CN106086220A - 一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂，基因位点SNP检测的特异性引物和单碱基延伸引物，所述基因位点包括CBR1基因位点rs3787728、TP63基因位点rs7631358和CIR1基因位点rs13009079。本发明反应体系可以检测多个基因多态性位点，减少反应次数，提高了检测通量，减少了样品和各种消耗品的使用；不需要荧光染料、特殊酶等价格昂贵的试剂，降低了成本；本发明确性99.99％，灵敏度5纳克基因组DNA，能够同时准确检测出多个基因的多态性位点，具有高通量、自动化、成本低等特点。

Description

一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种单核苷酸多态性检测用的试剂盒，尤其是一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及其应用。
(二)背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率死亡率持续上升，严重威胁人类健康和生命。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌病理类型的绝大部分。肺癌是多因素、多基因疾病，由环境与遗传因素等共同致病。随着分子医学的发展，目前已发现了大量的肺癌相关基因，但是肺癌的发病机制仍然不完全清楚，肺癌的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。因此，对可变因素的控制，如对肺癌危险因素的预防，可在一定程度上延缓和预防肺癌的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不足却在一定程度上严重影响着对肺癌发病、诊断和治疗。因此，对肺癌遗传学的研究十分重要。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。SNP成为第三代遗传标志人体许多表型变异、对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。
人羰基还原酶1(CBR1)属于短链脱氢酶(SDR)家族，是依赖于辅酶NADP(H)催化各种醌、酮和醛等底物还原的一类氧化还原酶。在细胞代谢过程：如类固醇代谢、药物代谢、解毒、药物抗性、变异发生、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生转移等生理病理过程中，都发挥着重要的作用。NNK(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone)是烟草当中发现的一种亚硝胺类的强力致癌物，能被细胞色素P450激活发生α羟基化，形成中间反应物并使DNA烷化，目前认为它很可能引起肺癌。NNK能通过CBR1的还原解毒，代谢为NNAL，然后经糖醛酸化途径从体内清除。吸烟者体内代谢NNK的CBR的水平有很大的差异，而低水平者更容易患上肺癌。研究表明CBR1基因多态性与肺癌易感性相关。
TP53分子是重要的抑癌基因，其编码的TP53蛋白是一类重要的细胞周期因子和肿瘤抑制因子，由其主导的应激通路通过DNA修复、细胞周期捕获和诱导凋亡等作用机制可维持基因组稳定，以抑制肿瘤形成。TP63属TP53基因家族成员，具有与TP53同源的DNA结合域。TP63能激活多种TP53下游靶基因，引发细胞周期停滞及细胞凋亡。此外，炎症转录因子家族NF-κB/REL的激活和抑癌基因TP53/p63/p73家族转录因子的功能障碍是肿瘤进展中的关键分子事件。研究表明TP63基因多态性与肺癌易感性相关。
Notch信号通路是决定细胞命运的重要调控机制，在胚胎、神经和循环系统的生长发育等多种生命活动中起关键作用。其功能紊乱影响细胞的分化、增殖、凋亡程序，与许多肿瘤的发生发展密切相关，包括肺癌。Notch受体经γ-分泌酶水解剪切并释放其胞内段的活性部分(NIC)，随后，NIC转移至细胞核内，与转录因子结合调控下游基因表达。在哺乳动物中NIC的直接靶蛋白包括CBFl，当CBF1与NIC结合后，通过蛋白的构象改变使原先被抑制的位于CBF1结合序列下游的基因开放表达。CIR1与CBF1结合可抑制转录。研究表明CIR1易感性基因可能参与非小细胞肺癌的发展。
综上所述，为了最终实现治疗肺癌，本领域迫切需要寻求非小细胞肺癌易感基因，并开发监测原发性支气管肺癌易感基因的方法、试剂盒以及相关的治疗药物。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及应用，同时检测CBR1基因上的rs3787728号SNP位点、TP63基因上的rs7631358号SNP位点、CIR1基因上的rs13009079号SNP位点的特异性引物。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的CBR1基因、TP63基因和CIR1基因上的SNPs位点基因携带型来预测个体对非小细胞肺癌的易感性。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂，基因位点SNP检测的特异性引物和单碱基延伸引物，所述基因位点包括CBR1基因位点rs3787728、TP63基因位点rs7631358和CIR1基因位点rs13009079：
①CBR1基因位点rs3787728
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGATTTCCAGAGGATCCCTATC-3＇；下游引物RPRimer：5＇-ACGTTGGATGTGACCTGCAGGATCCTGGTG-3＇；单碱基延伸引物：5＇-CCTTTTCCCTAAGTCGT-3＇；
②TP63基因位点rs7631358
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGGGAGCCGACTGAGAGATTAA-3＇；下游引物RPRimer：5＇-ACGTTGGATGACACATGCACATGTACTTAC-3＇；单碱基延伸引物：5＇-cATTTGAAATAATTTGTGCACTTCA-3＇；
③CIR1基因位点rs13009079
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGTCCTTAGCTTTCCCTACGAC-3＇；下游引物RPRimer：5＇-ACGTTGGATGAGCCACGTCCACTCAAAAAC-3＇；单碱基延伸引物：5＇-ggaggATTGCAGCTTGATGGCCC-3＇。
进一步，本发明所述PCR反应试剂包括PCR Buffer、MgCl2、dNTP、HotstarTaq和H2O。
进一步，本发明所述试剂盒组成为：H2O、含15mM MgCl2的10×PCR Buffer、25mMMgCl2、2.5mM dNTP、基因位点SNP检测的特异性引物、5U/μL HotstarTaq、10×SAP Buffer、1U/μL SAP酶、10×iPlex Buffer、iPlex Termination mix、单碱基延伸引物、iPlexenzyme。
本发明还提供一种所述非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒的应用，所述应用为：(1)提取待测样品总DNA，加入基因位点SNP检测的特异性引物和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，PCR扩增产物进行SAP酶消化反应，获得消化反应液；(2)向消化反应液中加入单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，得反应产物；(3)反应产物分离纯化后经质谱检测，TYPER软件分析实验结果，获得样品单核苷酸多态性；其中rs3787728位点分型为CC、CT、TT；rs7631358位点分型为AA、AG、GG；rs13009079位点分型为CC、CT、TT；rs4413407位点分型为AA、AG、GG。
进一步，所述PCR扩增的反应体系为H2O 0.95μL、含15mM MgCl2的10×PCR Buffer0.625μL、25mM MgCl2 0.325μL、2.5mM dNTP 1μL、引物1μL、5U/μL HotstarTaq0.1μL，10ng基因组模板。
进一步，所述PCR扩增的反应条件为94℃15分钟，随后进行45个循环的扩增(94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟)，循环结束后再72℃3分钟，4℃保存。
进一步，所述SAP酶消化体系为：H2O 1.53μL、10×SAP Buffer 0.17μL、1U/μL SAP酶0.3μL。
进一步，所述SAP酶消化程序为：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃保存。
进一步，所述单碱基延伸反应的反应体系为：H2O 0.755μL、10×iPlex Buffer0.2μL、iPlex Termination mix 0.2μL、单碱基延伸引物0.804μL、iPlex enzyme0.041μL。
进一步，所述单碱基延伸反应的反应程序为：94℃30秒后，随后进行40次大循环，大循环过程为94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒(其中每次大循环过程中的52℃5秒，80℃5秒要共进行5次小循环)，72℃3分钟，4℃保存。
进一步，所述反应产物纯化方法为：
①取6mg阳离子交换树脂加在384孔板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20minutes；
②将反应结束的384孔板1000rpm离心1minute，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜；
③以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20minutes，3500rpm、5minutes离心后，取上清即为纯化后的产物，备用。
本发明根据待测样品的单核苷酸多态性基因型分型结果，判读个体是否携带肺癌风险基因或者携带肺癌风险基因的个数。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
①一个反应体系可以检测多个基因多态性位点，减少反应次数，提高了检测通量，减少了样品和各种消耗品的使用；
②不需要荧光染料、特殊酶等价格昂贵的试剂，降低了成本；
③本发明的技术方案采用质谱技术，具有高灵敏度、自动化、高通量检测等特点，准确性99.99％，灵敏度5纳克基因组DNA。与其他现有方法相比，能够同时准确检测出多个基因的多态性位点，具有高通量、自动化、成本低等特点。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
与上海邃志生物科技有限公司合作完成。仪器：离心机(Eppendorf公司)，D-37520台式离心机(Thermo公司)，PCR仪(GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems公司)，MassArray TM Nanodispenser(SAMSUNG公司)，MassARRAY compact System(SEQUENOM公司)，G384+10Spectrochip TM(SEQUENOM公司)，移液枪(Eppendorf公司)。试剂：HotStarTaqDNA Polymerase(1000U)(包括4×250units HotStarTaq DNA Polymerase,10×PCRBuffer,25mM MgCl2，Qiagen公司)，iPLEX TM Reagent Kit(包括10×SAP Buffer，1U/uLSAP enzyme，10×iPlex Buffer,iPlex Termination mix，iPlex enzyme，SEQUENOM公司)，Clean Resin(SEQUENOM公司)，dNTP Mixture(TaKaRa公司)。
实施例1
试剂盒组成：H2O、含15mM MgCl2的10×PCR Buffer 0.625μL、25mM MgCl2 0.325μL、2.5mM dNTP 1μL、基因位点SNP检测的特异性引物1μL、5U/μL HotstarTaq0.1μL、10×SAPBuffer 0.17μL、1U/μL SAP酶0.3μL、10×iPlex Buffer 0.2μL、iPlex Termination mix0.2μL、位点特异性延伸引物0.804μL、iPlex enzyme 0.041μL。
根据发明内容所述实施方案，对500名非小细胞肺癌患者和500名健康对照分别进行检测。
第一、提取检测者总DNA于384孔板中，加入基因位点SNP检测的特异性引物进行PCR扩增，引物如下：
CBR1基因rs3787728
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGATTTCCAGAGGATCCCTATC-3＇；
下游引物R PRimer：5＇-ACGTTGGATGTGACCTGCAGGATCCTGGTG-3＇；
TP63基因rs7631358
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGGGAGCCGACTGAGAGATTAA-3＇；下游引
物R PRimer：5＇-ACGTTGGATGACACATGCACATGTACTTAC-3＇；
CIR1基因rs13009079
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGTCCTTAGCTTTCCCTACGAC-3＇；
下游引物R PRimer：5＇-ACGTTGGATGAGCCACGTCCACTCAAAAAC-3＇；
PCR扩增的反应体系为：
PCR扩增的反应程序为：
第二、PCR扩增后进行SAP酶消化反应
SAP酶消化体系为：
SAP酶消化程序为：
第三、加入单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，引物如下：
CBR1基因rs3787728
单碱基延伸引物：5＇-CCTTTTCCCTAAGTCGT-3＇；
TP63基因rs7631358
单碱基延伸引物：5＇-cATTTGAAATAATTTGTGCACTTCA-3＇；
CIR1基因rs13009079
单碱基延伸引物：5＇-ggaggATTGCAGCTTGATGGCCC-3＇；
单碱基延伸反应的反应体系为：
单碱基延伸反应的反应程序为：
第四、反应产物纯化
①取6mg阳离子交换树脂(sequenom)在384孔板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20minutes；
②将反应结束的384孔板1000rpm离心1minute，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜；
③以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20minutes，3500rpm、5minutes离心后，取上清即为纯化后的产物，备用。
第五、检测
将纯化后的检测样品从384孔板通过MassARRAY Samsung Nanodispense转移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片。将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入MassARRAY Analyzer Compac质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。最后用TYPER软件分析实验结果，获得样品不同SNP位点的分型数据，如CC、CT、TT等。
第六、检测结果
表1、CBR1rs3787728等位基因比较
注：NSCLC，Non-small cell lung cancer(非小细胞肺癌)；Controls(对照组)；M，Male(男性)表2、CBR1rs3787728基因型比较
注：NSCLC，Non-small cell lung cancer(非小细胞肺癌)；Controls(对照组)；M，Male(男性)；ADC，adenocarcinoma(腺癌)；SCC，squamous cell carcinoma(鳞癌)
由表1、2可见，携带CBR1rs3787728位点T等位基因、T/T基因型的个体患非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌的危险显著增高。
表3、TP63rs7631358等位基因比较
注：NSCLC，Non-small cell lung cancer(非小细胞肺癌)；Controls(对照组)；ADC，adenocarcinoma(腺癌)
表4、TP63rs7631358基因型比较
注：NSCLC，Non-small cell lung cancer(非小细胞肺癌)；Controls(对照组)；ADC，adenocarcinoma(腺癌)
由表3、4可见，携带至少1个TP63rs7631358位点A等位基因(即AG或AA基因型)的个体患非小细胞肺癌、肺腺癌的危险显著增高。
表5、CIR1rs13009079等位基因比较
注：ADC，adenocarcinoma(腺癌)；Controls(对照组)；M，Male(男性)
表6、CIR1rs13009079基因型比较
注：ADC，adenocarcinoma(腺癌)；Controls(对照组)；M，Male(男性)
由表5、6可见，携带CIR1rs13009079位点T等位基因、T/T基因型的个体患肺腺癌的危险显著增高。
综合表1-6可见，携带CBR1rs3787728位点T等位基因、T/T基因型，携带至少1个TP63rs7631358位点A等位基因(即AG或AA基因型)，携带CIR1rs13009079位点T等位基因、T/T基因型的个体患非小细胞肺癌的风险增高。

Claims (10)

1.一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括PCR反应试剂，基因位点SNP检测的特异性引物和单碱基延伸引物，所述基因位点包括CBR1基因位点rs3787728、TP63基因位点rs7631358和CIR1基因位点rs13009079：
①CBR1基因位点rs3787728
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGATTTCCAGAGGATCCCTATC-3＇；下游引物R PRimer：5＇-ACGTTGGATGTGACCTGCAGGATCCTGGTG-3＇；单碱基延伸引物：5＇-CCTTTTCCCTAAGTCGT-3＇；
②TP63基因位点rs7631358
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGGGAGCCGACTGAGAGATTAA-3＇；下游引物R PRimer：5＇-ACGTTGGATGACACATGCACATGTACTTAC-3＇；单碱基延伸引物：5＇-cATTTGAAATAATTTGTGCACTTCA-3＇；
③CIR1基因位点rs13009079
上游引物F PRimer：5＇-ACGTTGGATGTCCTTAGCTTTCCCTACGAC-3＇；下游引物R PRimer：5＇-ACGTTGGATGAGCCACGTCCACTCAAAAAC-3＇；单碱基延伸引物：5＇-ggaggATTGCAGCTTGATGGCCC-3＇。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述PCR反应试剂包括PCR Buffer、MgCl2、dNTP、HotstarTaq和H2O。
3.一种权利要求1所述非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒的应用，其特征在于所述应用为：(1)提取待测样品总DNA，加入基因位点SNP检测的特异性引物和PCR试剂进行PCR扩增反应，PCR扩增产物进行SAP酶消化反应，获得消化反应液；(2)向消化反应液中加入单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，得反应产物；(3)反应产物分离纯化后经质谱检测，TYPER软件分析，获得样品单核苷酸多态性。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为H2O 0.95μL、含15mMMgCl2的10×PCR Buffer 0.625μL、25mM MgCl2 0.325μL、2.5mM dNTP 1μL、基因位点SNP检测的特异性引物1μL、5U/μL HotstarTaq0.1μL，10ng基因组模板。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应条件为94℃15分钟，随后进行45个循环的扩增(94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟)，循环结束后再72℃3分钟，4℃保存。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述SAP酶消化体系为：H2O 1.53μL、10×SAPBuffer 0.17μL、1U/μL SAP酶0.3μL。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述SAP酶消化程序为：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃保存。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述单碱基延伸反应的反应体系为：H2O0.755μL、10×iPlex Buffer 0.2μL、iPlex Termination mix 0.2μL、单碱基延伸引物0.804μL、iPlex enzyme 0.041μL。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述单碱基延伸反应的反应程序为：94℃30秒后，随后进行40次大循环，大循环过程为94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒，其中每次大循环过程中的52℃5秒，80℃5秒要共进行5次小循环，72℃3分钟，4℃保存。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应产物纯化方法为：
①将阳离子交换树脂加在384孔板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20minutes；
②将反应结束的384孔板1000rpm离心1minute，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜；
③以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20minutes，3500rpm、5minutes离心，取上清即为纯化后的产物。
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