CN104946757A - 一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法与应用 - Google Patents

一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，先通过PCR法扩增检测位点所在基因片段然后采用SNaPshot技术结合毛细管电泳技术进行检测。本发明提供的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法通过采用多重PCR对3个位点所在的基因片段进行扩增，同时采用SNaPshot技术进行检测，与常规的对多个位点进行单独扩增相比，不仅减少了扩增程序，降低了扩增成本，同时保证了高的灵敏性、准确度以及精密地，保证了该检测方法的可靠性。

Description

一种 CYP2C19(*2 、 *3 、 *17) 基因多态性 SNaPshot 检测方法与应用
技术领域
本发明属于基因多态性检测领域，具体涉及一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法与应用。
背景技术
肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素P450 (cytochrome P450 )是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19酶广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等组织器官，主要在肝脏。其参与多种外源性物质代谢如：药物、酒精、抗氧化剂、有机溶剂、染料、环境污染物质等。从理论上讲，所有的药物代谢酶都具有遗传多态性。绝大多数药物代谢酶的多态性是一种单基因多态性，是由于同一基因位点上具有多个等位基因引起的。遗传学的改变使CYP450酶表现出遗传多态性，并且具有明显个体、种族或地域差异。
等位基因编码的代谢酶具有不同的代谢能力：正常野生型表现为快代谢型(EM)；绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代谢型(PM)，这对治疗的个体反应和药物毒副作用都产生重要影响。
CYP2C19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1，CYP2C19等位基因主要是*1，*2，*3……*17。而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上。*2，*3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*2 等位基因变异的外显子5第681位处的碱基发生变异(G/A)形成了一个异常剪接点，使得转录时在外显子5的始端丢失了40个碱基对(643-682bp)，从而在翻译时丢失了215-227位氨基酸，使215位氨基酸开头的阅读框架发生移动，因此在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生1个终止密码，使蛋白合成过早被终止，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质丧失了催化活性。由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为30%。CYP2C19*3等位基因是在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失。通过该酶代谢的药物（如质子泵抑制剂，抗惊厥药等）随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。
目前常用的对基因多态性位点检测的方法有Sanger测序及AS-PCR+琼脂糖凝胶电泳,Sanger测序的方法检测基因多肽性位点成本相对较高，AS-PCR+琼脂糖凝胶电泳的方法检测多态性位点灵敏性相对较低。因此需要开发一种成本相对较低，同时灵敏性好，准确度与精密度高的基因多态性位点检测方法。
发明内容
本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其包括如下步骤：首先提取血液基因组DNA，将其稀释至100μg/mL后通过PCR扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3及CYP2C19*17所在序列，PCR扩增产物纯化后将对应的序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并通过软件分析SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。
作为本发明所优选的一种实施方式，所述的检测方法，具体包括如下步骤：
1）DNA提取：提取方法参照TIANampBloodDNAkit(购自Tiagen，货号DP318)的说明书，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至100μg/mL；
2）PCR扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3及CYP2C19*17所在序列：PCR反应体系中组分及体积份数分别为Q5™Master Mix12.5份，双蒸水8.5份，，ward1份，Reverse1份；准确量取PCR反应体系23μL，向其中加入2μL稀释后DNA模板；置PCR管放于PCR仪上并将反应程序设置如下：1：98℃，3 min；2：98℃，10 sec；3：58℃，30 sec；4：72℃，1 min；5：往复进行35个循环 ；6：72℃，5 min；7：25℃ ；
3）PCR扩增产物纯化：取2体积份的ExoSAP-IT和3体积份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分装到新的8连管中，每管加入PCR扩增产物2μL，混匀微离心，按以下程序进行反应：1：37℃,15 min ；2：80℃,15 min 3：4℃；
4）SNaPshotPCR扩增：SNaPshotPCR反应体系中组分及体积份数分别为SnaPshot ReadyMix 2.5份；5×sequencing buffer 1份；Primers Mixer 2份；ddH2O 3.5份；其中引物混合物，比例如下：SNE_CYP2C19*2：SNE_CYP2C19*3：SNE_CYP2C19*17=1：1：3；准确量取SNaPshotPCR反应体系9μL，向其中加入1μL步骤3）得到纯化产物，混匀微离，按以下程序进行PCR1：96℃，10 sec；2：55℃，5 sec；3：60℃，30 sec；4：往复进行25 个循环；5：4℃ ；
5）SNaPshotPCR产物纯化：向SNaPshotPCR产物中加入1μLSAP酶，按以下程序进行反应：1：37℃，60 min ；2：75℃，15 min ；3：4℃；
6）SNaPshot分析：步骤5）获得的产物经 ABI 3100-XL基因分析仪毛细管电泳法检测荧光信号，通过GENEMAPPERIDV4.1软件分析确定SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，所述检测位点包括CYP2C19*2: c.681G>A(p.Pro227=)(SNP:rs4244285); CYP2C19*3: c.636G>A(p.Trp212Ter)(SNP:rs4986893); CYP2C19*17: c.-806C>T(SNP:rs12248560)。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，所述PCR中扩增CYP2C19(*2)的引物对如下：正向引物：AATTACAACCAGAGCTTGGC(SEQ ID NO.1)；反向引物为：CTTCTCCATTTTGATCAGGA(SEQ ID NO.2)。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，所述PCR中扩增CYP2C19(*3)的引物对如下：正向引物：GCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA(SEQ ID NO.3)；反向引物为：ACTTCAGGGCTTGGTCAATA(SEQ ID NO.4)。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，所述PCR中扩增CYP2C19(*17)的引物对如下：正向引物：GCCCTTAGCACCAAATTCTC(SEQ ID NO.5)；反向引物为：ATTTAACCCCCTAAAAAAACACG(SEQ ID NO.6)。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法， SNaPshot中扩增CYP2C19（*2）的引物如下：TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC(SEQ ID NO.7)。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法， SNaPshot中扩增CYP2C19（*3）的引物如下：GGATTGTAAGCACCCCCTG(SEQ ID NO.8)。
所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法， SNaPshot中扩增CYP2C19（*17）的引物如下：TTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG(SEQ ID NO.9)。
本发明采用上述引物和扩增条件得到CYP2C19(*2、*3、*17)基因的扩增片段如下：
_CYP2C19 （*2）引物扩增片段为
aattacaacc agagcttggc atattgtatc tataccttta ttaaatgctt ttaatttaat
aaattattgt tttctcttag atatgcaata attttcccac tatcattgat tatttcccgg
gaacccataa caaattactt aaaaaccttg cttttatgga aagtgatatt ttggagaaag
taaaagaaca ccaagaatcg atggacatca acaaccctcg ggactttatt gattgcttcc
tgatcaaaat ggagaa；
_CYP2C19 （*3）引物扩增片段为：
gctaggctgt aattgttaat tcgagattaa tgtaaaagtg atgtgttgat tttatgcatg
ccaaactctt ttttgctttt aagggaattc ataggtaaga tattacttaa aatttctaaa
ctattattat ctgttaacaa atatgaagtg ttttatatct aatgtttact catattttaa
aattgtttcc aatcatttag cttcaccctg tgatcccact ttcatcctgg gctgtgctcc
ctgcaatgtg atctgctcca ttattttcca gaaacgtttc gattataaag atcagcaatt
tcttaacttg atggaaaaat tgaatgaaaa catcaggatt gtaagcaccc cctggatcca
ggtaaggcca agttttttgc ttcctgagaa accacttaca gtcttttttt ctgggaaatc
caaaattcta tattgaccaa gccctgaagt；
CYP2C19 （*17）引物扩增片段为：
gcccttagca ccaaattctc tgagatcagc tcttccttca gttacactga gcatttcccc
tctgcagtga tggagaaggg agaactctta ttttttctca tgagcatctc tggggctgtt
ttccttagat aaataagtgg ttctatttaa tgtgaagcct gttttatgaa caggatgaat
gtggtatata ttcagaataa ctaatgtttg gaagttgttt tgttttgcta aaacaaagtt
ttagcaaacg attttttttt tcaaatttgt gtcttctgtt ctcaaagcat ctctgatgta
agagataatg cgccacgatg ggcatcagaa gacctcagct caaatcccag ttctgccagc
tatgagctgt gtggcaccaa caggtgtcct gttctcccag ggtctccctt ttcccatttg
aaatataaaa aataacaatt cctgccttca cgtgtttttt tagggggtta aat。
以上所述的检测方法在CYP2C19代谢相关药物治疗中的应用。
本发明提供的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法通过采用多重PCR对3个位点所在的基因片段进行扩增，同时采用SNaPshot技术进行检测，与常规的对多个位点进行单独扩增相比，不仅减少了扩增程序，降低了扩增成本，同时保证了高的灵敏性、准确度以及精密地，保证了该检测方法的可靠性。
本发明提供的检测方法能够在CYP2C19代谢相关药物治疗前进行CYP2C19*2、*3和*17基因多态性检测，判定患者的药物代谢速率类型，有助于医生为患者正确选择药物并合理调整药物剂量。
附图说明
图1为CYP 2C19(*2, *3, *17)基因扩增产物测序图。
图2为SNaPshot法检测CYP 2C19(*2, *3, *17)图。
具体实施方式：
实施例1
1. CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测
本检测方法是通过采用PCR法扩增检测位点所在基因片段后采用荧光标记单碱基延伸技术(SNaPshot)结合毛细管电泳技术进行检测，检测结果采用GENEMAPPERID V4.1进行分析，根据峰的移动位置确定延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色确定该SNP位点的基因型。
本检测用于检测来源于EDTA抗凝外周血的DNA样本，采用PCR扩增检测位点所在基因片段后采用荧光标记单碱基延伸技术(SNaPshot)结合毛细管电泳技术进行检测，检测结果采用GENEMAPPERID V4.1进行分析，根据峰的移动位置确定延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色确定该SNP位点的基因型。
本检测的检测位点包括CYP2C19*2: c.681G>A(p.Pro227=)(SNP:rs4244285); CYP2C19*3: c.636G>A(p.Trp212Ter)(SNP:rs4986893); CYP2C19*17: c.-806C>T(SNP:rs12248560)。
主要试剂及仪器如下：
（1）引物
本检测所用引物均由自行设计(见表1)，NCBI基因参考序列号如下：NC_000010.10, NM_000769.1。PCR引物序列见表1，所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
表1 PCR引物序列
（2）试剂
本检测DNA提取采用Qiagen公司产品TIANamp Blood DNA Kit，货号DP318；
PCR扩增采用NEB公司产品Q5™热启动超保真2X Master Mix，货号M0494L；
SNaPshot单碱基延伸测序采用ABI 公司产品SNaPshot® Multiplex Kit，货号4323151；
详细步骤参考各自操作说明书。
（3）主要仪器见下表2
表2 检测所用仪器
序号 仪器名称 用途 品牌 备注
1 BioRad S1000 PCR扩增 BioRad 编号：FB86
2 ABI 9700 PCR扩增 Life 编号：FB38
3 ABI 3500xl SNaPshot测序 Life 编号：FB110
实施例2
（1）引物特异性
1)各引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：P450_CYP2C19(*2)引物扩增片段位于chr10: 96541498-96541754，长度为257bp；P450_CYP2C19(*3)引物扩增片段位于chr10: 96540056-96540505，长度为450bp；P450_CYP2C19(*17)引物扩增片段位于chr10: 96521370-96521842，长度为473bp。所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因。
2)使用表1中PCR扩增引物分别对检测样本进行扩增及Sanger测序，测序结果显示，各引物扩增片段与CYP2C19基因参考序列吻合(见附图1，仅显示部分结果)。
3)使用表1中SNaPshot PCR引物对上一步骤中的PCR产物进行微测序，结果显示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰(见附图2)。
4）表1中PCR扩增引物具有以下特点：a），引物长度适宜，分别为20/20(CYP2C19*2)，24/20(CYP2C19*3)，20/20(CYP2C19*17)；b），GC含量为40；c），Tm为55-58℃。该扩增引物能够有效且特异的扩增目的DNA片段。
（2）检测特异性
本检测的检测特异性定义为阴性符合率。
本检测共对22例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用Sanger测序法进行验证。其中，使用SNaPshot测序法检测无突变的样本(阴性)共8例(如表3所示)，与Sanger测序法显示的结果相符。本检测的检测特异性为100%。
表3 检测特异性实验数据
（2）检测灵敏度
本检测的检测灵敏度定义为阳性符合率。
本检测共对22例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用Sanger测序法进行验证。其中，使用SNaPshot测序法检测突变的样本(阳性)共14例(如表4所示)，与Sanger测序法显示的结果相符。本检测的检测灵敏度为100%。
表4 检测灵敏度实验数据
（3）准确度
本检测准确度定义为不同方法检测结果的一致性。
22例标本经SNaPshot法和Sanger测序法检测，两种方法检测结果完全一致，如表5所示。本检测的准确度为100%。
表5准确度实验数据
（4）精密度
本检测准确度定义为不同方法检测结果的一致性。
本检测进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验(表6)，所有结果均显示一致，本检测精密度为100%。
备注：位点1: CYP2C19*2 c.681G>A; 位点2: CYP2C19*3 c.636G>A; 位点3: CYP2C19*17 c.-806C>T
表6精密度实验数据
注：I：仪器编号
（5）临床特异性和临床灵敏度
P450 2C19(CYP2C19)是细胞色素P450酶系的重要一员，是体内药物代谢的主要酶系，同多种药物代谢密切相关，如氯吡咯雷、奥美拉唑、他莫昔芬等。
目前数据表明，CYP2C19至少有12个亚族，具有多个遗传多态性位点，在东亚人群中，CYP2C19等位基因最常见的是*1(~60%)，*2(~29%)，*3(~8.9%)以及*17(~2.7%)型(在本检测中，*1代表未检测到CYP2C19*2、*3和*17)。
CYP2C19酶活性因遗传多态性位点的不同而在不同个体和种族之间存在显著差异，如CYP2C19*2、*3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*17等位基因编码的酶表达增强，从而导致药物代谢能力、药物疗效及副作用的个体差异。根据对药物代谢能力的差异将人群分为：超快代谢(UM)、快代谢(EM)、中等代谢(IM)、慢代谢(PM)等四种类型（见表7）。快代谢型患者对药物的代谢能力正常，慢代谢型患者对药物的代谢能力差，按常规方法治疗效果较差，详细信息参考CPIC或FDA药物标记，或参考http://www.pharmgkb.org/index.jsp。
表7 CYP2C19基因多态性临床意义
表型 说明 基因型示例
超快代谢型(UM, 约5~30%) 携带1个或2个增强等位基因 *1/*17;*17/*17
快代谢型(EM, 约35~50%) 携带2个功能性等位基因 *1/*1(在本检测中代表*2、*3、*17均未检测到多态性)
中间代谢型(IM, 约18~45%) 携带1个无功能等基因 *1/*2；*1/*3
慢代谢型(PM, 约2~15%) 携带2个无功能等位基因 *2/*3；*3/*3；*2/*2
实施例3
临床用途
在患者使用氯吡格雷、奥美拉唑、他莫昔芬等CYP2C19代谢相关药物治疗前进行CYP2C19*2、*3和*17基因多态性检测，判定患者的药物代谢速率类型，有助于医生为患者正确选择药物并合理调整药物剂量。临床用药结果显示，本发明检测方法的确定的CYP2C19(*2、*3、*17)基因型准确，可用于CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性检测，为临床用药提供基因信息参考。
<110> 广州金域医学检验中心有限公司
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tttttttttt caaatttgtg tcttctgttc tcaaag 36

Claims (10)

1.一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，首先提取血液基因组DNA，将其稀释后通过PCR扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3及CYP2C19*17所在序列，PCR扩增产物纯化后将对应的序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并通过软件分析SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。
2.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
1）DNA提取：提取方法参照TIANampBloodDNAkit(购自Tiagen，货号DP318)的说明书，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至100μg/mL；
2）PCR扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3及CYP2C19*17所在序列：PCR反应体系中组分及体积份数分别为Q5™Master Mix12.5份，双蒸水8.5份，ward1份，Reverse1份；准确量取PCR反应体系23μL，向其中加入2μL稀释后DNA模板；置PCR管放于PCR仪上并将反应程序设置如下：1：98℃，3 min；2：98℃，10 sec；3：58℃，30 sec；4：72℃，1 min；5：往复进行35个循环 ；6：72℃，5 min；7：25℃ ；
3）PCR扩增产物纯化：取2体积份的ExoSAP-IT和3体积份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分装到新的8连管中，每管加入PCR扩增产物2μL，混匀微离心，按以下程序进行反应：1：37℃,15 min ；2：80℃,15 min 3：4℃；
4）SNaPshotPCR扩增：SNaPshotPCR反应体系中组分及体积份数分别为SnaPshot ReadyMix 2.5份；5×sequencing buffer 1份；Primers Mixer 2份；ddH2O 3.5份；其中引物混合物，比例如下：SNE_CYP2C19*2：SNE_CYP2C19*3：SNE_CYP2C19*17=1：1：3；准确量取SNaPshotPCR反应体系9μL，向其中加入1μL步骤3）得到纯化产物，混匀微离，按以下程序进行PCR1：96℃，10 sec；2：55℃，5 sec；3：60℃，30 sec；4：往复进行25 个循环；5：4℃ ；
5）SNaPshotPCR产物纯化：向SNaPshotPCR产物中加入1μLSAP酶，按以下程序进行反应：1：37℃，60 min ；2：75℃，15 min ；3：4℃；
6）SNaPshot分析：步骤5）获得的产物经 ABI 3100-XL基因分析仪毛细管电泳法检测荧光信号，通过GENEMAPPERIDV4.1软件分析确定SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。
3.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测位点包括CYP2C19*2: c.681G>A(p.Pro227=)(SNP:rs4244285); CYP2C19*3:c.636G>A(p.Trp212Ter)(SNP:rs4986893);CYP2C19*17:c.806C>T(SNP:rs12248560)。
4.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述PCR中扩增CYP2C19(*2)的引物对如下：正向引物：AATTACAACCAGAGCTTGGC；反向引物为：CTTCTCCATTTTGATCAGGA。
5.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述PCR中扩增CYP2C19(*3)的引物对如下：正向引物：GCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA；反向引物为：ACTTCAGGGCTTGGTCAATA。
6.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述PCR中扩增CYP2C19(*17)的引物对如下：正向引物：GCCCTTAGCACCAAATTCTC；反向引物为：ATTTAACCCCCTAAAAAAACACG。
7.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，SNaPshot中扩增CYP2C19（*2）的引物如下：TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC。
8.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，SNaPshot中扩增CYP2C19（*3）的引物如下：GGATTGTAAGCACCCCCTG。
9.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，SNaPshot中扩增CYP2C19（*17）的引物如下：TTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG。
10.权利要求1所述的检测方法在CYP2C19代谢相关药物治疗中的应用。
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