CN106222247B - Comt位点相关引物及该位点基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

Comt位点相关引物及该位点基因多态性检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种COMT位点相关引物，属于生物技术领域。本发明的目的是通过设计四个引物，从而具有测序准确性的COMT位点相关引物及该位点基因多态性检测试剂盒。本发明包括正向扩增引物、反向扩增引物、G延伸引物和A延伸引物。本发明推出的引物特异延伸法，具有测序的准确性，不会产生任何基因分型误判，而且还具有实时定量PCR操作简单的优势。

Description

COMT位点相关引物及该位点基因多态性检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
帕金森病又称特发性帕金森病(idiopathic Parkinson’s disease，PD)，简称Parkinson病，是中老年人常见的神经系统退行性疾病之一。65岁以上人群患病率约为2%，随年龄增高，男性多于女性。该病的主要临床特点：静止性震颤、动作迟缓及减少、肌张力增高、姿势不稳等为主要特征。
帕金森病应强调综合性治疗，包括药物、理疗、水疗、医疗体育和日常生活调整和外科手术等，不应强调单一治疗方法。治疗帕金森病药物至今已发展到第三代。第一代抗胆碱能药；第二代左旋多巴；第三代是多巴胺受体激动剂和增强剂。
恩他卡朋作为标准药物左旋多巴/苄丝肼或左旋多巴/卡比多巴的辅助用药，用于治疗以上药物不能控制的帕金森病及剂末现象(症状波动)。
恩他卡朋属于儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂，它是一种可逆的、特异性的、主要作用于外周的COMT抑制剂，与左旋多巴制剂同时使用。通过抑制COMT酶减少左旋多巴代谢为3-氧位-甲基多巴(3-OMD)，这使左旋多巴的生物利用度增加，并增加了脑内可利用的左旋多巴总量。
临床试验显示，左旋多巴加用恩他卡朋可延长"开"的时间达16%，缩短"关"的时间达24%。恩他卡朋主要抑制周围组织中的COMT。红细胞内的COMT抑制作用与本品的血浆浓度密切相关，而体现了COMT抑制作用的可逆性。
儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-Omethytransferase,COMT)是广泛存在于人体内的一种代谢酶, 是具生物活性或毒性的儿茶酚胺的主要代谢酶, 也是中枢神经系统外多巴胺的主要降解酶。
儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-Omethytransferase,COMT)具有基因多态性,不同的基因型显示不同的COMT活性, 从而决定不同的代谢物的分解速度, 在与儿茶酚胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺等相关的疾病发病过程中起到重要作用。COMT的生理底物是儿茶酚胺和一些神经递质, 如肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺等。以上神经递质与多种疾病的发病机制相关。
人类COMT基因定位于22号染色体长臂1区1带2 亚带(22ql1.2), 其cDNA已获全长克隆。目前已发现COMT基因有108 位和158 位基因两种, 分别生成可溶性(s-COMT)和膜结合性(MB-COMT) 2种酶。COMT基因在第4号外显子存在1个G与A的置换点突变, 使其编码的108或158位的氨基酸由缬氨酸被甲硫氨酸取代(Val-Met), 导致活性改变。
Val-COMT和Met-COMT等位基因与酶活性的高低有关。Met-COMT基因编码的酶,其活性比Val-COMT基因编码的酶低3到4倍。Val/Val（G/G）基因型的酶具有高活性, Val/Met（G/A）基因型的酶具有中度活性, 而Met/Met(A/A)基因型的酶活性低。
常使用测序和实时定量PCR等方法进行COMT基因分型。测序法需要较为复杂的实验平台，需要在样品扩增后进行后续处理，难以在临床推广。实时定量PCR法有操作简便、无需扩增后处理的优势，但是由于需要设置内对照，其成本较高。而且，人群中约千分之四的人其COMT Val158Met紧邻另一个SNP位点，从而导致实时定量PCR法无法正确分型。尽管千分之四不是一个很高的比例，但对于每一个被错误分型的个体都会带来巨大的损失。
发明内容
本发明的目的是通过设计四个引物，从而具有测序准确性的COMT位点相关引物及该位点基因多态性检测试剂盒。
本发明包括正向扩增引物、反向扩增引物、G延伸引物和A延伸引物；其核苷酸序列分别是：正向扩增引物：5’-GCGGATGGTGGATTTCGC-3’； 反向扩增引物：5’-AACGGGTCAGGCATGCAC-3’； G延伸引物：5’-CTTGTCCTTCAC-3’； A延伸引物：5’-CCTTGTCCTTCAT-3’。
本发明的G延伸引物和A延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与G基因型匹配，进行硫代修饰。
本发明试剂盒包括：(1) 两种扩增引物和两种延伸引物、高保真DNA合成酶pfu、荧光染料、相关缓冲体系；(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明试剂盒采用聚合酶链反应技术对待测DNA 片段进行扩增。
本发明试剂盒中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线的方法分析样本COMTVal158Met的基因多态性。
本发明推出的引物特异延伸法，具有测序的准确性，不会产生任何基因分型误判，而且还具有实时定量PCR操作简单的优势。
附图说明
图1所示，该样本的两个反应中均有扩增峰，说明反应成功；同时，该样本的G反应中出现延伸峰，A反应中无延伸峰，说明该样本为GG基因型；
图2所示，该样本的两个反应中均有扩增峰，说明反应成功；同时，该样本的G反应中出现延伸峰，A反应中也有延伸峰，说明该样本为GA基因型；
图3所示，该样本的两个反应中均有扩增峰，说明反应成功；同时，该样本的G反应中无延伸峰，A反应中出现延伸峰，说明该样本为AA基因型。
具体实施方式
本发明包括正向扩增引物、反向扩增引物、G延伸引物和A延伸引物；其核苷酸序列分别是：正向扩增引物：5’-GCGGATGGTGGATTTCGC-3’； 反向扩增引物：5’-AACGGGTCAGGCATGCAC-3’； G延伸引物：5’-CTTGTCCTTCAC-3’； A延伸引物：5’-CCTTGTCCTTCAT-3’。
本发明G延伸引物和A延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与G基因型匹配，进行硫代修饰。
本发明试剂盒包括：(1) 两种扩增引物和两种延伸引物、高保真DNA合成酶pfu、荧光染料、相关缓冲体系；(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明试剂盒采用聚合酶链反应技术对待测DNA 片段进行扩增。
本发明试剂盒中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线的方法分析样本COMTVal158Met的基因多态性。
以下对本发明做进一步说明：
本发明目的1是提供检测COMT Val158Met基因型的四种引物。即为正向扩增引物、反向扩增引物、G延伸引物和A延伸引物。所使用的引物序列分别为：正向引物5’-GCGGATGGTGGATTTCGC-3’；反向引物 5’-AACGGGTCAGGCATGCAC-3’；G延伸引物（该延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与G基因型匹配，进行硫代修饰）5’-CTTGTCCTTCAC-3’；A延伸引物（该延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与A基因型匹配，进行硫代修饰）5’-CCTTGTCCTTCAT-3’。
本发明的目的2是提供一种检测COMT Val158Met基因型的试剂盒。该试剂盒使用待测基因组DNA为模板，通过PCR扩增和等位基因特异引物延伸，结合高分辨率熔解曲线分析，确定COMT Val158Met位点基因型。
四种引物的获得过程为：查阅关于COMT位点的文献及相关报道，由此可确定该位点数据库名称为rs4680及该位点含有两个等位基因，分别为G等位基因和A等位基因。其次根据该位点的数据库名称在基因数据库中查找突变位点的上下游序列，然后利用软件辅助设计出2-3组最佳序列组合，最后通过试验验证，筛选出一组最佳的序列组合。
其技术关键点在于设计基因正向扩增引物，序列为：
5’-GCGGATGGTGGATTTCGC-3’。
其技术关键点还在于设计基因反向扩增引物 5’-AACGGGTCAGGCATGCAC-3’。
其技术关键点还在于设计基因G特异延伸引物，该延伸引物的3’端与COMTVal158Met多态性位点重叠，分别与G基因型匹配，并进行硫代修饰，并保证其扩增的区域包含COMT基因片段，序列为：5’-CTTGTCCTTCAC-3’。
其技术关键点还在于设计基因A特异延伸引物，该延伸引物的3’端与COMTVal158Met多态性位点重叠，分别与A基因型匹配，并进行硫代修饰，并保证其扩增的区域包含COMT基因片段，序列为：5’-CCTTGTCCTTCAT-3’。
根据本发明的一个优选实施方案，可以使用DNA 合成装置合成所需的寡核苷酸引物，并可用分子筛和快速蛋白质液相层析法(HPLC) 纯化，然后进行氨解处理。
本发明的关键点还在于特异性延伸引物，该延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与G或A基因型匹配，进行硫代修饰，这种修饰对于引物延伸到特异性极为重要，使用无修饰的延伸引物常常会导致不匹配情况下的非特异延伸，从而出现错误结果。
为了实现目的2，采用了以下技术方案：
（1）设计一个PCR扩增体系，包括（a）高保真DNA合成酶pfu、（b）2-脱氧核苷三磷酸(dNTPs）、（c）与模板DNA匹配的正向扩增引物、（d）与模板DNA匹配的反向扩增引物、（e）G等位基因延伸引物（该延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与G基因型匹配，进行硫代修饰）、（f）A等位基因延伸引物（该延伸引物的3’端COMTVal158Met位点重叠，与A基因型匹配，进行硫代修饰），还有（g）荧光染料。
(2) 选择来源于真核细胞的DNA作为模板，正向扩增引物和反向扩增引物中，正向扩增引物互补结合到真核细胞DNA 目的序列的5’- 端，反向扩增引物互补结合到真核细胞DNA 目的序列的3’- 端，使用上述PCR 扩增体系通过聚合酶链反应扩增COMT基因片段。由于正向扩增引物量多于反向扩增引物，本PCR反应为非对称PCR，得到的产物中包含双链扩增产物，也包含正向的单链扩增产物。单链扩增产物能够作为下一步的引物延伸反应的模板。
(3) 针对扩增后产物进行COMT基因片段的检测和分析，确定COMTVal158Met位点基因型。
基于以上技术方案发明的试剂盒包括：(1) 分别装有由正向扩增引物、反向扩增引物和G延伸引物组成的混合物1；由正向扩增引物、反向扩增引物和A延伸引物组成的混合物2；pfu酶和荧光染料及缓冲体系；水等。加盖密封的多个试剂瓶或管。(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
根据本发明的关键点在于试剂盒中引物混合物1包括能够与待检位点双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向扩增引物、能够与待检片段双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向扩增引物和G特异性延伸引物。G特异性延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与G基因型匹配，进行硫代修饰，这种修饰对于引物延伸到特异性极为重要，使用无修饰的延伸引物常常会导致不匹配情况下的非特异延伸，从而出现错误结果。
根据本发明的关键点还在于试剂盒中引物混合物2包括能够与待检位点双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向扩增引物、能够与待检片段双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向扩增引物和A特异性延伸引物。A特异性延伸引物的3’端与COMTVal158Met位点重叠，与A基因型匹配，进行硫代修饰，这种修饰对于引物延伸到特异性极为重要，使用无修饰的延伸引物常常会导致不匹配情况下的非特异延伸，从而出现错误结果。
根据本发明的一个优选实施方案，引物混合物中引物的工作浓度范围为0.5μM-15.0μM，优选范围为1μM-10μM。
根据本发明的一个优选实施方案，使用高保真DNA聚合酶，目前常使用的高保真聚合酶包括pfu、pfusion、phanta、Kod、Vent等。高保真DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。每微升的PCR 反应液中加入2.0-3.0单位pfu 酶。
根据本发明的一个优选实施方案，体系中含有荧光染料，目前常使用的荧光染料包括LC green、Eva green、Srbr green等。通过高分辨率熔解曲线方法分析反应管中是否存在延伸峰即可确定COMTVal158Met位点基因型。
根据本发明关键点还在于本发明采用非对称PCR的方式进行基因扩增，从而同时得到双链基因扩增产物和单链基因扩增产物。其中过量的正向扩增引物和限量的反向扩增引物用于特异扩增COMTVal158Met区段DNA。
根据本发明的关键点还在于反应中使用的正向扩增引物和反向扩增引物浓度不同，其中正向扩增引物过量，而反向扩增引物限量。因此，通过扩增可以同时产生大量的目的区段双链DNA和目的区段正向单链DNA。由于两个延伸引物长度远远短于正向扩增引物和反向扩增引物，且退火延伸温度较高。扩增过程中延伸引物无法结合于其配对的DNA，因此不参与、不影响扩增反应。
根据本发明的关键点还在于扩增反应结束后，反应管无需任何处理，直接在PCR仪上进行引物延伸反应。延伸反应的模板是扩增反应产生到正向单链DNA，延伸反应的催化酶是扩增反应后仍存在活性pfu，延伸反应使用的dNTP和缓冲体系也与扩增体系相同。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA样品来源于人体血细胞或体细胞的DNA。
根据本发明的关键点还在于体系中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线方法分析反应管中是否存在延伸峰来确定COMTVal158Met位点基因型。
简单地说，本发明的试剂盒包括一个混合多种成分的PCR 反应体系；选择来源于
真核细胞的DNA 作为模板；在相互配对的引物中，至少有1 对以上的扩增引物。其中一条互补到真核细胞DNA 目的序列的5’- 端，另一条互补于真核细胞DNA 目的序列的3’- 端；而且PCR 缓冲液和扩增反应需要的pfu 酶参与扩增反应。
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明：
实施例1 ：四种引物的溶解及检测
（1）溶解引物
由于Oligo DNA 呈很轻的干膜状伏在管壁上，打开时极易散失，所以打开管盖时请先离心，然后在慢慢打开管盖，溶解时加足量水后盖好管盖，充分震荡5-10min。
（2）引物检测
1.检测引物的浓度
用紫外分光光度计，纯水测定空白值，取2ul引物（10uM），测定核酸浓度。
四种引物的检测结果应符合以下要求：
正向扩增引物 OD（260/280）检测结果为10uM：70-100ng/ul；反向扩增引物 OD（260/280）检测结果为10uM：70-100ng/ul；G延伸引物 OD（260/280）检测结果为10uM：40-60ng/ul；A延伸引物 OD（260/280）检测结果为100uM：400-600ng/ul。
2. 检测引物的纯度
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和溶液溶解或引物中加入尿素干粉直到饱和，上样前95℃，2min加热变性。600v电压进行电泳，约2-3h，在紫外灯下进行观察，在20bp处呈现单一条带，没有杂带。
实施例2 ：检测试剂盒及其使用
(1) 制备包括下列组成成分的试剂盒：引物混合物①1 管(36μl/ 管)、引物混合物②1管(36μl/ 管)、PCR 反应液1 管(420μl/ 管)、去离子水1 管(500μl/ 管)、阳性和阴性对照各1管（10μl/ 管)。
(2) 标本采集、运送和保存：
1. 标本采集：标本为血液，羊水，绒毛组织。血液为常规取静脉血2ml 或者胎儿脐带血0.5-1ml，EDTA 抗凝处理；经穿刺获羊水2-5ml 或者绒毛组织两条。
2. 保存：可立即检测，4℃保存一周，-20℃保存期可达一年。
3. 运输：标本运送应采用0℃冰壶。
(3) 检测步骤和结果分析：
1.DNA 提取
建议使用Qiagen DNA 提取试剂盒。
外周全血的DNA 提取：4℃ 1000g 离心1.5ml 外周全血10 分钟，去掉上清。加入200μl 冰预冷的1×PBS 溶液重悬沉淀。接下来按照Qiagen Blood Protocol 说明书进行，直到最后一步。加入100μl AE 溶液或者蒸馏水到QIAamp spin column，室温温育至少5 分钟。室温6000g 离心1 分钟收集DNA 溶液。
脐血、静脉血或者绒毛组织DNA 提取：按照Qiagen Blood Protocol 说明书进行，最后收集到200μl DNA 溶液。
2.PCR 反应体系配制
对于每一个PCR 反应体系，混合以下成分到总体积为10ul。
G反应
DNA (25ng/ul)： 1ul
A管 1.2ul
C管 7.0ul
D管 0.8ul
总体积： 10ul
A反应
DNA (25ng/ul)： 1ul
B管 1.2ul
C管 7.0ul
D管 0.8ul
总体积： 10ul
3.PCR 反应条件：
94℃ 3min
80℃ 30s X50循环
65℃ 5s
72℃ 3min
37 ℃ 5min
60℃ 2min
95℃ 30s
40℃ 1min
63℃ 1s
86℃ continous
4. 荧光收集，高分辨率溶解曲线检测。
5.观测图谱，进行分析。

Claims (2)

1.一种COMT位点相关引物，其特征在于：包括正向扩增引物、反向扩增引物、G延伸引物和A延伸引物；其核苷酸序列分别是：正向扩增引物：5’-GCGGATGGTGGATTTCGC-3’； 反向扩增引物：5’-AACGGGTCAGGCATGCAC-3’； G延伸引物：5’-CTTGTCCTTCAC-3’； A延伸引物：5’-CCTTGTCCTTCAT-3’；
G延伸引物的3’端与COMTVal158Met多态性位点重叠，分别与G基因型匹配，并进行硫代修饰，并保证其扩增的区域包含COMT基因片段；
A延伸引物，该延伸引物的3’端与COMTVal158Met多态性位点重叠，分别与A基因型匹配，并进行硫代修饰，并保证其扩增的区域包含COMT基因片段。
2.包含权利要求1所述的COMT位点相关引物的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括：(1)两种扩增引物和两种延伸引物、高保真DNA合成酶pfu、荧光染料、相关缓冲体系；(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；
试剂盒采用聚合酶链反应技术对待测DNA 片段进行扩增；其中两种扩增引物是指正向扩增引物：5’-GCGGATGGTGGATTTCGC-3’； 反向扩增引物：5’-AACGGGTCAGGCATGCAC-3’；两种延伸引物是指：G延伸引物：5’-CTTGTCCTTCAC-3’； A延伸引物：5’-CCTTGTCCTTCAT-3’；
试剂盒中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线的方法分析样本COMTVal158Met的基因多态性。
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A novel SNP in COMT is associated with alcohol Dependence but not opiate or nicotine dependence:a case control study;Joanne Voisey et al.;《Behavioral and Brain Functions》;20111231;第7卷(第51期);摘要，第3页第3-5段 *

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