CN107447034A

CN107447034A - 一种氯吡格雷用药相关基因cyp2c19的检测试剂盒

Info

Publication number: CN107447034A
Application number: CN201710850051.7A
Authority: CN
Inventors: 邵敏华; 黄迅威
Original assignee: Suzhou Kgene Diagnostic Co Ltd
Current assignee: Suzhou Kgene Diagnostic Co Ltd
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2017-12-08

Abstract

一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，属于基因检测领域；本发明包括分别检测rs4244285位点的引物组和rs4986893位点的引物组；检测rs4244285位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，下游引物具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6；检测rs4986893位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10：12序列，下游引物具有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14；本发明分型结果准确性高达99％以上，重复性好，没有假阳性影响；同时检测多个SNP位点，检测成本低。

Description

一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，通过检测CYP2C19的单核苷酸多态性位点(SNP)，来检测个体的氯吡格雷用药相关基因。

背景技术

CYP2C19具有遗传多态性，突变的等位基因可以引起酶活性的缺失或减弱，呈现出强代谢和弱代谢两种表型，其基因缺陷将直接影响该酶的活性。抗血小板聚集药氯吡格雷在临床上很常用，研究证实它能够有效降低缺血性脑卒中，特别是脑血管支架置入术后的主要不良血管事件，包括支架内血栓形成的风险，所以其被广泛应用于缺血性脑卒中及行经皮脑血管介入病人的治疗。但是有部分患者存在氯吡格雷抵抗，其疗效的个体差异十分明显，研究表明多种因素对其有影响，其中最重要的内部因素是其基因多态性。目前，CYP2C19等位基因多态性尚未完全被探明，CYP2C19等位基因多态性与氯吡格雷抵抗的关系受到科研工作者广泛的关注。近年来，围绕CYP2C19等位基因多态性与氯吡格雷抵抗的关系已进行了很多的研究，尤其是CYP2C19等位基因多态性与氯吡格雷抵抗的相关性成为研究热点。

CYP2C19基因位于号染色体q24.1-q24.3位点，编码CYP2C19蛋白酶。其包括5个内含子和个9外显子，全长1.94kb，其中编码区为1.473kb。现在已经发现的等位基因有CYP2C19*1-*25，其中,23个等位基因编码蛋白。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1。CYP2C19基因多态性具有个体变异和种族差异，尤其在亚洲人和高加索人之间这种差异很明显。虽然CYP2C19酶占人体的肝微粒体CYP450的含量较小，但是它的酶缺陷在东方人中高达15%-23%。此外，在亚洲人群中几乎100%氯吡格雷的弱代谢者都是由CYP2C19的两个重要突变等位基因所编码的功能缺陷性药物代谢酶引起的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒的特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术，综合检测和分析受检人群是否携带氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的目的。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，包括分别检测rs4244285位点的引物组和rs4986893位点的引物组；所述检测rs4244285位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2和对应的探针SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列，所述检测rs4244285位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6和对应的探针SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8序列；

所述检测rs4986893位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10和对应的探针SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12序列，所述检测rs4986893位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14和对应的探针SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16序列。

包括试剂盒包括MgCl2 溶液，蛋白酶K，反应缓冲液，特异性引物混合液、探针混合液、Extension Dilution Buffer，10×ExtensionMix， 20×Wash Buffer 1，64×WashBuffer 2和去离子水。

反应缓冲液的含量为：300ul 0.5mol/L的MgCl2溶液；200μl 10mg/ml 的蛋白酶K混合液；480μl反应缓冲液；浓度为20pmol/L特异性引物混合液50ul，浓度为20pmol/L特异性延伸探针混合液15ul,900ul Extension Dilution Buffer，90ul 10×Extension Mix，2500ul 20×Wash Buffer 1， 800ul 64×Wash Buffer 2和灭菌纯化水200ml。

所述反应缓冲液包括3mol/L 20ul dNTP混合液， 15ul 5U/ul Taq DNA聚合酶，200ul 1U/ul SAP和灭菌纯化水300μl。

所述MgCl2溶液由MgCl2和灭菌纯化水配置而成，利用0.2μm滤膜过滤除菌后保存，保存温度为3-5℃。

试剂盒保存温度为-20℃。

本发明的有益效果是：分型结果准确性高达99％以上，重复性好，没有假阳性影响；同时检测多个SNP位点，检测成本低；操作简便；灵敏度高；本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

1、DNA的提取：

取受检者外周静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)20μl，55℃孵育15分钟，异丙醇沉淀、漂洗液洗涤四次，晾干后溶于适量TB溶液中。

2、PCR扩增

取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板中，进行多重PCR扩增：

反应总体积5ul，其中3mol/L dNTPs 0.0375ul，10×PCR Buffer 0.5ul，25mmol/LMgCl2 1ul，模板DNA 30ng，引物混合液20pmol/L 0.15ul，Amplitaq Gold(5U/ul)0.1ul，补足水到5ul。置于PCR仪上反应：预变性95℃ 5min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，72℃ 5min 35 个循环；Hold 4℃。

扩增引物混合液包括下列引物：

1F AGAGTGGGAGAATGCTGAGG (SEQ ID NO：1)

1R GCACAAGGTCTGTTTGAGGGA (SEQ ID NO：5)

2F CTGCAATGCTGAGTGTGCC (SEQ ID NO：2)

2R GACCTCTCTGTATTGGTTGACTTA (SEQ ID NO：6)

3F AGTTCACCTAAACCCTAGGTCTCCT(SEQ ID NO：9)

3R GTGACCAAGCTAAGGTGACAGT(SEQ ID NO：13)

4F CCCTAGTTGCCACTCACTCAGT (SEQ ID NO：10)

4R GTATGATCACCCTGGCGTC (SEQ ID NO：14)

3、引物延伸反应

纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物：extension Dilution Buffer 3.76ul，延伸探针混合液0.18ul，20×Extension Mix 0.2 ul，5U/ul DNA聚合酶0.12ul，灭菌纯化水3ul。反应程序：Hold 96℃ 3min；94℃ 20sec， 55℃ 25sec，37个循环；Hold 4℃。

延伸探针混合液包含下列探针：

1P TTGTTACGCACGTGTGATTCCACGTTCACTGTCACCCAACCTCCT (SEQ ID NO：3)

2P GGCGTGATCCGTCTGGCCCCTATCAAATGTTTACTATGTGTTGAG(SEQ ID NO：4)

3P CGTGCCGCTCGTGATAGAATTCACCTGTCGGRGATTTGTTGATCC(SEQ ID NO：7)

4P ATCTGAGCCCGGCGAGATATCATGCGGCCCCCGGTGGCTCGTCCC(SEQ ID NO：8)

5P CGCAACTTGTGCGTCCAGTGATCACTTTACCTTGTATCCACCTCC(SEQ ID NO：11)

6P GGATGGCGTTCCGTCCTATTTGCCCAATGCTATATGTCAGTTGAG(SEQ ID NO：12)

7P CGCACTGCCTGTGCTGRGATCGCTCGTGAAGATTATTATCGTTGC(SEQ ID NO：15)

8P AGATCGTCCGGCTGCCCCGTGCGACGCATGGACCGTCCCGTAGTC (SEQ ID NO：16)

以上延伸探针5’端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。

4、延伸反应结束后，加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。

孵育温度42℃，孵育时间2小时。

5、激光扫描检测荧光信号

同时检测上述2个基因对预测、比较个体的氯吡格雷用药代谢弱的概率具有重要意义。本发明通过大量的筛选数据表明氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的2个基因位点rs4244285和rs4986893均发生突变，则患者氯吡格雷代谢若的概率最高；反之则概率低。

本发明采用单核苷酸延伸技术方法，针对上述2个位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增携带SNP 位点的2个基因片段，根据SNP位点上游5’端24-25bp的序列设计探针，此探针与序列杂交后3’末端位于snp5’端上游1bp处。检测时聚合酶根据SNP携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧光的ddNTP，根据结合的ddNTP不同，其所携带的荧光颜色也不相同，在探针的5’端根据与微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列，不同的探针结合在芯片的不同区域，通过检测对应位置的荧光，达到同时进行多个SNP分型的目的。

传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部份患病风险人群，对于由于其他基因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警，检测的准确性因此会大幅降低，受检者不能全面的了解自身疾病的易感情况。

本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能给受检者提出具有针对性和有效地健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。

由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成本，可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测，本发明针对氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的两个多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能够给受检者提出具有针对性的健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。本发明通过单核苷酸延伸技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％，对检测氯吡格雷用药相关基因CYP2C19以及后续的辅助治疗具有重要意义。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

<110> 苏州康吉诊断试剂有限公司

<120> 一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒

<130> 233794072

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtgggag aatgctgagg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgcaatgct gagtgtgcc 19

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgttacgca cgtgtgattc cacgttcact gtcacccaac ctcct 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcgtgatcc gtctggcccc tatcaaatgt ttactatgtg ttgag 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcacaaggtc tgtttgaggg a 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacctctctg tattggttga ctta 24

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtgccgctc gtgatagaat tcacctgtcg grgatttgtt gatcc 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atctgacccc ggcgagatat catgcggccc ccggtggctc gtccc 45

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agttcaccta aaccctaggt ctcct 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacctctctg tattggttga ctta 24

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcaacttgt gcgtccagtg atcactttac cttgtatcca cctcc 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggatggcgtt ccgtcctatt tgcccaatgc tatatgtcag ttgag 45

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgaccaagc taaggtgaca gt 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtatgatcac cctggcgtc 19

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgcactgcct gtgctgrgat cgctcgtgaa gattattatc gttgc 45

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agatcgtccg gctgccccgt gcgacgcatg gaccgtcccg tagtc 45

Claims

1.一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，其特征在于：包括分别检测rs4244285位点的引物组和rs4986893位点的引物组；所述检测rs4244285位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2和对应的探针SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列，所述检测rs4244285位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6和对应的探针SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8序列；

2.根据权利要求1所述一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，其特征在于：包括试剂盒包括MgCl2 溶液，蛋白酶K，反应缓冲液，特异性引物混合液、探针混合液、Extension Dilution Buffer，10×ExtensionMix， 20×Wash Buffer 1，64×Wash Buffer2和去离子水。

3.根据权利要求2所述一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，其特征在于：反应缓冲液的含量为：300ul 0.5mol/L的MgCl2溶液；200μl 10mg/ml 的蛋白酶K混合液；480μl反应缓冲液；浓度为20pmol/L特异性引物混合液50ul，浓度为20pmol/L特异性延伸探针混合液15ul,900ul Extension Dilution Buffer，90ul 10×Extension Mix，2500ul 20×Wash Buffer 1， 800ul 64×Wash Buffer 2和灭菌纯化水200ml。

4.根据权利要求3所述一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液包括3mol/L 20ul dNTP混合液， 15ul 5U/ul Taq DNA聚合酶，200ul1U/ul SAP和灭菌纯化水300μl。

5.根据权利要求3所述一种氯吡格雷用药相关基因CYP2C19的检测试剂盒，其特征在于：所述MgCl2溶液由MgCl2和灭菌纯化水配置而成，利用0.2μm滤膜过滤除菌后保存，保存温度为3-5℃。