CN104404163A - 检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的探针及试剂盒 - Google Patents

检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。本发明采用特异性的引物、荧光探针及优化的检测体系，既可单独也可同步检测上述三种基因型，且检测线性广，以25μL检测体系可检测2ng-600ng人基因组DNA；准确性高，检测结果与金标准测序方法100％一致。

Description

检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及用于一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的探针和试剂盒。
背景技术
华法林(Warfarin)属香豆素类口服抗凝血药，是用于治疗血液栓塞性疾病(如心脏瓣膜置换术后、心房颤动、静脉血栓形成及肺梗塞等)的一线药物。CYP2C9是华法林的主要代谢酶，其SNP的某些基因型会造成CYP2C9的酶活下降，以致华法林在体内的清除减慢。华法林是通过抑制维生素环氧化物还原酶(VKOR)，使维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成受阻，从而发挥抗凝作用，因此VKOR的一个重要亚单位基因(VKORC1)的SNP亦会造成个体对华法林的敏感性存在明显差异。加之华法林的治疗窗较窄，很少的剂量变化也可能导致血栓或出血，因此在临床应用上，相关基因的单核苷酸多态性检测可作为个性化治疗的给药依据。
目前，对基因多态性的检测分析技术方法主要包括：ARMS荧光PCR法,基因测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、基因芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。
1、ARMS荧光PCR法：扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutationsystem，ARMS)利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出基因突变。
2、直接测序：Sanger测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法。缺点是测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，较难形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。
3.限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5～10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。
4.基因芯片法：该方法是将探针固定于支持物上，如玻片或膜，通过PCR方法扩增出靶基因，再通过杂交手段进行芯片杂交，应用仪器进行结果判读。该方法可以进行高密度基因检测，但成本高、操作繁琐、检测流程相对较长，在市场推广上将受到一定限制。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种特异性高的检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性试剂盒，该试剂盒既能实现CYP2C9基因*2(C430T)位点、*3(A1075C)位点和VKORC1基因(G-1639A)的基因型的单独检测，又能实现上述三个位点的并行检测。
实现上述目的的技术方案如下。
一种检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。
在其中一个实施例中，所述针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在其中一个实施例中，所述针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
在其中一个实施例中，所述针对VKORC1基因扩增引物的碱基组成如SEQID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
在其中一个实施例中，还包括有UNG酶。
在其中一个实施例中，检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，包括有针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2以及碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及碱基组成如SEQ IDNO:6所示荧光检测探针、和针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物SEQID NO:7和SEQ ID NO:8以及碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。
本发明的另一目的还提供用于检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的检测探针。
具体技术方案如下。
用于检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的检测探针，包括有针对CYP2C9基因C430T位点的碱基组成如SEQ ID NO:3所示的探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的碱基组成如SEQ ID NO:6所示探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的碱基组成如SEQ ID NO:9所示的探针。
本发明采用的具体技术原理是在每个检测靶点的PCR体系中，加入一对非等量的特异性引物和一条覆盖SNP位点的荧光探针。首先通过不对称PCR扩增出含检测位点的单链寡核苷酸靶序列，其后运行熔解曲线荧光采集程序。从低温到高温的熔解过程中，荧光探针与单链靶序列形成的杂交产物从互补配对到解链变性，期间的荧光值变化记录为熔解曲线。将熔解曲线对温度作一阶负导数可获得杂交产物的熔解峰图，并计算出相应的熔点(Tm值)。由于SNP位点的碱基变化不同，导致靶序列与探针的匹配程度不一，因此杂交产物的温度稳定性及熔解行为各有差异。若单链靶序列中只有1种等位基因，并与探针完全匹配，则只有1个熔解峰，其Tm值较高；反之，单一熔解峰的Tm值较低；若靶序列含有2种等位基因，则会出现2个熔解峰，Tm值分别与两种纯合等位基因的熔解峰的Tm值一致。通过对熔解峰图的分析可对检测位点基因型进行判读。
本发明的主要有益效果如下：
(1)采用特异性的引物、荧光探针及优化的检测体系，既可单独也可同步检测CYP2C9基因*2(C430T)位点、*3(A1075C)位点和VKORC1基因(G-1639A)的基因型，且检测线性广，以25μL检测体系可检测2ng-600ng人基因组DNA；准确性高，检测结果与金标准测序方法100％一致。
(2)闭管操作，检测速度快，检测过程只需90分钟即可完成。
(3)抗污染，试剂盒中含有UNG酶，可以消除由于PCR产物导致的污染。
附图说明
图1为实施例2对CYP2C9*2(C430T)位点进行检测，不同基因型所检测结果示意图。
图2为实施例3对CYP2C9*3(A1075C)位点进行检测，不同基因型所检测结果示意图。
图3为实施例4对VKORC1基因(G-1639A)位点进行检测，不同基因型所检测结果示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1CYP2C9基因*2(C430T)位点、*3(A1075C)位点和VKORC1基因(G-1639A)检测试剂盒
本实施例针对CYP2C9基因*2(C430T)位点、*3(A1075C)位点和VKORC1基因(G-1639A)设计了特异性引物和探针，及含有特异性引物和特异性探针的试剂盒。具体组成如下。
表1 人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒的引物和探针序列
运用包括上述引物和荧光探针的试剂盒，进行同步检测，方法如下：
1、样本处理和DNA提取：
检测样本为EDTA抗凝全血样本，样本保存室温不超过1周，4℃不超过1个月，-20℃不超过7周，血液样本反复冻融不超过5次。采用广州好芝DNA提取试剂盒(货号：DTK-050)进行DNA提取，提取的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃保存，保存期为6个月，或于-70℃长期。以分光光度计对提取后的DNA储备液检验纯度，OD260nm/OD280nm比值应在1.6-2.0范围，推荐DNA工作浓度10～60ng/μL。
2、反应体系配制和扩增：
配制各位点混合液(Mix)，按下表所示比例配制。
每反应体积(μL) N个反应体积(μL)
检测反应液 19.5 19.5×N
酶混合液 0.5 0.5×N
a)混合液分装，按反应数每孔/管加入20μL Mix。
b)加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5μL阳性对照、阴性对照、样本DNA。
c)反应体系中各组分终浓度如下：
组分 终浓度
各引物F 各0.05～0.1μM
各引物R 各0.1～0.5μM
各探针 各0.1～0.5μM
PCR缓冲液 1×
dATP,dCTP,dGTP,dUTP 0.5～1mM
dTTP 0.25～0.5mM
MgCl2 2.0-6.0mM
酶混合液 0.1-0.5U/μL
模板 5μL
总体积 25μL
其中，反应体系的组分包括表1所列的引物和探针，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
d)PCR反应条件如下：
e)结果判读：
本实施例所示结果各Tm值是在Roche480荧光PCR仪上多次试验，经统计所得的均值。
结合CYP2C9*2和*3位点的检测结果，确定CYP2C9的型别。
实施例2
本实施例以血样临床样本(浓度范围为2ng/μL-60ng/μL)、CYP2C9*2杂合型质粒(序列来源于NCBI序列号：NG_008385.1)为标准品(质粒稀释到20fg/μL)为例阐述本发明的实际临床样本检测结果。
针对CYP2C9*2位点的所用引物和探针以及检测方法同本实施例1所述的相同，此处不再赘述。
结果显示，各型别均可以有效判读，临床样本经金标准Sanger法基因测序验证型别完全一致。实验结果见附图1a，1b，1c。
实施例3
本例以血样临床样本(浓度范围为2ng/μL-60ng/μL)、CYP2C9*3杂合型质粒(序列来源于NCBI序列号：NG_008385.1)为标准品(质粒稀释到20fg/μL)为例阐述本发明的实际临床样本检测结果。
针对CYP2C9*3位点的所用引物和探针以及检测方法同本实施例1所述的相同，此处不再赘述。
结果显示，各型别均可以有效判读，临床样本经金标准Sanger法基因测序验证型别完全一致。实验结果见附图2a，2b，2c。
实施例4
本例以血样临床样本(浓度范围为2ng/μL-60ng/μL)、VKORC1杂合型质粒(序列来源于NCBI序列号：NG_011564.1)为标准品(质粒稀释到20fg/μL)为例阐述本发明的实际临床样本检测结果。
针对VKORC1G-1639A位点的所用引物和探针以及检测方法同本实施例1所述的相同，此处不再赘述。
结果显示，各型别均可以有效判读，临床样本经金标准Sanger法基因测序验证型别完全一致。实验结果见附图3a，3b，3c。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对VKORC1基因扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以及碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8以及碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括有UNG酶。
7.用于检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的检测探针，其特征在于，包括有针对CYP2C9基因C430T位点的碱基组成如SEQ ID NO:3所示的探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的碱基组成如SEQ ID NO:6所示探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的碱基组成如SEQ ID NO:9所示的探针。
8.根据权利要求7所述的检测探针，其特征在于，包括有针对CYP2C9基因C430T位点的碱基组成如SEQ ID NO:3所示的探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的碱基组成如SEQ ID NO:6所示探针、和针对VKORC1基因G-1639A位点的碱基组成如SEQ ID NO:9所示的探针。
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