SU1346048A3 - Способ получени клона бактерий ЕSснеRIснIа coLI,трансформированного плазмидой pBR322,содержащей вставку РSт-1,кодирующую интерферон @ или @ - Google Patents

Способ получени клона бактерий ЕSснеRIснIа coLI,трансформированного плазмидой pBR322,содержащей вставку РSт-1,кодирующую интерферон @ или @ Download PDF

Info

Publication number
SU1346048A3
SU1346048A3 SU833598429A SU3598429A SU1346048A3 SU 1346048 A3 SU1346048 A3 SU 1346048A3 SU 833598429 A SU833598429 A SU 833598429A SU 3598429 A SU3598429 A SU 3598429A SU 1346048 A3 SU1346048 A3 SU 1346048A3
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
dna
mmol
clone
interferon
cdna
Prior art date
Application number
SU833598429A
Other languages
English (en)
Inventor
Дворкин-Растл Эва
Дворкин Марк-Брус
Адольф Гюнтер
Мейндл Петер
Бодо Герхард
Светлый Петер
Original Assignee
Др.Карл Томэ Гмбх (Фирма)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6164725&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SU1346048(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Др.Карл Томэ Гмбх (Фирма) filed Critical Др.Карл Томэ Гмбх (Фирма)
Application granted granted Critical
Publication of SU1346048A3 publication Critical patent/SU1346048A3/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к области биотехнологии и генной инженерии . Целью изобретени   вл етс  одновременный отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, ксдируюпщм ei- и 0-интерферон. Одновременный отбор клонов обеспечиваетс  наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональными IFN-Ыи генами. Участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAACTG-3 . Кроме того , и РНК из клеток Namalva выдел ют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осугчествл ют на (Л) РНК с величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о. иэ ы

Description

Изобретение относитс  к области биотехнологии и генной инженерии.
Целью изобретени   вл етс  одно- временный отбор клонов, несущих рекомбинатные молекулы ДНК с геном, кодирующим с.; - ий -интерферон.
Одновременный отбор клонов обеспечиваетс  наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональшлми IFW-ei- и IFN-fl-генами. При этом участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAA- CTG3 . Кроме того, и РНК из клеток Namalwa выдел ют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осу .ществл ют на (А) РНК с величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о.
Пример 1, Выбирают подход щие клетки дл  производства поли(А) РНК, которые содержат человеческие IFN-ciH IFN-|3- иРНК,.
Различные человеческие клетки индуцируют сендайвирусом; дл  про™ изводства интерферона известными методами . Через 24-48 ч определ ют содержание IFN-ci и нейтрализацией специфической дл  типов антисывороткой « ,
Вы вл ютJ что клетки намальва продуцируют более 50% IFE-et и до . 50% IFN-|i после индукции сендайвиру- сом,
Тест на нейтрализацию провод т следуюпщм образом.
Приблизительно 10 ед,, интерферона инкубируют при 37 С в течение 60- 80 мин:
1 ) антисыворотка против IFN-c i; окончательное разбавление
2)антисыворотка против человеческого IFN-ft; конечное разбавление l:300j
3)смесь первой и второй антисыво роток.
После инкубации определ ют остаточную активность интерферона методом определени  стерилы-1ых п тен,
П р и м е р 2„ Получают поли(А) РНК, котора  содержит человеческие IFN-ct- . :иРНК из клеток намальва, индуцированных сендаивирусом.
Развод т клетки намальва и инду цируют сендаивирусом. иРНК выдел ют через 9 ч после индукции сендаивирусом , так как после этого интервала количество интерферонспецифнчефсих мРНК достигает максимума,
Клетки отдел ют центрифугированием в течение 20 мин при 1000 g, один раз промывают буфером NP-40 (0,14моль
ИаС1, 1,5 ммоль MgCl, Ю ммоль трис- НС1, рН 7,4) и ресуспендируют в NP 40 (Shell)-буфере с О,-5% неионного детергента (Шелл) и 2 мг/моль бентонита. Через 5 мин в лед ной
бане клеточное  дро центрифугируют, пеллетируют, как описано выше, экстрагируют содержащую РНК цитоплазмичес- кую фракцию добавлением 2% натрий- додецилсульфата, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты и
50 ммоль трис-НС, рН 9, затем триж ды смесью фенол - хлороформ и один раз хлороформом и непосредственно после этого осаждают РНК спиртом,
ПОЛИ(А)РНК очищают с помощью олиго- (dT)-целлюлозной хроматографии, в результате центрифугировани  в 5- 20%-ном градиенте сахарозы в Юммоль буфера ацетата натри , рН 5,5,,
i ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты(20 ч при скорости 25000 об/мин с ротором Spinco SW 27) раздел ют по величине молекулы и собирают молеку- л-ы величиной пор дка 6 S (единица седиментации) и 18 S (дл  простоты названна  поли 12S-PHK).
Содержание интерферонспецифичес- кой иРНК (iFN-ciH IFN, мРНК) определ ют в результате микроинъекции 12S-PHK в ооциты херононуса, измер ют активность интерферона в ооцитах. При этом получают 1 щ- г инъецированной (12S-PHK среднего титра интерферона около 1000 IE интернациональна  единица интерферона , счита  на
стандарт интерферона 69/19.
При этом около 80% -активности нейтрализуетс  антисывороткой против oi-типа интерферона, в то врем  как обща  активность нейтрализуетс  толь-
ко смесью, состо щей из анти-о -1-И анти-|6-интерферона антисыворотки,
Пример 3. ПОЛН(А) РНК, котора  имеет величину молекулы 5-18 S
()5 примен ют в качестве матрицы дл  получени  однониточной кДНК, причем 40 |1| r/ivm поли(А)РНК инкубируют в 50 ммоль трис-НС1, рН 8,3, 10 ммоль MgClj, 100 моль КС1, 1 ммоль
(fflTPS, 0,4 ммоль дитиотрейтола,
4 ммоль пирофосфата натри , 20/ц г/мл олиго (деокси/тимидина 12-18 (Р1г-био хими ), 25 (U г/мл актиномицина D со 100 ед/мл АМУ обратной транскрипта3134
зы в течение 45 мин при 44-45°С. Непосредственно после этого PHk гибрида РНК-ДНК удал ют путем одночасовой инкубации в 0,3 моль NaOH при 50 С, после чего однониточную кДНК нейтрализуют и осаждают этанолом.
Втора  нитка ДНК, комплементарна  к однониточной ДНК, синтезируетс  при следующих услови х: 30 ш г/мл од- нониточной кДНК инкубируют в 0,12 моль буфера фосфата кали , рН 659, 10 ммоль MgCl, 10 ммоль дитио- трейтола, 1 ммоль dNTPS с 300 ед/мл ДНК поли1.1еразы 1 (Bolhringer Mann- heim), 6 ч 15°С. Затем экстрагируют фе:-олом и осаждают этанолом.
Полученную таким образом двуниточную смесь кДНК у обоих концов нитки модифидируют, удал ют выступающие концы отдельных нитей. Дл  этого ДНК инкубируют в 0,3 моль NaCl, 30 ммоль ацетата натри j рН 4,5, 1 ммоль ZnCl с 1250 ед/мл S 1 нуклеазы (Miles Laboratories) в течение 30 мин при , после чего экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Полученную таким образом двуниточную кДНК раздел ют на 5 20%-ном градиенте сахарозы в 10 ммоль буфера ацетат натри  при рН 5,5, в I ммоль этилен- динитрилотетрауксусной кислоты и выдел ют те фракции, которые имеют по крайней мере 600 о.п. кДНК (0,5шг) удлин ют приблизительно на 15 нуклео
тидов путем наложени  олигодезокси- цитидина у 3 -конца обеих в результате инкубации в 140 ммоль калийкако зилата, рН 6,9, 30 ммоль трис-НС1, рН 6,9, 2 ммоль СоС, 0,1 ммоль ди- тиотрейтола, 0,1 мг/мл BSA, 5 |Х моль dCTPs с помощью 500 ед. терминальной трансферазы в течение 4 мин при 37°С Аликвоту 2 1г г pBR322 линеаризз т с помощью, рестрикционной эндокуклеазы Pst 1, смесь кДНК удлин ют путем на- ложени  олигодезоксигуанидина у конца 3 молекулы и модифицируют, ча  выступаюпще концы олигодезокси- гуанидйна. Получают стабильные днДНК путем основного спаривани  концов олигодеоксигуанидина со свободными
концами олигодезоксицитидина молекул кДНК. Дл  этого оба компонента этой реакции инкубируют в 0,1 ммоль-NaCl, 1 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 20 ммоль трис-НС1, рН 8, в течение 10 мин при 65 С, затем в течение 2,5 ч при 45 С и затем в течение ночи при 37 С.
5 о
0
n
0
5
С помощью этого метода регенерируетс  место расщеплени  рестрикционной эндонуклеазой Pst 1 и в последствии это можно использовать дл  того , чтобы вырезать из векторного гибрида кДНК-вставку.
Полученные этим методом гибрид- плазмиды из pBR322 и намальва-кДНК примен ют дл  трансформации Escheri- chia coli НВ 101 Этим методом полу чают 30000 клонов трансформированных клеток Е„ ccli, которые раздел ют на микротитропластинах.
И р и м е р 3. Тридекануклеотид мет т в 50 ммоль трис-НС, рН 7,5, 10 ммоль MgCl, 5 ммоль дитиотрейто- лд, О 5 1 нмоль спермидина, 1 rii м Р /р-аденозинтрифосфата с 60 ед./мл Т4 полинуклеотидкиназы (Bethesda Research La,boratories) в течение 30 мин при 37 С до специфической активности около 500 Ки/ммоль у 5 -конца молекулы.
Этот меченый Тридекануклеотид примен ют в качестве праймера (Dsi- mes) дл  синтеза однониточной кДНК, при этом в качестве матрицы служит ПОЛИ{А)ДНК из индуцированных сендаи- вирусом клеток намальва. Реакцию провод т при 5-10-кратном мол рном избытке праймера по отношению к РНК в 50 ммоль трис--НС1, рН 8,3, 60 ммоль КС1, 5 ммоЛь дитиотрейтола, 50р г/мл актиномицина I , 4 ммоль MgCl , .4 ммоль натрийпирофосфата, 0,5 ммоль dNTPS со 100 ед./мп АМУ обратной транскриптазы в течение 90 мин при 37°С. После удалени  РНК гибрид РНК- ДНК инкубирук т 1 ч в 0,3 моль NaOH при 50 С с последующей нейтрализацией 0,3 моль уксусной кислоты и кДНК примен ют в качестве пробы гибридизации . Полученна  таким образом кДНК несет радиоактивнзто метку липь в молекулах, которые были синтезированы из интерферонспецифического три- декануклеотида в качестве праймера и, следовательно, обладает высокой специфичностью дл  опознани  интер- феронДНК-последовательности в гибридизации .
П р н м е р 4. Клетки отдельных клонированных трансформантов перевод т на нитроцеллюлозный фильтр (22x15 см, величина пор 0,45 им, Millipore odes Schlliches), выращивают до величины колонии 2 мм диаметром и подготавливают к гибридизации . Гибридизацию нуклеиновой кислоты меченой на концах кДНК прово д т в смеси, содержащей 50% форм- амида, 4xSET (lxSET 0,15 моль NaCl, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксус ной кислоты, 50 ммоль трис-НС, рН 8), 1 раствора Денхардта (0,02% BSA, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирро- лидона), 0,5 мг/мл денатурированной спермы лосос  ДНК, 0,1% натрийпиро- фосфата и 0,1% натрийдодецилсульфа- та, в течение 48 ч при 37°С. Фильтр промывают в растворе, состо щем из 50% формамида и 0,2xSSC (1х SSC 0,15 моль NaCl, 0,015 моль нитрата натри ) при С в течение 6-8 ч и затем опрыскивают раствором IxSSC. Фильтры высзтпивают при 20-2 5°С и при -70°С экспонируют с рентгеновс- кой пленкой (кодак ХВ). Всего в рв зультате скрининга получают приблизительно 13000 трансформированных колоний бактерий и вьщел ют 190 клонов В соответствии с этим около 1% всех клонов клонбанка содержат специфическую последовательность dCCTTCT- GGMCTG.
Прим ер 5. Тридекануклеотид- позитивные клоны (микротитропластины PI и Р2) и произвольно выбранные клоны микротитровой пластины (Е52) перенос т на нитроцеллюлозный фильтр развод т , подготавливают дл  гибридизации бактерий и гибридизуют различными Р-меченными кДНК-вставками. Гибридизацию провод т. Добавл   в раствор гибридизации 50 ju г/мл поли(и и lOfur/мл поли (l) : поли(С), фильтр промывают после гибридизации в 50%-ном формамиде и 1х SSC. Оказа- лось, что клон Р1Н1 гибридизирует более чем 90% всех тридекануклеотид- позитивных клонов пластины Р1 и Р2, а также некоторые клоны пластины Б;52 Идентичность многих этих клонированн последовательностей подтверждают ре- стрикционным анализом. Клон Р2Н10 гибридизируетс  не только сам с собой , а также с клоном позиции 1С12, IF12, Е52Е1. Клоны Р1А6 и Р2В10 ана- лизирзтот таким же методом.
П р и м е р 6. 11оли(А)РНК отдел ют от индуцированных и неиндуцирован ных клеток намальва, денатурируют в результате инкуба1щи в течение 1 ч при в 1 моль глиоксал , 50%-ном диметилсульфоксиде, 10 ммоль буфера фосфата натри , рН 7, раздел ют на
1,4%-ном плавающем агаре, перенос т на нитроделлюлозный фильтр и-гибри- дизируют с плазмндной ДНК, Р-мечен- ной с помощью никтрансл ции. Плазмид- ную ДНК, котора  произошла от индуцированного гена, гибридизируют в этой серии опытов только РНК из индуцированных клеток, но не РНК из неиндуцированных клеток. Примен емые дл  гибридизации плазмиды-ДНК  вл ютс  РШ1 (А), P1.FI2 (В,1), Р2Н10(С) Р1А6 (Ё), Р2В10 (г). Из испытанных плазмид гибридизировались только P1F12, Р2Н10 и Р1А6 только с РНК из индзо ированных клеток, в то врем  как Р1Н1 и Р2В10 гибридизуютс  также с РНК из неиндуцированных клеток. Величина молекулы РНК, гибридизирутощей- с  с P1F12 и Р2Н10, 11-12 S, вели- чина РНК, гибридизирующейс  с Р1АН, 12-14 Б (эти величины молекул известны дл  TFN-ci или IFN-/i-HPHK.- Пла-зми- ды P1F12, Р2Н10 и Р1А6 исследуют- дополнительно, чтобы однозначно установить их содержание в интерферонДНК- последовательности.
П р и м е р 7. Плазмидную ДНК фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и инкубируют при услови х гибридизации с ПОЛИ(А) РНК из индуцированных клеток намальва. Получают св занную ДНК-последовательность интерферона, Негибридизированную РНК смывают, гиб- ридизированную РНК вьтлавл ют из ДНК и инъецируют в ооциты Xenopus laevis Если в ооцитах синтезируетс  интерферон-протеин , антивирусные свойства которого могут быть доказаны методом подсчета стерильньпс бл шек, 10 г линеаризованной плазмидной ДНК дена- турирзтот в 200 |цл 0,5 н. NaOH, нейтрализуют 200 ju л 0,5 н. уксусной кислоты и 20 X SET и фильтруют св зыванием на нитроцеллюлозном фильтре диаметром 2,5 мм. Фильтр высушивают при комнатной температуре, выдерживают 2 ч при 80°С и затем в течение 1 ч при 53 С или также при 37 С в смеси, содержащей 50% формамида, 20 ммоль nHnepa3HH-N5N -биc-(2-этaн cyльфoкиcлoты), рН 6,5, 0,4 моль RaCl, 5 ммоль этилендинитрилотетра- уксусной кислоты, 10% декстрансульфа- та, 1% натрийдодецилсульфата,20|чг/мл Е. coli ntPHK, 50 jur/мл поли(А)пре- гибридизированной, и в самом буфере после добавлени  14-40 (Иг индуцированной намальва-поли(АГ РНК гибридизировали в течение 5 ч. После этого фильтр промывают 3x20 мин при 25°С в смеси, содержащей 0,2-1 SET, 0,2% натрийдодецилсульфата, 1% декстран- сульфата, 5 (цг/мл т-РНК, затем 2 мин при 25°С в смеси, содержащей 2 ммрль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% натрийдодецил- сульфата, 1% декстрансульфата, 5 |иг/мл т-РНК, затем 5 мин в смеси 2 ммоль этилендинитрилотетра- уксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% нат- рийдодецилсульфата, 1% декстрансульфата , 5 (U г/мл т-РНК, затем 5 мин при в 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2% натрийдодецилсульфата, 5 lu г/мл т-РНК. Гибридизированную РНК в течение
4мин элюируют при 100 С в 1 мл Н,20 с 10 /иг т-РНК. После хроматографии на олиго-((1Т)-целлюлозной колонке РНК осаждают этанолом, внос т в
5мл HjO и инъецируют в ооциты Хе- nopus laevis. Ооциты после инкубации- в течение 2 дней при комнатной температуре испытывают методом подсчета стерильных бл шек на активность интерферона .
Подтвердилось, что клоны P1F12 и Р2Н10 несут вставку интерферонДНК.
В таблице приведены результаты испытаний.
Пример. Исследуют вставки кДНК клона P1F12 и Р2Н10 с помощью рестрикционной эндонуклеазы, причем определ ют наличие сайтов рестрикции эндонуклеаз B&JnHI, Bgl II, Eco RI Hind III, EstI и Pvxi II. Сравнивают рестрикционные карты P1F12 и Р2Н10 с известным из литературы геном дл  IFN-p. Все три клона имеют Pvu II,
0
PstI и Bgl Ii сайты рестрикции. Кроме того, последовательность ДНК вставки клонов P1F12 и Р2Н10 с IFIJ- геном определ ют по методу Максама и Гилберта (правый 3 Рлш II - и Bgl II фрагмент) и сравнивают с опубликованной IFN-|3-последовательностью . Последовательности P1F12 и
Р2Н10 идентичны с IFN- -геном.
Вы снилось3 оба клона на 5 конце не имеют полной IFN-p-последовательности , у них отсутствуют приблизительно 60 нуклеотидов региона, ко-
5 дирующего дл  зрелого протеина, У
3 -конца P1F12  вл етс  полным, Р2Н10 также содержит весь 3 -регион -кДНК, включа  поли,оА)последователь ность, лроисход щ что от ПОЛИ(А)РИК.
Q P2H1D простираетс  однако епе замь:Т- .нее (1400 п.о.), З пoли(dA) в одной области с последовательностью олиго(д.С), следу  от последовательности неизвестного происхождени , ана5 ЛИЗ ДНК-последовательности различных отрезков этого дополнительного региона Р2Н10 не дает гомологии с геном. Перекрестно гибридизированные с клоном Р2Н10 клоны Р1С12 и Е52Е1 гибридизируютс  и с дополнительным регионом Р2Н10, а не с частью IFTJ-j, Примере. Клон Р1А6 гибриди- зируют с вирус-лндуцнрованной намаль- ва-РНК в регионе 12-14 S. Он содержит вставку кдак приблизительно 900 п.о., котора , как показал ре- стрикционный анализ, не имеет сайта рестрикции дл  BamHI, Bgl II, Eco RI, Hind III, PstI и Pvu II.
Доказательство того, что клон Р1А6 содержит IFK-|9-последовательность получают путем анализа ДНК- последовательности , Последовательность кДНК-вставки Р1А6 определ ют сравнением с IFN-oi-последовательно- стью. Оказалось, что клон Р1А6 содержит на 49 пар оснований более короткий вариант LelFNC. Наличие поли-(А)- последовательности у З -конца Р1А6 указывает на то, что клон Р2А6 произошел от более короткой иРНК, чем опубликован1л.1Й клон LeIFN С.Регион кодировани  LeIFN С, содержитс  в плазмидной ДНК.
5 И р и м е р 9. Клон Р1А6 - единственный 1П 1-Л-тип клона индентифи- цируют из коллекции 190 тридекану- клеотидпозитивных клонов. Гибриди- зуют 1800 клонов первоначального
0
5
0
9
кДНК-бакка со вставкой кДНВ клона Р1А6с | Тровод т рестрикнионный анали и час тйчно определ ют ДНК- Последова тельность кЦНК данного клона. Выл,е- л ют клон IF7„ Клон IF/ содержит как LeIFN А и сайты рестрикции дл  эндонуклеаа Bgl II и Ц,
Анализируют последовательносT)J «части ДНК IFN--(,i.-tHrfa клона (IF7) .
Дл  позиций 120--327 найдены еле-- дующкге части последоБательнос: Гиs
0. , CCTCK;;-CACAGATGAGGAOAATCTCTCTTTTCr CCTGCTT -.AAGGACACACG TGAT :0 GGATTTCCC . AGGAGGA-.-TTTGGGAACCAGTTCCMAAG аСТ(Ш1 CCA TCCCTGTCGTCGAT(; AOATGATCCAGCAGA TCTTCAA.TCTCTTCAGCACAAAaGAC TGATGv GGTGGTTGGGATGAGACGC JCCTA(;;,/ .CAAATTCT,i:
По сг авненкю с последовательнс -- стью IF:4 .fi--A THna клона, известкой литературы, нова  последова.тепькост ДНК IFfi ;А-типа хли;::й ( з иблист нуклеотцаов № 120- 327  меет скедуп-- щие различн ; в позицклю 137 н 170 соответ.:твенно нукле(;т д А з-аыещеш нуклеотидом G-
П р и мер 10. .Пизаты культу бактерий,, траксфорккронанных PlAi; кл IF7 5 иесмшдуюг . -содержание биологически а:к ;квногт)  вгерферс а  , Дл  этого 1GO мл культv p t i б.;лктернй вьфа; щивают г L-Bro :,h--cps-.i- дс опт чэ-мсс плотнос ги ,, 8 ггелу втир удот тем цен л рифул- ИроБО - К;. в г еч ние 10 мин . рк 7000 об. ;жн. прокьнают
50 ммоль трис - HGl,. рл 6. 30 и-лсл KaGl и суспендирукт в i.5 моль тсгс же самог о буфера. После 1 Ш:куба,ци; Е
1МГ/М31 лкзоциь;а в 1ч:чение 30 миь бактерии :а гикра г::-ю амора кивают во льду и с | ч аивают j иослг. з тэго удгллют центрифугированием в течение 1 ч при 40000 об/мин обломки клеток, Осадок стерильно фильтрз от и метсдо подсчета стерильных бл шек  спытъ, вают на активнс1сть кнтарферонае 1 полученных таккм ,четодом л затах кл на IF7 1оказьшаит наличие прибли;и-- те.г1ьно 500 ед, на мл инчерферона; клон ЧАб в этом i ec 1-a не показал
активности, что объ сн етс  ,верой 1Н другим ориентированкйм зс газки з ве торе плазмидыо
Пример S 1, Д-1Я :;; с иесси;-: интерферона 3 кодированного IF7. s к честве промоторной лоследоватепьаос ти берут известньш из литературы пр мотор триптофаи:оперона Serratia. marcescens;, а ь жа-шстзе Г1РС - извв
10
стную из литературы последовательность ДНК. IF7-кДHK нocлeдoвaтeль- ность переваривают экзонуклеазой BAL 31S специфичной дл  двуниточной ДНК, в результате чего получают смесь молекул различной длины Затем эти i-.юлекулы лигируют в плазг-шду Штамм НВ1 01 трансформмруют зтнми плазмида- :-Ш; отдельные транСхформанты были ис пытаны на продукцию интерферона.
0,5-1 г TF7-3ставки инкубируют в 100 л 20 ммоль TpHc-HGl, рН 8,1
О.б моль Na,Gl5 12 ммоль MgGlg.j
i 2 ммоль GaGI.25 1 ммоль этилендинит- рршотетрауксусн.ой киспоты в течение 3 мик лрн 30°G с 0;5 ед, ВА1-31 rFjethesda Researcli Laborat. )« После этог о реак тим чаканчива,ют доба.влением 300 .; л 1Ь ммоль этилендинитрилотет- рауксусной кислоть;„ рН 1 .;й., нагревают 1 О- :VMH до G5 G5 экстрагир ук т Фенолом и эфиром и осаждают этанолом.
Осгдок внос т в И) тл 70 ммоль трис- KClj рН , 7 ммоль MgGl,„ i ммоль дитиотрей голад 0,4 ммоль аденозинтри- (Ьосфата, вместе с ммоль фосфо ризированных Hind ТЦ-левых (Bethes- da Research АаЪО Га ;, ) и инкубирут-тт
3 течение ночи при 14 € с О.,5-1 ед.
еакл шс заканчивают нагреванием в течение 10 мин до 65 G,, добавл ют
2моль Н -аиетата и очищают гены ин - ерферона от нелигированных левых
и 3 о п р о п а н о л о м (0,6 о б ъ е м а)о Осадок раствор ют ;з 30--50|цл 33 ммоль трис- ацетата.; рН- 7;9. бь ммоль К-а детата ;0 ммоль Mg-aireTaTa, i00 (ц г/мл сыво ротки альбу1-шна Бо винаи и переваривают 30-50 ед. H-.nd III в течение 23ч„ Реакдшо заЧа11ЧИБают путем нарезани  в течение
мин до 65 Си
посла добавлени  2 моль NH -ацетата гены интерферона осаж,дают изопропа- иолом 1,0,0 эоъема.) : Осадок раствор - ;от Б 10л 70 1 П ;оль трис- КС, рН 7,5, 7 ьмоль MgGIg S ммоль дитиотрейто jiE;, Up5 ммоль аденогзинтрифг сфата и с помор ью 10 ед„ Т4 -лигазы лигиру :от с 0,,2 ;иг Hind III - линеаризо- :t;a-:iHbiM обработанным фосфатазой экс- нрессионньпу; плазмидом рЕРЮЗ в тече- ние ночи при , рЕРЮЗ  вл етс  PB.R 3 2 2-пр он 31Э о д ;-5ым S которое, с о д ерусгт :ооследовательность .промотора трипто- фаноперона S, marcescens и известную из .литературы ПРК его монно ли- н&а.ркзоЕать с Hind III вблизи ПРС.
Полученньш таким образом плазмиды примен ют дл  трансформации Е. coli НВ101 и испытывают продук1шю интерферона отдельных трансформантов. По- лучают увеличение экспрессии интерферона приблизительно до 10 -кратного значени  сии.
спонтанной экспрес Формула изобретени 
Способ получени  клона бактерий Escherichia coli, траисфгфмированно- го плазмидой рВЕ322, содержащей вставку Pst-1, кодирующую интерферон ei или f , вкгаочаюрщй получение фрагментов кДНК, содержащих кодирующую последовательность дл  генов об- и |Ь-интерферона, путем вьщелени  иРНК из индуцированных вирусом Сендай клеток В-лимфоцитов синтеза на матрице поли( А) кДНК с помощью обратной транскриптазы, получени  на основе одн, кДНК дн. ДНК в присутствии ДНК полимеразы 1, которую далее обрабатывают S-нуклеазой и присоедин ют к 3 -концу этой ДНК олигодезоксицити- дин дп  нуклеотиды с помощью конце-
Составитель Н.Кузенкова Редактор Л.Веселовска  Техред И,Верес
Заказ 5728Тираж 500Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб,, д. А/5
.Троизводственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4
0
5
0
5
вой дезоксирибонуклеотидилтрансфера- зы, вставку полученного фрагмента в плазмиду pBR322, которую предварительно обрабатывают эндонуклеазой Pst-l, S-1 нуклеазой, и к 5-концу которой присоедин ют олигодезоксигу- анидин нуклеотзеды и трансформацию полученными гибридными плазмидами штамма Ё. coli НВ101 с последующим отбором нужного клона, отличающийс  тем что, с целью одновременного отбора клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном,
кодирующим и и/ -интерферон, иРНК вьщел ют из клеток В -лимфоцитов Hamalva по истечении 9 ч после индукции вирусом, синтез кДНК осуществл ют на (А)РНК с величиной молеку- лъ 6 и 18 S, получают дн. ДНК размером 600 п.о., а выбор клона, содержащего комплементарную последовательность к тридекануклеотиду, меченному радиоактивным фосфором, с формулой 5 ССТТСТГгОААСТО-З осуществл ют пр мой гибридизацией с последующей идентификацией клона, содержащего рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим интерферон oi к |Ь „
Корректор В.Бут га

Claims (1)

  1. Формула изобретения
    Способ получения клона бактерий Escherichia coli, трансформированного плазмидой pBR322, содержащей вставку Pst-.l, кодирующую интерферон еб или р , включающий получение фрагментов кДНК, содержащих кодирующую последовательность для генов «6- и р—интерферона, путем выделения иРНК из индуцированных вирусом Сендай клеток В—лимфоцитов синтеза на матрице полй(А)+РНК кДНК с помощью обратной транскриптазы, получения на основе одн, кДНК дн, ДНК в присутствии ДНК 25 полимеразы 1, которую далее обрабатывают S-нуклеазой и присоединяют к Закончу этой ДНК олигодезоксицитидин для нуклеотиды с помощью конце вой дезоксирибонуклеотидилтрансфера— зы, вставку полученного фрагмента в плазмиду pBR322, которую предварительно обрабатывают эндонуклеазой Pst-1, S-1 нуклеазой, и к 5-концу которой присоединяют олигодезоксигу— анидин нуклеотиды и трансформацию полученными гибридными плазмидами штамма Ё. coli НВ101 с последующим отбором нужного клона, отличающийся тем., что, с целью одновременного отбора клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим й и β-интерферон, иРНК выделяют из клеток р —лимфоцитов Namalwa по истечении 9 ч после индукции вирусом, синтез кДНК осуществляют на (а)+РНК с величиной молекулы 6' и 18 S, получают дн, ДНК размером 600 п.о., а выбор клона, содержащего комплементарную последовательность к тридекануклеотиду, меченному радиоактивным фосфором, с формулой 5* CCTTCTGGAACTG-3' осуществляют прямой гибридизацией с последующей идентификацией клона, содержащего рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим интерферон οό и β> »
SU833598429A 1982-05-28 1983-05-27 Способ получени клона бактерий ЕSснеRIснIа coLI,трансформированного плазмидой pBR322,содержащей вставку РSт-1,кодирующую интерферон @ или @ SU1346048A3 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19823220116 DE3220116A1 (de) 1982-05-28 1982-05-28 Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1346048A3 true SU1346048A3 (ru) 1987-10-15

Family

ID=6164725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU833598429A SU1346048A3 (ru) 1982-05-28 1983-05-27 Способ получени клона бактерий ЕSснеRIснIа coLI,трансформированного плазмидой pBR322,содержащей вставку РSт-1,кодирующую интерферон @ или @

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4820638A (ru)
EP (1) EP0095702B1 (ru)
JP (2) JPH0774238B2 (ru)
KR (1) KR920006349B1 (ru)
AT (1) ATE42114T1 (ru)
AU (1) AU565479B2 (ru)
DD (1) DD211359C4 (ru)
DE (2) DE3220116A1 (ru)
DK (1) DK164742C (ru)
ES (2) ES522762A0 (ru)
FI (1) FI82072C (ru)
GR (1) GR79236B (ru)
HK (1) HK112893A (ru)
HU (1) HU196452B (ru)
IL (1) IL68790A (ru)
MX (1) MX9202815A (ru)
NO (1) NO168538C (ru)
NZ (1) NZ204384A (ru)
SG (1) SG38692G (ru)
SU (1) SU1346048A3 (ru)
UA (1) UA8037A1 (ru)
ZA (1) ZA833845B (ru)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3247922A1 (de) * 1982-12-24 1984-06-28 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten
DE3515336C2 (de) * 1985-04-27 1994-01-20 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon
US4709324A (en) * 1985-11-27 1987-11-24 Motorola, Inc. Data processor control unit having an interrupt service using instruction prefetch redirection
CA2025180A1 (en) * 1989-10-12 1991-04-13 William G. Weisburg Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts
US6685933B1 (en) * 1998-07-28 2004-02-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Interferon α hybrids
US20020197235A1 (en) * 2000-11-03 2002-12-26 Moran Stanford Mark Method for short-term and long-term drug dosimetry
FR2817559B1 (fr) * 2000-12-06 2003-12-12 Genodyssee Procede de determination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fontionnel(s) dans la sequence nucleique d'un gene "candidat" fonctionnel preselectionne et ses applications
FR2821625B1 (fr) * 2001-03-01 2003-05-16 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
FR2823220B1 (fr) * 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
EP1536839B1 (en) * 2001-11-09 2010-09-15 Intarcia Therapeutics, Inc Combination therapy comprising omega-interferon for treating infection with hepatitis c virus or yellow fever virus
US20040063912A1 (en) * 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
AU2002304965A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy
EP1539960B1 (en) * 2002-09-09 2010-04-28 Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides
JP2007519422A (ja) 2004-02-02 2007-07-19 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
DE602007009377D1 (de) 2006-05-30 2010-11-04 Intarcia Therapeutics Inc Zweiteiliger flussmodulator mit einem internen kanal für ein osmotisches ausgabesystem
US7682356B2 (en) 2006-08-09 2010-03-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Osmotic delivery systems and piston assemblies for use therein
US20080260820A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Gilles Borrelly Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides
JP5351884B2 (ja) 2007-04-23 2013-11-27 インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド インスリン分泌促進性ペプチドの懸濁製剤及び使用
CA2726861C (en) 2008-02-13 2014-05-27 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
HUE035862T2 (en) 2009-09-28 2018-05-28 Intarcia Therapeutics Inc Rapid development and / or completion of substantially steady-state drug delivery
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
WO2013024156A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2013024158A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2014033266A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
ES2968262T3 (es) 2015-06-03 2024-05-08 I2O Therapeutics Inc Sistemas de colocación de implantes
WO2017200943A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
CN110225762A (zh) 2017-01-03 2019-09-10 因塔西亚制药公司 包括glp-1受体激动剂的连续施用和药物的共同施用的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2906160A1 (de) * 1979-02-17 1980-09-04 Thomae Gmbh Dr K Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon
AU538665B2 (en) * 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
CY1346A (en) * 1980-01-08 1987-01-16 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides
GB2068970B (en) * 1980-02-06 1983-06-22 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DE3005843A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus
DE3005897A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
ES8302778A1 (es) * 1980-11-10 1983-02-01 Genentech Inc Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral.
DE3106982A1 (de) * 1981-02-25 1982-09-09 Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach "neues tridecadeoxynukleotid, verfahren zu seiner herstellung und verwendung"
IL63327A (en) * 1981-07-16 1985-11-29 Yeda Res & Dev Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria
GB2108510B (en) 1981-10-03 1984-12-12 Ciba Geigy Ag Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature, 284, 316-320, 1980. Nature, 285, 542-547, 1980. *

Also Published As

Publication number Publication date
MX9202815A (es) 1992-06-30
EP0095702A1 (de) 1983-12-07
DK164742C (da) 1992-12-28
IL68790A0 (en) 1983-09-30
FI82072B (fi) 1990-09-28
FI82072C (fi) 1991-01-10
HU196452B (en) 1988-11-28
GR79236B (ru) 1984-10-22
FI831818L (fi) 1983-11-29
ATE42114T1 (de) 1989-04-15
EP0095702B1 (de) 1989-04-12
IL68790A (en) 1991-06-10
ES529360A0 (es) 1984-10-01
JPH0678774A (ja) 1994-03-22
NO168538B (no) 1991-11-25
AU565479B2 (en) 1987-09-17
KR920006349B1 (ko) 1992-08-03
ES8403522A1 (es) 1984-03-16
JPH0774238B2 (ja) 1995-08-09
FI831818A0 (fi) 1983-05-23
DK239383D0 (da) 1983-05-27
US4820638A (en) 1989-04-11
AU1504483A (en) 1983-12-01
ES522762A0 (es) 1984-03-16
DD211359A5 (de) 1984-07-11
DD211359C4 (de) 1986-09-24
JPS5925689A (ja) 1984-02-09
NO168538C (no) 1992-03-04
HK112893A (en) 1993-10-29
DK239383A (da) 1983-11-29
DE3220116A1 (de) 1983-12-01
DK164742B (da) 1992-08-10
ES8500321A1 (es) 1984-10-01
KR840004944A (ko) 1984-10-31
ZA833845B (en) 1985-01-30
DE3379591D1 (en) 1989-05-18
DE3220116C2 (ru) 1993-02-18
NZ204384A (en) 1986-11-12
UA8037A1 (ru) 1995-12-26
SG38692G (en) 1992-09-04
JP2558422B2 (ja) 1996-11-27
NO831903L (no) 1983-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1346048A3 (ru) Способ получени клона бактерий ЕSснеRIснIа coLI,трансформированного плазмидой pBR322,содержащей вставку РSт-1,кодирующую интерферон @ или @
US5359053A (en) Modified deazapyrimidines
US4321365A (en) Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
Haynes et al. The Chinese hamster Alu-equivalent sequence: a conserved highly repetitious, interspersed deoxyribonucleic acid sequence in mammals has a structure suggestive of a transposable element
Rougeon et al. Insertion of a rabbit β-globin gene sequence into an E. coli plasmid
Tschudi et al. Polygene transcripts are precursors to calmodulin mRNAs in trypanosomes.
Kindle et al. Identification and analysis of Dictyostelium actin genes, a family of moderately repeated genes
JP2022137068A (ja) 化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集
Rowekamp et al. Isolation of developmentally regulated genes from Dictyostelium
CA3124374A1 (en) Rna-directed dna cleavage by the cas9-crrna complex
Dame et al. Cloning and characterization of a ribosomal RNA gene from Plasmodium berghei
US5089406A (en) Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences
Bhat et al. Molecular cloning and partial characterization of delta-crystallin cDNA sequences in a bacterial plasmid.
Hawkins Gene structure and expression
US4808519A (en) Method of detecting nucleic acid sequences
Rougeon et al. Cloning and amplification of rabbit alpha-and beta-globin gene sequences into Escherichia coli plasmids.
Lu et al. Nucleotide sequence of a 5S ribosomal RNA gene in the sea urchin Lytechinus variegatus
Steinbrück Overamplification of genes in macronuclei of hypotrichous ciliates
US4401759A (en) Detection and isolation of glucagon mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide
KR20220151175A (ko) 킬로베이스 스케일에서 rna-가이드된 게놈 재조합
EP0133321A1 (en) DNA gene, process for production thereof and plasmid containing the same
Semler et al. Persistent vesicular stomatitis virus infection mediates base substitutions in viral RNA termini
Merlino et al. Cloning of sea urchin actin gene sequences for use in studying the regulation of actin gene transcription
JPS60126299A (ja) 新規インターフェロンγとその製造方法
Tomarev et al. Molecular cloning of double-stranded cDNA from the eye lens of the frog Rana temporaria: construction of the cDNA clonotheque and identification of a clone containing the nucleotide sequences of the γ-crystallin gene: Gene bank; clone library; recombinant DNA; ophthalmology; poly (A)+ RNA