HU196452B - Process for producing microbiologically alpha- and beta-interferons, dna sequences encoding these interferons and microorganisms containing the genetic information - Google Patents
Process for producing microbiologically alpha- and beta-interferons, dna sequences encoding these interferons and microorganisms containing the genetic information Download PDFInfo
- Publication number
- HU196452B HU196452B HU831890A HU189083A HU196452B HU 196452 B HU196452 B HU 196452B HU 831890 A HU831890 A HU 831890A HU 189083 A HU189083 A HU 189083A HU 196452 B HU196452 B HU 196452B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- interferon
- dna
- ifn
- cdna
- rna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás oC2(Arg)-interferon, ezt az interferont kódoló DNS-szekvencia, valamint a genetikai információt hordozó mikroorganizmusok előállítására.
A szakirodalomból három humán interferon ismeretes, ezek a következők: leukocita interferon (oC-interferon, rövidítve: IFN-oC), fibroblaszt interferon (β-interferon, rövidítve: IFN-β) és immun interferon (^-interferon, rövidítve: IFN-γ). [W. E. Stewart, II, .The 10 Interferon System, Springer, WienNew York, 2. kiadás (1981)]. A vírussal stimulált emberi leukociták, vagy emberi mieloblasztoid sejtek termelik a leukocita interferont, vírussal, vagy egy megfelelő nukleinsavval indukált emberi fibroblasztok a fibroblaszt interferont és a mitogénnel, például konkanavalinnal indukált emberi T-limfociták az immun interferont.
Ezenkívül ismert még, hogy a B limfocita tipusú emberi sejtek, ilyenek például az 5 NC-37, Namalwa, Akuba vagy RPMI 1788 sejtvonalak, vírussal történő stimulálás után egyidejűleg termelnek leukocita interferont és fibroblaszt interferont [Journal of General Virology, 38, 51-59 (1977)]. Ebben az esetben a termelt IFN-cC és IFN-β mennyiségi viszonyai az indukció körülményeivel befolyásolhatók [Journal of Interferon Research, 2, 575-585 (1982)]. Például a különböző sejtvonalak Sendai vírussal indukált sejtjeiből a 15 következő IFN-oC és IFN-β mennyiségek térmelhetők:
Sejtvonal IFN-cC IFN-β . IFN-oC + IFN-β ellen termelt speciális antiszérummal neutralizált interferon aktivitás százaléka
Namalwa | 52 | 34 | 298 |
NC-37 | 40 | 52 | 297 |
Akuba | 85 | 27 | 298 |
RPMI 1788 | 68 | 29 | 298 |
Továbbá a leukocita és mieloblasztoid sejt eredetű IFN-oC gének molekula klónozása [Natúré, 284 , 316-320 (1980)]; Science, 209, 1343-1347n (1980) és a 0.032.134 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés illetve Natúré 287, 411-416 (1980), 290, 20.26 (1981); 2 079 291 számú nyilvánosságra hozott brit szabadalmi bejelentés szolgáltatta azt az eredményt, hogy az IFN-oí-t egy olyan gén család kódolja, amely legalább 10 egymástól megkülönböztethető génből áll, s ebből az következik, hogy ezen DNS szekvenciák géntermékei nem egységes proteinek, azaz az IFN-c< egymáshoz hasonló proteinek keverékéből áll. Ezeket· a szubtipusokat az irodalom a kövekezőképpen jelöli:
IFN-oC 1,2,3......... [Natúré, 287, 401-408 (1980) és Gene, 15, 379-394 (1981)] vagy LelFN A, B, C,...... [Natúré, 290, 20-26 (1981)].
Ezzel szemben azt találtuk, hogy az IFN-8-t egységes DNS szekvencia határozza meg, s ez azt jelenti, hogy a fibroblaszt interferont egyetlen gén kódolja, így nem is ismertek altípusok [Natúré, 285, 542-547 (1980)].
Jóllehet az IFN-oC-t és IFN-ű-t kódoló gének közt nem jön létre kereszthibridizáció, csak az IFN-cC gén családon belül, szekvenciáik mintegy 45%-a homológ [Natúré, 285, 547-549 (1980)]. Itt az a leghosszabb szekvencia darab, amely a funkcionális IFN-oC génekben (a hétből ötben) és az INF-β génben teljesen azonos, 13 nukleotid hosszúságú.
Ezt az 5’-dCCTTCTGGAACTG-3’ képletű tridekanukleotidot az European Journal of
Cell Biology 25, 8-9 (1981) közleményben ismertetik, és egyidejűleg javasolják, hogy ezt a szintetikus tridekanukleotidot vagy ezzel, mint primerrel szintetizált cDNS-t hibridizá35 ciós mintaként alkalmazzák Namalwa-sejt klóntár átvizsgálására és az interferon-szekvenciákat tartalmazó kiónok azonosítására.
E tridekanukleotidot tartalmazó IFN-e< gének a LelFN B, C, D, F, G; a LelFN A-ban és H-ban a 13-ból csak 12 nukleotid van meg [Natúré, 290, 20-26 (1981)].
A 2 069 970 számú nyilvánosságra hozott nagy-britanniai szabadami leírásban hasonlóképpen javasolják, hogy kiválasztott oligonukleotidokat, például olyan oligonukleotidot, amelynek szekvenciája a fibroblastés leukocita-interferon-génnel közös, alkalmazzanak emberi kromoszóma-géntárakban lévő vagy teljesen genomikus DNS restrikciós hasításával kapott, különböző interferon-gének felismerésére és izolálására.
Továbbá a 0.076.489 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi leírásban azt javasolják, hogy egy radioaktívan jelzett, szintetikus oligonukleotidot, például a fent említett tridekanukleotidot, vagy egy radioaktivan jelzett oC- és β-specifikus IFN-cDNS-t, például egy olyan cDNS-t, amelyet az említett tridekanukleotiddal, mint primerrel szintetizáltak, kromoszómális IFN-ot és IFN-fl-géneket tartalmazó telepek azonosítására szondaként használjanak.
A fent említett tridekanukleotid segítségével és az előzőekben ismertetett módszer alkalmazásával sikerült az új IFN-oC2(Arg)-t kódoló új 1F7 klón felismerése. Ez a klón tartalmazza az IFN-oC2(Arg)-ot kódoló
C | CTG | GCA | CAG | ATG | AGG | AGA | ATC | TCT | CTT | TTC | TCC | 153 | ||
. TGC | TTG | AAG | GAC | AGA | CGT | GAC | TTT | GGA | .TTT | CCC | CAG | GAG | GAG | 195 |
TTT | GGC | AAC | CAG | TTC | CAA | AAG | GCT | GAA | ACC | ATC | CCT | GTC | CTC | 237 |
CAT | GAG | ATG | ATC | CAG | GAG | ATC | TTC | AAT | CTC | TTC | AGC | ACA | AAG | 279 |
GAC | TCA | TCT | GCT | GCT | TGG | GAT | GAG | ACC | CTC | CTA | GAC | AAA | TTC | 321 |
TA | 323 | |||||||||||||
képletű részszekvenciát, | , amely az IFN-oC2(Argl- | •bán lévő | 1' | |||||||||||
Leu | Alá | Gin | Met | Arg | Arg | Ile | Ser | Leu | Phe | Ser | >28 | |||
Gys · | Leu | Lys | Asp | Arg | Arg | Asp | Phe | Gly | Phe | Pro | Gin | Glu | Glu | 42 |
Phe | Gly | Asn | Gin | Phe | Gin | Lys | Alá | Glu | Thr | Ile | Pro | Val | Leu | 56 |
His | Glu | Met | Ile | Gin | Gin | Ile | Phe | Asn | Leu | Phe | Ser | Thr | Lys | 70 |
Asp | Ser | Ser | Alá | Alá | Trp | Asp | Glu | Thr | Leu | Leu | Asp | Lys | Phe | 84 |
képletű részszekvenciát | kódolja. Az | uj IFN- | rikciós endonukleázzal | lineárissá | alakítunk, |
-<£2(Arg) a Natúré 287, 408-411 (1981) közleményben ismertetett összes interferontól a 18-84 aminosav-tartományban tér el, nevezetesen 23 és 34 helyzetű Arg-ban.
A találmány szerint a kővetkező módon járhatunk el. Namalwa sejteket Sendai vírussal ismert módon indukálunk és a megfelelő sejteket kiválasztjuk.
A kiválasztott sejteket, célszerűenn 6-12 órával, előnyösen 9 órával a vírussal történő indukció után, célszerűen a maximális IFN-mRNS szintézis időpontjában, denaturáljuk. A sejtmagok leválasztása után a sejt-citoplazmából fenolos extrakció és etilalkoholos kicsapás segítségével állítjuk elő a tisztított RNS-t, amelyből ezután oligo(dT)-cellulöz kromatográfiával izoláljuk a poli(A)‘RNS-t, s ezt gradiens centrifugálás révén interferon specifikus szekvenciákra nézve dúsítjuk (lásd 1. ábra baloldali részét).
Az így tisztított poli(A)*RNS-t használjuk templátként a reverz transzkriptáz enzim segítségével történő egyszálú cDNS előállításához. Ehhez az egyszálú DNS lánchoz a DNS-polimeráz I-el történik a komplementer második DNS szál szintetizálása. A cDNS szintézisét és a komplementer második DNS szál szintézisét az adenin, timidin, guanozin és citidin de2oxinukleozid-trifoszfátjait tartalmazó oldatban végezzük. A kapott kétszálú cDNS keveréket ezt követően az SÍ nukléáz enzimmel a szálak mindkét végén úgy módosítjuk, hogy a léncvégekről túllógó darabokat eltávolítjuk, majd azokat a kettósszállú DNS molekulákat izoláljuk gradiens centrifugálással, amelyek legalább 600 bázispárral rendelkeznek. Az igy kapott cDNS keverékben mindkét fonál 3* végét 15 mukleotiddal meghosszabbítjuk oligo-dezoxicitidin hozzáadásával, terminális transzferáz enzim segítségével, s igy a rekombináns molekulák szintézisének egyik alkotórésze már készen áll (lásd az 1. ábra baloldali részét).
Második komponensként gyűrűs, kétszálú, előnyösen Escherichia coliból származó plazmidot használunk, például az Escherichia coli pBR322 plazmidját, amelyet a Pst I restmajd a cDNS keveréknél követett eljárással analóg módon a molekula 3’ végeit oligo-dezoxiguanozin hozzákapcsolásával úgy módosítjuk, hogy kilógó oligo-dezoxiguanozin végek keletkezzenek. Ezek a végek a cDNS molekulák szabad oligo-dezoxicitidin végeivel stabil kétszálú DNS darabokat képeznek (lásd az 1. ábra jobboldali részét).
Az így előállított - például a pBR322-ból és a cDNS-ból előállított - hibrid plazmiddal egy mikroorganizmust, például az Escherichia coli HBlOl-et, gazdasejtté transzformálunk, amelyben e DNS-nek a replikációja és kifejeződése végbemegy.
Az így előállított kiónok közül telep hibridizációs módszerrel kimutatjuk azokat, amelyek IFN-oC-t vagy IFN-fi-t kódoló specifikus szekvenciákat tartalmaznak. Minta-anyagként radioaktív izotóppal jelzett cDNS-t használunk, amelyet az 5'dCCTTCTGGAACTG3' interferon szekvenciákra specifikus primerrel IFN-mRNS-t tartalmazó RNS-ből reverz transzkripció segítségével szintetizálunk. Itt a tridekanukleotid radioaktív jelzése a végén történik, előnyösen a K-32P-ATP-vel és T4-polinukleotid kinázzal. A re45 verz transzkriptáz reakcióhoz szükséges iniciációs komplexet feleslegben adagolt jelzett tridekanukleotiddal és Sendai vírussal indukált sejtekből származó poli(A)*RNS-el állítjuk eló, az előbbiekben leirt feltételekkel analóg módon (lásd a 2. ábrát). Az így előállított cDNS tehát csak akkor lesz radioaktív jelzéssel ellátva, ha a reverz transzkriptáz reakcióhoz szükséges iniciációs komplex létrejön a tridekanukleotiddal, mivel a jelzést kizárólag ez a szegmentum tartalmazza. Ezáltal - a találmánynak megfelelően a tridekanukleotiddal komplementer DNS szekvenciával rendelkező DNS felismerésének és ezáltal az cí- és ű- interferon DNS felismerésének biztosítunk nagy szelektivitást. Azokat a transzformált baktériumtele’peket, amelyek beépített tridekanukleotid komplementer DNS szekvenciával rendelkező hibrid plazmidokat tartalmaznak, autoradiográfiával tesszük lát65 hatóvá (lásd a 3. ábrát). Ezen a módon kö-36 rülbelül 13.000 transzformált baktérium klónból 190 olyan kiónt izoláltunk, amelyek a tridekanuk-leotiddal iniciált cDNS miatt pozitív szignált adtak, azaz a génbank kiónjainak körülbelül 1%-a tartalmazta a dCCTTCTGGAACTG specifikus szekvenciát.
A rekonbináns DNS molekulákban az interferon specifikus nukleinsavak kimutatását RNS-transzfer-hidridizáciöval, hibrid izolálással, restrikciós térképezéssel és nukleinsav szekvencia analízissel végezzük. A képződött interferon-polipeptid biológiai vizsgálatát úgy végezzük, hogy meghatározzuk vírusellenes hatását és immunológiai módszerekkel meghatározzuk az interferon típusát.
Az ilyen módon izolált IFN-cC2(Arg)-t kódoló gén exprsszióját baktériumokban - de más organizmusokban is, mint például élesztőben is - megvalósíthatjuk, amikoris egy promoter és egy riboszömakötő szekvencia kombinációjának beiktatásával a spontán expresszió értékének mintegy lO^szeresét érhetjük el.
A kővetkező példák hivatottak a találmány közelebbi megvilágítására.
A pé/da
Megfelelő sejtvonal kiválasztása humán IFN-cC - IFN-j) - mRNS-t tartalmazó poli(A)*RNS termelésére
Különböző humán sejtvonalakat indukálunk Sendai vírussal interferon termelésre a szakirodalomból ismert eljárással, majd 24-48 óra múlva tipus-specifikus antiszérumokkal történő neutralizációval meghatározzuk a sejt felűlüszök IFN-cC és IFN-0 tartalmát. Néhány vizsgált sejtvonalban az IFN-oC és IFN-β közti mennyiségi viszonyokat a fenti táblázatban közöltük. Ebből kitűnik, hogy például a Namalwa sejtek valamivel több, mint 50% IFN-oC-t és körülbelül 50% IFN-ű-t termelnek, Sendai vírussal történő indukálás után.
A neutralizációs vizsgálatot a következőképpen végezzük.
A Sendai vírussal indukált sejttenyészetek felülúszójából körülbelül 10 interferon egységet tartalmazó mennyiséget 60-90 percig 37 °C-on inkubálunk.
1. IFN-cC elleni antiszérummal; végső hígítás 1 : 100; (következő intézménytől kaptuk: Research Resources Branch, National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Md, USA),
2. humán IFN-β elleni antiszérummal; végső hígítás 1 : 300; (dr. Y. H. Tan-tói University of Calgary, Kanada - kaptuk),
3. az 1. és 2. antiszérum keverékével.
Inkubálás után a maradék interferon aktivitást plakkredukciós vizsgálattal határozzuk meg. [Journal of Interferon Research, 2, 575-585 (1982)].
B példa
Emberi IFN-oC- és IFN-/3- mRNS-t tartalmazó poli(A)*RNS előállítása Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekből
A Namalwa sejtek tenyésztését és a Sendai vírussal történő indukciót a szakirodalomból ismert módszer szerint végezzük [Methods in Enzymology, 78A kötet, 69-75 old. (1981), Academic Press, New York]. A mRNS preparálásának időpontjául a Sendai vírussal történő indukció utáni 9. órát (6-12 óra) választjuk, mivel az interferon specifikus mRNS részaránya ezen időtartam után éri el maximumát.
A sejteket 20 percen át 1000 g mellett lecentrifugáljuk, egyszer ΝΡ-40-pufferben (0,14 M nátrium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid, 10 mM trisz-sósav pH = 7,4) mossuk, majd 0,5% NP-40 (Shell) nem ionos detergenst és 2 mg/ml bentonit tartalmú NP-40 pufferben reszus2pendáljuk. A keveréket 5 percig tartjuk jégfürdöben, majd a sejtmagokat centrifugálással - mint fent - ülepítjük, majd az RNS tartalmú citoplazma frakcióhoz (felülúszó) 2% SDS-t, 5 mM EDTA-t és 50 mM trisz-sósavat (pH = 9,0) adtunk, s ezután az elegyet háromszor fenol-kloroform elegyével és egyszer kloroformmal extraháljuk. Ezután az RNS-t etilalkohollal kicsapjuk. A poli(ApRNS-t a szakirodalomból ismert módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1408-1412 (1972)] oligo-(dT)-cellulóz kromatográfiával tisztítjuk és 10 mM nátrium-acetát puffer (pH = 5,5) és 1 mM EDTA tartalmú 5-20% szacharóz-grádiens centrifugálással (20 órán át 25000 fordulat/perc mellett, Spinco SW27 rotorral) molekula tömegük szerint elválasztjuk, majd a 6S (szedimentációs egység) és 18S (az egyszerűség kedvéért .12S-RNS -nek neveztük) nagyságrend közti molekulákat összegyűjtjük (lásd az 1. ábra baloldalát).
Az interferon specifikus mRNS (IFN-cCés IFN-B-mRNS) tartalmat a .12S-RNS -nek Xenopus laevis oocitákba [J. Embryol. and Exper. Morph., 20, 401-414 (1968)] történő mikroinjekciója révén állapítjuk meg és az interferon aktivitás mértékét az oocita felülúszöban határozzuk meg. 1 pg injiciált .12S-RNS közepes interferon titert, körülbelül 1000 nemzetközi interferon egységet (I. E.) eredményezett a 69/19 interferon standardra vonatkoztatva:
A Sendai vírussal | 1 ml oocita | IFN-oC IFN-cC + IFN-Ő |
indukált Namalwa | felülúszó | ellen termelt antiszé- |
sejtekből származó | interferon | rumok által neutralizált |
.12S ’-poli(A)‘RNS | egység | interferon aktivitás |
mennyisége | tartalma | százaléka |
pg 1000 80 >98
Tehát az interferon aktivitásának mintegy 80%-a neutralizálható az cí-tipusú interferon elleni antiszérummal, mig az összaktivitást csak az anti-cC- és anti-£-interferon antiszérum keveréke neutralizálja.
C példa
Namalwa - cDNS - klónbank előállítása
A 6 - 18S molekulatömeggel rendelkező poli(A)*RNS-t (.12S-RNS-; lásd a B példát) használjuk templátként az egyszálú cDNS előállításához úgy, hogy 40 pg/ml poli(A)*RNS-t 50 mM trisz-sósavat (pH = 8,3), 10 mM magnézium-kloridot, 100 mM kálium-kloridot, 1-1 mM dNTP-t, 0,4 mM DTT-t, 4 tnM nátrium-pirofoszfátot, 20 pg/ml oligo(dT)i2-is-at (PL-Biochemicals) és 25 pg/ml Actinomycin D-t 100 egység/ml AMV reverz transzkriptázzal (dr. J. Beard, Life Sciences, Inc. 1509 — 49th Street, South, St. Petersburg, Florida 33707, USA) 45 percig 44-45 °C-on inkubálunk. Ezt követően az RN£-DNS-hibrid RNS részét 0,3 M nátriura-hidroxidban 50 °C-on történő egy órás inkubálással eltávolítjuk, ezután az egyszálú cDNS-t neutralizáljuk és etilalkohollal kicsapjuk.
A szimpla DNS-szállal komplementer második DNS szálat a következő feltételek mellett szintetizáljuk: 30 pg/ml egyszálú cDNS-t 0,12 M kálium-foszfát puffer (pH = 6,9), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT és 1-1 mM dNTP elegyében 300 egység/ml DNS polimeráz ’Ι-el (Boehringer Mannheim) inkubálunk 6 órán át 15 °C-on, ezután az elegyet fenollal extraháljuk és etilalkohollal kicsapjuk.
Az így előállított duplaszálú cDNS-keveréket a szélvégeken úgy módosítjuk, hogy a túllógó egyszálú darabokat eltávolítjuk. Ennek elérésére a DNS-t 0,3 M nátrium-klorid, 30 mM nátrium-aeetát (pH = 4,5) és 1 mM cink-klorid elegyében 1250 egység/ml Sl nukleázzal (Miles Laboratories) 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, az elegyet ezután fenollal extraháljuk és etilalkohollal kicsapjuk. Az ily módon előállított .blunt ended' kétszálú cDNS-t 1 mM nátrium-aeetát puffer és 1 mM EDTA tartalmú 5-20% szacharóz-gradiensben elválasztjuk és azokat a frakciókat izoláljuk, amelyek legalább 600 bázispár hosszúságúak.
A kapott cDNS keverék 0,5 pg-jánál a kettósszálak 3’ végeit oligo-dezoxicitidin hozzáadásával mintegy 15 nukleotiddal meghosszabbítjuk úgy, hogy az elegyet 140 mM kálium-kakodilát (pH = 6,9), 30 mM -trisz-sósav (pH = 6,9), 2 mM kobalt-klorid, 0,1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA és 5pM dCTP elegyében 500 egység/ml terminális transzferázzal inkubáljuk 4 percig 37 °C-on. Ezzel a lépéssel a
2θ rekombináns molekulák egyik alkotórésze, a cDNS keverék, készen áll (lásd az 1. ábra baloldalát).
Második komponensként az Escherichia coli pBR322 plazmidját - mely egy gyűrűs kétszálű DNS molekula - használjuk fel. A pBR3222 pg-jának alikvot részét Pst I restrikciós endonukleázzal linearizáljuk, és hasonló módon, mint ahogy a cDNS-keveréknél jártunk el, a molekula 3’ végein oligo-de2q zoxiguanozin hozzáadásával olyan módosítást végzünk, hogy túllógó oligo-dezoxinukleotid végek keletkezzenek (az 1. ábra jobb oldala). Ezek az oligo-dezoxiguanozin végek bázispárosodás révén a cDNS molekulák szabad oli35 go-dezoxieitidin végeivel stabil kettósszálú DNS régiókat képeznek. E reakciónak mindkét komponensét 0,1 M nátrium-klorid, 1 mM EDTA és 20 mM trisz-sósav (pH = 8) elegyében 10 percig 65 °C-on, majd 2,5 órán ét
45 °C-on, ezután egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk.
Ezzel a módszerrel a Pst I restrikciós endonukleáz hasítási helyét regeneráljuk és később az enzimet a cDNS inszertumnak a vektorhibridböl való kihasitására felhasználhatjuk.
A pBR322-ből és a Namalwa-cDNS-böl ily módon előállított hibrid plazmidot használjuk fel, az irodalomból ismert módon [Proc. Natl.
Acad. Sci, USA, 69, 2110-2114 (1972)], az Escherichia coli HB 101 transzformációjára. Ezzel a módszerrel a transzformált Escherichia coli sejtekből 30000 kiónt kaptunk és ezeket egyenként mikrotitráló lemezekre osz55 tottuk fel.
D példa
IFN-cC-t és IFN-ű-t meghatározó DNS szekvenciákra specifikus hibridizációs próba-anyag előálitása egy szintetikus 5 ’dCCTTCTGGAACTGS' tridekanukleotid felhasználásá val
-510
Az az interferon szekvenciákat tartalmazó transz-formáit E. coli kiónok szelekciójára alkalmas módszer, mely ennek a találmánynak alapjául szolgál, egy 5’dCCTTCTGGAACTG3* szekvenciájú szintetikus tridekanukleotid használatán alapszik. Ez a szekvencia képviseli azt a leghosszabb és egybefüggő DNS szegmentumot, amely homológiát mutat az IFN-oC-t kódoló gének legtöbbjében és az IFN-ö-t kódoló génben. A tridekanukleotid szintézise ismert.
A tridekanukleotidot a molekula 5’ végén jelezzük 37 °C-on, 30 percen át a következő elegyben: 50 mM trisz-sósav (pH = = 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin, 1 μΜ 32Ρ-γ-ΑΤΡ és 60 egység/ml T4-polinukleotid kináz (Bethesda Research Laboratories). A jelzett tridekanukleotid specifikus aktivitása körülbelül 500 Ci/mMól.
Az ily módon jelzett tridekanukleotidot primerként használjuk a (egyszálú) cDNS szintéziséhez, ahol a Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekből származó poli(A)‘RNS (lásd a B példát) szolgál templátként. A reakciót a primernek az RNS-hez viszonyított 50-10-szeres feleslegében folytatjuk le 90 percen át 37 °C-on a következő elegyben: 50 mM trisz-sósav (pH = 8,3), 60 mM kálium-klorid, 5 mM DTT, 50 pg/ml Actinomycin D, 4 mM magnézium-klorid, 4 mM nátrium-pirofoszfát, 0,5-0,5 mM dNTP és 100 egység/ml AMV reverz transzkriptáz. Az RNS-DNS-hibrid RNS részét 50 °C-on 0,3 M nátrium-hidroxidban történő egy órás inkubálással távolítjuk el, ezután az elegyet 0,3 M ecetsavval semlegesítjük és ekkor az igy előállított cDNS-t hibridizációs próba-anyagként használhatjuk. Az eljárás sematikus ábrázolását a ' 2. ábra mutatja be. Az igy előállított cDNS-ből csak azok a molekulák hordozzák a radioaktív jelzést, amelyek az interferon specifikus tridekanukleotidból, mint primerből kiindulva szintetizálódtak, s így nagy specificitást mutatnak interferon-DNS-szekvenciák felismerésére hibridizálás esetén.
E példa
Telephibridizálás tridekanukleotid prímé rrel előéllitott cDNS-el
Az ebben a példában leírt módszer azoknak a transzformált baktériumklönoknak a felismerésére szolgál, amelyek tridekanuk- leotid komplementer DNS szekvenciákat hordozó hibrid plazmidokat tartalmaznak. Az egyes klónozott transzformált sejtekből sejteket viszünk rá nitorcellulóz szűrólemezre (pórusnagyság 0,45 μιη, Millipore vagy Schleicher-Schuell gyártmány), a szürőmembránon addig tenyésztjük, mig a telep nagysága el nem éri a 2 mm-t, majd a telepeket kolónia hibridizációhoz készítjük eló az irodalomból ismert módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975) és Analytical Biochemistry, 98, 60-63 (1979)]. A jelzett cDNS-el történő nukleinsav hibridizálást 48 órán át végezzük, 37 °C-on, a következő elegyben: 50% formamid, 4 x SET [1 x SET = 0,15 M nátrium-klorid, 5 mM EDTA, 50 mM trisz-sósav (pH = 81), 1 x Denhardt oldat (0,02% BSA, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidon), 0,5 mg/ml denaturált és zúzott (gescherter) lazac sperma DNS, 0,1% nátrium-pirofoszfát és 0,1% SDS. Ezután a szúrőmembránokat több órán keresztül (6-8 óra) mossuk 20-25 °C-on a következő összetételű oldatban: 50% formamid és 0,2 x SSC (1 SSC = 0,15 M nátrium-klorid, 0,15 M nátrium-citrát), majd 1 x SSC oldattal leöblítjük. A szűrómembránokat 20-25 °C-on megszárítjuk és -70 °C-on röntgenfilmre (Kodak XR) exponáljuk. A 3* ábra egy ilyen kísérletre jellemző képet mutat be: az ábrázolt felületen 1536 baktérium kolóniát tenyésztettünk és kolónia hibridizációval vizsgáltuk. A nyíl egy olyan transzformált baktérium kiónra mutat példákként, amelyben a hibrid plazmid-DNS a radioaktív próba-anyaggal jelet adott. Összesen körülbelül 13.000 transzformált baktérium telepet vizsgáltunk, amelyekből 190 olyan kiönt izoláltunk, amelyek a Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekből származó tridekanukleotiddal iniciált cDNS-el pozitív jelet adtak; ezeket két míkrotitráló lemezre (Pl és P2) gyűjtöttük össze. Fentiek szerint a klónbank kiónjainak körülbelül 1%-a tartalmazta a specifikus dCCTTCTGGAACTG szekvenciát.
F példa
A tridekanukleotid printerrel előállított cDNS-el hibridizált kiónok szekvencia komplexitásának vizsgálata
Ahhoz, hogy a 190 tridekanukleotid-pozitiv kiónban (lásd az E példát) a különböző szekvenciájú kiónok számát (szekvencia komplexitás) megállapítsuk, a különböző klónokból Pst I-el történő emésztéssel (lásd a C példát), 0,8%-os agaróz gélben végzett elektroforézissel, majd a kivánt sáv elúciöjával (a sávot tartalmazó géldarabkát kivágjuk és az agarózból a DNS-t elektroforetikusan eluáljuk egy dializáló hurkában) izoláljuk a cDNS inszertumokat, majd ezeket az irodalomból ismert módszerrel, nick-traszláció segítségével 32P-vel jelezzük [J. Mól. Bioi. 113, 237-251 (1977)]. A Pl és P2 míkrotitráló lemezen lévő tridekanukleotid pozitív kiónoknak és egy önkényesen kiválasztott mikrotitráló lemezen (E52) lévő kiónoknak a lenyomatait nitrocellulóz szürómembránra vittük át, itt tenyésztettük, a tenyészetet telep hibridizáláshoz előkészítettük (lásd az E példát) és a különböző 32P-vel jelzett cDNS inszer7
-612 tumokkal hibridizáltuk. A hibridizálást úgy végezzük, ahogy azt az E példában leírtuk, de a hibridizáló oldathoz még 50 ug/ml poli(U)-t és 10 pg/ml poli(I) : poli(C)-t adunk és a szürőmembránt a hibridizálás után 50%-os formamidban és 1 x SSC-ben mossuk. A P1AG kiónt ilyen módon analizáltuk, és csak saját magával hibridizált.
G példa
RNS-transzfer-hibridizációk
Annak eldöntésére, hogy egy adott tridekanukleotid pozitív baktérium klón tartalmazhat-e interferon kódoló szekvenciákat, megvizsgáljuk, hogy vajon Namalwa sejtekből származó Sendai vírussal indukált mRNS-el saját plazmid DNS-e hibridizál-e. E célból indukált és nem indukált Namalwa sejtekből, a B példában megadott módon, poli(A)*RNS-t izolálunk. Az izolált anyagot egy órán át 50 °C-on történő inkubálással 1 M glioxál, 50% DMSO, 10 mM nátrium-foszfát puffer (pH = 7) elegyében denaturáljuk, majd 1,4%-os agaróz gélben elválasztjuk, s ezután az irodalomból ismert módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)] lütrocellulóz szűrőmembránra visszük fel, s nick-transzláció segítségével 32P-vel jelzett (lásd az F példát) plazmid-DNS-el hibridizáljuk. Az a plazmid DNS, amely indukált génből származik, ebben a kísérleti elrendezésben csak indukált sejtekből való RNS-el hibridizál, de nem indukált sejtekből származó RNS-el nem. A 4. ábra egy ilyen kísérlet autoradiográfiás képét mutatja be: egy párból az indukált RNS-t (.ί’) mindig a hasáb baloldalán, a nem indukált RNS-t (.n‘) a jobboldalán tüntetjük fel. A hibridizáláshoz a használt plazmid DNS P1A6 csak az indukált sejtekből származó RNS-el hibridizált. A PlA6-al hibridizáló RNS tömege 12-14S körül volt. Ezért a P1A6 plazmidot tovább vizsgáltuk, hogy interferon-DNS szekvencia tartalmát egyértelműen igazoljuk.
H példa
A P1A6 IFN-cC típusú klón analízise
A P1A6 klón a vírussal indukált Namalwa-RNS-el a 12-14S régióban hibridizált (a G példában irtuk le). Egy körülbelül 900 bázispár hosszúságú cDNS-inszertumot tartalmazott, amely - restrikciós analízissel vizsgálva - a Bam Hl, Bgl II, Eco Rí, Hin dili, Pst I és Pvu II enzimmel nem volt hasítható (lásd az 5. ábrát). Annak bizonyítékát, hogy ugyanis a P1A6' klónnak IFN-cf-kódoló szekvenciái vannak, a DNS-szekvencia analízis szolgáltatta: a P1A6 cDNS-inszertumának szekvenciáját az inszertumot határoló Pst I-hasítási helytől befelé vezettük le (lásd a 6. ábrát) és a Goeddel és munkatársai [Natúré, 290, 20-26 (1981)] által leírt IFN-of-szekvenciával hasonlítottuk össze. Megállapítottuk, hogy a P1A6 klón a LelFN C kódoló szekvencia 49 bázispárral rövidebb változatának felel meg. A P1A6 3' végén jelenlevő poli(A)-szekvencia arra utal, hogy a P1A6 klón egy rövidebb mRNS-ból származik, mint a leközölt LelFN C klón. A LelFN C proteint kódoló régió azonban teljesen jelen volt.
I példa
Egy további IFN-oC-típusú klón (1F7) azonosítása és analízise
A P1A6 volt az egyetlen olyan IFN-oC-tipusü ’ klón, amelyet a 190 tridekanukleotid pozitív klón gyűjteményéből (lásd az E példát) azonosítottunk. Hogy további IFN-oC-tipusú kiónok jelenlétét deríthessük ki, az eredeti cDNS klónbankból (C példa) kolónia hibridizáció segítségével (ahogy az F példában leírtuk) 1800 kiónt hibridizáltunk a P1A6 klón cDNS ’r.szertumával. Ezen a módon egy további IFN-oC kiónt (1F7) találtunk. Az 1F7 cDNS inszertumának restrikciós analízise és részleges DNS-szekvencia analízise azt mutatta, hogy az 1F7 egy 175 bázispárral hoszszabb variánsa a LelFN A (Goeddel és munkatársai, lásd fent) klón típusnak. Az IF7-nek ugyanúgy, mint a LelFN A kódolónukkotidnak a Bgl Π-vel és Pvu II-vel (6. ábra) két hasítási helye van; a vizsgált DNS szekvenciákat az inszertum 5’ és 3’ végével a 6. ábrán mutatjuk be.
A továbbiakban az 1F7 IFN-oC-típusú klón DNS szekvenciájánnak részeit didezoxi módszerrel [Messing és munkatársai, Nuc. Acid. Rés. 9, 2871 (1981) és R. C. Gardner és munkatársai, Nuc. Acid. Rés. 9, 2871 (1981)], egy univerziális primerrel analizáltuk. A 120-tól 323-ig terjedő pozícióban a következő rész-szekvenciákat találtuk:
CCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCT CCTGCTTGAAGGACAGACGTGACTTTGGATTTCCCCA GGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACC ATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCA ATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGA TGAGACCCTCCTAGACAAATTCTA......
Összehasonlítva az IFN-oC A típus irodalomból ismert szekvenciáját [D. V. Goeddel és munkatársai, Natúré, 290, 20 (1981)] az 1F7 üj IFN-oC típusú DNS szekvenciájával, kitűnt, hogy a 120-323 nukleotidot felölelő tartományban a következő különbségek vannak: a 137. és 170. pozícióban az A nukleotidot mindig G nukleotíd helyettesíti.
-714
3. példa
Az 1F7 hibrid plazmiddal transzformált
E. coli HB101 lizátumának interferon aktivitása
Megvizsgáltuk a PlA6-al vagy lF7-el transzformált baktériumtenyészetek lizátumait biológiailag aktiv interferon tartalomra nézve. 100 ml baktériumtenyészetet L-Broth táptalajon tenyésztettünk, 0,6-0,8 optikai denzitás eléréséig, a tenyészetet 10 percig 7000 fordulat/perc mellett centrifugálással ülepítettük, egyszer mostuk 50 mM trisz-sósavat (pH = 8) és 30 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldattal, végül ugyanebben a pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenziót 1 mg/ml lizozimmel 30 percen át jégfürdőben inkubáltuk, majd a baktériumokat ötször egymásutáni fagyasztással és felolvasztással tártuk fel. Ezután a sejttörmeléket 1 órán át 4000 fordulat/perc mellett történő centrifugálással távolitottuk el. A felülúszót sterilre szűrtük és plakk-redukciós módszerrel interferon aktivitásra vizsgáltuk. Az 1F7 klón ily módon kapott lizátumában ml-enként körülbelül 500 egység interferon volt kimutatható; a P1A6 klón ebben a vizsgálatban nem mutatott aktivitást, ami feltehetően arra vezethető vissza, hogy a plazmid-vektorban az inszerturanak más volt az orientációja.
K példa
Az 1F7 által kódolt interferon típus kifejeződésének fokozása
DNS szinten három feltételnek kell teljesülnie, hogy egy génnek jö kifejeződését érjük el: először, a gén előtt egy protmoternek (egy RNS-polimeráz kötőhelynek) kell lennie, másodszor a transzláció iniciációs kodonja előtt a leolvasott RNS-nek egy riboszóraakötó szekvenciát (RBS) kell hordoznia, harmadszor az RBS és az iniciációs kodon közti távolságnak megfelelő hosszúságúnak kell lennie.
Az 1F7 által kódolt interferon kifejeződéséhez, mint pormoter szekvenciát a Serratia marcescens triptofán operonjának irodalomból ismert promoterét (Natúré, 276, 684-689 (1978)1 és mint RBS-t egy irodalomból ismert DNS szekvenciát (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5543-5548 (1981)] alkalmaztuk. Az lF7-nél az RBS és az iniciációs kodon közti optimális távolság meghatározásához a következő stratégiát választottuk: az 1F7-cDNS szekvenciát a kétszaiú DNS-re specifikus BAL 31 exonukleázzai rövid ideig emésztettük, miáltal különböző hosszúságú molekulák keverékét kaptuk. Ezután ezeket a molekulákat szintetikus linker-szekvenciák segítségével megfelelő módon egy .expressziós-plazmid'-bán megkötöttük, azaz egy olyan plazmidban, amely promotert és RBS-t tartalmaz. Ezzel a plazmiddal E. coli HB101 törzset transzformáltunk és az egyes transzformált sejtek interferon termelő képességét meghatároztuk.
Ezt a kísérletet - részletezve - a következőképpen végeztük: 0,5-1 ug 1F7 inszertumot 100 ul 20 mM trisz-sósav (pH = = 8,1), 0,6 M nátrium-klorid, 12 mM magnézium-klorid és 1 mM EDTA tartalmú elegyben 3 percig 30 °C-on 0,5 egység BAL 31-enzimmel (Bethesda Research Laboratories) inkubálLunk. A reakciót ezután 300 ul 15 mM-os EDTA oldat (pH = 7,8) hozzáadásával leállítottuk, a reakciókeveréket 10 percig 65 °C-on melegítettük, fenollal és éterrel extraháltuk és etilalkohollal kicsaptuk. A csapadékot 10 ul 70 mM trisz-sósav (pH = 7,5), 7 mM rnagnézium-klorid, 1 iuM DTT és 4 mM ATP tartalmú elegyben 30-60 pMol foszforilált Hind ni-linkerrel (Bethesda Research Laboratories) egy éjszakán át 14 “C-on inkubáltuk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy az elegyet 10 percig 65 “C-on tartottuk, hozzáadtunk 2 M amniónium-aeetátot és az interferon gént a kötetlen 'linkerektől 0,6 térfogat izopropanollal történő kicsapással tisztítottuk meg. A csapadékot 30-50 ul 33 mM trisz-acetát (pH = 7,9), 66 mM ksliuin-acetát, 10 mM magnézium-acélát és 100 ug/ml BSA tartalmú elegyben oldottuk fel és 30-50 egység Hind Ill-al 2-3 órán át emésztettük. A reakciót 10 percig 65 “C-ra történő hevítéssel állítottuk le, azután a reakció elegyhez hozzáadtunk 2 m animónium-acetátot és az interferon gént 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki. A csapadékot 10 ul 70 mM trisz-sósav (pH = 7,5), 7 mM magnézium-klorid, 1 mM DTT és 0,5 mM ATP tartalmú elegyben oldottuk és 10~2 egység T4 ligáz segítségével egy éjszakán át 14 “C-on 0,2 ug Hind Ill-al linearizált, foszfáttal kezelt pER103 expressziós plazmidhoz kötöttük. A pER103 egy pBR322-származék, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter szekvenciáját és egy irodalomból ismert RBS-t tartalmaz (lásd fent); a Hind ΙΙΙ-al az RBS közelében linearizálható. A2 igy kapott plazmidokat az E. coli HB101 transzformálására használtuk fel és az egyes transzformált sejtek interferon termelő képességét a J. példában leirt módon vizsgáltuk. igy az interferon kifejeződésének 104-szeres értékű fokozását értük el a spontán expresszióhoz képest.
Mintaként a következő mikroorganizmusokat és rekombináns DNS molekulákat helyeztük letétbe 1982 május 17-én a .Deutsche Sanimlunk von Mikro-Organismen (Griesebach Slrasse 8, 3400 Göttingen) intézménynél az alábbi DSM-számolc alatt:
2362 (1F7), 2363 (P1A6).
Ezek a mikroorganizmusok és rekombináns DNS molekulák a budapesti szerződés
-816 értelmében a nyilvánosság számára hozzáférhetők.
Szűrömembránhibridizálás;
Használt fogalmak és rövidítések (d) A:
Antiszérum:
ATP:
Autoradiográfia:
Bázispár:
Blunt ends:
BSA:
(d) C: cDNS:
cDNS-pool:
Kódolni:
DMSO:
DNS:
DNS szekvencia:
DTT:
EDTA:
Elektroforézis:
Expresszió = kifejeződés (dezoxi ladenozin antitesteket tartalmazó szérum adenozin-trifoszfát a radioaktivitás kimutatására szolgáló fotográfiás módszer két komplementer nukleotid, például A-T, G-C kétfonalú DNS molekula vége, ahol pár nélküli bázis nincs, megkülönböztetésül az egyfonalú kilógó végektől marha szérum albumin (dezoxilcitidin RNS-el komplementer DNS különböző szekvenciájú cDNS molekulák keveréke információt hordozni valamire nézve; a DNS nukleotid szekvenciájában hordozza a proteinek aminosav szekvenciájára vonatkozó információt dimetil-szulfoxid dezoxiribonukleinsav foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolt lineáris elrendezettségü nukleotidok ditiotreitol etilén-diamin-tetraecetsav molekulák (DNS vagy RNS) elválasztása elektromos térben a molekulák tömege szerint (d) G: Gén:
Gén-családok:
Gén-termék:
Gradiens:
Homológia (DNS szekvenciáknál):
Hibrid:
Hibridizáció (nukleinsavakká):
Hibridizációs próbaanyag (minta):
Hibrid plazmid:
egy gén információjának átváltozása mRNS-sé transzkripció segítségével és ezt követően polipeptiddé (proteinné) transzláció segítésével
I:
IFN-oC:
IFN-fl:
IFN-r
In vitro:
Indukció (interferon termelésére):
nukleinsavak hibridizálása, ahol az egyik partner szurőmembránra van kötve (dezoxi) guanozin a DNS egy szegmentuma, amely egy olyan meghatározott RNS molekula információját hordozza, amely a továbbiakban proteinné alakítható génekből álló családok, amelyek közeli rokonságban lévő termékeket (szubtipusok) kódolnak RNS (transzkripciós termék), protein (transzlációs termék) lásd: szacharóz gradiens
DNS szekvenciák közti rokonság, amelyet hasonló nukleotid-sorrend jellemez egymással legalábbis részben komplementer DNS szálak stabil komplexé egymással komplementer egyszeres DNS- vagy RNS-szálak közti stabil komplexek létrehozása radioaktív jelzéssel ellátott nukleinsavak, amelyek a velük komplementer szekvenciák felkutatására szolgálnak plazmid, amelyben a DNS egyik szegmentuma idegen organizmusból származik inozin leukocita interferon fibroblaszt interferon immun interferon kémcsőben sejtek stimulálása indukáló anyagok-918
Iniciációs kodon:
Iniciáciös komplex:
Inszertum, cDNS-in-
szertum: | egy hibrid plazmid- | Oligonukleotidok: | ||
bán lévő DNS darab egy cDNS) | idegen (például | 20 | ||
Klón: | egyetlen | bakteri- | Oligo(C): | |
• | umból | származó | ||
baktérium | telep | |||
(baktérium | kolónia) | |||
Klónbank, cDNS- | 25 | Oligo(dT): | ||
-klónbank: | baktérium | kiónok | ||
gyűjteménye, | ||||
amelyben | minden | |||
baktérium | cDNS in- | 01ígo(dT)-cellulóz: | ||
szertummal | rendel- | 30 |
Klónozni:
Telep-hibridizálás (= kolónia hibridizálás):
Komplementer:
Kereszthibridizáció:
Mikrotitráló lemez:
kal (vírusok, kétszálú RNS, mitogének) történd kezeléssel interferon szintézisre a mRNS AUG szekvenciája, amely a transzláció kezdetéhez ad jelet a reverz transzkriptáz kapcsolata a mRNS-el és printerrel, amely a cDNS szintézisét teszi lehetővé kező hibrid plazmidot tartalmaz kiónok előállítása; általában olyan kiónok előállítása értendő ezalatt, amelyek hibrid plazmidot tartalmaznak szűrőmé mbránhoz kötött, denaturált baktérium telepekkel végzett hibridizáció egymáshoz illő nukleotidok a DNSben: A komplementer a T-vel, G komplementer a Cvel nem identikus, de homológ DNS szekvenciák egymással történő hibridizáPoli(I):
Ligáz enzimes reakció:
ciója | ||
DNS szekvenciák | ||
közti kovalens kötés létesítése ligáz | 60 | Poli(I):poli(C): |
enzim segítségével 96 tartállyal ellátott | ||
lemez, amely 1-12 és A-Z koordinátákkal van jellemezve, | 65 | Poli(U): |
Mitogén:
Molukula klónozás: mRNS:
Neutralizálás (sémin legesités):
dNTP-ok:
PIPES:
Plazmid:
Poli(A) vagy (dA):
Poli(A)*RNS:
Poli(C) vagy (dC): 50 olyan anyag, amely a sejteket mitózisra (sejt osztódásra) stimulálja lásd: klónozás messzendzser RNS, mely proteint kódoló RNS antigén inaktiválása antitesttel a 4 dezoxinukleozid-trifoszfát, azaz a dATP, dTTP, dCTP, dGTP négy nukleotid keveréke foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolt néhány (kevés) nukleotid C-csoportok oligomerei, foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolva dT-csoportok oligomerei, foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolva cellulózhoz kötött oligo(dT) láncok piperazin-Ν,Ν’-bisz(2-etán-szulfonsav) gyűrűs, kromoszómán kívüli bakteriális DNS, amely önállóan replikálódik A- vagy (dA)-csoportok polimerei, foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolva mRNS, amely nukleinsav szekvenciájának 3’ végén poli(A)-böl álló homopolimer régiót tartalmaz
C- vagy dC-csoportok polimerei, foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolva
I-csoportok polimerei, foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolva kettősszálú nukleinsav, amely poli(I) és poli(C) láncokból áll
U-csoportok polimerei, foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolva
-1020
Primer:
Próba-anyag:
Promoter:
RBS:
Rekombináns DNS:
Replikáció (DNS-é):
Restrikciós analízis:
Restrikciós endonukleáz:
Restrikciós térképezés:
Reverz transzkripció:
Riboszóma kötő szekvencia:
RNS:
RNS-polimeráz:
Szacharóz grádiens:
SDS:
Szűrővizsgálat (screening):
Szekvencia komplexitás:
egy RNS molekula egy darabjával komplementer oligonukleotid, amelyből kiindulva a cDNS . . . . , 5 szintézisé végbemegy lásd a hibridizációs próba-anyag nál DNS szekvencia, amelyhez az RNS polimeráz kötődik lásd: riboszóma kötő szekvencia olyan DNS szekven- jg cia, amely különböző eredetű in vitro egymáshoz kapcsolt DNS darabokból áll egy DNS molekula 20 megkettőződése egy DNS molekula feltérképezése a restrikciós endonukleázok hasítási 25 helyeinek figyelembevételével enzim, amely a kétszálú DNS-t egy 30 meghatározott DNS szekvenciánál hasítja.
lásd: restrikciós 35 analízis
RNS molekula cDNS másolatának előállítása templát és oligonukleotid segít- 40 ségével a mRNS azon része, amely a riboszómához tud kötődni 45 ribonukleinsav . enzim, amely a DNS-el komplementer RNS láncot tud szintetizálni 50 (RNS-) molekulák keverékének felbontásához szolgáló eljárás a molekulák tömege alapján 55 nátrium-dodecilszulfát egy bizonyos tulajdonság keresésére θθ irányuló vizsgalat meghatározott mennyiségű DNS-ben a minőségileg 55
különböző DNS szekvenciák száma | |
Transzformált sejt: | baktérium, amely • transzformáció révén idegen DNS-t tartalmaz |
Transzformáció: | idegen DNS beépítése baktriumokba |
Transzkripció: | mRNS másolat készítése a vele komplementer DNS szekvenciáról |
Transzláció: | a mRNS információjának átfordítása polipeptiddé (transzlációs ter- mékké) |
Tridekanukleotid | 13 nukleotid részből álló oligonukleotid |
Tridekanukleotid | |
pozitív: | tridekanukleotiddal hibridizáló |
Trisz: | trisz-hid roximetil-aminometán |
U: | uridin |
Vektor: | idegen DNS baktériumokba történő beépítéséhez alkalmas hordozó, legtöbbször egy plazmid |
Vektor hibrid, azaz | |
hibrid vektor: | lásd: hibrid plazmid |
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra egy cDNS klónbank előállításának sematikus ábrázolása.
A 2. ábra egy hibridizációs próba-anyagul szolgáló cDNS előállítását mutatja be, amelynek hatására egy specifikus tridekanukleotid primer alkalmazása következtében az IFN-cC- és IFN-ű-specifikus DNS szekvencia tartalom feldúsul.
A 3. ábra egy klónbank telepeinek hibridizációjával kapott eredményt mutatja be. A hibridizáció Namalwa sejtekből származó, tridekanukleotiddal iniciált cDNS-el történt. Az ábra egy olyan nitrocellulóz merabránszűrö autoradíográfiás felvételét mutatja, amelyben 1536 különböző klón van. A nyíl egy tridekanukleotid kiónra mutat.
A 4. ábra egy indukált és nem indukált Namalwa sejtekből származó poli(A)'RNS P1A6 plazmiddal végbement szűrőmembrán hibridizációjának autoradíográfiás képét ábrázolja. A vírussal indukált poli(A)‘RNS-t (,i a párok baloldali része) és a nem indukált Namalwa sejtekből származó poli(A)*RNS-t (.n' a párok jobboldali része) molekula tömegük szerint elektroforézissel elválasztottuk, ezután a frakciókat nitrocellulóz szűrőre vittük át, majd a szűrőt radioaktív jelzéssel ellátott
-1122 plazmid-DNS-el hibridizáltuk, végül elvégeztük az autoradiográfiát.
Az 5. ábrán mutatjuk be a rekombináns DNS molekukákból származó, találmány szerint előállított, két DNS inszertum restrikciós 5 térképének sematikus összehasonlítását. A P1A6 és 1F7 plazmid DNS-ins2ertumai az IFN-oC-DNS két különböző szubtipusával mutatkoztak homológnak.
A 6. ábra két IFN-oC-DNS specificitású 10 inszertum (P1A6 és 1F7 klón) 3'- és 5’- végén lévő szegmentumának nukleotid szekvenciáját ábrázolja. Az aláhúzott ATG szekvencia a transzláció iniciáeiós kodonja.
Claims (4)
1. Eljárás alfa2(Arg)-interferon bioszintéziséhez a genetikai információt a pBR322 20 plazmid Pstl-inszertumában tartalmazó pBR322(Pst) 1F7 jelű hibrid plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy Sendai-virussal indukált Namalwa-sejtekból elkülönített RNS-sel szintetizált cDNS-t a pBR322 plazmidba beépítjük, a plazmiddal valamely Escherichia coli mikroorganizmust transzformálunk, az így előállított klóntárböl izotóppal jelzett
5’-dCCTTCTGGAACTG-3’ szekvenciája tridekanukleotiddal hibridizálás révén ezt a tridekanukleotidot tartalmazó és LelFN-B-t, C-t, D-t, F-et és G-t kódoló kiónt meghatározzuk, majd az alfa2(Arg)-interferont kódoló kiónt a fenti klón cDNS-inszertjével való hibridizálással kiválasztjuk.
2. Eljárás az alfa2(Arg)-interferon bioszitéziséhez a genetikai információt a pBR322(Pst) 1F7 hibrid plazmidban tartalmazó Escherichia coli mikroorganizmus és mutánsai előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított plazmiddal Escherichia coli sejteket transzformálunk.
3. Eljárás alfa2(Arg)-interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint transzformált Escherichia coli törzset vagy mutánsát tenyésztjük, és az alfa2(Arg)interferont a tenyészközegből elkülönítjük.
4. Eljárás a 120
TA 323 képletű részszekvenciát tartalmazó DNS előál- 35 pont szerint előállított pBR322(Pst, 1F7 jelű lítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igény- plazmidból a DNS-t kiválasztjuk.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19823220116 DE3220116A1 (de) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU196452B true HU196452B (en) | 1988-11-28 |
Family
ID=6164725
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU831890A HU196452B (en) | 1982-05-28 | 1983-05-27 | Process for producing microbiologically alpha- and beta-interferons, dna sequences encoding these interferons and microorganisms containing the genetic information |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4820638A (hu) |
EP (1) | EP0095702B1 (hu) |
JP (2) | JPH0774238B2 (hu) |
KR (1) | KR920006349B1 (hu) |
AT (1) | ATE42114T1 (hu) |
AU (1) | AU565479B2 (hu) |
DD (1) | DD211359C4 (hu) |
DE (2) | DE3220116A1 (hu) |
DK (1) | DK164742C (hu) |
ES (2) | ES522762A0 (hu) |
FI (1) | FI82072C (hu) |
GR (1) | GR79236B (hu) |
HK (1) | HK112893A (hu) |
HU (1) | HU196452B (hu) |
IL (1) | IL68790A (hu) |
MX (1) | MX9202815A (hu) |
NO (1) | NO168538C (hu) |
NZ (1) | NZ204384A (hu) |
SG (1) | SG38692G (hu) |
SU (1) | SU1346048A3 (hu) |
UA (1) | UA8037A1 (hu) |
ZA (1) | ZA833845B (hu) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
US4709324A (en) * | 1985-11-27 | 1987-11-24 | Motorola, Inc. | Data processor control unit having an interrupt service using instruction prefetch redirection |
CA2025180A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts |
US6685933B1 (en) * | 1998-07-28 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Interferon α hybrids |
US20020197235A1 (en) * | 2000-11-03 | 2002-12-26 | Moran Stanford Mark | Method for short-term and long-term drug dosimetry |
FR2817559B1 (fr) * | 2000-12-06 | 2003-12-12 | Genodyssee | Procede de determination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fontionnel(s) dans la sequence nucleique d'un gene "candidat" fonctionnel preselectionne et ses applications |
FR2821625B1 (fr) * | 2001-03-01 | 2003-05-16 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques |
FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
EP1536839B1 (en) * | 2001-11-09 | 2010-09-15 | Intarcia Therapeutics, Inc | Combination therapy comprising omega-interferon for treating infection with hepatitis c virus or yellow fever virus |
US20040063912A1 (en) * | 2002-03-15 | 2004-04-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Central airway administration for systemic delivery of therapeutics |
AU2002304965A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
EP1539960B1 (en) * | 2002-09-09 | 2010-04-28 | Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. | Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides |
JP2007519422A (ja) | 2004-02-02 | 2007-07-19 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用 |
US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
DE602007009377D1 (de) | 2006-05-30 | 2010-11-04 | Intarcia Therapeutics Inc | Zweiteiliger flussmodulator mit einem internen kanal für ein osmotisches ausgabesystem |
US7682356B2 (en) | 2006-08-09 | 2010-03-23 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Osmotic delivery systems and piston assemblies for use therein |
US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
JP5351884B2 (ja) | 2007-04-23 | 2013-11-27 | インターシア セラピューティクス,インコーポレイティド | インスリン分泌促進性ペプチドの懸濁製剤及び使用 |
CA2726861C (en) | 2008-02-13 | 2014-05-27 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
HUE035862T2 (hu) | 2009-09-28 | 2018-05-28 | Intarcia Therapeutics Inc | Lényegében állandósult gyógyszeradagolás gyors kialakítása és/vagy befejezése |
US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
WO2013024156A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection |
WO2013024158A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection |
WO2014033266A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection |
US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
ES2968262T3 (es) | 2015-06-03 | 2024-05-08 | I2O Therapeutics Inc | Sistemas de colocación de implantes |
WO2017200943A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof |
USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
CN110225762A (zh) | 2017-01-03 | 2019-09-10 | 因塔西亚制药公司 | 包括glp-1受体激动剂的连续施用和药物的共同施用的方法 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2906160A1 (de) * | 1979-02-17 | 1980-09-04 | Thomae Gmbh Dr K | Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon |
AU538665B2 (en) * | 1979-10-30 | 1984-08-23 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Human interferon dna |
IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
CY1346A (en) * | 1980-01-08 | 1987-01-16 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
GB2068970B (en) * | 1980-02-06 | 1983-06-22 | Searle & Co | Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon |
DE3005843A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
ES8302778A1 (es) * | 1980-11-10 | 1983-02-01 | Genentech Inc | Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral. |
DE3106982A1 (de) * | 1981-02-25 | 1982-09-09 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | "neues tridecadeoxynukleotid, verfahren zu seiner herstellung und verwendung" |
IL63327A (en) * | 1981-07-16 | 1985-11-29 | Yeda Res & Dev | Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria |
GB2108510B (en) | 1981-10-03 | 1984-12-12 | Ciba Geigy Ag | Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof |
-
1982
- 1982-05-28 DE DE19823220116 patent/DE3220116A1/de active Granted
-
1983
- 1983-05-19 US US06/495,944 patent/US4820638A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-05-23 FI FI831818A patent/FI82072C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-05-24 DE DE8383105116T patent/DE3379591D1/de not_active Expired
- 1983-05-24 EP EP83105116A patent/EP0095702B1/de not_active Expired
- 1983-05-24 GR GR71447A patent/GR79236B/el unknown
- 1983-05-24 AT AT83105116T patent/ATE42114T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-26 DD DD83251287A patent/DD211359C4/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-26 IL IL68790A patent/IL68790A/xx unknown
- 1983-05-27 NZ NZ204384A patent/NZ204384A/en unknown
- 1983-05-27 DK DK239383A patent/DK164742C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 JP JP58093886A patent/JPH0774238B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-27 AU AU15044/83A patent/AU565479B2/en not_active Ceased
- 1983-05-27 HU HU831890A patent/HU196452B/hu not_active IP Right Cessation
- 1983-05-27 ZA ZA833845A patent/ZA833845B/xx unknown
- 1983-05-27 NO NO831903A patent/NO168538C/no unknown
- 1983-05-27 SU SU833598429A patent/SU1346048A3/ru active
- 1983-05-27 UA UA3598429A patent/UA8037A1/uk unknown
- 1983-05-27 ES ES522762A patent/ES522762A0/es active Granted
- 1983-05-28 KR KR1019830002362A patent/KR920006349B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-02-01 ES ES529360A patent/ES8500321A1/es not_active Expired
-
1992
- 1992-04-07 SG SG386/92A patent/SG38692G/en unknown
- 1992-06-12 MX MX9202815A patent/MX9202815A/es unknown
-
1993
- 1993-03-22 JP JP5062065A patent/JP2558422B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-21 HK HK1128/93A patent/HK112893A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU196452B (en) | Process for producing microbiologically alpha- and beta-interferons, dna sequences encoding these interferons and microorganisms containing the genetic information | |
US5541312A (en) | Production of interferon | |
US4530901A (en) | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides | |
FI86558C (fi) | Dna- sekvenser, rekombinant-dna- molekyler och foerfaranden foer framstaellning av humant interferon av -typ och val av dna-sekvensen. | |
HU193512B (en) | Process for preparing hybride interferones from human erythrocytes | |
US5089400A (en) | Polypeptides and process for the production thereof | |
HU193507B (en) | Process for producing interferen-like pelypeptides | |
JP2566909B2 (ja) | 新規遺伝子配列、それによつてコ−ドされるi型インタ−フエロンペプチドおよびそのインタ−フエロンを産生する微生物 | |
Padmanaban et al. | Translation of RNA that contains polyadenylate from yeast mitochondria in an Escherichia coli ribosomal system. | |
JPS6156199A (ja) | 新規ヒトインタ−フエロンα類 | |
JPS60126299A (ja) | 新規インターフェロンγとその製造方法 | |
KR890001828B1 (ko) | 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법 | |
JPH0829104B2 (ja) | 牛疫ウィルスのフュージョン蛋白質をコードするdna | |
SU1572419A3 (ru) | Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК pRH W11 или pRH W12, кодирующей омега-интерферон | |
JPH1175855A (ja) | 耐熱性F型ATPase及びそれをコードする遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 | ||
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |