CN113637748A - 一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，该试剂盒包含：miRcute miRNA提取分离试剂盒、TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒和TruSeq SR Cluster Kitv3‑cBot–HS试剂盒。本发明提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，在数十例人肺腺癌组织和正常对照组织中进行验证，确定miR‑215‑5p，miR‑1283，miR‑129‑1‑3p，miR‑126‑3p，miR‑199b‑5p较目前其他预测顺铂敏感性的参数有着更高的稳定性和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体的说，涉及一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒及其应用。
背景技术
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20～25个核苷酸。miRNA参与各种各样的调节途径，在肿瘤生成、增殖、代谢、凋亡中都发挥着极为重要的作用，在肿瘤诊断和监测等方面也有着广阔的发展前景。
顺铂主要通过靶向DNA复制而抑制肿瘤细胞增殖并引发程序性凋亡。但是，患者接受治疗过程中容易产生顺铂耐药，影响治疗效果。顺铂的耐药机制较为复杂，该药进入肿瘤细胞后，在靶向染色体之前可能会失去活性，失活后的药物将无法与DNA络合以杀伤细胞。因此，预测患者顺铂治疗的敏感性对于肿瘤患者治疗方案的制定极为重要。
技术内容
本发明的目的在于提供一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，该试剂盒包含：miRcute miRNA提取分离试剂盒(天根公司)、TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒(美国Illumina公司)和TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒(美国Illumina公司)；
本发明所提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，还包含说明书；
本发明所提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，还包含乙醇、水等常用试剂。
本发明提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的步骤如下：
(1)使用miRcute miRNA提取分离试剂盒(miRcute miRNA Isolation Kit)提取肿瘤组织样本中的miRNA；
(2)miRNA文库构建：采用TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒完成；
(3)簇生成：采用TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒完成；
(4)Illumina Hiseq2000测序：Hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成Fastq格式；
(5)数据分析：
①对原始Fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段；
②将测序结果与miRbase数据库比对过滤，鉴定出结果中的已知人的miRNA数据；
③根据鉴定的miRNA进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM(transcript permillion)计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106；
④将目的miRNA的表达量(TPM)进行相关计算，预测评分值＝-0.0061*miR-215+(-0.0011*miR-129-1-3p)+0.0120*miR-1283+(-0.0007*miR-126-3p)+(-0.0088*miR-199b-5p)。
基于上述评分模型，计算每个样本的评分，得到预测评分值。当预测评分值<10，可认定该患者肿瘤对顺铂高度敏感；当预测评分值≥10并且≤27时，可认定该患者肿瘤对顺铂中度敏感；当预测评分值>27，可认定该患者肿瘤对顺铂不敏感。
其中所述的目的miRNA为：miR-215-5p、miR-1283、miR-129-1-3p、miR-126-3p和miR-199b-5p；其所对应的序列分别为：
5'-AUGACCUAUGAAUUGACAGAC-3',
5'-UCUACAAAGGAAAGCGCUUUCU-3'，
5'-AAGCCCUUACCCCAAAAAGUAU-3'，
5'-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3',
5'-CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC-3'。
本发明的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，其工作原理是基于如下：
1.肿瘤miRNA表达数据分析
首先，从CCLE数据库中获得肿瘤细胞系的miRNA测序结果，共包含30种常见肿瘤的1775种细胞系。按照miRbase V21.0的MIMAT序列号整理mature miRNA和star miRNA，分析每种miRNA的表达量，以TPM值表示。
其次，通过edgeR包中的filterByExpr函数提供了自动过滤基因的方法自动过滤低表达miRNA，以防止其干扰结果，从而对数据中均值-方差关系进行更精确的估计，减少观察差异表达下游分析中的运算量。最终以顺铂敏感组建立分布，同时得到差异表达miRNA，结果如附图1所示。
2.miR-215-5p，miR-1283，miR-129-1-3p，miR-126-3p，miR-199b-5p与IC50模型构建，通过Lasso回归进一步得到了与IC50值显著相关的miRNA，最终挑选出5个miRNA为：miR-215-5p，miR-1283，miR-129-1-3p，miR-126-3p，miR-199b-5p；通过Logistic回归，训练数据集，特征数据x＝{x1,x2,…,xm}和对应的分类数据y＝{y1,y2,…,ym}。构建逻辑回归模型f(θ)，应用极大似然估计构建评分模型score(预测评分值)＝-0.0061*miR-215+(-0.0011*miR-129-1-3p)+0.0120*miR-1283+(-0.0007*miR-126-3p)+(-0.0088*miR-199b-5p)，附图2。
基于上述评分模型，计算每个待测样本的评分，得到预测评分值。当预测评分值<10，可认定该患者肿瘤对顺铂高度敏感；当预测评分值≥10并且≤27时，可认定该患者肿瘤对顺铂中度敏感；当预测评分值>27，可认定该患者肿瘤对顺铂不敏感。
本发明的创新点：
本发明提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，通过检测组织样本中miR-215-5p，miR-1283，miR-129-1-3p，miR-126-3p和miR-199b-5p的表达量，用于预测肿瘤顺铂敏感性，较目前其他预测顺铂敏感性的参数有着更高的稳定性和应用价值。顺铂在临床上广泛地应用于肿瘤患者的治疗，应用本发明的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，可以有效指导肿瘤患者的个体化治疗，提高临床获益，同时避免不必要的医疗资源浪费。
附图说明
图1与顺铂敏感性相关的差异表达miRNA
图2通过LASSO回归与Logistic回归建立的miRNA预测IC50模型
图3 KM生存分析：TCGA中使用顺铂进行术后化疗患者的生存时间分析
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实验所用仪器：
Hisq2000高通量测序仪(美国Illumina公司)、
CBOT簇生成仪(美国Illumina公司)、
冷冻离心机(美国Eppendorf公司)、
Nanodrop(美国Thermo公司)
实验所用试剂或试剂盒：
miRcute miRNA Isolation Kit(天根TIANGEN公司)、
TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS(美国Illumina公司)、
实施例1
本实施例提供了一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，该试剂盒包含：miRcute miRNA提取分离试剂盒(天根公司)、TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒(美国Illumina公司)和TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒(美国Illumina公司)；
本发明所提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，还包含使用说明书；
本发明所提供的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，还包含乙醇、水等常用试剂。
本实施例还提供了使用上述用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
(1)使用天根公司(TIANGEN)miRcute miRNA Isolation Kit提取组织样本中的miRNA，具体步骤如下(下列步骤中使用的试剂全部来自miRcute miRNA Isolation Kit)：
①样品处理：取50ug新鲜肿瘤组织标本，加入200ul体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30sec。
②室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
③室温12,000rpm(～13,400×g)离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
④加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。
⑤室温12,000rpm(～13,400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
⑥量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇(如：300μl的转移液加100μl无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min,室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。
⑦量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇(如：300μl的流出液加200μl无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。
⑧向吸附柱miRelute中加入500μl去蛋白液MRD(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
⑨向吸附柱miRelute中加入600μl漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。重复一次。
⑩将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心1min，去除残余液体。
(2)miRNA文库构建：(采用TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒完成)(下列步骤中所使用的试剂和3端接头、5端接头等均来自TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒)
①加3端接头：取1ug步骤(1)中提取到的miRNA，用水调整体积到5ul，加1ul3端接头充分混匀，PCR仪70℃2min，立即放冰上。加2ul时ML，1ul RNase抑制剂，1ul T4 RNA连接酶2，充分混匀。PCR仪28℃1h。加1ul STP，充分混匀，28℃15min
②加5端接头：取1.1ul RNA 5端接头。PCR仪70℃2min，立即放冰上。加1.1ul10mMdATP，充分混匀。加1.1ul T4 RNA连接酶，充分混匀。加3ul上述混合物到步骤①的管中。28℃1h，放置冰上。
③RT-PCR富集：稀释dNTP(0.5ul 25mM dNTP mix加25ul水，充分混匀)。取6ul加过接头的miRNA，加1ul RTP，充分混匀。PCR仪70℃2min，立即放冰上。加2ul 5X First strandbuffer，0.5ul 12.5mM dNTPs，1ul 100mM DTT，1ul RNase抑制剂，1ul SSII。充分混匀之后，PCR仪50℃1h。取12.5ul RT产物，加8.5ul水，25ul PML，2ul RP1和2ul RPIX，充分混匀。98℃30sec，11循环(98℃10sec，60℃30sec，72℃10sec)，72℃5min。
(3)簇生成：(采用TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒完成)(下列步骤中所用的试剂均来自TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒)
①取4ul 10nM miRNA文库，加1ul 2N NaOH，加15ul TrisCl，混匀，室温放置5min。
②取6ul上述溶液，加994ul冷的杂交buffer。取140ul，放在8连管中，使用CBOT簇生成仪，开始簇生成。
(4)Illumina Hiseq2000测序：将步骤(3)中生成的miRNA簇进行测序(Hiseq2000上机)，测序结果原始数据转换成Fastq格式。
(5)数据分析：
①对原始Fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段。
②将测序结果与miRbase数据库比对过滤，鉴定出结果中的已知人的miRNA数据。
③根据鉴定的miRNA进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM(transcriptpermillion)计算度量指标；
TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106。
④将目的miRNA的表达量(TPM)进行相关计算，score＝-0.0061*miR-215+(-0.0011*miR-129-1-3p)+0.0120*miR-1283+(-0.0007*miR-126-3p)+(-0.0088*miR-199b-5p)。
基于上述评分模型，计算每个待测样本的评分，得到预测评分值。当预测评分值<10，可认定该患者肿瘤对顺铂高度敏感；当预测评分值≥10并且≤27时，可认定该患者肿瘤对顺铂中度敏感；当预测评分值>27，可认定该患者肿瘤对顺铂不敏感。
实施例2
TCGA数据库预测
通过TCGA数据库中的临床信息，筛选出经历术后化疗，并且化疗方案中包括顺铂的患者，共1000余例，提取其miR-215-5p，miR-1283，miR-129-1-3p，miR-126-3p，miR-199b-5p的表达信息，并计算出每位患者的score值，将小于10(<10)的患者(共197位)归为Low组，将大于27(>27)的患者(共309位)归为High组，而后结合其生存信息，通过KM生存分析，发现两组患者存在显著生存差异(p<0.05)，如图3所示。
实施例3自身样本预测
提取肺腺癌肿瘤组织样本中的miRNA，检测miR-215-5p，miR-1283，miR-129-1-3p，miR-126-3p，miR-199b-5p等在肺腺癌组织中的表达情况。其中包含肿瘤组织40例(20例顺铂治疗后存活大于3年，20例顺铂治疗后存活小于1年；40例肿瘤组织均来自复旦大学附属中山医院胸外科)。
分析结果表明：采用预测模型分析后，存活大于3年的20位患者中有18位患者的score值小于10(<10)，而存活小于1年的20位患者中仅有4位的score值小于等于27(≤27)。因此综合判断该预测模型灵敏度为90％，特异性为80％。
Claims (4)
1.一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含：miRcutemiRNA提取分离试剂盒、TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒和TruSeq SR ClusterKitv3-cBot–HS试剂盒。
2.根据权利要求1所述的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒，还包含使用说明书。
3.应用权利要求1所述的用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒预测肿瘤患者顺铂敏感性的方法，包含如下步骤：
(1)使用miRcute miRNA提取分离试剂盒提取肿瘤组织样本中的miRNA；
(2)miRNA文库构建：采用TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒完成；
(3)簇生成：采用TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒完成；
(4)Illumina Hiseq2000测序：Hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成Fastq格式；
(5)数据分析：
①对原始Fastq文件数据筛选质量可靠的测序片段；
②将测序结果与miRbase数据库比对过滤，鉴定出结果中的已知人的miRNA数据；
③根据鉴定的miRNA进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106；
④将目的miRNA的表达量进行相关计算，预测评分值＝-0.0061*miR-215+(-0.0011*miR-129-1-3p)+0.0120*miR-1283+(-0.0007*miR-126-3p)+(-0.0088*miR-199b-5p)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：当预测评分值<10，可认定该患者肿瘤组织对顺铂高度敏感；当预测评分值≥10并且≤27时，可认定该患者肿瘤组织对顺铂中度敏感；当预测评分值>27，可认定该患者肿瘤组织对顺铂不敏感。
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|---|---|---|---|---|
| CN115927645A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-04-07 | 复旦大学附属中山医院 | Hnf4g在检测肺腺癌顺铂敏感性中的应用 |
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| CN109536601A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-03-29 | 杭州师范大学 | 儿童哮喘血清特异miRNAs及决策树模型的建模方法 |
| CN112609003A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-04-06 | 上海润安医学科技有限公司 | 一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途 |
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2021
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