CN109097479A

CN109097479A - Cyp2c19基因多态性检测试剂盒

Info

Publication number: CN109097479A
Application number: CN201710441527.1A
Authority: CN
Inventors: 戴维·约翰·弗伦奇; 莫妮卡·帕纳苏; 杨松江
Original assignee: Binjiang Huakang Biotechnology Co Ltd (beijing)
Current assignee: Binjiang Huakang Biotechnology Co Ltd (beijing)
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2018-12-28

Abstract

本发明公开了CYP2C19基因多态性检测试剂盒。本发明试剂盒具有如下优点：(1)检测灵敏度高，最低检测限为62.5pg DNA；(2)操作简便，无需专业知识，可以实现床旁检测；(3)检测时间短，最短只需45分钟；(4)检测特异性高，使用特异性的荧光探针，具有很高的准确性；(5)无需核酸提取，加入低熔点琼脂糖(agarose)，很大程度避免了PCR污染。本发明的试剂盒搭配ParaDNA基因扩增检测仪器实现床旁检测(POCT)，可用于在临床上指导氯吡格雷和伏立康唑用药。

Description

CYP2C19基因多态性检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CYP2C19基因多态性检测试剂盒。

背景技术

CYP2C19即细胞色素P450同工酶2C19，涉及多种药物的代谢，包括氯吡格雷、S-美芬妥英、依他普仑、丙咪嗪、多种质子泵抑制剂(如兰索拉唑、奥美拉唑)、伏立康唑、地西泮和去甲西泮等药物的代谢。CYP2C19基因位于人类第10号染色体上，该基因的多态性会导致其编码酶活性出现较大的个体差异。CYP2C19基因多态性在不同人种分布差异较大，其中，*1、 *2、*3和*17在不同的人群中所占的比例比较稳定并且较高。其中，CYP2C19*1编码正常功能的酶；CYP2C19*2导致剪接缺失，CYP2C19*3为终止密码子突变，二者会导致编码的酶活性丧失；而CYP2C19*17(rs12248560)可引起CYP2C19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强。这些不同的CYP2C19基因使人群出现超快代谢者(ultrarapid metabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediate metabolizer，IM) 和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表现型。超快代谢者个体CYP2C19基因型为*17*17或*1*17；快代谢者个体基因型为*1*1；中间代谢者个体基因型为*1*2、*1*3、*2*17或*3*17；慢代谢者个体基因型为*2*2、*2*3或*3*3。

CYP2C19*2(rs4244285)和CYP2C19*3(rs4986893)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19 酶缺陷的主要等位基因。在东方人群中，75-85％的慢代谢者由CYP2C19*2基因型所致，剩下的约20-25％的慢代谢者由CYP2C19*3基因型所致。

氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需考虑改变治疗方案。CYP2C19基因多态性与氯吡格雷用药情况如表1所示。

表1、CYP2C19基因多态性与氯吡格雷用药情况

伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药，CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C19 EM与PM 个体间伏立康唑的血液浓度存在显著差异。FDA批准的药物说明书中指出应用伏立康唑前需检测CYP2C19基因型，以确保用药安全。CYP2C19基因多态性与伏立康唑用药情况如表2所示。

表2、CYP2C19基因多态性与伏立康唑用药情况

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测CYP2C19基因多态性的成套引物。

本发明提供的成套引物由成套引物甲、成套引物乙和成套引物丙组成；

所述成套引物甲由用于检测rs4244285位点的引物对甲和探针甲组成；所述引物对甲由引物1和引物2组成；

所述成套引物乙由用于检测rs4986893位点的引物对乙和探针乙组成；所述引物对乙由引物3和引物4组成；

所述成套引物丙由用于检测rs12248560位点的引物对丙和探针丙组成；所述引物对丙由引物5和引物6组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)序列4所示的单链DNA分子；

d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物5为如下e1)或e2)：

e1)序列5所示的单链DNA分子；

e2)将e1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物6为如下f1)或f2)：

f1)序列6所示的单链DNA分子；

f2)将f1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述探针甲为如下g1)或g2)：

g1)序列7所示的单链DNA分子；

g2)将g1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述探针乙为如下h1)或h2)：

h1)序列8所示的单链DNA分子；

h2)将h1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述探针丙为如下i1)或i2)：

i1)序列9所示的单链DNA分子；

i2)将i1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套引物中，

所述成套引物甲中，所述引物1、所述引物2和所述探针甲的摩尔量比为(1-5):(1-5): 1，在本发明的具体实施例中，所述引物1、所述引物2和所述探针甲的摩尔量比为3:1:1；

所述成套引物乙中，所述引物3、所述引物4和所述探针乙的摩尔量比为(1-5):(1-5): 1，在本发明的具体实施例中，所述引物3、所述引物4和所述探针乙的摩尔量比为3:1:1；

所述成套引物丙中，所述引物5、所述引物6和所述探针丙的摩尔量比为(1-5):(1-5): 1，在本发明的具体实施例中，所述引物5、所述引物6和所述探针丙的摩尔量比为3:1:1。

上述成套引物中，

所述探针甲的第2位和第7位碱基均为荧光基团修饰的碱基T，所述荧光基团具体为FAM；

图15为试剂盒最低检测限实验的CYP2C19*3熔解曲线结果。

图16为PCR产物的电泳结果。

所述探针丙的第9位和第12位碱基均为荧光基团修饰的碱基T，所述荧光基团具体为 FAM。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测CYP2C19基因多态性的PCR试剂。

本发明提供的用于检测CYP2C19基因多态性的PCR试剂其包括上述成套引物和DNA聚合酶。

上述PCR试剂中，所述DNA聚合酶为Phire Hotstart II DNA聚合酶；

所述PCR试剂由所述引物1、所述引物2、所述探针甲、所述Phire Hotstart II DNA聚合酶、琼脂糖、dNTPs、buffer和水组成；

所述PCR试剂由所述引物3、所述引物4、所述探针乙、所述Phire Hotstart II DNA聚合酶、琼脂糖、dNTPs、buffer和水组成；

所述PCR试剂由所述引物5、所述引物6、所述探针丙、所述Phire Hotstart II DNA聚合酶、琼脂糖、dNTPs、buffer和水组成；

所述引物1或引物3或引物5在所述PCR试剂中的浓度均为(0.01-5)μM，在本发明的具体实施例中，所述引物1或引物3或引物5在所述PCR试剂中的浓度均为0.86μM；

所述引物2或引物4或引物6在所述PCR试剂中的浓度均为(0.01-5)μM，在本发明的具体实施例中，所述引物2或引物4或引物6在所述PCR试剂中的浓度均为0.29μM；

所述探针甲或探针乙或引物丙在所述PCR试剂中的浓度均为(0.01-5)μM，在本发明的具体实施例中，所述探针甲或探针乙或引物丙在所述PCR试剂中的浓度均为0.29μM；

所述Phire Hotstart II DNA聚合酶在所述PCR试剂中的浓度为(0.05-5)U/μL，在本发明的具体实施例中，所述Phire Hotstart II DNA聚合酶在所述PCR试剂中的浓度为0.2 U/μL；

所述琼脂糖在所述PCR试剂中的质量分数为(0.1-10)％，在本发明的具体实施例中，所述琼脂糖在所述PCR试剂中的质量分数为0.2％。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。

本发明提供的用于检测CYP2C19基因多态性的试剂盒其包括上述成套引物或上述PCR试剂。

本发明的第四个目的是提供上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下m1)-m8)中任一种中的应用：

m1)制备检测或辅助检测CYP2C19基因多态位点的产品；

m2)检测或辅助检测CYP2C19基因多态位点；

m3)制备检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型的产品；

m4)检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型；

m5)制备检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因的产品；

m6)检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因；

m7)制备用于在临床上指导氯吡格雷和/或伏立康唑用药的产品；

m8)在临床上指导氯吡格雷和/或伏立康唑用药；

所述CYP2C19基因多态位点为rs4244285和/或rs4986893和/或rs12248560位点。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型的方法为如下(x1)或(x2)或 (x3)：

(x1)使用上述引物对甲和探针甲对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测样品的基因型：

若待测患者的Tm值为49.0-53.0，则待测患者的基因型为或候选为AA基因型；

若待测患者的Tm值为57.7-61.7，则待测患者的基因型为或候选为GG基因型；

若待测患者的Tm值为57.7-61.7和49.0-53.0，则待测患者的基因型为或候选为GA基因型；

所述AA基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4244285位点均为A的纯合型；

所述GG基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4244285位点均为G的纯合型；

所述GA基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4244285位点为G和A的杂合型；

(x2)使用上述引物对乙和探针乙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测样品的基因型：

若待测患者的Tm值为46.1-50.1，则待测患者的基因型为或候选为AA基因型；

若待测患者的Tm值为57.8-61.8，则待测患者的基因型为或候选为GG基因型；

若待测患者的Tm值为57.8-61.8和46.1-50.1，则待测患者的基因型为或候选为GA基因型；

所述AA基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4986893位点均为A的纯合型；

所述GG基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4986893位点均为G的纯合型；

所述GA基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4986893位点为G和A的杂合型；

(x3)使用上述引物对丙和探针丙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测样品的基因型：

若待测患者的Tm值为49.8-53.8，则待测患者的基因型为或候选为AA基因型；

若待测患者的Tm值为58.6-62.6，则待测患者的基因型为或候选为GG基因型；

若待测患者的Tm值为58.6-62.6和49.8-53.8，则待测患者的基因型为或候选为GA基因型；

所述AA基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs12248560位点均为A的纯合型；

所述GG基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs12248560位点均为G的纯合型；

所述GA基因型为CYP2C19基因的两条同源染色体的rs12248560位点为G和A的杂合型。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因的方法为如下 (y1)或(y2)或(y3)：

(y1)使用上述引物对甲和探针甲对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测患者是否携带CYP2C19*2突变等位基因：

若待测患者的Tm值为57.7-61.7，则待测患者不携带CYP2C19*2突变等位基因；

若待测患者的Tm值为如下1)或2)，则待测患者携带CYP2C19*2突变等位基因：

1)49.0-53.0；

2)57.7-61.7和49.0-53.0；

所述CYP2C19*2突变等位基因是权利要求8中(x1)所述的AA基因型和GA基因型；

(y2)使用上述引物对乙和探针乙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测患者是否携带CYP2C19*3突变等位基因：

若待测患者的Tm值为57.8-61.8，则待测患者不携带CYP2C19*3突变等位基因；

若待测患者的Tm值为如下3)或4)，则待测患者携带CYP2C19*3突变等位基因：

3)46.1-50.1；

4)57.8-61.8和46.1-50.1；

所述CYP2C19*3突变等位基因是权利要求8中(x2)所述的AA基因型和GA基因型；

(y3)使用上述引物对丙和探针丙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测患者是否携带CYP2C19*17突变等位基因：

若待测患者的Tm值为58.6-62.6，则待测患者不携带CYP2C19*17突变等位基因；

若待测患者的Tm值为如下5)或6)，则待测患者携带CYP2C19*17突变等位基因：

5)49.8-53.8；

6)58.6-62.6和49.8-53.8；

所述CYP2C19*17突变等位基因是权利要求8中(x3)所述的AA基因型和GA基因型。

上述方法中，所述PCR扩增的延伸时间为3-10秒，在本发明的具体实施例中，所述PCR 扩增的延伸时间为5秒。

本发明的第七个目的是提供一种在临床上指导待测患者氯吡格雷和/或伏立康唑用药的方法。

本发明提供的在临床上指导待测患者氯吡格雷和/或伏立康唑用药的方法包括如下步骤：

(1)根据上述检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因的方法，判断待测患者携带的CYP2C19突变等位基因；

(2)根据所述待测患者携带的CYP2C19突变等位基因指导待测患者氯吡格雷和/或伏立康唑用药。

所述根据待测患者携带的CYP2C19突变等位基因指导待测患者氯吡格雷和/或伏立康唑用药的方法如表1和表2所示。其中，基因型为*1*1是指CYP2C19基因的两条同源染色体的 rs4244285、rs4986893和rs12248560位点均没有发生突变；基因型为*1*2是指CYP2C19基因的一条同源染色体的rs4244285位点由G突变为A，且另一条同源染色体没有发生突变；基因型为*1*3是指CYP2C19基因的一条同源染色体的rs4986893位点由G突变为A，且另一条同源染色体没有发生突变；基因型为*1*17是指CYP2C19基因的一条同源染色体的rs12248560位点由G突变为A，且另一条同源染色体没有发生突变；基因型为*2*2是指CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4244285位点均由G突变为A；基因型为*3*3是指CYP2C19 基因的两条同源染色体的rs4986893位点均由G突变为A；基因型为*17*17是指CYP2C19基因的两条同源染色体的rs12248560位点均由G突变为A；基因型*2*3是指一条同源染色体的 rs4244285位点由G突变为A，且另一条同源染色体的rs4986893位点由G突变为A；基因型 *2*17是指一条同源染色体的rs4244285位点由G突变为A，且另一条同源染色体的 rs12248560位点由G突变为A；基因型*3*17是指一条同源染色体的rs4986893位点由G突变为A，且另一条同源染色体的rs12248560位点由G突变为A。

上述成套引物或PCR试剂或试剂盒或方法或应用中，所述rs4244285位点为CYP2C19基因的第24154位，也即序列10的第501位；所述rs4986893位于CYP2C19基因的第22948位，也即序列11的第501位；所述rs12248560位于CYP2C19基因的第4195位，也即序列12的第511位。

本发明的试剂盒中加入DNA聚合酶Phire Hotstart II DNA polymerase，该酶具有启动速度快、催化速度快、转化率高、抗PCR抑制效果好等优点，从而使得本试剂盒在检测口腔拭子时，无需进行核酸提取。

本发明的试剂盒中加入低熔点的琼脂糖，所以试剂盒在使用前为固态，当该琼脂糖在高温PCR扩增反应和熔解曲线分析时变为液态，不影响目标基因的扩增和分析，待分析过程结束后试剂盒恢复为室温，琼脂糖又变为固体，这样可以防止扩增产生的大量目标基因片段形成气溶胶污染。

本发明试剂盒的优点和效果如下：

(1)检测灵敏度高，最低检测限为62.5pg DNA；

(2)操作简便，无需专业知识，可以实现床旁检测；

(3)检测时间短，将PCR扩增产物的长度控制在150bp左右，从而将PCR循环中的延伸时间缩短至5s，使整个PCR扩增和分析时间只需21分钟；

(4)检测特异性高，使用特异性的荧光探针，具有很高的准确性；

(5)加入DNA聚合酶Phire Hotstart II DNA polymerase具有启动速度快、催化速度快、转化率高、抗PCR抑制效果好等优点，从而使得本试剂盒在检测口腔拭子时，无需进行核酸提取。

(6)加入低熔点琼脂糖(agarose)，很大程度避免了PCR污染。

本发明提供了一种特异性的检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，该试剂盒搭配ParaDNA 基因扩增检测仪器实现床旁检测(POCT)，建立了一种床旁检测(POCT)CYP2C19*2基因、 CYP2C19*3和CYP2C19*17的PCR-荧光探针熔解曲线法。通过实验证明：本发明的试剂盒具有无需核酸提取、快速、操作简单、特异性高、灵敏度高等优点，不仅可以实现有效检测CYP2C19 基因多态性，而且可用于在临床上指导氯吡格雷和伏立康唑用药。

附图说明

图1为探针工作原理。

图2为试剂盒的组成示意图。

图3为本发明的试剂盒的检测方法。

图4为CYP2C19*2探针熔解曲线分析结果：CYP2C19*1*1携带者(蓝色、Tm＝59.7±0.3℃)、CYP2C19*1*2携带者(绿色、Tm＝59.7±0.3℃和51.0±0.6℃)、CYP2C19*2*2 携带者(红色、Tm＝51.0±0.6℃)、阴性对照(黑色)的熔解曲线分析结果。

图5为CYP2C19*3探针熔解曲线分析结果：CYP2C19*1*1携带者(蓝色、Tm＝59.8±0.4℃)、CYP2C19*1*3携带者(绿色、Tm＝59.8±0.4℃和48.1±0.3℃)、CYP2C19*3*3 携带者(红色、Tm＝48.1±0.3℃)、阴性对照(黑色)的熔解曲线分析结果。

图6为CYP2C19*17探针熔解曲线分析结果：CYP2C19*1*1携带者(蓝色、Tm＝60.6±0.2℃)、CYP2C19*1*17携带者(绿色、Tm＝60.6±0.2℃和51.8±0.3℃)、CYP2C19*17*17 携带者(红色、Tm＝51.8±0.3℃)、阴性对照(黑色)的熔解曲线分析结果。

图7为患者1的本发明试剂盒PCR熔解曲线结果和Sanger测序结果。

图8为患者2的本发明试剂盒PCR熔解曲线结果和Sanger测序结果。

图9为患者3的本发明试剂盒PCR熔解曲线结果和Sanger测序结果。

图10为患者4的本发明试剂盒PCR熔解曲线结果和Sanger测序结果。

图11为患者5的本发明试剂盒PCR熔解曲线结果和Sanger测序结果。

图12为PCR电泳结果。

图13为试剂盒最低检测限实验的CYP2C19*2熔解曲线结果。

图14为试剂盒最低检测限实验的CYP2C19*3熔解曲线结果。

图15为试剂盒最低检测限实验的CYP2C19*3熔解曲线结果。

图16为PCR产物的电泳结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的CYP2C19*1*1携带者(野生型)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4244285(位于CYP2C19基因的第24154位)、rs4986893(位于CYP2C19基因的第22948位)和rs12248560(位于CYP2C19基因的第4195位)位点均未发生突变的个体，将该个体的基因型记作为GG基因型。

下述实施例中的CYP2C19*1*2携带者(突变杂合子)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体中，一条同源染色体的rs4244285位点由G突变为A，且另一条同源染色体的 rs4244285位点没有发生突变的个体，将该个体的基因型记作GA基因型；CYP2C19*2*2携带者(突变纯合子)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4244285位点均由G突变为A的个体，将该个体其基因型记作为AA基因型。基因型为GA基因型和AA基因型的个体为携带CYP2C19*2突变等位基因的个体。

下述实施例中的CYP2C19*1*3携带者(突变杂合子)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体中，一条同源染色体的rs4986893位点由G突变为A，且另一条同源染色体的 rs4986893位点没有发生突变的个体，将该个体的基因型记作GA基因型；CYP2C19*3*3携带者(突变纯合子)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体的rs4986893位点均由G突变为A的个体，将该个体其基因型记作为AA基因型。基因型为GA基因型和AA基因型的个体为携带CYP2C19*3突变等位基因的个体。

下述实施例中的CYP2C19*1*17携带者(突变杂合子)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体中，一条同源染色体的rs12248560位点由G突变为A，且另一条同源染色体的rs12248560位点没有发生突变的个体，将该个体的基因型记作GA基因型；CYP2C19*17*17 携带者(突变纯合子)为经基因型鉴定CYP2C19基因的两条同源染色体的rs12248560位点均由G突变为A的个体，将该个体其基因型记作为AA基因型。基因型为GA基因型和AA基因型的个体为携带CYP2C19*17突变等位基因的个体。

下述实施例中的试剂及其参数与购买处如表3所示。

表3、试剂及其参数与购买处

实施例1、一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒及检测方法

一、CYP2C19基因多态性检测引物

CYP2C19基因位于人类第10号染色体上，编码CYP2C19即细胞色素P450同工酶2C19。该基因的多态性会导致CYP2C19酶活性出现较大的个体差异。CYP2C19基因多态性在不同人种分布差异较大，在不同的人群中所占的比例比较稳定并且较高。其中，CYP2C19*1编码正常功能的酶；CYP2C19*2(rs4244285)导致剪接缺失，CYP2C19*3(rs4986893)为终止密码子突变，二者会导致编码的酶活性丧失；而CYP2C19*17(rs12248560)可引起CYP2C19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强。

本发明根据以上目标基因CYP2C19基因序列。首先设计了该目标基因的扩增引物，并且通过blast验证了该引物的特异性。引物序列如表4所示，序列均由美国Bioserch公司合成。

表4、引物序列

引物名称	引物序列
		CYP2C19*2 forward(引物1)	CAGAGCTTGGCATATTGTAT(序列1)
CYP2C19*2 reverse(引物2)	CAGAGCTTGGCATATTGTAT(序列2)
		CYP2C19*3 forward(引物3)	AACATCAGGATTGTAAGCAC(序列3)
CYP2C19*3 reverse(引物4)	AGGCAAGACTGTAGTATTCA(序列4)
		CYP2C19*17 forward(引物5)	TGAACAGGATGAATGTGGTA(序列5)
CYP2C19*17 reverse(引物6)	GCTGAGGTCTTCTGATGC(序列6)

二、CYP2C19基因多态性检测试剂盒

本发明的CYP2C19基因多态性检测试剂盒包括检测CYP2C19*2(rs4244285)的引物和探针、检测CYP2C19*3(rs4986893)的引物和探针、检测CYP2C19*17(rs12248560)的引物和探针以及PCR反应体系。

1、引物

检测CYP2C19*2(rs4244285)的引物、检测CYP2C19*3(rs4986893)的引物和检测CYP2C19*17(rs12248560)的引物如表4所示。

2、探针

检测CYP2C19*2(rs4244285)的探针、检测CYP2C19*3(rs4986893)的探针、检测CYP2C19*17(rs12248560)的探针如表5所示。

检测CYP2C19*2(rs4244285)的探针中，序列7中第2位和第7位的碱基T均为FAM荧光标记的碱基T，该探针5’端用三甲氧基二苯乙烯(TMS)保护，3’端用磷酸基团phosphate封闭。其中，TMS如式(Ⅰ)所示，FAM荧光标记的碱基T如式(Ⅱ)所示。本发明的探针序列由美国Bioserch公司合成，其工作原理是其在单链状态下，荧光基团会发生猝灭，当探针与目标基因片段杂交(与PCR产物的第98-119位发生杂交)后，荧光基团恢复，因此可以根据荧光探针与目标基因片段进行熔解分析后得到的Tm值，判断目标基因片段的rs4244285位点是否发生突变。

检测CYP2C19*3(rs4986893)的探针中，序列8中第5位和第9位的碱基T均为FAM荧光标记的碱基T，该探针5’端用三甲氧基二苯乙烯(TMS)保护，3’端用磷酸基团phosphate封闭。其中，TMS如式(Ⅰ)所示，FAM荧光标记的碱基T如式(Ⅱ)所示。本发明的探针序列由美国Bioserch公司合成，其工作原理是其在单链状态下，荧光基团会发生猝灭，当探针与目标基因片段杂交(与PCR产物的第21-36位发生杂交)后，荧光基团恢复，因此可以根据荧光探针与目标基因片段进行熔解分析后得到的Tm值，判断目标基因片段的rs4986893位点是否发生突变。

检测CYP2C19*17(rs12248560)的探针中，序列9中第9位和第12位的碱基T均为FAM荧光标记的碱基T，该探针5’端用三甲氧基二苯乙烯(TMS)保护，3’端用磷酸基团phosphate封闭。其中，TMS如式(Ⅰ)所示，FAM荧光标记的碱基T如式(Ⅱ)所示。本发明的探针序列由美国Bioserch公司合成，其工作原理是其在单链状态下，荧光基团会发生猝灭，当探针与目标基因片段杂交(与PCR产物的第112-133位发生杂交)后，荧光基团恢复，因此可以根据荧光探针与目标基因片段进行熔解分析后得到的Tm值，判断目标基因片段的rs12248560 位点是否发生突变。

上述检测原理如图1所示。

表5、探针序列

探针名称	探针序列
		CYP2C19*2	5’trimethoxystilbene-ATGGGTTCCCGGGAAATAATCA(序列7)-phosphate 3’
CYP2C19*3	5’trimethoxystilbene-TACCTGGATTCAGGGG(序列8)-phosphate 3’
		CYP2C19*17	5’trimethoxystilbene-ATCAGAGATGCTTTGAGAAC(序列9)-phosphate 3’

3、PCR反应体系

本发明的PCR反应体系为35μL，体系中的各个组成成分及其在体系中的浓度如表6-8 所示。

表6、CYP2C19*2的PCR反应体系

表7、CYP2C19*3的PCR反应体系

表8、CYP2C19*17的PCR反应体系

二、本发明试剂盒的使用方法(图3)

1、移样器取样

使用医用口腔拭子在待测患者(CYP2C19*1*1携带者、CYP2C19*1*2携带者和CYP2C19 *2*2携带者)的口腔两颊内侧刮取少量的口腔脱落细胞，然后使用特制的四头移样器的末端摩擦口腔拭子的棉花处，将拭子上的样品转移到取样器的末端。以ddH₂O为阴性对照。

使用医用口腔拭子在待测患者(CYP2C19*1*1携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19 *3*3携带者)的口腔两颊内侧刮取少量的口腔脱落细胞，然后使用特制的四头移样器的末端摩擦口腔拭子的棉花处，将拭子上的样品转移到取样器的末端。以ddH₂O为阴性对照。

使用医用口腔拭子在待测患者(CYP2C19*1*1携带者、CYP2C19*1*17携带者和CYP2C19 *17*17携带者)的口腔两颊内侧刮取少量的口腔脱落细胞，然后使用特制的四头移样器的末端摩擦口腔拭子的棉花处，将拭子上的样品转移到取样器的末端。以ddH₂O为阴性对照。

2、插入反应板

将取样器的末端分别插入到反应板的四个孔中，反应板的各个孔中含有表6-表8中的各个PCR反应体系(35μL)(图2)，并确认密封，得到密封的反应板。

3、PCR扩增

将密封的反应板放入到ParaDNA仪器(LGC有限公司，ParaDNA仪器含有4个独立的PCR 反应及检测单元Para-010)中进行PCR扩增。PCR扩增程序如表9所示。

表9、PCR扩增程序

4、熔解曲线分析

扩增程序结束后，ParaDNA仪器进行熔解曲线分析，分析程序为35℃-80℃，升温速率为 0.1℃/s。

(1)CYP2C19*2等位基因检测结果

CYP2C19*2等位基因的熔解曲线分析结果如图4所示。图4中，CYP2C19*1*1携带者的熔解曲线为蓝色，其Tm值为59.7±0.3℃；CYP2C19*1*2携带者的熔解曲线为绿色，其Tm值为59.7±0.3℃和51.0±0.6℃；CYP2C19*2*2携带者的熔解曲线为红色，其Tm值为51.0 ±0.6℃；阴性对照的熔解曲线为黑色。

因此可以根据待测样本的熔解曲线图中的Tm值分析待测样本的基因型：

若待测样本的Tm值为49.0-53.0，则待测样本的基因型为或候选为AA基因型；

若待测样本的Tm值为57.7-61.7，则待测样本的基因型为或候选为GG基因型；

若待测样本的Tm值为57.7-61.7和49.0-53.0，则待测样本的基因型为或候选为GA基因型。

还可以根据待测样本的熔解曲线图中的Tm值分析待测样本是否携带CYP2C19突变等位基因：

若待测样本的Tm值为57.7-61.7，则待测样本不携带CYP2C19*2突变等位基因；

若待测样本的Tm值为如下1)或2)，则待测样本携带CYP2C19*2突变等位基因：

1)49.0-53.0；

2)57.7-61.7和49.0-53.0。

(2)CYP2C19*3等位基因检测结果

CYP2C19*3等位基因的熔解曲线分析结果如图5所示。图5中，CYP2C19*1*1携带者的熔解曲线为蓝色，其Tm值为59.8±0.4℃；CYP2C19*1*3携带者的熔解曲线为绿色，其Tm值为59.8±0.4℃和48.1±0.3℃；CYP2C19*3*3携带者的熔解曲线为红色，其Tm值为48.1 ±0.3℃；阴性对照的熔解曲线为黑色。

若待测样本的Tm值为46.1-50.1，则待测样本的基因型为或候选为AA基因型；

若待测样本的Tm值为57.8-61.8，则待测样本的基因型为或候选为GG基因型；

若待测样本的Tm值为57.8-61.8和46.1-50.1，则待测样本的基因型为或候选为GA基因型。

若待测样本的Tm值为57.8-61.8，则待测样本不携带CYP2C19*3突变等位基因；

若待测样本的Tm值为如下1)或2)，则待测样本携带CYP2C19*3突变等位基因：

1)46.1-50.1；

2)57.8-61.8和46.1-50.1。

(3)CYP2C19*17突变等位基因

CYP2C19*17等位基因的熔解曲线分析结果如图6所示。图6中，CYP2C19*1*1携带者的熔解曲线为蓝色，其Tm值为60.6±0.2℃；CYP2C19*1*17携带者的熔解曲线为绿色，其 Tm值为60.6±0.2℃和51.8±0.3℃；CYP2C19*17*17携带者的熔解曲线为红色，其Tm值为51.8±0.3℃；阴性对照的熔解曲线为黑色。

若待测样本的Tm值为49.8-53.8，则待测样本的基因型为或候选为AA基因型；

若待测样本的Tm值为58.6-62.6，则待测样本的基因型为或候选为GG基因型；

若待测样本的Tm值为58.6-62.6和49.8-53.8，则待测样本的基因型为或候选为GA基因型。

若待测样本的Tm值为58.6-62.6，则待测样本不携带CYP2C19*17突变等位基因；

若待测样本的Tm值为如下1)或2)，则待测样本携带CYP2C19*17突变等位基因：

1)49.8-53.8；

2)58.6-62.6和49.8-53.8。

实施例2、CYP2C19多态性检测试剂盒的应用

取5例急性冠状动脉综合征(ACS)/经皮冠状动脉介入治疗(PCI)患者(来源于北京阜外医院，所有ACS/PCI患者均经临床诊断确定，并经知情同意)的口腔拭子样品，每个患者的口腔拭子样品等量分成两份，一份使用本发明的CYP2C19基因多态性检测试剂盒按照实施例1步骤三中的方法检测待测患者样本的基因型，另一份送到Sanger测序公司测序。并根据基因检测结果指导患者使用氯吡格雷进行的抗血小板治疗。

检测结果如表10所示。熔解曲线和测序结果结果如图7-11所示。从图中和表中可以看出：本发明试剂盒的检测结果与测序法检测结果一致，说明本发明的试剂盒可以有效的检测待测患者样本的基因型，可以用于检测CYP2C19基因多态性。

表10、ACS/PCI患者的CYP2C19基因多态性检测结果

实施例3、CYP2C19多态性检测试剂盒的特异性检测

1、引物的设计

根据CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)和CYP2C19*17(rs12248560)序列，针对每个基因片段设计了2对引物。3组引物(共6对)均由Bioserch公司合成，引物序列见表11。

2、PCR扩增

以核酸提取的CYP2C19*2*2携带者的DNA的为模板，分别采用CYP2C19*2F1/R1和CYP2C19*2F2/R2引物进行PCR扩增，PCR扩增体系如表6所示，PCR扩增程序如表9所示。

以核酸提取的CYP2C19*3*3携带者的DNA为模板，分别采用CYP2C19*3F1/R1和CYP2C19*3F2/R2引物进行PCR扩增，PCR扩增体系如表7所示，PCR扩增程序如表9所示。

以核酸提取的CYP2C19*17*17携带者的DNA为模板，分别采用CYP2C19*17F1/R1和CYP2C19*17F2/R2引物进行PCR扩增，PCR扩增体系如表8所示，PCR扩增程序如表9所示。

待扩增结束后将PCR的反应液进行电泳分析，电泳结果如图12所示。

电泳结果表明：CYP2C19*2的CYP2C19*2F1/R1实现了目标基因片段的特异性扩增，而 CYP2C19*2F2/R2没有扩增的产物；CYP2C19*3的CYP2C19*3F1/R1实现了目标基因片段的特异性扩增，而CYP2C19*3F2/R2出现非特异性扩增；CYP2C19*17的CYP2C19*17F1/R1实现了目标基因片段的特异性扩增，而CYP2C19*17F2/R2出现非特异性扩增。说明本发明的用于检测CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)和CYP2C19*17(rs12248560)引物具有很好的特异性。

表11、CYP2C19*2、*3、*17的3组引物序列

引物名称	引物序列
		CYP2C19*2 F1	CAGAGCTTGGCATATTGTAT
CYP2C19*2 R1	CATCGATTCTTGGTGTTCTT
		CYP2C19*2 F2	GAGCTTGGCATATTGTATCT
CYP2C19*2 R2	CATCGATTCTTGGTGTTCTT
		CYP2C19*3 F1	AACATCAGGATTGTAAGCAC
CYP2C19*3 R1	AGGCAAGACTGTAGTATTCA
		CYP2C19*3 F2	AACATCAGGATTGTAAGCAC
CYP2C19*3 R2	AAGCCTTGTGAGTAATGGAA
		CYP2C19*17 F1	TGAACAGGATGAATGTGGTA
CYP2C19*17 R1	GCTGAGGTCTTCTGATGC
		CYP2C19*17 F2	TGAACAGGATGAATGTGGTA
CYP2C19*17 R2	TGAGCTGAGGTCTTCTGA

实施例4、CYP2C19基因多态性检测试剂盒的灵敏度检测

提取CYP2C19*1*2携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19*1*17携带者的咽拭子样品的DNA，将所得到的DNA提取液经Nanodrop 1000(Thermo Scientific，ND-1000)定量后依次稀释浓度为500pg/μL、31.25pg/μL、7.81pg/μL的DNA溶液。然后分别用移液枪吸取 2μL的上述DNA溶液按照实施例1的步骤三中的方法分别检测不同浓度的DNA溶液中CYP2C19 基因多态性。每个浓度重复3次。

结果如图13、图14和图15所示。本发明的CYP2C19基因多态性检测试剂盒的最低检测 DNA含量达到62.5pg/μL。

实施例5、CYP2C19基因多态性检测试剂盒的应用

采用如下两种不同的酶：Phire Hotstart II DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶按照实施例 1的步骤三中的方法分别检测CYP2C19*1*2携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19*1*17 携带者的CYP2C19基因多态性。具体步骤如下：

(1)Phire Hotstart II DNA聚合酶进行PCR扩增

分别以咽拭子液体样本CYP2C19*1*2携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19*1*17携带者)和核酸提取的咽拭子液体样本(CYP2C19*1*2携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19 *1*17携带者)的DNA溶液(浓度为100ng/μL)为模板，分别采用表4中设计的三对引物使用CFX96TouchTM荧光定量PCR仪(BIO-RAD，1855196)进行PCR扩增，分别得到PCR产物。Phire酶的PCR反应体系如表12所示。PCR扩增程序如表9所示。

表12、Phire酶的PCR反应体系

(2)Taq DNA聚合酶进行PCR扩增

分别以咽拭子液体样本CYP2C19*1*2携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19*1*17携带者)和核酸提取的咽拭子液体样本(CYP2C19*1*2携带者、CYP2C19*1*3携带者和CYP2C19 *1*17携带者)的DNA溶液(浓度为100ng/μL)为模板，分别采用表4中设计的三对引物使用CFX96Touch^TM荧光定量PCR仪(BIO-RAD，1855196)进行PCR扩增，分别得到PCR产物。Taq酶的PCR反应体系如表13所示。PCR扩增程序如表9所示。

表13、Taq酶的PCR反应体系

PCR扩增结束后，将PCR产物进行电泳分析，电泳结果如图16所示。Taq DNA聚合酶针对提取核酸后的DNA模板可以特异性扩增出一条核苷酸片段，而针对未提取核酸的咽拭子样本没有明显的扩增条带。而Phire Hotstart II DNA聚合酶针对提取DNA和未提取DNA的模板均可以特异性扩增出一条核苷酸片段，将该条带回收测序，经BLAST比对该条带为含有 CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)或CYP2C19*17(rs12248560)的CYP2C19基因部分片段。

上述结果表明：Phire Hotstart II DNA聚合酶可以扩增未经核酸提取的咽拭子样本，并且检测结果准确。

序列表

<110>滨江华康（北京）生物科技有限公司

<120>CYP2C19基因多态性检测试剂盒

<160>12

<210>1

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cagagcttgg catattgtat 20

<210>2

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cagagcttgg catattgtat 20

<210>3

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aacatcagga ttgtaagcac 20

<210>4

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aggcaagact gtagtattca 20

<210>5

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tgaacaggat gaatgtggta 20

<210>6

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gctgaggtct tctgatgc 18

<210>7

<211>22bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

atgggttccc gggaaataat ca 22

<210>8

<211>16bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

tacctggatt cagggg 16

<210>9

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

atcagagatg ctttgagaac 20

<210>10

<211>1001bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

ctcccacttc taaaatacta attcaatttc agaggctgct tgatagaaat caatatagca 60

gggactatct ttgtagtatc aatcaggttg tgcaaactct tttaacctat gctatcatct 120

ccaaaatgtt aatgtagtaa ttcataccat cttatatttc aagattgtag agaagaattg 180

ttgtaaaaag taagagaatt aatataaaga tgcttttata ctatcaaaag caggtataag 240

tctaggaaat gattatcatc tttgattctc ttgtcagaat tttctttctc aaatcttgta 300

taatcagaga attactacac atgtacaata aaaatttccc catcaagata tacaatatat 360

tttatttata tttatagttt taaattacaa ccagagcttg gcatattgta tctatacctt 420

tattaaatgc ttttaattta ataaattatt gttttctctt agatatgcaa taattttccc 480

actatcattg attatttccc gggaacccat aacaaattac ttaaaaacct tgcttttatg 540

gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa caccaagaat cgatggacat caacaaccct 600

cgggacttta ttgattgctt cctgatcaaa atggagaagg taaaatgtta acaaaagctt 660

agttatgtga ctgcttgcgt atttgtgatt cattgactag ttttgtgttt actacggatg 720

tttaacaggt caaggagtaa tgcttgagaa gcatatttaa gtttttattg tatgcatgaa 780

tatccagtaa gcatcataga aaatgtaaaa ttaaattgtt aaataattag aatacataga 840

agaaattgtt tagataaata taatctatct gaacaataag gatgtcagga taggaaaagc 900

tctgttctgc agcttccagt gagatcagca caggaggaac ttaaatttaa aagaaaataa 960

aaaacatctc catcaaaaag tgagtgaagg atatgaacag a 1001

<210>11

<211>1001bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

ttgtctacag actttgcaga ctgatgtgat tccctctgaa acttgaatta tttggtttct 60

aaaaaagtct ctttttttct ttccaaagta aaagacaaat aggccgggaa tgtaaattta 120

gcatttgagc aaccattatt taaccagcta ggctgtaatt gttaattcga gattaatgta 180

aaagtgatgt gttgatttta tgcatgccaa actctttttt gcttttaagg gaattcatag 240

gtaagatatt acttaaaatt tctaaactat tattatctgt taacaaatat gaagtgtttt 300

atatctaatg tttactcata ttttaaaatt gtttccaatc atttagcttc accctgtgat 360

cccactttca tcctgggctg tgctccctgc aatgtgatct gctccattat tttccagaaa 420

cgtttcgatt ataaagatca gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc 480

aggattgtaa gcaccccctg gatccaggta aggccaagtt ttttgcttcc tgagaaacca 540

cttacagtct ttttttctgg gaaatccaaa attctatatt gaccaagccc tgaagtacat 600

ttttgaatac tacagtcttg cctagacagc catggggtga atatctggaa aagatggcaa 660

agttctttat tttatgcaca ggaaatgaat atcccaatat agatcaggct tctaagccca 720

ttagctccct gatcagtgtt ttttccacta aactccaaag ccctgtttct ataaagtact 780

ttggtgacag ccccaaagcg tgcttatatc actccatgga catccaggca ctttggagtc 840

ttccattact cacaaggctt gtccttcaat tcacactttg tcatattgtg tgacagaaat 900

atcctaatct aaaagacatt atctccttca aggacagaga atatttggaa ccacagaagc 960

tgccaagaaa cactgaatag ggcagaggtg tttgatgtct c 1001

<210>12

<211>1090bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

gctcccgtta aggtctatac attgtggtgg ttttgtgctg tgggtccatt tagtgatttc 60

cctacctccc atcctctatt agattcacaa ctgttgttct gcccataatt tcctatgctt 120

gctttgcatt gttacatttt tttttgaaaa tcagaaagca aaatcaatat aaagcagcca 180

tgtctggagg agaccaggag gtcaagaagc cttagtttct caagccctta gcaccaaatt 240

ctctgagatc agctcttcct tcagttacac tgagcatttc ccctctgcag tgatggagaa 300

gggagaactc ttattttttc tcatgagcat ctctggggct gttttcctta gataaataag 360

tggttctatt taatgtgaag cctgttttat gaacaggatg aatgtggtat atattcagaa 420

taactaatgt ttggaagttg ttttgttttg ctaaaacaaa gttttagcaa acgatttttt 480

ttttcaaatt tgtgtcttct gttctcaaag gatctctgat gtaagagata atgcgccacg 540

atgggcatca gaagacctca gctcaaatcc cagttctgcc agctatgagc tgtgtggcac 600

caacaggtgt cctgttctcc cagggtctcc cttttcccat ttgaaatata aaaaataaca 660

attcctgcct tcacgtgttt ttttaggggg ttaaatggta aaggtgttta tatctgctaa 720

ggtaatttac ttgatatatg tttggttatt gaagatatat gagttatgtt agctatttca 780

tgtttaggct gctgtatttt tagtaggcta tattaaatag aggatttcat tataaaggac 840

aaagtctcct aatcttcgat ataggattga catacttttt aaatatacaa ggcatagaat 900

atggccattt ccgttaaatc ataaattccc aactggttat taatctaaga attcagaatt 960

ttaagtaatt gtttttgcat cagattgttt acttcagtgc tctcaattat gacggtgcat 1020

tggaaccact tgggttaaca tttttttgtt tttattacca atacctaggc ttcaacctag 1080

tacaatgaaa 1090

Claims

1.一种用于检测CYP2C19基因多态性的成套引物，其由成套引物甲、成套引物乙和成套引物丙组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)序列4所示的单链DNA分子；

所述引物5为如下e1)或e2)：

e1)序列5所示的单链DNA分子；

所述引物6为如下f1)或f2)：

f1)序列6所示的单链DNA分子；

所述探针甲为如下g1)或g2)：

g1)序列7所示的单链DNA分子；

所述探针乙为如下h1)或h2)：

h1)序列8所示的单链DNA分子；

所述探针丙为如下i1)或i2)：

i1)序列9所示的单链DNA分子；

2.根据权利要求1所示的成套引物，其特征在于：

所述成套引物甲中，所述引物1、所述引物2和所述探针甲的摩尔量比为(1-5):(1-5):1；

所述成套引物乙中，所述引物3、所述引物4和所述探针乙的摩尔量比为(1-5):(1-5):1；

所述成套引物丙中，所述引物5、所述引物6和所述探针丙的摩尔量比为(1-5):(1-5):1。

3.根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：

所述探针乙的第5位和第9位碱基均为荧光基团修饰的碱基T，所述荧光基团具体为FAM；

所述探针丙的第9位和第12位碱基均为荧光基团修饰的碱基T，所述荧光基团具体为FAM。

4.一种用于检测CYP2C19基因多态性的PCR试剂，其包括权利要求1-3中任一所述的成套引物和DNA聚合酶。

5.根据权利要求4所述的PCR试剂，其特征在于：

所述DNA聚合酶为Phire Hotstart II DNA聚合酶；

所述引物1或引物3或引物5在所述PCR试剂中的浓度均为(0.01-5)μM；

所述引物2或引物4或引物6在所述PCR试剂中的浓度均为(0.01-5)μM；

所述探针甲或探针乙或引物丙在所述PCR试剂中的浓度均为(0.01-5)μM；

所述Phire Hotstart II DNA聚合酶在所述PCR试剂中的浓度为(0.05-5)U/μL；

所述琼脂糖在所述PCR试剂中的质量分数为(0.1-10)％。

6.一种用于检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其包括权利要求1-3中任一所述的成套引物或权利要求4或5所述的PCR试剂。

7.权利要求1-3中任一所述的成套引物或权利要求4或5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在如下m1)-m8)中任一种中的应用：

m1)制备检测或辅助检测CYP2C19基因多态位点的产品；

m2)检测或辅助检测CYP2C19基因多态位点；

m3)制备检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型的产品；

m4)检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型；

m6)检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因；

m8)在临床上指导氯吡格雷和/或伏立康唑用药；

8.一种检测或辅助检测待测患者CYP2C19基因型的方法，为如下(x1)或(x2)或(x3)：

(x1)使用权利要求1-3中所述的引物对甲和探针甲对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测样品的基因型：

(x2)使用权利要求1-3中所述的引物对乙和探针乙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测样品的基因型：

(x3)使用权利要求1-3中所述的引物对丙和探针丙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测样品的基因型：

9.一种检测或辅助检测待测患者是否携带CYP2C19突变等位基因的方法，为如下(y1)或(y2)或(y3)：

(y1)使用权利要求1-3中所述的引物对甲和探针甲对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测患者是否携带CYP2C19*2突变等位基因：

1)49.0-53.0；

2)57.7-61.7和49.0-53.0；

(y2)使用权利要求1-3中所述的引物对乙和探针乙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测患者是否携带CYP2C19*3突变等位基因：

3)46.1-50.1；

4)57.8-61.8和46.1-50.1；

(y3)使用权利要求1-3中所述的引物对丙和探针丙对待测患者的口腔拭子样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的Tm值，根据所述Tm值判断待测患者是否携带CYP2C19*17突变等位基因：

5)49.8-53.8；

6)58.6-62.6和49.8-53.8；

10.一种在临床上指导待测患者氯吡格雷和/或伏立康唑用药的方法，包括如下步骤：

(1)根据权利要求9所述的方法，判断待测患者携带的CYP2C19突变等位基因；