CN111378739A - 一种检测cyp2c19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用，所述引物组合物包括针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物、针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物和针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物；本发明通过选用特异位点并设计得到引物组合物，结合检测体系中各组分浓度和反应条件的相互配合，实现了简洁高效，一步反应，特异性好，灵敏度高的多态性检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点、引物组合物及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用。

背景技术

CYP2C19是一种重要的药物代谢酶，其对药物反应起着关键性的作用。其基因多态性可影响到许多重要临床应用药物的代谢。CYP2C19为常染色体隐性遗传，至少存在14种突变基因和18种等位基因突变。CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因其活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19*2突变会引起高加索人和日本人群抗痉挛药物的弱代谢。携带*2/*2基因型的患者对HIV蛋白酶抑制的代谢效率降低了50％。CYP2C19*3联合CYP2C19*2可100％解释该人群抗痉挛药物的弱代谢。CYP2C19*2和CYP2C19*3为CYP2C19基因的主要突变体，其等位基因占东方人弱代谢表型的99％以上。CYP2C19*17型导致CYP2C19基因编码的酶活性增加，加速药物在体内代谢，治疗效果降低。在乳癌临床试验中，携带CYP2C19*17突变的患者可能受益于它莫西芬的辅佐治疗。目前已知的CYP2C19参与代谢的主要药物有奥美拉唑、埃索美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、瑞舒伐他汀、伏立康唑、华法林、S-美芬妥英、氯吡格雷等。因此，CYP2C19基因型的检测，可以指导临床设计个体化用药方案，合理用药，充分发挥药物对机体的作用，为临床安全、有效用药以及减少药物毒副反应提供重要依据。

目前，常用的基因分型方法主要有：1)基于凝胶电泳技术，如：PCR反应结合限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法、等位基因特异性扩增法等；2)基于荧光标记杂交反应的基因分型技术，如：寡核苷酸连接分析、焦磷酸法DNA测序、直接杂合子测序、等位基因特异性引物延伸等方法。前述两种技术都是在PCR扩增反应之后，再采取不同的方法检测多态性位点，这些方法操作繁琐，检测周期长，检测结果不易准确，不能满足临床快速、高效、灵敏检测的要求。3)基因芯片技术，基因芯片技术可将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。基因芯片技术由于高通量等优点在基因多态性检测中得到大量应用，一次实验即可高通量检测所有待测样本基因的信息，简单、快速，但存在检测时条件难以控制、重复性差，准确性低，检测成本高昂，易出现假阳性、假阴性结果、灵敏度较低等缺点；且现有技术中大多仅能同时检测CYP2C19相关基因中的1个或2个基因型，能够同时实现多个基因型的检测的研究较少。

因此，开发一种特异性好、灵敏度高、费用低廉、可同时检测多个CYP2C19相关基因(CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17)多态性的方法/技术，为临床确定最佳治疗剂量、制定合理用药方案、发挥最大疗效、避免和减少不良反应提供指导依据，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用，选用特异检测位点并设计得到引物组合物，结合检测体系中各组分浓度和反应条件的相互配合，实现了简洁高效、一步反应、特异性好、灵敏度高的多态性检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点，所述检测位点包括CYP2C19*2的12662A>G、CYP2C19*3的87313A>C或CYP2C19*17的3402C>T中的任意一种或至少两种的组合，优选为CYP2C19*2的12662A>G、CYP2C19*3的87313A>C和CYP2C19*17的3402C>T的组合。

本发明中，发明人为解决现有技术检测CYP2C19基因多态性的方法存在的不足，基于多重PCR的方法，特异性选择三个检测位点并设计筛选出三对检测CYP2C19基因多态性的引物组合物，实际科研过程中，CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17中每个均存在多个位点，发明人特异性选择针对药物代谢有明显影响的三个位点，CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T设计符合实验要求的特异性的引物，进行检测，结果可靠稳定，操作简便。

第二方面，本发明提供一种检测CYP2C19基因多态性的引物组合物，所述引物组合物包括针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物、针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物或针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物中的任意一种或至少两种的组合，优选为针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物、针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物和针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物的组合；

其中，所述针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示，所述针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.3-4所示，所述针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.5-6所示。

本发明提供的检测位点和引物可以单独使用或任意一种或至少两种的组合使用，并不局限于三个位点或三对引物的组合使用。

序列表如表1所示；

表1

引物名称	引物序列
		CYP2C19*2F SEQ ID NO.1	GTTTCGTTTCTCTTCCTGTTAGCAA
CYP2C19*2R SEQ ID NO.2	ACCCTGCTTCACATGAGCTA
		CYP2C19*3F SEQ ID NO.3	GGAAATTTTAAGAAAAGTAACTACTACA
CYP2C19*3R SEQ ID NO.4	TTTATCCTACAAGCCCAGCC
		CYP2C19*17F SEQ ID NO.5	CTCACCAAGAAGACATACAGAAAGT
CYP2C19*17R SEQ ID NO.6	CTCTTCCTCACGAGCCCTA

本发明中，发明人为解决现有技术检测CYP2C19基因多态性的方法存在的不足，基于多重PCR的方法，特异性选择三个检测位点并设计筛选出三对检测CYP2C19基因多态性的引物组合物，实际科研过程中，CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17中每个均存在多个位点，发明人特异性选择针对药物代谢有明显影响的CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T设计符合实验要求的特异性的引物；CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T在目标基因型的各个变体中都同时存在，所以只需检测CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T就可以检测CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17的多态性；CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T在不同基因型中不同时存在，所以检测时不同基因型不互相干扰；现有技术利用qPCR Taqman探针的方法检测CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17的多态性，但是本发明用普通PCR方法并选择了新的位点，实现了准确快速的检测，结果可靠稳定，操作简便。

引物设计的具体方法为：CYP2C19*2和CYP2C19*3的上游引物以WT为模板，CYP2C19*17的上游引物以Mut为模板，多态性位点位于引物的3’端；为避免后续PCR反应和琼脂糖凝胶电泳不能区分WT和Mut，最终设计的CYP2C19*2和CYP2C19*3的上游引物对于WT有一个不匹配位点，对于Mut有两个不匹配位点，CYP2C19*2和CYP2C19*3的上游引物在多态性位点处与WT匹配，与Mut不匹配；CYP2C19*17的上游引物对于Mut有两个不匹配位点，对于WT有三个不匹配位点，CYP2C19*17的上游引物在多态性位点处与Mut匹配，与WT不匹配，然后结合软件设计与CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17各自的上游引物最佳配对的下游引物，控制引物的长短以调节其Tm值，并协调各对上下游引物之间的距离以便区分三个PCR产物的大小，最终得到所述引物组合物。

优选地，所述CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的PCR产物大小为303bp。

优选地，所述CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的PCR产物大小为450bp。

优选地，所述CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的PCR产物大小为632bp。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的引物组合物用于制备药物和/或试剂盒的应用。

第四方面，本发明提供一种基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括检测第一方面所述检测位点的引物组合物，优选为包括第二方面所述的引物组合物。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括各种PCR反应试剂或者各种PCR反应试剂的混合物，优选地，所述各种PCR反应试剂包括PCR缓冲液(包括Mg²⁺)、dNTPs、Taq酶和去离子水。

在上述试剂盒中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant(Mut)和野生型Wild type(WT)。

其中，所述野生型Wild type的序列如SEQ ID NO.7所示，所述同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant的序列为SEQ NO.8。

优选地，所述试剂盒还包括添加了Mg²⁺的PCR缓冲液、模板、dNTPs、Taq酶和去离子水。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

其中，所述阴性对照为去离子水，所述阳性对照为同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant质粒和野生型Wild type质粒。

第五方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包括检测第一方面所述检测位点的引物组合物，优选为包括第二方面所述的引物组合物。

优选地，所述检测体系还包括添加了Mg²⁺的PCR缓冲液、模板、dNTPs、Taq酶和去离子水。

优选地，所述dNTPs的浓度为0.8-1.2mM，例如可以是0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM或1.2mM。

优选地，所述引物组合物的每条引物的浓度为0.8-1.2pmol/μL，例如可以是0.8pmol/μL、0.9pmol/μL、1pmol/μL、1.1pmol/μL或1.2pmol/μL。

优选地，所述Taq酶的浓度为0.1-0.3U/μL，例如可以是0.1U/μL、0.2U/μL或0.3U/μL。

优选地，所述模板的浓度为1.4-1.8ng/μL，例如可以是1.4ng/μL、1.5ng/μL、1.6ng/μL、1.7ng/μL或1.8ng/μL。

优选地，所述检测体系还包括阳性对照和阴性对照。

其中，所述阴性对照为去离子水，所述阳性对照为同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant质粒和野生型Wild type质粒。

其中，所述野生型Wild type的序列如SEQ ID NO.7所示，所述同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant的序列如SEQ NO.7所示。

优选地，所述检测体系的方法包括多重PCR法。

所述检测体系的条件为：96℃2min预变性；96℃15s，58℃15s，72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保藏。

第六方面，本发明提供一种检测CYP2C19基因多态性的方法，采用采用检测第一方面所述检测位点的引物组合物、如第二方面所述的引物组合物、第四方面所述的试剂盒或第五方面所述的检测体系中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述方法的PCR条件为：96℃2min预变性；96℃15s，58℃15s，72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保藏。

本发明的实验验证方法可行性的思路如下：

步骤一，合成同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant(Mut)和野生型Wild type(WT)。

步骤二，以步骤一得到的合成DNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2的引物，对CYP2C19基因CYP2C19*2多态性进行PCR扩增；以步骤一得到的合成DNA为模板，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物，对CYP2C19基因CYP2C19*3多态性进行PCR扩增；以步骤一得到的合成DNA为模板，采用如SEQ ID NO.5-6所示的引物，对CYP2C19基因CYP2C19*17多态性进行PCR扩增；

步骤三，数据收集处理和分析。

在上述方法中，在所述步骤二中，所述PCR反应的条件为：96℃2min预变性；然后96℃15s，58℃15s，72℃40s，扩增30个循环；72℃5min，扩增一个循环；4℃保藏。

更优选地，所述PCR的反应液中部分组分及终浓度如下：1×的PCR缓冲液(含Mg²⁺)、1mM的dNTPs、各1pmol/μL的上下游引物、1.6ng/μL的模板、0.2U/μL的Taq酶。

本发明中，发明人基于多重PCR法，针对CYP2C19基因多态性，特异性设计三对引物，以引物为基础，优化反应体系的组分浓度和反应条件，各步骤各条件相互配合，最终实现了准确灵敏快速的检测。

现有技术包括基于凝胶电泳技术、基于荧光标记杂交反应的基因分型技术和基因芯片技术，前两中存在操作繁琐，检测周期长，检测结果不易准确，不能满足临床快速、高效、灵敏检测的要求，基因芯片技术存在检测时条件难以控制、重复性差，准确性低，检测成本高昂，易出现假阳性、假阴性结果、灵敏度较低等缺点；且现有技术中大多仅能同时检测CYP2C19相关基因中的1个或2个基因型，能够同时实现多个基因型的检测的研究较少。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的检测位点和引物组合物并用于检测基因多态性，基于多重PCR方法，特异性选择位点并设计引物，优化反应体系和条件，相互配合，操作简便、安全，检测周期短、成本低，特异性强，灵敏度高，假阳性低，仪器简便、易用，且为常规PCR仪器，仪器价格低，运行费用低，操作简单安全，速度快，通量高，可在2.5小时内完成检测；可同时检测多个CYP2C19相关基因(CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T)多态性，高效、快速，一个样本仅做1个反应即可即可获得基因型，大大简化检测步骤，非常实用，检测结果简单易懂。

附图说明

图1是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的PCR反应体系用CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性上下游引物扩增合成的同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mut和野生型WT的琼脂糖凝胶电泳图，Negative为阴性对照；

图2是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的PCR反应体系用CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性上下游引物扩增合成的同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mut和野生型WT的琼脂糖凝胶电泳图，Negative为阴性对照；

图3是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的PCR反应体系用CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性上下游引物扩增合成的同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mut和野生型WT的琼脂糖凝胶电泳图，Negative为阴性对照；

图4为本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的多重PCR(即Multi-PCR)反应体系用CYP2C19基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的特异性上下游引物扩增合成的同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mut和野生型WT的琼脂糖凝胶电泳图，Negative为阴性对照。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1组装试剂盒

1、引物设计

根据基因序列分别设计对上述各基因序列特异的引物，其中，CYP2C19基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库(NCBI)，CYP2C19基因ID为1557，参考序列号为NG_008384.1，特异性选择针对CYP2C19*2的12662A>G，CYP2C19*3的87313A>C，和CYP2C19*17的3402C>T设计特异性的引物，采用Primer5.0引物设计软件分别设计如下引物：CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性上下游引物、CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性上下游引物和CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性上下游引物，

通过上述设计得到三组引物，分别为：

(1)CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性上游引物序列：

5’-GTTTCGTTTCTCTTCCTGTTAGCAA-3’(SEQ ID NO.1)；

CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的特异性下游引物序列：

5’-ACCCTGCTTCACATGAGCTA-3’(SEQ ID NO.2)。

(2)CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性上游引物序列：

5’-GGAAATTTTAAGAAAAGTAACTACTACA-3’(SEQ ID NO.3)；

CYP2C19基因CYP2C19*3多态性的特异性下游引物序列：

5’-TTTATCCTACAAGCCCAGCC-3’(SEQ ID NO.4)。

(3)CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性上游引物序列：

5’-CTCACCAAGAAGACATACAGAAAGT-3’(SEQ ID NO.5)；

CYP2C19基因CYP2C19*17多态性的特异性下游引物序列：

5’-CTCTTCCTCACGAGCCCTA-3’(SEQ ID NO.6)。

2、组装试剂盒

将引物、阴性对照、阳性对照、10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)、dNTPs、Taq酶、去离子水和说明书组装成试剂盒；

其中，采用的阴性对照为：去离子水；阳性对照为：同时含有CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体(Mut)；野生型(WT)，采用常规DNA合成方法合成阳性对照。

野生型(WT)序列见SEQ NO.7，同时含有CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体(Mut)序列见SEQ NO.8，其中，加粗字体的碱基依次为CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17位点。

SEQ NO.7如下：

CCATCCACATGGCTGCCCAGTGTCAGCTTCCTCTTTCTTGCCTGGGATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCTTCCTGTTAGGAATCGTTTTCAGCAATGGAAAGAGATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTTGAGAAAAACCAAGGGTGGGTGAACATACTCTCTATCACTGACCTTTCTGGACTGCTCTCCTCTCTACTGACATTCTTGGAAACATTTCAGGGGTGGCCAGATCTTTTATTTGGAGTCCTGGTTGTTAGCTCATGTGAAGCAGGGTTTGAAGCTGAGAGCCAAGGGAATTTGCACATGTTTGTGCTGTGTGTGTACAGGCATGATTGTGCATACAGTGTGGGTATAAAAGTTCATTTAATCCTATGTTCTCCTGAACTTTGCTTCTTTGTTTTCAAATAAGAAATGATGAATATAGATTTTGAGTTCATTTTTTGAAAGAGTTAAAGAGCAGTGTTTTTCCCATTA TCTATTCCAGAACATGTCACCAGAGAATACTTGACAAGTGGACATGGTGGAAATGGCCCTATCACACCCCTAGGGAGCATGAACCAAATGGCATGTGCTTTTAACAAAGAATTTCCCAACCCAGAGATGTTTGACCCTCGTCACTTTCTGGATGAAGGTGGAAATTTTAAGAAAAGTAACTACTTCATGCCTTTCTCAGCAGGTAATATAAATTTATTTCCCTTTGTGTTTCAGGGTACAAGATAACTTTTTTGATCAGTTGGAACTTACATGTGCCTTCTCTGCAGTGGTACAGTTACTCTTTGTACATGATCAAGAGCACTGTTCTGAATGCCTGTGTTTTCTCCGCTGGTGATACATCCTCATTATTCGGCCAGATTAGTGGGTTTTGGAGAATTAATCCAATTCTTCCAAATTGAGAAAGCTGAAGTATAGGTTGGTTGAATTCTGCCTCTAGATACACCACTGAGGTACTCAAGAACTCCTCCTGGAAGATAAAACTAATTACATTTTCCTCACTAGCCATGAGGAAGTTATCTCACTCCAGAACTTCACTGAGTGTCTTCCACATGGTGTCCCTCACCCCCTAGGCTGGGCTTGTAGGATAAAATTATCCTCAAACACAGAATAGGGTCTTAAGAGGCTCACTTCTGTGTTTGGAAAGCAGAGTAAACAGATCATTGTAGTTCAATAGGACTGAGGCTGTGATATAGAAAAGAACAGGCTGTTGTGGGTTGGGAGGTAGATGGAAAAGCTGTCTGCTTCAATTAGAAATCAGACACCTTGATTAAAAAAATGGGCAACGGGTCTGAACAGACACCTCACCAAGAAGACATACAGATACCAAATAAATATATGAAAAGTACTAATCATTAAATGTCATTAGGGAACTGCAAGCTAAAACCCCGATGACATACTATTACACACTTATACACTGGCTAAAATTCAAAACACTGATAGAACCAAACACTGGCAAGGATATGCAGCAAGGAGAACTATTAGTCATTGCTGGTGGAAATGCAAAATGGTACAGACACTTCAGGAGACAGTTGGGCAGTATCTAATAAAACTAAAATATGTTTACTATATTATCTAGTAGTTGTGCTCCTTGGCATTTGCCAAATGAATTGAAAATATATTTCCACACAAAAATCTGCACATGGATGTTTATAGCAGTTTTATTCATCATTGTCAAAAATTAGAAATCACCAAGATGTTCTTCAATAGATAAATGAATAGACAACATGGTAAACCTATACAATGAATGTTATTTAGTGTTAAAAGAAATGAACTATCAAGCCATGAAAAGACATGGAGAAATTTTATACATATTAGTAAGTTAAATCTTAAAAGGCTACATACTGTATGATTCCAAACATATGACATTCTGGAAAAGGCAAAACTATGCCAACACTGCAAAGATTATTTGTTGCTAGGGCTCGTGAGGAAGAGA

SEQ NO.8如下：

CCATCCACATGGCTGCCCAGTGTCAGCTTCCTCTTTCTTGCCTGGGATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCTTCCTGTTAGGAGTCGTTTTCAGCAATGGAAAGAGATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTTGAGAAAAACCAAGGGTGGGTGAACATACTCTCTATCACTGACCTTTCTGGACTGCTCTCCTCTCTACTGACATTCTTGGAAACATTTCAGGGGTGGCCAGATCTTTTATTTGGAGTCCTGGTTGTTAGCTCATGTGAAGCAGGGTTTGAAGCTGAGAGCCAAGGGAATTTGCACATGTTTGTGCTGTGTGTGTACAGGCATGATTGTGCATACAGTGTGGGTATAAAAGTTCATTTAATCCTATGTTCTCCTGAACTTTGCTTCTTTGTTTTCAAATAAGAAATGATGAATATAGATTTTGAGTTCATTTTTTGAAAGAGTTAAAGAGCAGTGTTTTTCCCATTATCTATTCCAGAACATGTCACCAGAGAATACTTGACAAGTGGACATGGTGGAAATGGCCCTATCACACCCCTAGGGAGCATGAACCAAATGGCATGTGCTTTTAACAAAGAATTTCCCAACCCAGAGATGTTTGACCCTCGTCACTTTCTGGATGAAGGTGGAAATTTTAAGAAAAGTAACTACTTCCTGCCTTTCTCAGCAGGTAATATAAATTTATTTCCCTTTGTGTTTCAGGGTACAAGATAACTTTTTTGATC AGTTGGAACTTACATGTGCCTTCTCTGCAGTGGTACAGTTACTCTTTGTACATGATCAAGAGCACTGTTCTGAATGCCTGTGTTTTCTCCGCTGGTGATACATCCTCATTATTCGGCCAGATTAGTGGGTTTTGGAGAATTAATCCAATTCTTCCAAATTGAGAAAGCTGAAGTATAGGTTGGTTGAATTCTGCCTCTAGATACACCACTGAGGTACTCAAGAACTCCTCCTGGAAGATAAAACTAATTACATTTTCCTCACTAGCCATGAGGAAGTTATCTCACTCCAGAACTTCACTGAGTGTCTTCCACATGGTGTCCCTCACCCCCTAGGCTGGGCTTGTAGGATAAAATTATCCTCAAACACAGAATAGGGTCTTAAGAGGCTCACTTCTGTGTTTGGAAAGCAGAGTAAACAGATCATTGTAGTTCAATAGGACTGAGGCTGTGATATAGAAAAGAACAGGCTGTTGTGGGTTGGGAGGTAGATGGAAAAGCTGTCTGCTTCAATTAGAAATCAGACACCTTGATTAAAAAAATGGGCAACGGGTCTGAACAGACACCTCACCAAGAAGACATACAGATACTAAATAAATATATGAAAAGTACTAATCATTAAATGTCATTAGGGAACTGCAAGCTAAAACCCCGATGACATACTATTACACACTTATACACTGGCTAAAATTCAAAACACTGATAGAACCAAACACTGGCAAGGATATGCAGCAAGGAGAACTATTAGTCATTGCTGGTGGAAATGCAAAATGGTACAGACACTTCAGGAGACAGTTGGGCAGTATCTAATAAAACTAAAATATGTTTACTATATTATCTAGTAGTTGTGCTCCTTGGCATTTGCCAAATGAATTGAAAATATATTTCCACACAAAAATCTGCACATGGATGTTTATAGCAGTTTTATTCATCATTGTCAAAAATTAGAAATCACCAAGATGTTCTTCAATAGATAAATGAATAGACAACATGGTAAACCTATACAATGAATGTTATTTAGTGTTAAAAGAAATGAACTATCAAGCCATGAAAAGACATGGAGAAATTTTATACATATTAGTAAGTTAAATCTTAAAAGGCTACATACTGTATGATTCCAAACATATGACATTCTGGAAAAGGCAAAACTATGCCAACACTGCAAAGATTATTTGTTGCTAG GGCTCGTGAGGAAGAGA

实施例2CYP2C19基因多态性检测

采用如下步骤，检测受检者CYP2C19基因多态性。

(1)外周血基因组DNA抽提

采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号：69504)中的试剂，按照常规DNA抽提纯化方法快速提取0.5mL受检者外周血基因组DNA。

(2)外周血基因组DNA完整性鉴定

将(1)中提取的受检者外周血基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，采用紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算DNA的纯度与浓度，-20℃保存备用。

(3)PCR反应

受检者外周血基因组DNA与阳性对照进行PCR反应；

在实际应用中，根据具体需要可选用单对引物PCR或多对引物多重PCR反应，为节省检测时间可直接采用多重PCR法检测，多重PCR反应具体如下：

同时使用CYP2C19*2多态性的特异性上下游引物、CYP2C19*3多态性的特异性上下游引物、CYP2C19*17多态性的特异性上下游引物，分别对受检者外周血基因组DNA、阳性对照、阴性对照进行多重PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，得到琼脂糖凝胶电泳图。

PCR(或多重PCR)反应体系及反应条件如下。

PCR(或多重PCR)反应体系：

PCR(或多重PCR)反应体系总体积25μL，见表2，包括：1×的PCR缓冲液(含Mg²⁺)、1mM的dNTPs、各1pmol/μL的上下游引物、1.6ng/μL的模板、0.2U/μL的Taq酶，去离子水补足至25μL。

表2

组分	终浓度/体积
		1×PCR缓冲液(含Mg<sup>2+</sup>)	1×
上游引物	1pmol/μL
		下游引物	1pmol/μL
dNTPs	1mM
		Taq酶	0.2U/μL
基因组DNA	2μL

注：上表中，上游引物、下游引物，当采用PCR法时，将3对上游引物、下游引物分别进行PCR反应；当采用多重PCR法时，将3对上游引物、下游引物同时进行多重PCR反应。

反应条件见表3；

表3

(4)CYP2C19基因多态性的判定

将受检者外周血基因组DNA的CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因多态性的琼脂糖凝胶电泳图与阳性对照电泳图进行比较，分析受检者的CYP2C19基因多态性，并可结合表4和图1-图4判定

用单对引物或同时使用三对引物，以Mut和WT为模板进行PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳得到阳性对照电泳图，分别见图1-图4；

CYP2C19基因多态性判定方法如下。

野生型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为2条，大小分别为303bp、450bp；

CYP2C19*2突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为1条，大小为450bp；

CYP2C19*3突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为1条，大小为303bp；

CYP2C19*17突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为3条，大小分别为303bp、450bp、632bp；

CYP2C19*2和CYP2C19*3同时突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带0条；

CYP2C19*2和CYP2C19*17同时突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为2条，大小分别为450bp、632bp；

CYP2C19*3和CYP2C19*17同时突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为2条，大小分别为303bp、632bp；

CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17同时突变型：多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带为1条，大小为632bp。

CYP2C19*2位点检测：CYP2C19*2突变时将使CYP2C19酶活性丧失，导致药物代谢延迟，当此位点等位基因中存在≥1个野生型WT即为正常代谢；因此，只有当CYP2C19*2位点检测不出野生型WT时，才可判定为*2。

CYP2C19*3位点检测：CYP2C19*3突变时将使CYP2C19酶活性丧失，导致药物代谢延迟，当此位点等位基因中存在≥1个野生型WT时，即为正常代谢。因此，只有当CYP2C19*3位点检测不出野生型WT时，才可判定为*3。

CYP2C19*17位点检测：CYP2C19*17突变时将使CYP2C19酶活性提高，加速药物在体内代谢，导致治疗效果降低，当此位点等位基因中存在≥1个突变型Mut时，导致酶活性提高；因此，CYP2C19*17位点只要能检测出突变型Mut，即可判定为*17。

表4多重PCR结果判定

多态性类型	PCR产物条带数	PCR产物大小(bp)
			野生型	2	303,450
*2	1	450
			*3	1	303
*17	3	303,450，632
			*2，*3	0	/
*2，*17	2	450，632
			*3，*17	2	303,632
*2，*3，*17	1	632

此外，由于不同引物对之间的相互作用，会有出现非目的条带的可能，但并不影响多态性位点的检测，也不影响实验的可靠性。

综上所述，本发明提供了一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用，选用特异位点并设计的引物组合物，结合检测体系中各组分浓度和反应条件的相互配合，实现了简洁高效，一步反应，特异性好，灵敏度高的多态性检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州泓迅生物科技股份有限公司

<120> 一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点、引物组合物及其应用

<130> 2018年

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtttcgtttc tcttcctgtt agcaa 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

accctgcttc acatgagcta 20

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<212> DNA

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<400> 3

ggaaatttta agaaaagtaa ctactaca 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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tttatcctac aagcccagcc 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctcaccaaga agacatacag aaagt 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctcttcctca cgagcccta 19

<210> 7

<211> 2014

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccatccacat ggctgcccag tgtcagcttc ctctttcttg cctgggatct ccctcctagt 60

ttcgtttctc ttcctgttag gaatcgtttt cagcaatgga aagagatgga aggagatccg 120

gcgtttctcc ctcatgacgc tgcggaattt tgggatgggg aagaggagca ttgaggaccg 180

tgttcaagag gaagcccgct gccttgtgga ggagttgaga aaaaccaagg gtgggtgaac 240

atactctcta tcactgacct ttctggactg ctctcctctc tactgacatt cttggaaaca 300

tttcaggggt ggccagatct tttatttgga gtcctggttg ttagctcatg tgaagcaggg 360

tttgaagctg agagccaagg gaatttgcac atgtttgtgc tgtgtgtgta caggcatgat 420

tgtgcataca gtgtgggtat aaaagttcat ttaatcctat gttctcctga actttgcttc 480

tttgttttca aataagaaat gatgaatata gattttgagt tcattttttg aaagagttaa 540

agagcagtgt ttttcccatt atctattcca gaacatgtca ccagagaata cttgacaagt 600

ggacatggtg gaaatggccc tatcacaccc ctagggagca tgaaccaaat ggcatgtgct 660

tttaacaaag aatttcccaa cccagagatg tttgaccctc gtcactttct ggatgaaggt 720

ggaaatttta agaaaagtaa ctacttcatg cctttctcag caggtaatat aaatttattt 780

ccctttgtgt ttcagggtac aagataactt ttttgatcag ttggaactta catgtgcctt 840

ctctgcagtg gtacagttac tctttgtaca tgatcaagag cactgttctg aatgcctgtg 900

ttttctccgc tggtgataca tcctcattat tcggccagat tagtgggttt tggagaatta 960

atccaattct tccaaattga gaaagctgaa gtataggttg gttgaattct gcctctagat 1020

acaccactga ggtactcaag aactcctcct ggaagataaa actaattaca ttttcctcac 1080

tagccatgag gaagttatct cactccagaa cttcactgag tgtcttccac atggtgtccc 1140

tcacccccta ggctgggctt gtaggataaa attatcctca aacacagaat agggtcttaa 1200

gaggctcact tctgtgtttg gaaagcagag taaacagatc attgtagttc aataggactg 1260

aggctgtgat atagaaaaga acaggctgtt gtgggttggg aggtagatgg aaaagctgtc 1320

tgcttcaatt agaaatcaga caccttgatt aaaaaaatgg gcaacgggtc tgaacagaca 1380

cctcaccaag aagacataca gataccaaat aaatatatga aaagtactaa tcattaaatg 1440

tcattaggga actgcaagct aaaaccccga tgacatacta ttacacactt atacactggc 1500

taaaattcaa aacactgata gaaccaaaca ctggcaagga tatgcagcaa ggagaactat 1560

tagtcattgc tggtggaaat gcaaaatggt acagacactt caggagacag ttgggcagta 1620

tctaataaaa ctaaaatatg tttactatat tatctagtag ttgtgctcct tggcatttgc 1680

caaatgaatt gaaaatatat ttccacacaa aaatctgcac atggatgttt atagcagttt 1740

tattcatcat tgtcaaaaat tagaaatcac caagatgttc ttcaatagat aaatgaatag 1800

acaacatggt aaacctatac aatgaatgtt atttagtgtt aaaagaaatg aactatcaag 1860

ccatgaaaag acatggagaa attttataca tattagtaag ttaaatctta aaaggctaca 1920

tactgtatga ttccaaacat atgacattct ggaaaaggca aaactatgcc aacactgcaa 1980

agattatttg ttgctagggc tcgtgaggaa gaga 2014

<210> 8

<211> 2014

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccatccacat ggctgcccag tgtcagcttc ctctttcttg cctgggatct ccctcctagt 60

ttcgtttctc ttcctgttag gagtcgtttt cagcaatgga aagagatgga aggagatccg 120

gcgtttctcc ctcatgacgc tgcggaattt tgggatgggg aagaggagca ttgaggaccg 180

tgttcaagag gaagcccgct gccttgtgga ggagttgaga aaaaccaagg gtgggtgaac 240

atactctcta tcactgacct ttctggactg ctctcctctc tactgacatt cttggaaaca 300

tttcaggggt ggccagatct tttatttgga gtcctggttg ttagctcatg tgaagcaggg 360

tttgaagctg agagccaagg gaatttgcac atgtttgtgc tgtgtgtgta caggcatgat 420

tgtgcataca gtgtgggtat aaaagttcat ttaatcctat gttctcctga actttgcttc 480

tttgttttca aataagaaat gatgaatata gattttgagt tcattttttg aaagagttaa 540

agagcagtgt ttttcccatt atctattcca gaacatgtca ccagagaata cttgacaagt 600

ggacatggtg gaaatggccc tatcacaccc ctagggagca tgaaccaaat ggcatgtgct 660

tttaacaaag aatttcccaa cccagagatg tttgaccctc gtcactttct ggatgaaggt 720

ggaaatttta agaaaagtaa ctacttcctg cctttctcag caggtaatat aaatttattt 780

ccctttgtgt ttcagggtac aagataactt ttttgatcag ttggaactta catgtgcctt 840

ctctgcagtg gtacagttac tctttgtaca tgatcaagag cactgttctg aatgcctgtg 900

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tactgtatga ttccaaacat atgacattct ggaaaaggca aaactatgcc aacactgcaa 1980

agattatttg ttgctagggc tcgtgaggaa gaga 2014

Claims (10)

1.一种检测CYP2C19基因多态性的检测位点，其特征在于，所述检测位点包括CYP2C19*2的12662A>G、CYP2C19*3的87313A>C或CYP2C19*17的3402C>T中的任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的检测位点，其特征在于，所述检测位点包括CYP2C19*2的12662A>G、CYP2C19*3的87313A>C和CYP2C19*17的3402C>T的组合。

3.一种检测CYP2C19基因多态性的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物、针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物或针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物中的任意一种或至少两种的组合，优选为针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物、针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物和针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物的组合；

其中，所述针对CYP2C19*2的12662A>G的特异性上下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示，所述针对CYP2C19*3的87313A>C的特异性上下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3-4所示，所述针对CYP2C19*17的3402C>T的特异性上下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5-6所示。

4.一种如权利要求3所述的引物组合物用于制备药物和/或试剂盒的应用。

5.一种基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测权利要求1或2所述检测位点的引物组合物，优选为包括权利要求3所述的引物组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括添加了Mg²⁺的PCR缓冲液、模板、dNTPs、Taq酶和去离子水；

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；

其中，所述阴性对照为去离子水，所述阳性对照为同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant质粒和野生型Wild type质粒；

其中，所述野生型Wild type的序列如SEQ ID NO.7所示，所述同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant的序列为SEQ NO.8。

7.一种检测体系，其特征在于，所述检测体系包括检测权利要求1或2所述检测位点的引物组合物，优选为包括权利要求3所述的引物组合物。

8.根据权利要求7所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包括添加了Mg²⁺的PCR缓冲液、模板、dNTPs、Taq酶和去离子水；

优选地，所述dNTPs的浓度为0.8-1.2mM；

优选地，所述引物组合物的每条引物的浓度为0.8-1.2pmol/μL；

优选地，所述Taq酶的浓度为0.1-0.3U/μL；

优选地，所述模板的浓度为1.4-1.8ng/μL；

优选地，所述检测体系还包括阳性对照和阴性对照；

其中，所述阴性对照为去离子水，所述阳性对照为同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant质粒和野生型Wild type质粒；

其中，所述野生型Wild type的序列如SEQ ID NO.7所示，所述同时含有所述CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性的突变体Mutant的序列为SEQ NO.8。

9.根据权利要求7或8所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系的方法包括多重PCR法。

10.一种检测CYP2C19基因多态性的方法，其特征在于，所述方法采用检测权利要求1或2所述检测位点的引物组合物、权利要求3所述的引物组合物、权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7-9中任一项所述的检测体系中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述方法的PCR条件为：96℃2min预变性；96℃15s，58℃15s，72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保藏。

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