират както е описано в пример 4d с Nick-транслирана ДНК от омега I, измиват се и се експонират.Около 20 мкг от всеки козмид се разрязват с Hindlll и получените фрагменти се разделят чрез гелелектрофореза. Хибридизираните в предния опит с омега ДНК фрагменти се електроелюират и се пречистват през колона Elutyp (Schleicher & Schuell). Тези фрагменти се лигират с Hindlll линеаризиран, дефосфорилиран pUC8 ( Messing,J., Vieira, J., Gene 19, 269-276 (1092)). E. coli JM101 (supE, thi, (lac-pro-AB), [F', traD36, proAB, lac q Z M15](np. Fa. P.L.Biochemicals) се трансформира c лигазен реакционен разтвора Бактериите се посяват върху LB-arap, съдържащ 50 мкг/мл ампицилин, 250 мкг/ мл 5-Brom-4-Clor-3-indolyl-beta-Dgalactopyranosid (BCIG, Sigma) и 250 мкг/мл Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosid (IPTG, Sigma). Синьото оцветяване на получените колонии показва липсата на инсерт в pUC8. От няколко бели клона се изолира плазмиднатаДНК в малко количество, обработва се с Hindlll и се разделя върху 1% агарозен гел. ДНК-фрагментите се пренасят върху нитроцелулозен филтър и като по-горе се хибридизират с ³²Ромега-1 ДНК. Избира се по един субклон, произлизащ от cos 9 и coslO и се обозначават с pRHW22, съответно pRH57. От cosB се субклонират два добре хибридизирани с омега-1 сонда ДНКфрагменти и се обозначават с pRH51 и pRH52 съответно.

с) Анализ на последователностите

Включената в PUC8 ДНК се отделя от векторната част чрез обработка с Hindlll и гел-електрофореза. Тази ДНК (ок 10 мкг) лигира под действието на Т4 ДНК-лигаза в реакционен разтвор, обемат на разтвора се довежда до 250 мкл с Nick-транслационен буфер (пример 4d) и накрая ,при охлаждане в лед се разгражда с ултразвук (MSE 100 Watt Ultrasonic , Disintegrator, макс. подаване при 20 kHz, 5 пъти 30 секунди). След това краищата на разрязаните парчета се репарират с прибавяне на 1/100 об. 0,5 mM dATP, dGTP, dCTP и dTTP, както и 10 единици Кленов фрагмент от ДНК-полимераза I 2 часа при 14°С. фрагменти с големина между 500 и 1000 Ьр се изолират и се субклонират в дефосфорилиран, обработен със Smal фагов вектор М13. Едноверижната рекомбинантна фагова ДНК се изолира и се секвенира по метода на Sanger (Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci 74, 5463-5467 (1976)). Съпоставянето на единичните последователности към общата последователност се постига с компютър (Staden, R., Nucl.Acid Res. 10 47314731(1982)).

d) Последователност на субклон pRH57( интерферон омега-

Последователността е представена на фиг 11. Този 1933 Ьр дълъг фрагмент съдържа гена за интерферон омега-1. Протеинкодиращата област обхваща протеини 576 до 1163. Последователността е напълно идентична с тази на кДНК клона Р9А2. Нуклеотидният участък 576-674 кодира сигнален пептид, дълъг 23 аминокиселини. ТАТА-участъкяГ лежи на разстояние от стартовия кодон ATG, което е характерно за интерферонните гени от тип I ( позиции 476-482). Генът притежава сигнална последователност за полиаденилиране при транскрипцията (АТТААА при позиции 1497-1502, респ. 17641796; ААТААА при позиции 1729-1734, респ. 1798-1803), който се използува пръв в клон Р9А2.

e) Последователност на субклона pRHW22 (интерферонпсевдо-омега-2)

На фиг 12 е представена 2132 Ьр дълга секвенция с хибиридизираните Hindlll фрагменти на омега-1- сондата от

- Ь7 козмид cos9. Тя предоставя отворена рамка за четене от нуклеотид 905 до нуклеотид 1366. Дадена е произлизащата от нея аминокиселинна секвенция. Първите 23 аминокиселини са сходни със сигналния пептид на интерфероните от тип I. Следващите 131 аминокиселини показват до 65 аминокиселина сходство с омега-интерферон, при това тирозиьгаг е забележителен с това, че е първата аминокиселина на зрелия протеин. Върху аминокиселинна позиция 66 следва едно потенциално за N-гликозилиране място (Asn, Phe, Ser). От това място място аминокиселинната секвенция се различава от тази на тип I-интерферони. При това е показано, че чрез благоприятните инсерции и резултантните от тях премествания на протеиновата рамка произлиза прилика с омега-1 гена (вж. пример 9). От гледна точка на тип I-интерфероните при изолирания тук ген, става дума за един псевдоген: интерферонпсевдо-омега2.

f) Последователност на субклона pRH51 (интерферонпсевдо-омегаЗ)

Hindlll фрагмент, произлизащ от козмид В, дълъг 3500 Ьр и хибридизиран с омега1-сонда е секвениран частично (фиг. 13). Получава се отворена за четене последователност от нуклеотидна позиция 92 до 394. Първите 23 аминокиселини показват белезите на сигнален пептид. Последващата секвенция започва с триптофан и показва сходство с интерферон-омега 1 до аминокиселина 42. Следва секвенция, различна от интерферономега! до аминокиселина 78. Секвенцията може да се промени чрез инсерции така, че да прояви голяма хомоложност с интерферон-омега 1. (пример 9). Генът се обозначава като интерферон-псевдо-омегаЗ.

- Ь8 -

g) Последователност на инсерта от pRH52 (интерферонпсевдо-омега-4).

Секвенция на Hindlll фрагментите, дълга 3659Ьр и хибридизирана с омега 1 ДНК е изолирана от козмид Вие представена на фиг. 14. Отворена рамка за четене, чийто транслационен пункт показва частична хомоложност с интерферон-омега 1, се намира между нуклеотиди 2951 и 3250. След сигнален пептид, дълъг 23 аминокиселини започва с фенилаланин по-нататъшна аминокиселинна секвенция. Хомоложността със интерферон 1 се прекъсва след 16. аминокиселина, продължава отново при 22. и завършва при 41. аминокиселина. Би била възможна евентуална транслация до ΊΊ. аминокиселина. Аналогично на пример 8f и 8g може да се получи добра хомоложност към интерферон-омега1 чрез вмъкване на инсерции. Така изолираният псевдоген се обозначава като интерферон-псевдо-омега 4.

Пример 9

Подреждане на гените за четирите члена на семейството на интерферон-омега.

На фиг 15 са подредени един под друг гените от интерферономега1 до интерферон-псевдо-омега4 заедно с аминокиселинното им превеждане. За по-добро съвпадение са вмъкнати празнини в единични гени, които са представени с точки. Не са пропуснати бази. Номерирането на базите включва празнините. Аминокиселинното превеждане за омега 1 е запазено (напр. позиция 352-355: САС, кодиращо His). При псевдогените има превеждане в аминокиселина само там , където това е възможно недвусмислено. Въз основа на това представяне става ясно, че четирите изолирани гена са родствени помежду си. Например, получава се потенциално за N-гликозилиране &9 място (нуклеотидни позиции 301-309) във всичките четири гени. Също само при интерферон-псевдо-омега4 се намира триплет от нуклеотидни позиции 611 до 614, който представлява стоп-кодон и който при интерферон-омега 1 завършва протеин с дължина 172 аминокиселини. Без съмнение при това подреждане присъствуват преждевременни стоп-кодони при интерферонпсевдо-омега2 (нуклеотидни позиции 497-499) и интерферон псевдо-омега4 (нуклеотидни позиции 512-514).

Степента на родство между гените, респ. аминокиселинните последователности може да се пресметне от подреждането, дадено на фиг. 15. фигура 16 дава хомоложността между ДНК на членовете на семейството на интерферон-омега.Освен това при сравняването на чифтовете не са пресметнати тези позиции, при които единият партньор или и двата имат празнина. Сравнението дава една хомоложност от кръгло 85% между интерферон-омега1 и псевдогените. ДНК на интерферон-псевдоомега2 е хомоложна към ДНК на интерферон-омега-3, респ. интерферон-омега4 около 82%. фиг 17 показва резултатите от сравнението на сигналните поледователности, а фиг. 18 - тези от сравняването на зрелите протеини. Последните се движат между 72 и 88%. Тази хомоложност е значително по-голяма, отколкото хомоложността между интерферон-омега 1 и интерферон-алфа и интерферон-бета (пример 6). Обстоятелството, че отделните членове на семейството на интерферон-омега се различават понататък един от друг, както и от интерферон-алфа семейството пояснява, че три от четирите изолирани интерферон-омега гени са псевдогени и често не могат да бъдат основа на селекционни отпечатъци като функциониращи гени.

Пример 10 ферментация

Съхранение на щамовете:

Единична колония от щам HB101/pRHW12 върху LB-arap ( 25 мг/мл ампицилин)се пренася върху триптон-соев бульон (OXDID СМ129) с 25 мг ампицилин, разклаща се при 250 об.мин при 37°С, докато достигне оптична плътност около 5 (546шп). Прибавят се 10 тегловни процента стерилен глицерин, културата се разлива на порции от по 1,5 мл стерилни ампули и се замразява при -70°С.

Предварителна (първична) култура

Културалната среда съдържа 15 г/мл Na2HPO4 χ 12Н2О;0,5 г/л NaCl; 1,0 г/л NH₄C1; 3,0г/л КН₂РО₄; 0,25 г/л MgSO₄ х 7Н₂0; 0,01 lg/Ι СаС1₂; 5 g/Ι казеинов хидролизат (Merck 2238); 6,6 g/1 глюкоза-монохидрат; 0,1 g/1 ампицилин; 20 мг/л цистеин и 1 мг/л тиамин-хидрохлорид. 4 х 200 мл от тази среда се поставят в ерленмайерови колби от 1000 мл и всяка се инжектира с по 1 мл култура от HB101/pRHW14 и се инкубира при разклащане 250 об/мин, 18 часа при 37°С.

Главна култура:

Средата за ферментация съдържа 10g/l (NH4)₂HPO4; 4,6 g/1 К₂НРО₄ х ЗН₂О; 0,5g/l NaCl; 0,25 g/1 MgSO₄ x 7H₂O; 0,011 g/1 CaCl₂; llg/1 глюкоза- монохидрат; 21 g/I казеинов хидролизат ( Merck 2238); 20 mg/1 цистеин, 1 mg/1 тиамин-хидрохлорид и 20 mg/1 3-бета-индолакрилова киселина. 8 литра стерилна среда се поставят във ферментор с общ обем 14 л (височина:радиус = 3:1)и се инокулират с 800 мл първична култура.

ферментацията протича при 28°С, 1000 об/мин.(EffigasTurbine), аериране 1 wm (обем/обем/минута)и начално рН=6,9.

По време на ферментацията pH спада и се поддържа на 6,0 с ЗМ NaOH. Когато се достигне оптична плътност (546nm) 18-20 (обикновено след 8,5-9,5 часа ферментация) сместа се охлажда при същите условия до 20°С и pH се довежда до 2,2 с 6N H2SO4 (без аериране) и се разбърква 1 час при 20°С при 800 об/мин. без аериране. Така инактивираната биомаса се центрофугира при 30 000 об/мин (центрофуга- СЕРА тип GLE), замразява се и се съхранява при -20°С.

Пример 11

Пречистване на интерферон-омега Gly

а)Частично пречистване

Всички етапи се провеждат при 4°С.

140 г биомаса (E.coli НВ101 трансформирана с експресионен клон pRHW12) се разтваря в 1150 мл предварително охладена до 4°С оцетна киселина и се разбърква 30 мин. Суспенсията се довежда до рН=10,0 с 5М NaOH и се разбърква в продължение на 2 часа. След фиксиране на pH при 7,5 с 5М НС1 се разбърква още 15 мин. и се центрофугира (4°С, 1 часа, 10 000 об/мин, центрофуга J21, Beckman, JAlO-ротор).

Бистрата супернатанта се пренася върху колона CPG (стъклена, с контролирани пори) (CPG 10-350, Mesh Size 120/200) по 50 мл/час измива се с 1000 мл 25 mM Tris/ IM NaCl, рН=7,5 и се елюира с 25тМ Tris/1M KCNS/50% етиленгликол, рН=7,5 (50 мл/час).

Пиквт, съдържащ интерферонна активност, се събира, диализира се срещу 0,1 М Na-фосфат, рН=6,0 и 10% полиетиленгликол 40 000 в продължение на 1 нощ и полученият преципитат се центрофугира. (4°С, 1 час, 10 000 об/мин., J21центрофугаДА20-ротор (вж. табл.1).

2 полица I

	Об ем (ml)	Биологичен тест	Протеин (mg/ml)	общо. (mg)	U/mg Дооив е *
u/ml+	U total
нenpe- ту <Χ ρ гр ρ μ·	1150	15000	17,Зх106	3,6	4140	4180	100
DL	2200	< 600	< 1,Зх10б	0,74	1628	<600	< 5
Елюат	124,3	170000	21,0х106	16,8	2088	10000	121
сл ед диалида	41	300000	12,Зх10б 4	12,6	516,6	23800	71

+ CPE-редукционен тест: A349 - клетки,ЕМС-вирус U-Единици, изведени спрямо интерферон-алфа 2 /вж. пример 1 на ЕР-А-О. 11.5.613: E.coli, НВ 101, трансформирана с експресионен клон рЕР 33 като стандарт

PL-Протичащ през колоната оуфер

Ь) По-нататъшно пречистване

Диализираният и концентриран CPG-елюат се разрежда в съотношение 1:5 с буфер А (0,1 М натриев фосфат рН=6,25/ 25%

1,2 пропиленгликол и се пренася върху инжекционен уред 'Superloop' (Pharmacia) със скорост 0,5 мл/мин върху еквилибрирана с буфер A MonoS 5/5 колона (Pharmacia, катионообменник). Елюирането се постига чрез 20 мл линеарен градиент от 0,0 до IM NaCl в буфер А при поток 0,5 мл/мин. Събират се фракции по 1 мл и се изпитват за интерферонна активност с CPE-редукционен тест. Активните фракции се събират.

Пример 12

Характеризиране на човешки интерферон-омега!

A. Антивирусна активност върху човешки клетки

B. Антивирусна активност върху маймунски клетки

C. Антипролиферативна активност върху човешки Burkittлимфомни клетки ( клетъчна линия Daudi)

D. Антипролиферативна активност върху човешки цервикално-карциномни клетки (клетъчна линия He-La)

E. Киселинна стабилност

F. Серологична характеристика

А. Антивирусна активност върху човешки клетки

Клетъчна линия: Човешка белодробно-карциномна клетъчна линия А549 (ATCC CCL 185)

Вирус: Миши енцефаломиокардитен вирус (EMCV)

Тест-система: Задържане на цитопатичния ефект (всички титрации са проведени 4 пъти).

Частично пречистен препарат от човешки интерферономега1, с белтъчно съдържание 9,4 мг/мл се титрира в подходящи разреждания в гореспоменатата тестова система.

Препаратът показва антивирусно действие със специфична активност 8300 единици спрямо референтен стандарт Go-23-901527.

B. Антивирусна активност върху маймунски клетки

Клетъчна линия: GL-V3 маймунска клетъчна линия (Christofinis G.J., J.Med. Microbiol. 3, 251-258, 1970)

Вирус: Везикуларно-стоматитен вирус (VSV)

Тест-система: Плакоредуциращ тест ( всички титрации са проведени 4 пъти)

Описаният в пример 12А препарат показва специфична антивирусна активност 580 Е/мг в горепосочената тестова система.

C. Антипролиферативна активност върху човешки Burkittлимфомни клетки (клетъчна линия Daudi)

Човешка Burkitt-лимфомна клетъчна линия Daudi се отглежда в присъствието на различни концентрации от човешки интерферономега1. След три-, четири- и шестдневна инкубация при 37°С се определя клетъчната плътност; нетретираните клетки служат като контрола. Всички култури се залагат трикратно паралелно. От следващата илюстрация проличава, че интерферон-омега показва подчертано подтискане на клетъчната пролиферация при концентрация от 100 антивирусни единици (IE, вж. пример 12А) за мл. При концентрация от 10 IE/мл се наблюдава частично транзитиращо подтискане. ( В следващата фигура са използувани следните символи: О-конгрола,£2Г 11Е/мл,п-10 1Е/мл, ▼ 100 1Е/мл).

- 65 15

D. Антипролиферативна активност върху човешки цервикално- карциномни клетки (клетъчна линия He-La)

Човешката цервикално-карциномна линия He-La се отглежда в присъствието на следните протеини, респ. протеинни смеси: Човешки интерферон-омега! (вж. пример 12А) 100 IE/ml

Човешки гама-интерферон (вж.пример 12А) 100 IE/ml

Човешки тумор-некрозис фактор (Hu TNF),=98% пречистен, произведен от Genetech Inc., San Francisco, USA (вж. Pennica D. et al., Nature 312, 724-729, 1984) lOOng/ml.

Всички бинерни концентрации на гореспоменатите протеинови концентрации, както по-горе.

По две култури се залагат в 3 см пластмасови петрита за тъканни култури (50 000 клетки за петри) и се инкубират шест дни при 37°С. Накрая се определя клетъчната плътност. Третирането на клетките с HuTNF или HuINF-омега има незначително влияние върху клетъчния растеж, докато HuIFN-гама има подчертан цитостатичен ефект. Комбинацията между интерферон-гама и интерферон-омега показва синергично цитостатично и цитотоксично действие.

Следващата фигура показва резултатите от изследването.

Използувани са следните символи: С-нетретирана контрола, ТHuTNF.O- HuIFN-омега, G-HuIFN-гама.

• · · · ·		1 i		IT	Lil1	Uni-	ί i ‘..i	• I zr .· s: *
: _7т.·.·	i—:iG ·:=Ξϊ.-1::ϊγΞ	••IT· if						L1 : : *--
	.: :::1 -: ? L-L*.	.:.1 -.: i: • · ... · .	TLiLTiTrf	Μ·	ни		Lu
•		.· 1 ..Г-: I l :	•: ‘ ~~ .4 =4			тг: :
: -	..-ί7λ; : 1	Γί · «·’ ·.	t ··.	nr. :i:.		bt-i
	4:1-	·! K·	-—4 - τ’τ ί ,1.. . · -. · .-. ..4		-Ъ:1 —		» - ♦ . ♦
• . :		LIT			:.: .1 ;::: i	l;i ·.·	·	: * r
	• T TTI L !	LiTL	-: 1 : :: . .ι.— i -?·· ·		: ΛΙ . :·. t	•Li i’l	ψί-	i '! . r: .'T
• . * : · .1	<4 ·-·; ·· ‘L : I	. · . ! : :... • · i · . ·	,Τ Τ· :т-	U •		-..1 r 1 1	l l	i: i i · · ; · :. • . . . ’ .
..: l·! . 1	-. >ιΤ+Ο' : :: ..:. i . ··;··;*;·	: i i : I * . 1 .	-,-. :::- : :-. . · i :·	:: | 1	-· 1	Tllii ...;i -.1	:|·ί Ί Γ	:L4 T-

I

E. Киселинна стабилност

За изследване на киселинната стабилност на човешки интерферон-омега1 се взима разреждане на описания в пример 12А препарат в клетъчна културална среда (RPMI 1640, 10% фетален телешки серум) и се довежда до pH 2 с помощта на солна киселина. Инкубира се 24 часа при 4⁰С и се неутрализира с натриева основа. Тази проба се титрира в антивирусен тест (вж. пример 12А); тя показва 75% от биологичната активност на инкубирана в неутрално pH контрола. Интерферон-омега1 се обозначава като киселинно стабилен.

F, Серологична характеристика

За определяне на серологичните свойства на човешки интерферон'-омега1 в сравнение с човешки интерферон алфа2, пробите (разредени до 100 IE/ml) се преинкубират 90 мин при 37°С с равни обеми от разтвори на моноклонални антитела или поликлонални антисеруми. Накрая се определя антивирусната активност на пробите. Следващата таблица показва, че човешки интерферон-омега се неутрализира в сравнително висока концентрация само от един антисерум срещу човешки левкоцитен интерферон, но не и от антитела, насочени срещу човешки интерферон- алфа2 или човешки интерферон-бета. Следователно HuIFN-омега 1 не е серологично родствен нито с Ни11^;1Ч-алфа2 нито с HuIFN-бета.

Издание на Патентното ведомство на Република България

1113 София, бул. Д-р Γ. М. Димитров 52-Б

Експерт: Ст. Стефанова Редактор: Е. Синкова

Пор. 37292

Тираж: 40 ЗС

А

” г. . . ГУ f , г, - -» ·	г->зпеждане Неутрализиране от
е.к/: сн о Λπ τ··'· ,κπ ο	pg/ml HuIFN-a2 HuIFN-omegal

EEI-11}	1	+	-
	10	++ +	-
	100	+++	-
	1000	-	O
EBI-315	1	++ +	-
	10	+++	-
	100	+++	-
	1000	+ ++	0
L3B72)	100	+++	0
	1000	+++	0
Овче-аип-
w „ T, „ -IFN3'	1:50 000	+ + +
леекопит.
	1: 5 000	++ +	0
	1: 500	+++	+
	1: 50	-	+++
Заеипсо-анти
HuiFN-a2	1: 1 000	+ + +	-
	1: 100	+++	0
	1: :10	-	0
Овче-анти‘ Λ \
Util FN-B	1 : .50	-	0

^п = виж ЕР-А-0.119.476 ·» 1 “ = A. Berthold et al. in Arzneimittelforschung 35,

364-369 (1985) = Research Reference Reagent Catalog No. G-026-502-568

4) = Research Reference Reagent Catalog No. G -028-501-568 • ·

Research Resources Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, USA.

h етестузано h еутралицация

Ьез неутрализация + частична +++ пълна неутрализация

Claims (10)

1. Патентни претенции

   1. Рекомбинантна човешка ДНК-молекула, съдържаща кодираща последователност за нови човешки интерферонови протеини от тип I, състоящи се от 168-174 аминокиселини, за интерферон-псевдо-омега2 (вж. фигура 12), интерферон-псевдоомегаЗ (вж. фигура 13) или интерферон-псевдо-омега4 (вж. фигура 14), характеризираща се с това, че кодиращата последователност е хибридизирана при строги условия, които дават възможност да се разпознае хомоложност по-голяма от 85% с инсертите в срязващия участък на Pst-Ι: а)на плазмид Е76Е9 в E.coli 101, депозиран в DSM под номер DSM 3003 или Ь)на плазмид Р9А2 в E.coli НВ 101, депозиран в DSM под номер 3004.
2. 2. ДНК молекула, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че при строги условия, дава възможност за разпознаване на хомоложност, по-голяма от 90%.
3. 3. ДНК молекула, съгласно претенции 1 и 2, характеризираща се с това, че кодиращата последователност присъствува като инсерт в срязващия участък на Pst-Ι: а)на плазмид Е76Е9 в E.coli 101, депозиран в DSM под номер DSM 3003 или Ь)на плазмид Р9А2 в E.coli НВ 101, депозиран в DSM под номер 3004.

   или дегенерирали варианти на този инсерт.
4. 4. ДНК молекула съгласно претенции от 1 до 3, характеризираща се с това, че пренасящото средство е плазмид, който е реплицируем във прокариоти и еукариоти.
5. 5. ДНК молекула, съгласно претенция 4, характеризираща се с това, че е средство за експресия, реплицируемо В микроорганизми или клетки на бозайници.
6. 6. ДНК молекула, съгласно претенция 5, съдържаща последователността:

   - a. -

   TGT GAT CTG сст CAG ААС CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 45 GTG СТТ CTG САС САА ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 90 AAG GAC AGA AGA GAC ТТС AGG TTC CCC CAG GAG ATQ GTA AAA GGG 135 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC: ATG TCT GTC CTq CAT GAG ATG 180 CTG CAG CAG АТС ТТС AGC СТС TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 225 GCC TGG ААС ATG АСС СТС СТА GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 270 CAG САА CTG САА САС CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 315 GAA GGA GAA ТСТ GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 360 AGG AGG ТАС ТТС CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 405 ТАС AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 450: тсс TTG ттс ТТА ТСА АСА AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 4 9 5 1 GAT AGA GAC CTG GGC ТСА TCT 516'
7. 7. ДНК молекула, съгласно претенция 5, характеризираща се с това, че ДНК молекулата съгласно претенция 6 съдържа нуклеотид А вместо нуклеотид G в позиция 332.
8. 8. ДНК молекула съгласно претенция 5, характеризираща се с това че е а) плазмида Е76Е9 в E.coli 101, депозиран в DSM под номер DSM 3003 или Ь) плазмида Р9А2 в E.coli НВ 101, депозиран в DSM под номер 3004.
9. 9. ДНК молекула съгласно претенции 6 и 7, характеризираща се с това, че допълнително съдържа ДИСК секвенция с формула

   ATG GCC СТС CTG ТТС CCT СТА CTG GCA GCC СТА GTG ATG ACC AGC TAT AGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC_? кодираща водещия пептид.·
10. 10. Ген за интерферон-омега! с формула