JP3141024B2 - オリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルスまたはウ
イルスの抗体に関し、とくにヘルペス群のウイルスの検
出、このようなウイルスに対する抗体の産生および検
出、およびこれらのウイルスに対してワクチンに関す
る。

【０００２】

【従来の技術及びその課題】ウイルスのヘルペス群はか
なりの臨床的意味をもつ群であり、この群の最も重要な
メンバーは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バー−ウイル
ス（ＥＢＶ）および水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）
である。ＣＭＶによる感染は英国において頻繁に発生す
るので、大人の６０％は過去の感染の証拠を有する。時
々、ウイルスはパウル・ブンネル（Ｐａｕｌ Ｂｕｎｎ
ｅｌ）陰性腺熱の場合を生ずるが、感染した人々のほと
んど大部分は完全に無症候に止まる。したがって、この
ウイルスの感染は先天性感染をもつ新生児、および免疫
無防備の個体、例えば、腎臓または骨髄の同種移植の受
容体または後天性免疫不全症候群（エイズ）の患者であ
る、患者の特別の群において主として医学的重要性を有
する。これらの群の患者の各々において、ＣＭＶは重要
な病原体であり、そして臨床的観点から、臨床的試料の
中のＣＭＶの存在を信頼性をもって同定することができ
るアッセイ法が利用可能であることは非常に望ましい。

【０００３】現在、全体のＣＭＶゲノムのＤＮＡ配列は
決定されている（Ｃｈｅｅ ｅｔａｌ．、１９８９）。
このウイルスは糖タンパク質の遺伝子または糖タンパク
質の遺伝子のエクソンの特徴を示す５４のリーディング
フレームを有する。しかしながら、これらの潜在的糖タ
ンパク質のどれだけ多くが感染された細胞の中の実際に
翻訳され、感染性細胞表面上で発現され、あるいは実際
にウイルス粒子の中に組み込まれるか知られていない。
２つのＣＭＶ糖タンパク質、すなわち、名称ｇＢ（Ｃｒ
ａｎａｇｅｅｔ ａｌ．、１９８６）およびｇＨ（Ｃｒ
ａｎａｇｅｅｔ ａｌ.、１９８８）は、よく研究されて
きており、そしてウイルスのエンベロープ上に存在する
ことが示された。それらの両者はネズミモノクローナル
抗体を中和することによって認識されることが示され
（Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｒａｓｍｕｓｓｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．、１９８４）、これらのタンパク質が
ウイルスの感染性とって重要であり、こうしてサブユニ
ットのＣＭＶワクチンの潜在的な候補であることを示唆
する。

【０００４】ＣＭＶに対してレイズされた中和性ネズミ
モノクローナル抗体の大部分はｇＨよりむしろｇＢを認
識し（Ｇｏｍｐｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、マ
ウスにおいて、少なくともｇＢはｇＨより免疫原性であ
ることを示唆する。ＣＭＶを試験管内で中和する、１つ
のｇＢ特異的抗体７−１７、により認識された中和性エ
ピトープは、最近決定された（Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．、
１９８９）。Ｅ．ｃｏｌｉの中でβ−ガラクトシダーゼ
の融合タンパク質として発現された実験室の株ＡＤ１６
９からのｇＢについてのオープンリーディングフレーム
のオーバーラッピング断片を使用して、この抗体はアミ
ノ酸残基６０９および６２６の間の線状配列を認識こと
が示された。リウ（Ｌｉｕ）ら（１９８９）は、トウネ
（Ｔｏｗｎｅ）実験室株のｇＢ配列からのオーバーラッ
ピング合成ヘキサペプチドを使用し、そして２つの他の
線状中和性エピトープを同定し、これは残基５５９−５
６７および５８９−５９４にマッピングされた。バンク
ス（Ｂａｋｓ） ｅｔ ａｌ．（１９８９）は、ＣＭＶ
のトウネ（Ｔｏｗｎｅ）株を使用し、ネズミモノクロー
ナル抗体により中和することができる、少なくとも２つ
のエピトープを同定した。これらの２つのエピトープは
残基６２０−６８０の間に存在する。したがって、リウ
（Ｌｉｕ）らが記載する２つの部位およびウツ（Ｕｔ
ｚ）らが記載する１つに加えて、ｇＢ分子に対するネズ
ミモノクローナル抗体により認識される少なくとも１つ
のそれ以上のエピトープが存在する。

【０００５】配列Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１は、実験室株
ＡＤ１６９のある領域のＤＮＡおよびペプチドの配列を
示す。この領域はｇＢ遺伝子の一部分である。ＤＮＡに
対して番号は普通の使用、例えば、欧州特許出願（ＥＰ
−Ａ）第２３６，１４５号に記載する使用に従う。配列
ＩＤ Ｎｏ．２は、配列ＩＤ Ｎｏ．１のオープンリー
ディングフレームの翻訳を示す。番号はＩＤ Ｎｏ．１
と同一の使用に従う。

【０００６】第１図はＣＭＶの３つの実験室の試料およ
び２８の臨床的分離物からのＣＭＶのＤＮＡのＨｉｎｄ
ＩＩＩの消化の分析を示す。

【０００７】上記のｇＢ分子のエピトープは生物学的研
究および臨床目的の両方のために実験室で特に重要なも
のである。抗体７−１７のような、これらのエピトープ
に対する抗体は診断剤として使用されるものである。さ
らに、ＣＭＶは潜在性を確立することができかつ潜在的
に発癌性であるので、倫理的な考慮は生の弱毒化ＣＭＶ
ワクチンの使用を排除する。したがって、潜在的ＣＭＶ
ワクチンは多分弱毒化ワクチンよりむしろ重要なウイル
スのタンパク質に基づくであろう。

【０００８】ｇＢの１または２以上のエピトープに基づ
くＣＭＶに対するワクチンは、ワクチンがに基づく実験
室株の対応するエピトープが臨床的株に相当する場合、
臨床的実施において直面するＣＭＶの野生型株に対して
のみ有効であろう。同様に、実験室株に対してレイズさ
れた抗体は、抗体がそれに対してレイズされた抗体もの
と、同一でないにしても、それに密接に類似するエピト
ープを含む、ＣＭＶの臨床的分離物のみを検出するであ
ろう。明らかなように、実験室株と臨床的株との間の差
は、無効であるか、あるいは誤った陰性を与える診断の
抗体である、ＣＭＶに対してワクチンを生ずるであろ
う。

【０００９】今回、われわれは、臨床的ＣＭＶ試料を分
離しそしてＨｉｎｄＩＩＩを使用する制限酵素の消化に
より分析した。第１図は、臨床的株（１−２８）の中に
見いだされる２８のＣＭＶ株についてのこのような分析
および３つに組織培養株、ＡＤ１６９（Ａ）、トウネ
（Ｔｏｗｎｅ）（Ｔ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）
（Ｄ）との比較を示す。各分離物は独特なＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限プロフィルを有するが、各プロフィルは３つの実
験室適合株の面で分離するように思われる多形性を含有
する。例えば、ＡＤ１６９の断片Ｊはトウネ（Ｔｏｗｎ
ｅ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）株において追加のＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位を含有するし、そしてこの特徴を、ま
た、臨床的試料９−１２および２８が共有する。すべて
必要に応じて、多少の特異的多形性あ野生型ペリプラス
ミック内により頻繁に存在することがあり、ウイルスの
ある種の株のみが複製能力をもつこと、およびこれらが
臨床的検体の培養後に観察される種であることを説明す
る。

【００１０】しかしながら、前述の型の全体の制限分析
は、配列の異質性の機能的重要性について情報を提供し
ない。また、この分析により同定されない、大規模の多
形性断片内に配列の異質性が存在することがある。こう
して、ｇＢ領域の制限酵素の分析は実験室株と臨床的株
との間の類似性を示すことがあるが、特異的配列の変化
に関する情報を推定することができない。例えば、制限
部位における変化が重要なエピトープにおいて、あるい
はこのような領域の外側で起こるかどうかを決定するこ
とができない。

【００１１】

【課題を解決するための手段】今回、われわれは、ＤＮ
Ａ配列の変化が存在し、それらのあるものは、ＣＭＶの
臨床的分離物のｇＢ解読領域において、アミノ酸の変化
を生ずることを発見した。これはは抗体７−１７により
認識されるエピトープにおいて配列の変化を含む。

【００１２】ＣＭＶはこの分野において知られている任
意の適当な手段により分析できるが、ＣＭＶウイルスの
大きさは、２３５ｋｂのにおいて人間を感染することが
知られている最も長いウイルスのゲノムであり、多数の
試料における変化を分析すべきとき、いくつかの技術の
使用を排除する。われわれはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ；Ｓａｉｋ ｅｔ ａｌ．、１９８８）を使用し
て、各臨床的ＣＭＶ分離物の各々の問題の中和性エピト
ープを包含する、ｇＢ遺伝子からの１００ヌクレオチド
の断片を増幅した。次いで増幅したＤＮＡを適当なプラ
スミドのベクターの中にクローニングし、そして各分離
物の少なくとも３つの個々のクローンのＤＮＡ配列を決
定する。得られた特定の結果を下の実施例において表さ
れている。

【００１３】同定したＤＮＡの株の多数はアミノ酸配列
に対して変化を生じないが、ある種の変化はｇＢの従来
決定されたアミノ酸配列に対する変更を事実を生ずる。
とくに、アミノ酸残基のＮｏ．６１２、ロイシン、は置
換できる残基として同定された。さらに詳しくは、この
残基はＨｉｓ、ＶａｌまたはＰｈｅにより置換されてい
てもよい。残基Ｎｏ．６２２、アスパラギンは、また、
置換されていてもよい。とくに、それはチロシンで置換
されていることができる。残基Ｎｏ．６４５、アスパラ
ギン酸は、また、置換されていてもよい。とくに、それ
はグリシンで置換されていることができる。

【００１４】中和性エピトープのアミノ酸配列に対する
変化はことに有意にである。なぜなら、これは変更しな
いエピトープに対する抗体が変化したエピトープを認識
することができないようにすることがあるからである。
同様に、臨床的試料を、変更しないペプチド配列からな
るペプチドを使用して、ＣＭＶのエピトープに対する抗
体の存在について分析している場合、このような抗体
は、変更したエピトープに対して産生された場合、検出
されないことがある。

【００１５】臨床的場合において、これは、試料がＣＭ
Ｖの存在について分析されている場合、誤った陰性の結
果を生ずることがある。

【００１６】こうして、本発明は次のものを提供する：
少なくとも１つの変化、例えば、１、２、３または４〜
１０の変化、前記変化は置換、挿入または欠失である、
を含むが、そうでなければＣＭＶの特性を保持する、配
列ＩＤ Ｎｏ．１のＤＮＡ、およびその断片；好ましい
変化は１または２以上の、例えば、２、３または４〜１
０の、置換であり、それらの少なくとも１つはＤＮＡの
翻訳の変更を生ずる；前述の型のとくに好ましいＤＮＡ
断片は、ヌクレオチド１８３１−１８５７、１９２１−
１９３８、１９８１−２０３４、２０６８−２１１５に
相当するものおよびそれらの断片である；組み換えベク
ター、例えば、プラスミド、ファージまたはウイルス、
これらはこのようなＤＮＡを有し、そして必要に応じて
前記ベクターの選択のための配列および／またはＤＮＡ
の発現のためのシグナルを含有する；および上のベクタ
ーでトランスフェクションまたは形質転換された、細
胞、例えば、バクテリア、酵母菌、昆虫または哺乳動物
の細胞。

【００１７】本発明のＤＮＡ配列は、好ましくは、配列
ＩＤ Ｎｏ．１の対応する長さの領域に対して少なくと
も８０％、例えば、９０、９５または９９％の相同性を
有するであろう。

【００１８】好ましい特定の置換は、配列１−２７とし
て表１に示されている。

【００１９】ＣＭＶのトウネ（Ｔｏｗｎｅ）株において
見いだされる次の置換から成る、ＩＤ Ｎｏ．１のＤＮ
Ａ配列および適当ならばその断片： １８５４Ｃ→Ｔ、 １８９７Ｃ→Ａ、 １９４７Ｃ→Ｔ、 ２０１９Ｇ→Ｃ、 ２０７６Ｔ→Ｃ、 ２１０６Ｇ→Ａ、 ２１０９Ｔ→Ｃ、 ２１２７Ｔ→Ｃ、 ２１６６Ｇ→Ａ、 ２１６７Ｃ→Ｔ、 ２１９０Ｃ→Ｔおよび ２１９６Ａ→Ｇ は本発明から排除される。

【００２０】本発明は、また、置換、挿入または欠失で
ある、少なくとも１つの変化、例えば、１、２、３また
は４−１０の変化を含むが、そうでなければＣＭＶの特
性を保持する、ＩＤ Ｎｏ．２の配列のポリペプチドを
提供する。残基５５９−５６７、５８９−５９４、６０
９−６２６、６３８−６５３に相当するこの型のペプチ
ドおよびそれらの断片は好ましく、そしてペプチド６０
９−６２６およびその断片はことに好ましい。

【００２１】残基６０９−６２６に相当する本発明のペ
プチドおよびそれらの断片のうちで、残基６１２または
６２２に置換基（それらが存在するとき）をもつものは
とくに好ましい。より正確には、次の置換はことに好ま
しい： ６１２Ｌｅｕ−Ｈｉｓ ６１２Ｌｅｕ−Ｖａｌ ６１２Ｌｅｕ−Ｐｈｅ ６２２Ａｓｎ−Ｔｙｒ ６４５Ａｓｐ−Ｇｌｙ。

【００２２】６２２における置換は単独であるいは互い
にまたは６１２における置換、例えば、６１２Ｌｅｕ−
Ｈｉｓと組み合わせて起こることができる。

【００２３】本発明のペプチド配列は、好ましくは配列
ＩＤ Ｎｏ．２の対応する長さのある領域に対して少な
くとも８０％、例えば、８５％または９０％相同性であ
る。

【００２４】ペプチドはペプチド化学の分野において知
られている合成手段によるか、あるいは組み換え手段、
例えば、前述の型の発現ベクターを使用する組み換え手
段により産生することができる。

【００２５】用語「ＣＭＶの特性を保持する」は、本発
明のＤＮＡ（またはペプチド）配列をｇＢ遺伝子（また
はタンパク質）の中にを含め、引き続いてこれはＣＭＶ
の一部分を形成するとき、ＣＭＶのゲノムが実質的に野
生型ＣＭＶ株と同様な方法で宿主系において再生するこ
とができることを意味する。本発明のＤＮＡ（またはペ
プチド）配列からなるＣＭＶウイルスは、宿主細胞の中
のその再生に必須なタンパク質を産生することができ、
そしてまた、ウイルス粒子の形成について互いにアソシ
エーションすることができる他のタンパク質を産生する
ことができる。

【００２６】本発明は、さらに、本発明のペプチドに対
する抗体を提供する。抗体はポリクローナルまたはモノ
クローナルであることができる。

【００２７】ポリクローナル抗体は普通の手段により、
例えば、宿主動物、例えば、ラットまたはウサギに、必
要に応じて担体と結合した、本発明のペプチドを注射
し、そして免疫血清を回収することによって産生するこ
とができる。

【００２８】モノクローナル抗体は、また、普通の方法
により、例えば、ポリクローナル抗体の調製について前
述の手順に従うが、宿主動物を殺し、そしてその脾細胞
を永久分裂能化細胞系、例えば、マウス骨髄腫細胞系と
融合することによって産生することができる。

【００２９】本発明による抗体は、全抗体またはその結
合性断片、すなわち、それがレイズされた抗原に結合す
る能力を保持する断片であることができる。抗体は、ま
た、変更した抗体、例えば、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）
第０１２５０２３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に記載する
ようなヒト化抗体、または欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第
０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載するようなキ
メラ抗体を包含する。

【００３０】本発明は、さらに、本発明のペプチドまた
は前述の型のそれに対する抗体からなり、前記ペプチド
または抗体は必要に応じて、例えば、固定化および／ま
たは酵素、蛍光性マーカーまたは放射線標識で標識され
ていてもよい、試料、例えば、患者の血清の中のＣＭＶ
ウイルス株またはその株に対する抗体の存在を検出する
キットを提供する。

【００３１】ＣＭＶウイルスは、試料の中において、上
のペプチドを結合剤として使用して抗体の存在または不
存在を探すか、あるいは前述したような本発明の抗体を
使用してＣＭＶウイルスのペプチドの存在または不存在
を探すことによって検出することができる。

【００３２】本発明は、さらに、前述の型のペプチドま
たは抗体および製剤学的に許容されうる担体または希釈
剤からなる、ＣＭＶウイルスの感染の処置または予防の
ためのワクチンを提供する。ペプチドのワクチンは遊離
ペプチド、担体分子に取り付けられたペプチドとして投
与することができるか、あるいは臨床的に許容されうる
担体のウイルス、例えば、ワクシニアウイルスの組み換
えエピトープの一部分を形成することができる。

【００３３】

【実施例】次の実施例によって、本発明をさらに説明す
る。実施例１ ロイアル・フリー・ホスピタル（Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において腎臓または骨髄の移植を
実施する患者は、毎週集めた尿、唾液および血液の監視
の培養物を有する。臨床的検体をＣＭＶの存在について
試験し、そしてＣＭＶ培養のために一次ヒト胚肺線維芽
上に同時に接種した。

【００３４】ＨＣＭＶの臨床的分離物を一次ヒト胚肺線
維芽の中で１〜２継代培養のために増殖させた。ウイル
スのＤＮＡを次のようにして分離した：培養の上澄み液
を廃棄した後、溶菌緩衝液（０．１モルのトリスＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、０．００１モルのＥＤＴＡ、０．５％
のＳＤＳ）を細胞に添加し、そして染色体のＤＮＡをリ
ゼイトから４℃においてＮａＣｌ（５モル；０．２５体
積）で一夜沈澱させることによって除去した。４℃にお
いて２０，０００ｇで３０分間遠心した後、ウイルスの
ＤＮＡを含有する上澄み液を集めた。ウイルスのＤＮＡ
をプロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌ）で処理するこ
とによって精製し、次いでフェノール／クロロホルムで
抽出し、そして最後にエタノールで沈澱させた。

【００３５】ＨＣＭＶの各臨床的分離物から誘導された
ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして生ずるＤＮＡ
断片を０．７％のアガロースゲルを通す電気泳動により
分割した。ＤＮＡ断片をナイロンのフィルター（Ｈｙｂ
ｏｎｄ Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ）に移し、そしてランダムプライミングキット
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）お
よび確立された方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８９）を使用して、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９ゲ
ノムの独特の長いおよび独特の短い領域からの³²Ｐ標識
したクローニングしたＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を使用し
てプロービングした。

【００３６】ＰＣＲ増幅を、本質的にサイキ（Ｓａｉｋ
ｉ）および共同研究者ら（１９８６）が記載するように
実施した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは次の通り
であった： プライマー１： 5′-GAGGACAACGAAATCCTGTTGGGCA プライマー２： 5′-GTCGACGGTGGAGATACTGCTGAGG この反応混合物は次の成分を含有した：ＣＭＶのＤＮＡ
（１００ｎｇ）、２５ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．９、１７ミリモルの硫酸アンモニウム、３ミリモル
の塩化マグネシウム、１０ミリモルの２−メルカプトエ
タノール、０．００２％のゼラチン、１μモルの５’−
リン酸化（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９９
０）ＨＣＭＶ特異的プライマー、２００μモルのデオキ
シヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）およ
び１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ、Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）、合計の体積１
００μｌ。この反応混合物を１００μｌの鉱油でオーバ
ーレイし、そして試料を９５℃に６分間加熱することに
よって変性し、次いでハイバイド（Ｈｙｂａｉｄ）熱反
応器（ＨＢＴＲ１）を使用して３５のＰＣＲサイクルに
より増幅した。１サイクルは９４℃における９０秒間の
変性、６０℃における９０秒間のプライマーのアニーリ
ングおよび７２℃における１２０秒間の伸長を包含し
た。最後のサイクル後、試料を７２℃においてさらに１
０分間インキュベーションした。

【００３７】増幅した産生物（１００塩基対）を臭化エ
チジウムを含有する１．６％のアガロースゲル上で分析
し、そしてそれらが本物であることをサザンブロッティ
ングおよび³²Ｐ標識ＡＤ１６９ＨｉｎｄＩＩＩ Ｆプロ
ーブとのハイブリダイゼーションにより確証した。

【００３８】１００塩基対のＰＣＲ増幅した産生物をデ
オキシヌクレオチドトリホスフェート（２．５ミリモ
ル）の存在下にＤＮＡポリメラーゼＩ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）のクレノー断片で処理して、平滑末端の断片をつく
り、次いでサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９
８９）が記載するようにポリヌクレオチドキナーゼおよ
びＡＴＰで５’リン酸化した。生ずる断片をＳｍａＩ切
断した脱リン酸化ｐＴ７Ｔ３／１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）の中に結合した。成分Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の
形質転換後、断片を含有するクローンを³²Ｐ標識ＡＤ１
６９ＨｉｎｄＩＩＩ Ｆプローブを使用するコロニーの
ハイブリダイゼーションにより同定した（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。

【００３９】クローンをチェン（Ｃｈｅｎ）およびシー
バーグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）（１９８５）が開発したプラ
スミド配列決定プロトコルに従い両者の鎖について配列
決定した。少なくとも３つのクローンをＣＭＶ臨床的分
離物から誘導したＰＣＲ産生物について両者の鎖上で配
列決定して、手順反応の信頼性を確証した。

【００４０】表１はこれらの分離物において検出された
変化を示す。使用した番号は取り付けた配列のリストに
相当する。

【００４１】増幅した領域についてのアミノ酸配列は、
トリプレットのコドンの表示によりＤＮＡ配列から決定
した。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【００４４】参考文献 バンクス（Ｂａｎｋｓ）Ｔ． ｅｔ ａｌ．（１９８
９）、ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、７０：９７９−９８５。

【００４５】チー（Ｃｈｅｅ）ＭＳ ｅｔ ａｌ．、Ｃ
ｕｒｒ Ｔｏｐ Ｉｍｍ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（印刷
中）。

【００４６】チェン（Ｃｈｅｎ）ＥＹおよびシーバーグ
（Ｓｅｅｂｕｒｇ）ＰＨ（１９８５）、ＤＮＡ ４、１
６５−１７０。

【００４７】クラネイゲ（Ｃｒａｎａｇｅ） ｅｔ ａ
ｌ．（１９８６）、ＥＭＢＯ Ｊ．５：３０５７−６
３。

【００４８】クラネイゲ（Ｃｒａｎａｇｅ） ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８）、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
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【００４９】ゴンペルス（Ｇｏｍｐｅｌｓ）ＵＡ ｅｔ
ａｌ．（１９８７）、ジャーナル・オブ・ゼネラル・
ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、６８：７９
３−８０３。

【００５０】リウ（Ｌｉｕ）Ｎ−ＹＣ ｅｔ ａｌ．
（１９８９）、免疫学の第７回国際会議における提示
（Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ７ｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ベルリン１９８９、アブス
トラクトＮｏ．９８−５９。

【００５１】ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ＬＥ
ｅｔ ａｌ．（１９８４）、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）７９：６１６
−６２０。

【００５２】サイキ（Ｓａｉｋｉ）ＲＫ ｅｔ ａｌ．
（１９８８）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３
９、４８７−４９１。

【００５３】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、
フリトシ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）ＥＦおよびマニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）Ｔ（１９８９）、分子クローニング：
実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第
２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク州。

【００５４】ウツ（Ｕｔｚ）Ｕ ｅｔ ａｌ．、ウイル
ス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６３：１９９５−２
００１。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ROYAL FREE HOSPITAL SCHOOL OF MEDICINE <120> IMPROVEMENTS RELATING TO THE DETECTION OF VIRUSES <130> 200004078 <160> 2 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 1 aag gtg ctg cgt gat atg aac gtg aag gaa tcg cca gga cgc tgc tac 1878 Lys Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr 559 563 568 573 tca cga ccc gtg gtc atc ttt aat ttc gcc aac agc tcg tac gtg cag 1926 Ser Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln 578 583 588 tac ggt caa ctg ggc gag gac aac gaa atc ctg ttg ggc aac cac cgc 1974 Tyr Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg 593 598 603 act gag gaa tgt cag ctt ccc agc ctc aag atc ttc atc gcc ggg aac 2022 Thr Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn 608 613 618 tcg gcc tac gag tac gtg gac tac ctc ttc aaa cgc atg att gac ctc 2070 Ser Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu 623 628 633 638 agc agt atc tcc acc gtc gac agc atg atc gcc ctg gat atc gac ccg 2118 Ser Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro 643 648 653 ctg gaa aac acc gac ttc agg gta ctg gaa ctt tac tcg cag aaa gag 2166 Leu Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu 658 663 668 ctg cgt tcc agc aac gtt ttt gac ctc gaa 2196 Leu Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu 673 678 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 2 Lys Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr 559 563 568 573 Ser Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln 578 583 588 Tyr Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg 593 598 603 Thr Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn 608 613 618 Ser Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu 623 628 633 638 Ser Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro 643 648 653 Leu Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu 658 663 668 Leu Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu 673 678

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＤ１６９（Ａ）、ＤＡＶＩＳ（Ｄ）およびＴ
ＯＷＮＥ（Ｔ）株およびヒトサイトメガロウイルスの臨
床的分離物のＨｉｎｄＩＩＩ制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビンセント・エメリー イギリス国ロンドン エヌダブリユー３ ２キユージー・ハンプステツド・ポン ドストリート・ロイヤルフリーホスピタ ルスクールオブメデイシン・デパートメ ントオブバイロロジー (72)発明者 ポール・グリフイス イギリス国ロンドン エヌダブリユー３ ２キユージー・ハンプステツド・ポン ドストリート・ロイヤルフリーホスピタ ルスクールオブメデイシン・デパートメ ントオブバイロロジー (56)参考文献 特開 昭62−296891（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−502722（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／7143（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．63，Ｎ ｏ．５（1989）ｐ．1995−2001 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 70，Ｐｔ．４（1989）ｐ．979−985 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/11 C12Q 1/68 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列 5′-GAGGACAACGAAATCCTGTTGGGCA または 5′-GTCGACGGTGGAGATACTGCTGAGG を有するオリゴヌクレオチド。