CN103184266A - Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法 - Google Patents
Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103184266A CN103184266A CN201110446186XA CN201110446186A CN103184266A CN 103184266 A CN103184266 A CN 103184266A CN 201110446186X A CN201110446186X A CN 201110446186XA CN 201110446186 A CN201110446186 A CN 201110446186A CN 103184266 A CN103184266 A CN 103184266A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- apoe gene
- site
- amplification
- wild
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种APOE基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法。所述试剂盒对APOE基因上明显改变其产物活性的两个常见的多态性位点进行分型，包括：rs429358SNP位点和rs7412SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述两个SNP位点的分型，从而对APOE基因进行基因分型，为该基因所表达的酶的活性的预测提供分子生物学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法和检测方法，尤其是利用多重PCR结合分子开关技术检测APOE酶活性相关的SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
背景技术
载脂蛋白E(apolipoproteinE，apoE)是血浆载脂蛋白一个重要组成部分，是1973年首先在正常人的极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的，由299个氨基酸组成的单一多肽链，相对分子量为34kD的糖蛋白。人类apoE主要存在于VLDL、LDL、CM和CM残骸(Chylomicronremm-ants)中，也存在于β-VLDL和HDL的亚类HDL1和HDLc中。它主要在肝脏合成，约占血浆apoE的2/3-3/4。ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，对血脂代谢起重要的调节作用，近年来研究发现，APOE基因多态与冠心病、老年性痴呆(Alzheimer’s，AD)及老化等疾病有关。
Apo E是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3和E4，其基因APOE上存在2个SNP位点：Cys112Arg(rs429358)和Arg158Cys(rs7412)，野生型基因为Cys112、Arg158，表达为E3蛋白；E4蛋白为rs429358突变，即Arg112；E2蛋白为rs7412突变，即Cys158。ApoE的主要生理功能是通过与LDL受体结合并参与LDL代谢过程，APOE基因的变异可影响LDL受体结合活性而影响脂质代谢，进而影响疾病的发生。
发明内容
APOE基因上两个中国人常见SNP直接影响APOE酶的活性，影响多疾病的发生。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术对APOE基因进行基因检测的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
本发明采用的技术方案：一种APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测基因APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。
所述试剂盒包括检测APOE基因rs429358位点的两个正向引物、APOE基因rs7412位点的两个正向引物、APOE基因内参上游引物及一个反向共用引物。
所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT
正向突变型引物：TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC
所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC
正向突变型引物：TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT
所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物：
正向内参引物：CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG
反向共用引物：CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA。
所述的APOE基因检测试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是：内对照398bp，rs429358264bp，rs7412129bp；扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断2个SNP位点的基因型。
所述的APOE基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤：
预变性由1次循环构成，其条件为：温度为94℃，时间为5分钟；
PCR扩增由30次循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为30秒；
退火：温度为65℃，时间为30秒；
延伸：温度为72℃，时间为90秒；
扩增结束后于4℃保存至电泳检测。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
(1)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对2个包含SNP位点的DNA片段和1个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。
(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。
(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。
(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。
(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。
(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2×扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。
(7)本发明的试剂盒所提供的野生型和突变型2×扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，避免人为错误。扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loading buffer，操作方便快捷。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒可同时对APOE基因上的rs429358位点和rs7412位点进行扩增分型检测，以APOE基因为内参来检测扩增条件；野生型2×缓冲包含上述2个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和上游内参引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2×缓冲液包含上述2个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和上游内参引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。
所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT
正向突变型引物：TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC
所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC
正向突变型引物：TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT
所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物：
正向内参引物：CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG
反向共用引物：CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA
本发明试剂盒的组分和含量包括：
野生型2×扩增缓冲混合液，突变型2×扩增缓冲混合液，高保真聚合酶。
本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例
步骤1：全血细胞裂解液的制备
取受检者外周静脉血300μl，加入700μl细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心1分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入300μl双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。
步骤2：PCR扩增反应
1、配置野生型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×野生型扩增缓冲液和0.2μl聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表：
| 2×野生型扩增缓冲溶液 | 5μl |
| 细胞裂解悬液 | 4.8μl |
| 聚合酶(2.5U/μl) | 0.2μl |
2、配置突变型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×突变型扩增缓冲液和0.2聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表：
| 2×突变型扩增缓冲溶液 | 5μl |
| 细胞裂解悬液 | 4.8μl |
| 聚合酶(2.5U/μl) | 0.2μl |
3、对上述两个反应体系同时进行PCR反应，PCR程序见下表：
步骤3：扩增产物凝胶电泳
配置1.5％琼脂糖电泳凝胶，取扩增产物6-8μl直接加入加样孔内，每行另选一孔加入100bp Ladder Marker为分子量对照进行电泳，电泳条件为稳压6V/cm胶长，时间40分钟。
步骤4：观测结果
应用紫外成像系统观察电泳条带有无及位置。
四条区带由大到小依次是：内对照398bp，rs42912264bp，rs7412129bp。如果在野生型扩增产物中129bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为APOE野生型个体；反之为Apo-E2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中129bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中264bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为APOE野生型个体；反之为Apo-E4突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中264bp位置都出现阳性条带，则为杂合型个体。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.一种APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。
2.根据权利要求1所述的APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测APOE基因rs429358位点的两个正向引物、APOE基因rs7412位点的两个正向引物、APOE基因内参上游引物及一个反向共用引物。
3.根据权利要求2所述的APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT
正向突变型引物：TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC
所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC
正向突变型引物：TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT
所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物：
正向内参引物：CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG
反向共用引物：CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA。
4.一种权利要求1所述的APOE基因检测试剂盒所采用的检测方法，其特征在于，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是：内对照398bp，rs429358 264bp，rs7412 129bp；扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断2个SNP位点的基因型。
5.一种权利要求1所述的APOE基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
预变性由1次循环构成，其条件为：温度为94℃，时间为5分钟；
PCR扩增由30次循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为30秒；
退火：温度为65℃，时间为30秒；
延伸：温度为72℃，时间为90秒；
扩增结束后于4℃保存至电泳检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110446186XA CN103184266A (zh) | 2011-12-28 | 2011-12-28 | Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110446186XA CN103184266A (zh) | 2011-12-28 | 2011-12-28 | Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103184266A true CN103184266A (zh) | 2013-07-03 |
Family
ID=48675712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110446186XA Pending CN103184266A (zh) | 2011-12-28 | 2011-12-28 | Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103184266A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105525002A (zh) * | 2016-01-22 | 2016-04-27 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种检测apoe基因多态性的引物及其方法 |
| CN106434940A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-02-22 | 中源协和基因科技有限公司 | 一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法 |
| CN108508353A (zh) * | 2018-05-22 | 2018-09-07 | 杭州博日科技有限公司 | Pcr仪器的驱动线路板高温加速测试老化装置 |
| CN108660195A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-10-16 | 华中农业大学 | 用于mstn基因敲除猪鉴定的功能核酸快速pcr方法与试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008143367A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Seegene, Inc. | Haplotyping method by multiplex amplification |
-
2011
- 2011-12-28 CN CN201110446186XA patent/CN103184266A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008143367A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Seegene, Inc. | Haplotyping method by multiplex amplification |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PHILIP R. WENHAM ET AL: "analysis of apolipoprotein E genotypes by the amplification refractory mutation systme", 《CLIN. CHEM》, vol. 37, no. 2, 31 December 1991 (1991-12-31) * |
| YOUNG GEUN YANG ET AL: "apolipoprotein E genotyping by multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in single reaction tube", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》, vol. 131, 31 December 2007 (2007-12-31) * |
| 吴士良: "《生物化学与分子生物学实验教程》", 28 February 2009, article "十、定量PCR", pages: 50-51 * |
| 黄留玉: "《PCR最新技术原理、方法及应用》", 31 January 2011, article "常用的等位基因特异性PCR", pages: 325-328 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105525002A (zh) * | 2016-01-22 | 2016-04-27 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种检测apoe基因多态性的引物及其方法 |
| CN106434940A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-02-22 | 中源协和基因科技有限公司 | 一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法 |
| CN108660195A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-10-16 | 华中农业大学 | 用于mstn基因敲除猪鉴定的功能核酸快速pcr方法与试剂盒 |
| CN108508353A (zh) * | 2018-05-22 | 2018-09-07 | 杭州博日科技有限公司 | Pcr仪器的驱动线路板高温加速测试老化装置 |
| CN108508353B (zh) * | 2018-05-22 | 2023-08-08 | 杭州博日科技股份有限公司 | Pcr仪器的驱动线路板高温加速测试老化装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pilliod et al. | New practical definitions for the diagnosis of autosomal recessive spastic ataxia of C harlevoix–S aguenay | |
| Claes et al. | De novo mutations in the sodium-channel gene SCN1A cause severe myoclonic epilepsy of infancy | |
| Parisien et al. | Effect of human genetic variability on gene expression in dorsal root ganglia and association with pain phenotypes | |
| Lorenz et al. | Determination of the TLR4 genotype using allele-specific PCR | |
| Paradowska‐Gorycka et al. | Association between IL‐17F gene polymorphisms and susceptibility to and severity of Rheumatoid Arthritis (RA) | |
| Kurreeman et al. | Use of a multiethnic approach to identify rheumatoid-arthritis-susceptibility loci, 1p36 and 17q12 | |
| Chien et al. | Identification and molecular characterization of two novel chromosomal deletions associated with autism | |
| Karlsson et al. | MAGI1 copy number variation in bipolar affective disorder and schizophrenia | |
| Zhu et al. | NPY Leu7Pro and alcohol dependence in Finnish and Swedish populations | |
| TW201842191A (zh) | 預測患有發炎性腸病之個體對抗-tnf治療無反應的方法 | |
| Pollock et al. | Differential major histocompatibility complex class I chain‐related A allele associations with skin and joint manifestations of psoriatic disease | |
| CN102251043A (zh) | 检测华法林个体化用药相关snp位点的试剂盒及其多重pcr扩增方法和检测方法 | |
| Henson et al. | High-resolution genotyping and mapping of recombination and gene conversion in the protozoan Theileria parva using whole genome sequencing | |
| Park et al. | Genome-wide detection of allelic gene expression in hepatocellular carcinoma cells using a human exome SNP chip | |
| Stikker et al. | Decoding the genetic and epigenetic basis of asthma | |
| CN103184265A (zh) | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 | |
| Li et al. | Understanding the genetic and epigenetic basis of common variable immunodeficiency disorder through omics approaches | |
| Orozco et al. | Study of functional variants of the BANK1 gene in rheumatoid arthritis | |
| Drago et al. | Genome-wide association study supports the role of the immunological system and of the neurodevelopmental processes in response to haloperidol treatment | |
| Wallace et al. | Genetics in ocular inflammation—basic principles | |
| Xue et al. | Genome-wide association meta-analysis of 88,250 individuals highlights pleiotropic mechanisms of five ocular diseases in UK Biobank | |
| Li et al. | Association of genetic variations in TNFSF15 with acute anterior uveitis in Chinese Han | |
| CN103184266A (zh) | Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法 | |
| US8071307B2 (en) | Method of detecting relative risk for the onset of atopic dermatitis by gene single nucleotide polymorphism analysis | |
| CN105441540A (zh) | 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130703 |