CN110964827A - 与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用，该标志物为rs2046210。本发明从分子生物学及基因诊断水平上，提供了筛选非小细胞肺癌高危人群的技术方法。此方法基于我们前期的研究显示，BPA暴露水平和rs2046210位点共同影响中国人群的非小细胞肺癌易感性。通过开发高灵敏度的BPA水平测量平台及针对rs2046210位点进行巧妙的引物和探针设计进行基因分型，即可鉴别非小细胞肺癌的高危人群，辅助非小细胞肺癌患者的诊断，鉴别方法巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估非小细胞肺癌的患病风险提供了帮助，有助于临床上对该类人群进行非小细胞肺癌筛查和早期干预。

Description

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用

技术领域

本发明涉及于基因工程及肿瘤医学领域，具体涉及一种与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。

背景技术

肺癌是严重威胁我国人民健康的常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位列我国恶性肿瘤第一位，且随着我国人口老年化时代的到来，肺癌的发病率仍呈现不断上升的趋势。其中非小细胞肺癌为最常见的肺癌病理类型，约占所有肺癌的80％-85％。目前，针对肺癌尚缺乏有效的筛查方法和早期诊断方法。如能更为精准的针对肺癌的高危个体开展筛查和早期诊断，则可以显著改善患者预后，且为国家节省大量的医疗支出。

双酚A(Bisphenol A，BPA)是一类常见的环境雌激素类似物。其作为聚碳酸酯塑料和环氧树脂的交联剂，现已被广泛应用于日常生活产品的制造中。环境中BPA的暴露极有可能通过干扰内分泌系统功能影响人体健康。已有证据表明，雌激素在肺癌发病过程中发挥着重要作用。同时，细胞学实验表明，BPA暴露可通过G蛋白偶联雌激素受体(GFER)介导的基质金属蛋白酶(MMPs)上调引起肺癌细胞的迁移和侵袭。这些证据提示环境中BPA暴露可能与人群肺癌存在关联。另有研究表明，雌激素受体α编码基因ESR1遗传变异可与雌激素相关环境因素交互作用增加人群肺癌发病风险，提示基因-环境交互作用在疾病风险预测和早期诊断中的重要作用。

我们的前期研究表明，与健康者相比，非小细胞肺癌患者存在更高水平的BPA暴露，高水平的BPA水平暴露与非小细胞肺癌显著关联。而在ESR1基因上游存在一个遗传变异rs2046210，其变异在BPA高水平暴露人群中可显著增加非小细胞肺癌风险。相比于BPA低水平暴露和rs2046210野生纯合个体，携带rs2046210风险基因型且暴露于BPA高水平环境的个体，非小细胞肺癌的患病风险显著升高，可被认为是非小细胞肺癌的高危人群。因此，对BPA暴露水平及ESR1基因相关SNP的检测，可以辅助非小细胞肺癌的早期诊断，早期发现非小细胞肺癌患者。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。

本发明通过分离和研究非小细胞肺癌患者及健康对照外周血DNA中的遗传多态性和尿液中BPA水平，并研制出可便于临床应用的非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，为中国非小细胞肺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs2046210。

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性扩增引物，所述rs2046210的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性探针，所述rs2046210的特异性探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

上述SNP标志物在制备中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2046210。

进一步的，所述试剂盒还包括上述SNP标志物的特异性扩增引物和上述SNP标志物的特异性探针。

本发明的有益效果为：本发明的创新点在于从分子生物学及基因诊断水平上，提供了筛选非小细胞肺癌高危人群的技术方法。此方法基于我们前期的研究显示，BPA暴露水平和rs2046210位点共同影响中国人群的非小细胞肺癌易感性。通过开发高灵敏度的BPA水平测量平台及针对rs2046210位点进行巧妙的引物和探针设计进行基因分型，即可鉴别非小细胞肺癌的高危人群，辅助非小细胞肺癌患者的诊断。该技术方法设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估非小细胞肺癌的患病风险提供了帮助，有助于临床上对该类人群进行非小细胞肺癌筛查和早期干预。

附图说明

图1为基于BPA水平和ESR1基因多态的非小细胞肺癌风险预测模型ROC曲线。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs2046210。

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性扩增引物，所述rs2046210的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性探针，所述rs2046210的特异性探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

上述SNP标志物在制备中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2046210。

所述试剂盒还包括上述SNP标志物的特异性扩增引物和SNP标志物的特异性探针。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的受试者尿液和血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；(2)BPA水平检测：选择非小细胞肺癌病例和健康对照，采用超高效液相色谱-串联质谱分析测量尿液BPA水平。(3)基因型检测：选择非小细胞肺癌病例和健康对照，在ESR1基因区域找到与BPA水平具有交互效应并影响非小细胞肺癌易感性的SNP标志物；(3)对筛选出的阳性关联标志物，在独立的样本中进行验证，以判断其关联的稳定性；(4)非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据非小细胞肺癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物开发辅助诊断试剂盒。

具体来说本发明的研究的实验方法主要包括以下内容：

我们对募集到的具有完整病历资料及分型明确的615例非小细胞肺癌患者和615例无肿瘤病史的正常对照人群进行了尿液BPA水平的测量，并对其中507例病例和460例健康对照进行了外周血DNA rs2046210的分型。非小细胞肺癌患者和正常对照均为中国大陆汉族。患者经组织病理学确诊，无年龄限制；正常对照无肿瘤病史，经体检无肿瘤体征。收集了研究对象的性别、年龄等信息。研究对象的基本情况请见表1。每个研究对象均知情同意参加本研究并捐献2ml晨尿及2ml外周静脉血。尿液用于BPA水平测量，外周血用于基因分型。

表1.研究中采用的非小细胞肺癌患者及正常对照人群的基本资料

我们按照对照组中BPA水平的四分位数将BPA暴露水平进行分组，运用非条件logistic回归加性模型计算BPA暴露水平与非小细胞肺癌之间的关联。研究结果表明，与最低水平的BPA暴露相比，在校正性别、年龄、吸烟、饮酒及BMI人口学因素后，最高水平的BPA暴露与非小细胞肺癌的显著关联(OR＝1.91，95％CI：1.39-2.62，P<0.001，见表2)。

表2.BPA水平与非小细胞肺癌的关联

	对照	病例	OR(95％CI)<sup>a</sup>	P<sup>a</sup>	OR(95％CI)<sup>b</sup>	P<sup>b</sup>
							Q1	154	138	-	-	-	-
Q2	154	109	0.79(0.56-1.11)	0.169	0.83(0.58-1.17)	0.278
							Q3	154	111	0.80(0.58-1.13)	0.203	0.80(0.57-1.14)	0.214
Q4	153	257	1.87(1.38-2.54)	<0.001	1.91(1.39-2.62)	<0.001

^a：未调整混杂因素的OR值及P值。

^b：调整了性别、年龄、吸烟、饮酒状态和BMI的OR值及P值。

我们进一步分析了SNP rs2046210与中国人群非小细胞肺癌易感性的关联。结果显示，在杂合模型、突变纯合模型及加性模型中，rs2046210与非小细胞肺癌的关联均无统计学意义。然而，以对照组的中位BPA浓度为临界值将所有样本分为高浓度BPA组和低浓度BPA组之后再分析rs2046210与非小细胞肺癌之间的关联。结果表明，在低浓度BPA组，rs2046210与非小细胞肺癌无显著关联；而在高浓度BPA组，rs2046210与非小细胞肺癌之间的关联在突变纯合模型和加性模型中均具有显著意义，如表3所示。交互分析也显示在加性模型下，BPA水平和rs2046210之间具有交互效应(P＝0.049)。

表3.BPA水平与rs2046210变异交互作用

最后，我们用BPA水平和SNP位点建立了非小细胞肺癌的风险预测模型。我们构建了一个公式，综合考虑BPA水平、SNP分型、性别、年龄、吸烟、饮酒及BMI情况。其中，对于BPA水平，低暴露水平为“0”，高暴露水平为“1”；对于SNP基因型，GG为“0”，GA为“1”，AA为“2”；对于性别，男性为“0”，女性为“1”；年龄和BMI为连续型变量；对于吸烟/饮酒，吸烟/饮酒为“1”，不吸烟/不饮酒为“0”。分析时以多因素logistic回归系数β为权重，得到基于rs8100241分型危险评分的公式如下：

危险评分＝(0.549×性别的评分)+(0.00×年龄的评分)+(1.199×吸烟的评分)+(-0.401×饮酒的评分)+(-0.134×BMI的评分)+(0.496×BPA的评分)+(0.118×rs2046210分型的评分)。

通过绘制ROC曲线，可得该模型曲线下面积AUC为0.665(95％CI：0.631-0.700)，具体见图1。

实验方法：

1.BPA水平测量

1.1样本制备

取500μL尿样/质控/定标品转移到1.5毫升的聚丙烯管中，加入10μLβ-葡萄糖醛酸酶溶液(>110000单位)，在37℃下孵育12小时。酶解后的样品加入50μL内标物工作液，涡旋30秒，然后在10000g下离心10分钟，然后将上清液转移到5毫升玻璃管中，加入3毫升乙酸乙酯后超声60分钟。超声完成后在3000g下离心10分钟，将上层乙酸乙酯相转移到5mL玻璃管中，然后在40℃条件下在氮气吹干，最后加入250μL水/甲醇(50％/50％，％v/v)。复溶吹干的样本用于LC-MS/MS分析。

1.2液相色谱-串联质谱分析

目标分析物采用超高效液相色谱(UHPLC)系统Ultimate 3000进行分离，该系统配备1.7μm，100×2.1mm Acquity UPLC BEH C18分析柱。进样量为25μL，流动相为含0.01％氨水的水(A)和乙腈(B)，流速为0.4ml/min，柱温为40℃。梯度洗脱条件为：0.01min，60％A；4.00min，40％A；4.01min，35％A；6.00min，5％A；7.00min，5％A；7.01min；60％A；8.00min，60％A。检测器为高分辨质谱仪QExactive，在负离子模式下进行全扫描，质谱的分辨率为70000，离子最大注入时间为50ms，喷雾电压为3.8kv，毛细管温度为320℃，加热温度为350℃。鞘气和辅助气体的流量分别为40和10(AU，任意单位)。采用校准液每天对仪器进行校准以确保工作质量精度低于5ppm。该质谱仪采用美国热电公司的Q Exactive Tune软件对质谱仪进行控制，采用Xcalibur软件进行液质联用的控制和数据处理。定量方式采用选择离子监测(SIM)。选择的定量离子分别为227.1065、199.0758、249.0226、288.9412和235.1576、209.1385、257.0727、289.9632。

1.3方法验证

方法验证包括线性、批内和批间精密度、回收率和定量限。采用9点定标，浓度依次为0.063、0.125、0.250、0.500、1.00、2.00、10.00、20.00、100.00ng/mL。定标曲线的线性相关系数(R2)均大于0.966。注意：如果尿样中某种分析物的浓度远远高于定标曲线的线性范围，则需对样本进行稀释以确保测量的准确性。采用质控品(即0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL和10ng/mL)来评价批内和批间精密度。批内和批间精密度分别低于6.3％和1.7％。通过将已知量的工作溶液(4.0ng/mL、8.0ng/mL、16.0ng/mL和80.0ng/mL)加入到从本研究收集的样品中(随机挑选50份进行混合)，分析回收率。本项目中BPA回收率为94.5-113.5％。定量限(LOQs)是通过逐渐稀释定标品中的定浓度点，直到信噪比(S/N)等于10。本项目BPA的定量限为0.063ng/mL，检出限(LOD)为0.031ng/mL。低于检出限的BPA水平统一估算为LOD除以2的平方根。

统计分析时用尿肌酐对结果进行校正，尿肌酐采用自动生化分析仪Roche Cobas8000模块化分析仪系列C701进行测定。

2.外周血DNA提取

我们用常规酚-氯仿法提取DNA，具体步骤如下：

1)取约3ml抗凝血，室温下5,000×g离心15min，弃去上层，留约0.3ml血细胞。加入0.5ml新鲜配制的终浓度为20μg/ml RNA酶的抽提缓冲液，混匀后37℃孵育1h。

2)加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，混匀后37℃孵育过夜。

3)每管加入Tris缓冲液平衡的酚(pH＝7.0)0.7ml，充分混匀，室温下8,000×g离心15min。

4)将上层液体转移到另一1.5ml离心管中，加入等体积酚–氯仿(1:1)0.7ml，充分混匀15min；室温8,000×g离心15min。

5)将上层液体转移到另一干净1.5ml离心管中，加入10％体积的10M乙酸铵溶液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，–20℃静置2h以沉淀DNA。

6)沉淀出的DNA用75％乙醇洗涤，12,000×g离心15min后弃上层液体；再用75％乙醇洗涤，12,000×g离心15min后弃上层液体。

7)将管倒立在吸水纸上，待乙醇挥发干净后，每管加适当TE缓冲液，4℃放置一周后保存于–20℃备用。

3.基因分型

采用的分型平台为TaqMan基因分型技术(ABI 7900HT Real Time PCR system,Applied Biosystems)，5μl PCR反应体系如下：

组分	体积(μl)
		2×TaqMan master mix	2.5
正向引物(10μm)	0.225
		反向引物(10μm)	0.225
正向探针(10μm)	0.125
		反向探针(10μm)	0.125
DNA模版	1(10–20ng/μl)
		水	0.8

反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃ 15sec和60℃ 1min共40个循环。

反应所用的引物和探针序列如下：

rs2046210引物：

正向引物：gtgcctcaactgtcttgtgaatct

反向引物：agagtgttttccaaaagttctgacat

Rs2046210探针：

正向探针：fam-tcacatacgcatctac-mgb

反向探针：vic-tcacatacacatctacc-mgb

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcctcaac tgtcttgtga atct 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtgtttt ccaaaagttc tgacat 26

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacatacgc atctac 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacatacac atctacc 17

Claims (6)

1.与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于，该标志物为rs2046210。

2.根据权利要求1所述的与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于，所述rs2046210的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

3.根据权利要求1所述的与中国非小细胞肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性探针，其特征在于，所述rs2046210的特异性探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

4.权利要求1所述SNP标志物在制备中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

5.中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2046210。

6.根据权利要求5所述的中国非小细胞肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的特异性扩增引物与序列为SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的特异性探针。

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