CN103184265A - Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 - Google Patents

Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 Download PDF

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韩俊领
杜宏伟
周毓玲
崔丽娟
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Abstract

本发明公开了一种利用多重PCR技术结合SNP敏感性分子开关技术对细胞色素4502C19基因进行基因分型的基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法。所述试剂盒对CYP2C19基因上明显改变其产物活性的三个常见的多态性位点进行分型，包括：rs4244285SNP位点、rs4986893位点和rs12248560位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述三个SNP位点的分型，从而对CYP2C19基因进行基因分型，为该基因所表达的酶的活性的预测提供分子生物学依据。

Description

CYP2C19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法，尤其是利用多重PCR结合分子开关技术检测CYP2C19酶活性相关的SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
背景技术
细胞色素P450是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，在药物代谢中占有重要地位。大多数的药物进入体内后均需进行生物转化。生物转化主要包括I相反应和II相反应两个过程。I相反应涉及的代谢酶主要为肝细胞内质网的细胞色素P450酶系。细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)又称为S-美芬妥英羟化酶，是细胞色素P450的一个成员，其活性存在明显的个体差异，影响许多临床药物的代谢，对不同个体的药物治疗作用和不良反应及药物的毒性产生重要影响
1993年Wrighton等证明S-美芬妥英在人肝脏中由CYP2C19编码表达的羟化酶氧化为4’-羟基美芬妥英，根据美芬妥英羟化代谢的水平可以判断CYP2C19酶的活性。1994年Morais发现2C19上的2个多态性：m1(*2rs4244285)、m2(*3rs4986893)可以造成S-美芬妥英弱代谢，这两个多态性可以解释＞99％东方人的CYP2C19遗传多态性的弱代谢者的等位基因。CYP2C19*2是第5外显子第681位的碱基发生G→A变异，使得转录时在第5外显子的初始段丢失了40bp(634～682bp)的片段，从而改变了mRNA的阅读框架，提前产生一个终止密码，形成一个234个氨基酸的蛋白质缺失血红素结合区，从而丧失了催化活性。CYP2C19*3是第4外显子第636位处的碱基发生G→A变异，使212位原来编码色氨酸的密码子变为终止密码子，从而产生仅由211个氨基酸组成的没有活性的蛋白质。2006年Sim SC等发现一个新的SNP：-806C＞T(*17rs12248560)，可以造成S-美芬妥英极快速代谢，在亚洲人群中约5％的人群携带。
研究发现，CYP2C19参与许多药物代谢，如S-美芬妥英、苯巴比妥、丙戊酸(抗癫痫药)，奥美拉唑、雷贝拉唑(质子泵抑制剂)，氯胍、氯二胍(抗疟疾)，甲苯磺丁脲(降血糖药)，丙米嗪、氯丙米嗪、阿米替林(抗抑郁药)，地西泮、去甲地西泮(镇静、安眠药)等。CYP2C19酶活性存在多态性，因此不同的个体对药物代谢能力不同，产生的药物毒副作用及治疗效果不同。氯吡格雷是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠买综合征、冠脉支架术和冠心病的治疗。氯吡格雷属于前体药，其经过CYP2C19酶代谢后的活性产物才能发挥抗血小板的疗效。FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢型患者需要增加氯吡格雷剂量或者考虑改变治疗方案。奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂之一。伏立康唑是一种光谱的三唑类抗真菌药。这两种药都是由CYP2C19酶主要代谢的，CYP2C19快代谢者，会出现疗效不佳；CYP2C19弱代谢者，会出现严重不良反应。检测CYP2C19基因型，可以更精确地调整药物剂量。丙戊酸钠和丙戊酸镁是目前治疗全身性或部分性癫痫的首选药，但丙戊酸的代谢产物具有一定的肝毒性，对肝脏有损害。CYP2C19快代谢者相对于慢代谢者更容易出现肝毒性等不良反应。对于快代谢型者患者建议慎用丙戊酸。
发明内容
CYP2C19基因上三个中国人常见SNP直接影响CYP2C19酶的活性，影响多重药物的疗效和毒副作用。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术对CYP2C19基因进行基因检测的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
本发明采用的技术方案：一种CYP2C19基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测基因CYP2C19rs4244285位点、rs4986893位点和rs12248560位点的引物。
所述试剂盒包括检测CYP2C19基因rs4244285位点的两个正向引物及一个反向引物、检测CYP2C19基因rs4986893位点的两个正向引物及一个反向引物和检测CYP2C19基因rs12248560位点的两个正向引物及一个反向引物。
所述检测CYP2C19基因rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG
正向突变型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA
反向共用引物：TGAATCACAAATACGCAAGCAGTCAC
所述检测CYP2C19基因rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG
正向突变型引物：CATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA
反向共用引物：ATGTACTTCAGGGCTTGGTCAATATAG
所述检测CYP2C19基因rs12248560位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC
正向突变型引物：AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGT
反向共用引物：ATAGCCTACTAAAAATACAGCAGCCTA。
所述的CYP基因检测试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对3个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是：内对照733bp，rs12248560326bp，rs4244285217bp，rs4986893124bp；扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断3个SNP位点的基因型。
所述的检测CYP2C19基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤：
预变性由1次循环构成，其条件为：温度为94℃，时间为5分钟；
PCR扩增由30次循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为30秒；
退火：温度为58℃，时间为30秒；
延伸：温度为72℃，时间为90秒；
扩增结束后于4℃保存至电泳检测。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
(1)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对3个包含SNP位点的DNA片段和1个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。
(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。
(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。
(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。
(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。
(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2×扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。
(7)本发明的试剂盒所提供的野生型和突变型2×扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，避免人为错误。扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loading buffer，操作方便快捷。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的CYP2C19基因检测试剂盒，所述试剂盒可同时对CYP2C19基因上的rs4244285位点、rs4986893位点和rs12248560位点进行扩增分型检测，以β-Actin基因为内参来检测扩增条件；野生型2×缓冲包含上述3个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2×缓冲液包含上述3个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。
所述检测rs4244285位点的引物碱基序列如下所示(SEQ ID NO.1-9)：
正向野生型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG
正向突变型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA
反向共用引物：TGAATCACAAATACGCAAGCAGTCAC
所述检测rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG
正向突变型引物：CATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA
反向共用引物：ATGTACTTCAGGGCTTGGTCAATATAG
所述检测rs12248560位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC
正向突变型引物：AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGT
反向共用引物：ATAGCCTACTAAAAATACAGCAGCCTA
本发明试剂盒的组分和含量包括：
野生型2×扩增缓冲混合液，突变型2×扩增缓冲混合液，高保真聚合酶。
本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例一
步骤1：全血细胞裂解液的制备
取受检者外周静脉血300μl，加入700μl细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心1分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入300μl双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。
步骤2：PCR扩增反应
1、配置野生型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×野生型扩增缓冲液和0.2μl聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表：
 2×野生型扩增缓冲溶液   5μl
 细胞裂解悬液   4.8μl
 聚合酶(2.5U/μl)   0.2μl
2、配置突变型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×突变型扩增缓冲液和0.2聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表：
 2×突变型扩增缓冲溶液   5μl
 细胞裂解悬液   4.8μl
聚合酶(2.5U/μl)   0.2μl
3、对上述两个反应体系同时进行PCR反应，PCR程序见下表：
Figure BDA0000125874610000061
步骤3：扩增产物凝胶电泳
配置1.5％琼脂糖电泳凝胶，取扩增产物6-8μl直接加入加样孔内，每行另选一孔加入100bp Ladder Marker为分子量对照进行电泳，电泳条件为稳压6V/cm胶长，时间40分钟。
步骤4：观测结果
应用紫外成像系统观察电泳条带有无及位置。
四条区带由大到小依次是：内对照733bp，rs12248560326bp，rs4244285217bp，rs4986893124bp；如果在野生型扩增产物中124bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C19野生型个体；反之为CYP3A4*3突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中124bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中217bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C19野生型个体；反之为CYP2C19*2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中217bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中326bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C19野生型个体；反之为CYP2C19*17突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中326bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
实施例二
步骤1：全血基因组DNA的提取和稀释
取受检者外周静脉血300μl，按照全血基因组DNA提取试剂盒的说明提取全血基因组DNA。用分光光度计测量DNA的浓度，并稀释到15-20ng/μl。
步骤2：PCR扩增反应
1、配置野生型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×野生型扩增缓冲液和0.2μl聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表：
 2×野生型扩增缓冲溶液   5μl
 细胞裂解悬液   4.8μl
 聚合酶(2.5U/μl)   0.2μl
2、配置突变型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×突变型扩增缓冲液和0.2聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表：
 2×突变型扩增缓冲溶液   5μl
 细胞裂解悬液   4.8μl
 聚合酶(2.5U/μl)   0.2μl
3、对上述两个反应体系同时进行PCR反应，PCR程序见下表：
Figure BDA0000125874610000071
步骤3：扩增产物凝胶电泳
配置1.5％琼脂糖电泳凝胶，取扩增产物6-8μl直接加入加样孔内，每行另选一孔加入100bp Ladder Marker为分子量对照进行电泳，电泳条件为稳压6V/cm胶长，时间40分钟。
步骤4：观测结果
应用紫外成像系统观察电泳条带有无及位置。
四条区带由大到小依次是：内对照733bp，rs12248560326bp，rs4244285217bp，rs4986893124bp；如果在野生型扩增产物中124bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C19野生型个体；反之为CYP3A4*3突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中124bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中217bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C19野生型个体；反之为CYP2C19*2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中217bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中326bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C19野生型个体；反之为CYP2C19*17突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中326bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Figure IDA0000125874660000021

Claims (5)

1.一种CYP2C19基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因CYP2C19rs4244285位点、rs4986893位点和rs12248560位点的引物。
2.根据权利要求1所述的CYP2C19基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测CYP2C19基因rs4244285位点的两个正向引物及一个反向引物、检测CYP2C19基因rs4986893位点的两个正向引物及一个反向引物和检测CYP2C19基因rs12248560位点的两个正向引物及一个反向引物。
3.根据权利要求2所述的CYP2C19基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测CYP2C19基因rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG
正向突变型引物：TTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA
反向共用引物：TGAATCACAAATACGCAAGCAGTCAC
所述检测CYP2C19基因rs4986893位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG
正向突变型引物：CATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA
反向共用引物：ATGTACTTCAGGGCTTGGTCAATATAG
所述检测CYP2C19基因rs12248560位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC
正向突变型引物：AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGT
反向共用引物：ATAGCCTACTAAAAATACAGCAGCCTA。
4.一种权利要求1所述的CYP基因检测试剂盒所采用的检测方法，其特征在于，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对3个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是：内对照733bp，rs12248560326bp，rs4244285217bp，rs4986893124bp；扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断3个SNP位点的基因型。
5.一种采用权利要求1所述的检测CYP2C19基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
预变性由1次循环构成，其条件为：温度为94℃，时间为5分钟；
PCR扩增由30次循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为30秒；
退火：温度为58℃，时间为30秒；
延伸：温度为72℃，时间为90秒；
扩增结束后于4℃保存至电泳检测。
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