CN101978073A - 用于评估药物反应的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了预测和确定受试者对抗血小板剂的反应的方法，且所述方法包括使用基因多态性分析确定受试者对血小板凝集相关疾病的治疗方案或介入的适合性。本发明还涉及基因多态性在评估受试者对抗血小板剂的反应上的用途。还提供了适用于这种评估的核苷酸探针和引物、试剂盒，以及微阵列。

Description

用于评估药物反应的方法和组合物
技术领域
本发明涉及对药品的反应，评估药物反应和预测受试者对特定药物及药物治疗方案的反应的方法，以及对基因多态性和改变的基因表达的分析。
背景技术
下文包含的内容可用于了解本发明。这并非认定任何本文提供的内容相对于正在描述或要求保护的发明是现有技术，或与此相关，或者任何具体或隐含引用的出版物或文献是现有技术。
最近对人类基因组学领域的科技焦点是药物基因组学，其包含对使用发育中的人类DNA序列变异性和药物处方的努力。药物基因组学研究基于给定基因型和所得表型之间的相关性或关联。自从超过半个世纪前的首个相关性研究将不良药物反应联系到在两种药物代谢酶(血浆胆碱酯酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)上的氨基酸变异上，多个研究已经报道了药物代谢酶内部的序列多态性、药物靶向物和药物运输体以及与药物效果或安全性协调水平的相关性。
药物基因组学信息将特别适用于相关性信息可用于预防药物毒性的临床环境，或开发治疗方案。例如、经常就硫代嘌呤甲基转移酶基因上的遗传差异来筛选患者，该酶可降低6-巯基嘌呤或硫唑嘌呤的代谢。但在观察到的药物毒性中至今只有极少比例已经由一组药物基因组学标记物得到充分的解释。
另外，临床试验中“异常”的个体、或经历未预期到的效果的个体(当受试药物已经事先被证明兼具安全性和有效性)，在获得FDA药物批准时可导致实质性的延迟，并且甚至可导致某些药物从市场退出，尽管这些药物也许对多数受试者有效。
生物技术方法到目前为止曾用于识别靶基因组区域，包括、例如、差异性基因表达(其从根本上探寻受试样品和对照组之间在基因表达上的差异)；蛋白质-蛋白质相互作用图谱可用于识别药物受试者和其即时效应；并挖掘人类序列数据库中的类似于已知的疾病相关的、药物代谢动力或药效的调控子的序列。与此相比，关联和确证基因组区域与具体表型特征的联合研究依赖于群体遗传学和稳健的统计学度量。联合研究提供在更短时间内获得更多信息的强大工具，从而减少了搜索和开发努力的成本。
因为所有人类中99.9％的基因组成是一致的，其任意两个个体的DNA序列是几乎相同的。个体间的差异包括、例如、DNA序列的缺失和插入，非编码区中的重复DNA元件数的变化和单个核苷酸位点的改变，或“单核苷酸多态性”(SNP)。
SNP可用于进行联合研究，并已被鉴定为潜在适用于表型特征的遗传标记物。关注于药学领域的特定的表型特征包括对疾病的易患性及应对的特定药物或治疗方案。
例如，最近的研究报道对抗血小板剂氯吡格雷的反应是可变的，20～40％的患者由于ADP-诱导的血小板凝集或激活的低抑制而被规类为不良反应者或对氯吡格雷有抗性(Angiolillo DJ等人(2005)；Gurbel PA等人(2003)；Gurbel PA等人(2006)；Gurbel PA，Bliden，KP，Hayes KM等人(2005)；Mobley，JE等人(2004)；和Muller I等人(2003))。代谢酶(如细胞色素CYP450系统)和肠道吸收机制(如p-糖蛋白外排泵)也许负责所述改变。由放射性同位素标记的红霉素呼吸试验来测定的CYP3A4的活性，已被报道与氯吡格雷的反应相关(Lau WC等人)。CYP3A4据报道负责多数药物代谢，并且其已被确信该途径是对氯吡格雷到其活性代谢物的生物转化过程的主要限制因素。
但氯吡格雷的代谢也可受CYP2C19、CYP2C9影响，并可能受CYP3A5影响(Brandt JT，Close SL等人(2007)和Suh JH等人(2006))。数个经详细描述过的遗传多态性存在于所述这些酶的基因内，其致使个体成为弱代谢者或超代谢者。例如，CYP2C19＊2等位基因显示该酶的一种功能丧失，且载体据报道在使用每日一次75mg的氯吡格雷(Hulot JS等人(2006)和Fontana P，Senouf D等人(2007))和300mg的负荷剂量(Brandt JT，Close SL等人(2007))时显示减弱的抗血小板反应。CYP3A4多态性也已被报道与对300mg氯吡格雷的减弱的反应有关(Angiolillo DJ等人(2006)；和Fontana P，HulotJS等人(2006))。CYP3A5功能丧失基因型＊3已被报道与在经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后的个体中动脉粥样硬化的案例增加有关(SuhJH等人(2006))。
ISAR-CHOICE的药代动力学成分的研究提示600mg的氯吡格雷的升限效应也许是由于所述药物的可饱和肠道吸收作用(vonBeckerath N等人(2005))。其随后提出p-糖蛋白外排泵在该过程中可被涉及。另外ABCB1基因(C3435T)的一种多态性(编码p-糖蛋白)已被报道降低血浆母体药物水平(Taubert D等人)。但该结果尚未被转化到药效学影响。
减弱的药效反应被报道在数个临床研究中与不良心脏事件的更高相对风险有关，提示对氯吡格雷的减弱的药效反应是临床相关性的(Ajzenberg，N，等人(2005)；Barragan，P等人(2003)；Cuisset，T等人(2006)；Gurbel，PA，Bliden，KP，Samara，W等人(2005)；Gurbel，PA，Bliden，KP，Guyer，K等人(2005)和Matetzky，S等人(2004))。
对氯吡格雷的反应显示大范围的个体间变异，并且大量个体显示对该药物无或极小反应。重要的是，对处于心血管药物治疗的患者的药物基因组学试验目前已进入临床实践阶段。FDA最近已批准了在华法林疗法之前对VKORC1和CYP2C9多态性的药物基因组学试验。用标准诺莫图剂量鉴定弱反应者或那些有出血风险者可预防造成医院患者中的实质比例发病的药物相关并发症。
拥有一种生物标记物或生物标记物组合是可希望的和有利的，其可用于确定受试者对抗血小板剂的反应，或对受试者以一种或更多抗血小板剂使用各种剂量和剂量方案来进行治疗的适合性。本发明提供了这些生物标记物及它们在确定受试者的与对抗血小板药物及药物治疗方案的反应有关的这些表型特征的方法中的用途。
发明概述
本文阐述和要求保护的发明具有许多特性和实施方式，包括，但不限于，在本发明概述中的解释或阐述或引用的那些。其并非意图包括全部内容，且本文阐述和要求保护的发明不限于本发明概述中定义的特征或实施方式(其包括只用于解说性用途并且没有限制性)，或者不受其限制。
一方面，本发明涉及确定受试者中基因型和药物反应和/或对治疗方案的适合性之间的关系。
因此，根据此方面，提供预测或确定受试者对抗血小板剂的反应的方法，所述方法包括：对来自所述受试者的样品的一种或多种多态性的有或无进行分析，所述多态性选自：
1.编码细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽19(CYP2C19)的基因中的1A/G(rs28399504)，也被称为“CYP2C19＊4”，“基因型CYP2C19＊4”或“CYP2C19＊4携带者”；
2.编码CYP2C19的基因中的636G＞A，也被称为“CYP2C19＊3”，“基因型CYP2C19＊3”或“CYP2C19＊3携带者”。
3.编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)，也被称为“CYP2C19＊17”；和
4.编码核受体亚家族1，组I，成员2(NR1I2)的基因中的275A/G(rs1464602)(还被称为BXR、PAR、PRR、PXR、SAR、SXR、ONR1、PAR1、PAR2或PARq)。
在本发明的一个实施方式中，一种或多种所述多态性的有或无是受试者对抗血小板剂反应的标示。在一个实施方式中，有一种或多种所述多态性通常指示受试者对抗血小板剂的减弱的反应。
在本发明的另一个实施方式中，下述一种或多种多态性可与上述所列出的多态性1～5的一种或多种或全部联用：
5.编码细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽5(CYP3A5)的基因中的6986G/A(rs776746)，还被称为“CYP3A5＊1＊1”，“基因型CYP3A5＊1＊1”或“CYP3A5＊1＊1携带者”；和
6.编码CYP3A5的基因中的31611T/C。
这些多态性结合在一起被称为“CYP3A5＊1”(杂合子)或“CYP3A5＊1＊1”(纯合子)。在该实施方式中，有一种或多种所述多态性通常指示受试者对抗血小板剂的减弱的反应。在另一实施方式中，有一种或多种所述多态性可指示受试者对抗血小板剂的增强的反应。
在另一实施方式中，受试者有多态性CYP2C19＊2、CYP2C19＊3和CYP2C19＊4将指示所述受试者对已加大剂量的或持续加大剂量的抗血小板剂的增强的反应。另一方面，所述受试者可为无反应者或弱反应者。
在本发明的一个实施方式中，抗血小板剂选自噻吩并吡啶类抗血小板剂。在该实施方式的另一方面，该抗血小板剂选自第二代噻吩并吡啶类抗血小板剂。在优选实施方式中，该抗血小板剂优选氯吡格雷。
在另一实施方式中，该抗血小板剂选自第三代噻吩并吡啶抗血小板剂。在优选实施方式中，该抗血小板剂是普拉格雷。
在另一优选实施方式中，该抗血小板剂是氯吡格雷，且个体的基因型包括如本文阐述的CYP2C19＊2、CYP2C19＊3、CYP2C19＊4和CYP2C9＊3中的一种或多种或全部。在又一优选实施方式中，受试者的基因型包括编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)TT或GT，其可单独或与一种或多种或全部上述的多态性在一起。在个体中有一种或多种这些多态性指示对氯吡格雷的减弱的反应。
在尤其优选的实施方式中，抗血小板剂是氯吡格雷，且个体的基因型包括CYP2C19＊2和CYP2C9＊3。多态性的这个组合指示受试者接受氯吡格雷的治疗(包括，例如，以150mg的日剂量治疗)后在血小板的抑制上出现更大的变化。
在另一优选实施方式中，抗血小板剂是氯吡格雷，且个体的基因型包括CYP2C19＊17。该多态性指示在以氯吡格雷进行治疗后在血小板抑制上出现更大变化。
一种或多种多态性可被直接检测，或通过检测与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性来检测。
该方法可另外包括分析来自所述受试者的样品中有一种或多种选自下列的多态性，所述多态性选自：
7.编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)，也被称为“CYP2C19＊2”；
8.编码细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽9(CYP2C9)的基因中的42614A/C(rs1057910)，也被称为“CYP2C9＊3”；和
9.编码细胞色素P450，家族2，亚家族B，多肽6的基因中的516G＞T(rs3745274)，也被称为“CYP2B6＊9”。
在这个实施方式中，有一种或多种所述多态性单独或与一种或多种或全部上述记载的多态性一起通常指示受试者对抗血小板剂的减弱的反应。另外，一种或多种另外的多态性的检测可直接进行或通过检测与一种或多种另外的多态性连锁不平衡的多态性来检测。
有一种或多种选自下列的多态性指示对该抗血小板剂的弱反应或抗性，所述多态性选自：CYP3A5＊1＊1；CYP2C19＊4；CYP2C19＊3；编码CYP2C19的基因中的基因型-806C/T(rs12248560)TT或CT(在本文中还被称为基因型CYP2C19＊17或CYP2C19＊17携带者)；编码CYP2C19的基因中的基因型19154G/A(rs4244285)AA或GA(在本文中还被称为基因型CYP2C19＊2或CYP2C19＊2携带者)；编码CYP2C9的基因中的基因型42614A/C(rs1057910)CC或CA(在本文中还被称为基因型CYP2C9＊3或CYP2C9＊3携带者)；编码NR1I2的基因中的基因型275A/G(rs1464602)GG或GA；编码CYP2B6的基因中的基因型516G＞T(rs3745274)TT或GT。
有一种或多种选自下列的多态性指示对该抗血小板剂的反应性，该多态性选自：CYP3A5＊3＊3；编码CYP3A5的基因中的基因型31611T/C TC或CC；编码CYP2C19的基因中的基因型1G/A(rs28399504)AA；编码CYP2C19的基因中的基因型636G＞A(rs4986893)GG；编码CYP2C19的基因中的基因型-806T＞C(rs12248560)CC；编码CYP2C19的基因中的基因型19154A＞G(rs4244285)GG；编码CYP2C9的基因中的基因型42614C＞A(rs1057910)AA；或编码NR1I2的基因中的基因型275G＞A(rs1464602)AA；编码CYP2B6的基因中的基因型516G＞T(rs3745274)GG。
该抗血小板剂优选噻吩并吡啶，更优选氯吡格雷。
本发明的方法尤其适用于处于患与血小板凝集相关的疾病或症状的风险或正患该疾病或病症的受试者，所述与血小板凝集相关的疾病或症状包括：冠状动脉疾病，急性冠状动脉综合征，外周血管疾病，动脉粥样硬化(包括症状性动脉粥样硬化)，脑血管疾病，血栓栓塞；或正接受或已经接受对一种或多种这些疾病或症状的治疗的受试者，所述治疗包括手术治疗：包括放置血管内支架，搭桥手术，瓣膜置换术等。
本文中下述的讨论引用本发明的一个方面用于预测或确定受试者对一种或多种抗血小板剂的反应，也值得重视的是本发明这些方面也用于确定受试者对治疗方案的适合性，优选用于确定受试者对抗血小板剂的预防性或治疗性治疗的适合性，包括选自噻吩并吡啶类抗血小板剂的抗血小板剂，包括第二代噻吩并吡啶类抗血小板剂(包括氯吡格雷)，和第三代噻吩并吡啶抗血小板剂(包括普拉格雷)。
值得重视的是本发明的方法可识别多个类别的多态性或多态性组合，即与对一种或多种抗血小板剂弱反应或抗性相关的多态性(本文中称为“抗性多态性”)，与对一种或多种抗血小板剂反应相关的多态性(本文中称为“反应性多态性”)，与对一种或多种抗血小板剂治疗方案的反应相关的多态性，以及与对不同剂量(包括一种或多种抗血小板剂的增加的剂量)的反应相关的多态性。
这些SNP可计入使个体分类为反应者类别(即反应者(轻度减弱的反应，中度减弱的反应)或无反应者)的记分系统。无任何一种确定的抗性多态性都可将个体归类于反应者类别。
因此，本发明更提供了预测或确定受试者对抗血小板剂的反应的方法，所述方法包括：
确定与对抗血小板剂的弱反应或抗性相关的至少一种抗性多态性的有或无；
其中有至少一种抗性多态性指示对抗血小板剂的弱反应或抗性。
此外，值得重视的是上述方面可用于确定受试者对治疗方案或剂量的适合性，优选用于确定受试者对使用抗血小板剂方案或剂量的预防性或治疗性治疗的适合性。
在本发明的优选形式中，有全部反应性多态性指示对抗血小板剂的反应。
在本发明的另一优选形式中，有两种或更多种抗性多态性指示对抗血小板剂的弱反应或抗性。
在另一方面，本发明提供了预测和确定受试者对抗血小板剂反应的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的样品的一种或多种基因测试结果，以及分析一种或多种多态性的有或无的结果，该多态性选自本文阐述过的(或与任何一种或多种上述多态性连锁不平衡的一种或多种多态性)，或选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与任何一种或多种这些多态性连锁不平衡的一种或多种多态性；其中标志一种或多种所述多态性的有或无的结果指示受试者对抗血小板剂的反应。
在另一方面提供了预测和确定受试者对抗血小板剂的反应的方法，所述方法包括分析两种或更多种选自下列的多态性，该多态性选自：编码编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与任何一种或多种这些多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
在本发明的一个形式中如本文阐述的方法与一个或多个与对抗血小板剂的反应有关的危险因素分析联合进行，包括一个或多个流行病学危险因素。这种流行病学危险因素包括但不限于：吸烟或被动吸烟，年龄，性别，以及与血小板凝集有关的家族病史或症状，包括冠状动脉疾病，急性冠状动脉综合征，外周血管疾病，动脉粥样硬化(包括症状性动脉粥样硬化)，脑血管疾病，血栓栓塞，或正在接受或已接受对一种或多种这些疾病或症状的治疗的受试者，所述治疗包括手术治疗、包括放置血管支架，搭桥手术，瓣膜置换术等。
在另一方面，本发明提供了至少一种多态性在评估受试者对抗血小板剂反应中的用途，其中所述至少一种多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；或与所述多态性中的任何一种连锁不平衡的一种或多种多态性。
随机地，上述用途可与至少一种另外的多态性的用途相组合，所述另外的多态性选自：编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码CYP2C9的基因中的42614A/C(rs1057910)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；或与任意一种或多种这些多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
在本发明的另一方面提供了用于本文阐述的本发明的优选方法的一套核苷酸探针和/或引物。优选地，所述核苷酸探针和/或引物是跨距，或能用作跨距的，基因的所述多态性区域的那些。还提供了含本文阐述的任意一种探针和/或引物的序列的一种或多种核苷酸探针和/或引物。
在又一方面，本发明提供了用于本发明方法的核酸微阵列，微阵列包含：存在核酸序列的基体、所述核酸序列能够与编码本文阐述的一种或多种抗性或反应性多态性的核酸序列或与之互补的序列杂交。
在其他方面，本发明提供用于本发明方法的抗体微阵列，该微阵列包含基体、该基体上存在能与基因表达产物结合的抗体，当与本文阐述的抗性或反应性多态性相关时，该基因的表达被上调或下调。
在其它方面中，本发明提供了评估受试者对介入的适合性的方法，该介入用于诊断或治疗血小板凝集相关疾病，所述方法包括：a)提供来自受试者的样品的一种或多种基因测试的结果，以及b)分析所述结果中一种或多种反应性多态性的有或无、或者一种或多种抗性多态性的有或无，其中所述反应性或抗性多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与任何一种或多种这些多态性连锁不平衡的一种或多种多态性；其中有一种或多种抗性多态性指示受试者对该介入的适合性或不适合性。
在本发明的一个实施方式中，该介入是对与血小板凝集相关疾病或症状的诊断试验，所述疾病或症状包括：冠状动脉疾病，急性冠状动脉综合征，外周血管疾病，动脉粥样硬化(包括症状性动脉粥样硬化)，脑血管疾病，血栓栓塞，或或正在接受或已经接受针对一种或多种上述这些疾病或症状的治疗的受试者，所述治疗包括手术治疗：包括放置血管支架、搭桥手术，瓣膜置换术等。
在本发明的另一实施方式中，所述介入是对血小板凝集相关疾病或症状的治疗，包括冠状动脉疾病，急性冠状动脉综合征，外周血管疾病，动脉粥样硬化(包括症状性动脉粥样硬化)，脑血管疾病，血栓栓塞，或或正在接受或已经接受针对一种或多种上述这些疾病或症状的治疗的受试者，所述治疗包括手术治疗，包括放置血管支架：包括是否植入药物洗脱或稀有金属冠状动脉支架的确定，搭桥手术，瓣膜置换等，更优选对所述疾病或症状的预防性治疗。
优选地，所述方法包括对一种或多种另外的反应性或抗性多态性的有或无的分析，该多态性选自：编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码CYP2C9的基因中的42614A/C(rs1057910)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；或与任意一种或多种这些多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
在又一方面，本发明提供了在确定受试者对介入的适合性的情况中预测受试者对抗血小板剂的反应性的数据，所述介入是对血小板凝集相关疾病或症状的诊断或治疗，所述数据包含，组成自或包括对至少一种抗血小板剂的反应-相关的基因分析的结果、该基因分析选自本文阐述的一种或多种基因分析，且所述数据指示受试者对所述介入的适合性或不适合性。
例如，所述确定为是否植入药物洗脱冠状动脉支架还是稀有金属冠状动脉支架。在一个实施方式中，所述数据代表有一种或多种反应性多态性，或代表无一种或多种反应性多态性，或代表有一种或多种抗性多态性。
在另一方面，本发明提供了确定受试者对抗血小板剂反应的系统，所述系统包括：用于接收、处理和通信数据的计算机处理器设备；用于存储数据的存储设备，该数据包括关于对抗血小板剂的反应或关于与血小板凝集相关疾病或症状的至少一种基因分析结果的参照基因数据库和任选的与血小板凝集相关的疾病或症状的非基因危险因素的参照非基因数据库；以及被嵌入在计算机数据处理器内的计算机程序，一旦接收由基因分析的结果构成或包括基因分析的结果的数据，由于该数据被包括在所述参照基因数据库中，该计算机程序处理在所述参照数据库背景中的所述数据，以作为结果确定所述受试者对抗血小板剂的反应，一旦知道所述结果，可优选将所述结果通信给已输入所述数据的使用者。
优选地，至少一种基因分析是对选自下列的一种或多种多态性的分析，所述多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
在本发明的一个实施方式中，该数据由医疗保健提供者的代表输入。在另一实施方式中，该数据由受试者、他们的医学顾问或其它代表输入。优选地，所述系统容易经由网络或个人电脑获得。
优选地，所述参照基因数据库构成于、包含或包括与对抗血小板剂反应相关的基因分析的结果、该基因分析选自一种或多种本文阐述的基因分析，优选为对一种或多种选自下列的多态性的分析结果，该多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码CYP2C9的基因中的42614A/C(rs1057910)；或与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
更优选地，所述参照基因数据库构成于、包含或包括任意两种、任意三种、任意四种、或全部多态性的分析结果，该多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)。所述参照基因数据库可额外包含或包括选自下列的一种或多种多态性的结果分析，该多态性选自：编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；编码CYP2C9的基因中的42614A/C(rs1057910)。更优选地，所述参照基因数据库构成于、包含或包括全部本文阐述的基因分析的结果。
在又一方面，本发明提供了适宜于使用在系统上的计算机程序，该系统如上定义，包括持有程序代码的计算机可使用的媒介，体现在促使计算机程序处理接收的数据的媒介，该数据组成自或包括：在两种背景下：所述至少一种抗血小板剂反应-相关的基因分析的结果的参照基因数据库；和任选的与血小板凝集相关疾病或症状的非基因危险因素的参照非基因数据库，这两种背景下的至少一种抗血小板剂反应-相关基因分析的结果。
优选地，至少一种抗血小板剂反应-相关的基因分析选自一种或多种本文阐述的基因分析，优选至少一种抗血小板剂反应-相关的基因分析是对选自下列的一种或多种多态性的分析，该多态性选自编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。优选地，至少一种抗血小板剂反应-相关基因分析是对来自上述组的任意两种、任意三种、任意四种、或全部多态性的分析。
至少一种抗血小板剂反应-相关基因分析可额外包含对选自下列的一种或多种多态性的分析，该多态性选自：编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；编码CYP2C9的基因中的42614A/C(rs1057910)。
优选地，至少一种抗血小板剂反应-相关的基因分析是本文阐述过的基因分析。
还提供了用于确定受试者对介入的适合性的如上所述的计算机系统和程序，所述介入是对血小板凝集相关疾病或症状的诊断或治疗。
再一方面，本发明提供了预测受试者对血小板凝集相关疾病或症状的易患性的数据在对受试者对抗血小板剂反应的预测和确定中的用途，所述数据包含、构成自或包括至少一种抗血小板剂反应-相关基因分析的结果，该基因分析选自一种或多种本文阐述过的基因分析，且所述数据可代表受试者对抗血小板剂反应。
优选地，该数据包含、构成自或包括选自下列的一种或多种多态性的分析结果，该多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；或与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
更优选地，该数据包含、构成自或包括两种或更多种、三种或更多、四种或更多、或全部的上述的多态性的分析结果。更优选地，该数据包含、构成自或包括全部本文阐述过的基因分析。
在另一方面，本发明提供了评估受试者对抗血小板剂反应的试剂盒，所述试剂盒包括对来自所述受试者样品的本文阐述的一种或多种多态性的有或无的分析设备。
在又一方面，本发明提供了评价受试者对血小板凝集相关疾病的治疗性介入的适合性的方法，该方法包括：a)提供对来自受试者样品的一种或多种血小板抑制试验的结果；以及b)分析该结果；其中指示少于约10％的血小板抑制的结果指示受试者对所述介入的适合性和不适合性。
优选地，该治疗性介入是用，例如，氯吡格雷来治疗。另外可选择的，所述治疗性介入可用普拉格雷治疗。
优选地，所述血小板抑制试验是给予氯吡格雷后的血小板抑制试验，优选在氯吡格雷给药后约2小时进行血小板抑制试验。
优选使用快速血小板功能分析仪，更优选VerifyNow快速血小板功能分析仪，更优选将VerifyNow快速血小板功能分析仪及P2Y12试剂盒测定血小板抑制试验。
在一个实施方式中，少于约5％的血小板抑制的、少于约4％血小板抑制的，少于约3％血小板抑制的，或优选少于约2％的血小板抑制的结果，指示受试者对所述治疗性介入的不适合性，更优选指示受试者对使用氯吡格雷治疗的不适合性。
在另一实施方式中，少于约5％的血小板抑制的、少于约4％血小板抑制的，少于约3％血小板抑制的，或优选少于约2％的血小板抑制的结果，指示受试者对所述治疗性介入的适合性，更优选指示受试者对使用普拉格雷治疗的适合性。
在又一实施方式中，少于约10％的血小板抑制的、少于约5％的血小板抑制的、少于约4％的血小板抑制的、少于约3％的血小板抑制的、或优选少于约2％的血小板抑制的结果，指示受试者适对所述治疗性介入的适合性，更优选指示受试者对氯吡格雷的高剂量治疗方案的适合性，更优选指示受试者对氯吡格雷的高剂量治疗方案的适合性、包括：以约1200mg的负荷剂量和约150mg日维持剂量的氯吡格雷给药。
在更多方面本发明提供了预测或确定对受试者的与血小板凝集相关疾病的治疗方案的效果的方法，其中的治疗方案包括抗血小板剂的给药，该方法包括：a)提供对来自受试者样品的一种或多种血小板抑制试验的结果；以及b)分析所述结果；其中指示少于约10％的血小板抑制的结果指示治疗方案的效果减弱。
优选地，所述效果指长期疗效，更优选一周治疗后的、一个月治疗后的、或介于一个月和一年治疗后的所述治疗方案的效果。
优选地，所述抗血小板剂为例如、氯吡格雷。
治疗方案优选包括以约600mg的负荷剂量和约75mg的日维持剂量的氯吡格雷给药。
优选地，血小板抑制试验是以氯吡格雷给药后的血小板抑制试验，优选以氯吡格雷给药后约2小时时的血小板抑制试验。
优选使用快速血小板功能分析仪，更优选VerifyNow快速血小板功能分析仪，更优选VerifyNow快速血小板功能分析仪及P2Y12试剂盒来测量血小板抑制试验。
在本发明的实施方式中，少于约5％的血小板抑制的、少于约4％的血小板抑制的、少于约3％的血小板抑制的、或优选少于约2％的血小板抑制的结果指示治疗方案的效果减弱，更优选指示使用氯吡格雷治疗的效果减弱，更优选指示减弱以约600mg负荷剂量和约75mg日维持剂量的氯吡格雷治疗的减弱的效果。
在另一方面，本发明提供了对受试者的与血小板凝集相关疾病的治疗方法，该方法包括：a)对受试者在第一天的治疗中以氯吡格雷的负荷剂量给药，该负荷剂量介于600mg以上至约1800mg的范围；b)在随后每个治疗日对受试者以氯吡格雷的维持剂量给药，该维持剂量介于50mg以上至约200mg的范围。
在优选实施方式中，所述负荷剂量在600mg以上到约1500mg的范围，更优选在900mg以上到约1500mg的范围，更优选负荷剂量为约1200mg。
在优选实施方式中，维持剂量介于约50mg和约200mg之间，更优选介于约75mg到和150mg之间，更优选所述日维持剂量为约150mg。
优选地，受试者已经被认定为氯吡格雷无反应者或弱反应者，更优选受试者已经被认定为使用本发明方法的氯吡格雷的无反应者或弱反应者。
在其它方面，本发明提供了在受试者中治疗血小板凝集相关疾病的方法，所述方法包括：a)在治疗的第一天给予受试者以首次负荷剂量的氯吡格雷，所述首次负荷剂量为300mg以上到约900mg；b)在治疗的第一天给予受试者以第二次负荷剂量的氯吡格雷，所述第二次负荷剂量为300mg以上到约900mg；c)在随后每个治疗日给予受试者以维持剂量的氯吡格雷，所述维持剂量在50mg以上到约200mg；其中的第二次负荷剂量在首次负荷剂量之后约30分钟给药。
在优选实施方式中，首次负荷剂量为600mg。在另一优选实施方式中，第二次负荷剂量为600mg。
优选地，第二次负荷剂量是在首次负荷剂量后的约30分钟到4小时之间给药，优选在首次负荷剂量后的约45分钟到3小时之间给药，更优选在首次负荷剂量后的约1小时到2.5小时之间，更优选在首次负荷剂量后约2小时时给药。
在优选实施方式中，所述维持剂量介于约50mg到约200mg之间，更优选介于约75mg到约150mg之间，更优选所述日维持剂量为约150mg。
本发明还提供了产品，其包含：含有氯吡格雷的多个剂型、以及对患有血小板凝集相关疾病的患者给予氯吡格雷的产品说明，其中的产品说明提供根据如上所述的本发明的治疗方法施用氯吡格雷。
优选地，该产品说明提供氯吡格雷在治疗的第一天以约1200mg的负荷剂量给药，在其后每天的治疗中接下来给予约150mg的维持剂量。
优选地，多个剂型包括至少一个负荷剂量剂型以及至少一个维持剂量剂型，所述至少一个负荷剂量剂型提供了约1200mg的总剂量，并且所述维持剂量剂型含有约150mg。
优选地，所述产品说明提供在治疗的第一天以约600mg氯吡格雷的首次负荷剂量给药，且在首次负荷剂量后至少约30分钟时给予约600mg氯吡格雷的第二次负荷剂量，并且约150mg氯吡格雷的维持剂量是在随后的治疗中每天给药。
优选地，多个剂型包括至少两个负荷剂量的剂型和至少一个维持剂量的剂型，所述至少两个负荷剂量的剂型提供了约1200mg氯吡格雷的总剂量，且所述维持剂量剂型包括约150mg的氯吡格雷。优选地，至少两个负荷剂量的剂型各含有约600mg氯吡格雷。
优选地，所述剂型是口服剂型。
另外还提供氯吡格雷用于制备适用于上述方法的药剂或剂型的用途。
附图说明
图1显示对血小板活化的激动剂和抗血小板剂。
图2显示皮尔逊相关矩阵，该矩阵显示在两个时间间隔血小板功能反应之间的关系，以及给予氯吡格雷后基于较早时间间隔对血小板活性的后发抑制的可预测性。当发生在2小时的血小板抑制少于2％，可预测在7小时无反应(抑制发生＜10％)，伴随100％的灵敏性，和88％的特异性。
图3显示在给以600mg氯吡格雷后2小时时的血小板抑制。CYP2C19＊2和CYP2C19＊4携带者显示CYP2C19酶功能丧失，但CYP2C19＊17显示获得功能。P值使用Kruskal-Wallis检验计算。
图4显示第二次氯吡格雷负荷剂量后2小时时在CYP2C19＊1＊1正常携带者中的血小板抑制。＊1携带者显示正常CYP2C19酶的功能。P值使用Mann Whitney检验计算。
图5显示第二次氯吡格雷负荷剂量后2小时时在CYP2C19＊2或＊4功能丧失的携带者中的血小板抑制。
图6显示在CYP2C19正常携带者中7天的血小板抑制。
图7显示在CYP2C19＊2或＊4的功能丧失携带者中7天的血小板抑制。
图8显示无关剂量的全部个体中的弱反应者基因型(CYP2C19和CYP2C9)的累加效应。P值使用Wilcoxon检验计算。
图9显示对氯吡格雷反应者状况的基因型危险分值，其中针对2小时的抗血小板抑制标绘抗性基因型的数量。P值使用Wilcoxon检验计算。
实施方式
术语遗传药理学和药物基因组学术语及其语法上等同的术语在本文中可互换使用。这些术语指对个体的基因如何决定其(他或她)对药物的反应(如患者的“药物反应表型”、或“药物反应基因型”)的研究。药物基因组学使临床医生或内科医生对、例如将最为受益于所述治疗的患者进行靶预防性或治疗性治疗，或者避免对可能遭受药物相关的毒性副作用或者效果减弱或无效果的患者的治疗。
使用病例对照研究，已经比较了接受冠状动脉介入的受试者中候选基因的多个基因变异(多态性)的频率。这些候选基因的大多数对基因表达或蛋白功能有确定的(或可能的)功能性作用。特别比较了具有弱药物反应的受试者与具有良药物反应的受试者之间的多态性的频率。
在本文阐述过的一个实施方式中，鉴定了抗性基因多态性和反应性基因多态性。这些多态性列表如下：
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抗性基因多态性(在本文中也被称为抗性多态性)是当存在时指示对抗血小板剂的弱反应或抗性的多态性。相比之下，反应性基因多态性(在本文中也被称为反应性多态性)是当存在时指示对抗血小板剂的反应性的多态性。
如同本文使用的，当术语“反应”使用于涉及抗血小板剂的内容时，意味着受试者对抗血小板剂效果的感受性，并指所述制剂在所述受试者中的效力。
相应地，所述词组“对抗血小板剂的反应”意味着具有所述反应的受试者具有对抗血小板剂反应的遗传倾向或趋势，或所述受试者显示对抗血小板剂效果的感受性，从而所述抗血小板剂具有效果。这并不意味着这种人将必定总是在任何时候都对给定抗血小板剂有反应，而是仅仅意味着他或她与具有与对抗血小板剂的弱反应或抗性相关的多态性或不具有与对抗血小板剂的反应相关的多态性(在本文中被称为反应性多态性)的个体的普通人群相比，较有更大的反应的可能性。
类似地、所述词组“对抗血小板剂的弱反应或抗性”意即具有弱反应性或抗性的受试者具有对抗血小板剂反应的遗传非轻响或减弱的趋势，或受试者显示对抗血小板剂效果的减弱的感受性，这样抗血小板剂已减低或是无效果。相应地，弱反应或抗性包括无反应。这并不意味着这样的人将必定对给定抗血小板剂在任何时候都从不发生反应，只是指他或她与不具有与对抗血小板剂的弱反应或抗性相关的多态性或不具有与对抗血小板剂的反应相关的多态性(在本文中被称为反应性多态性)的个体的普通人群相比，有更大的不反应的可能性。
受试者对抗血小板剂的反应可通过分析来自所述受试者的样品中选自下列的多态性的有或无来确定，所述多态性选自：编码细胞色素P450、家族3、亚家族A、多肽5(CYP3A5)的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码细胞色素P450、家族2、亚家族C、多肽19(CYP2C19)的基因中的1A/G(rs28399504)；编码细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽19(CYP2C19)的基因中的636G＞A；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与上述组中的任意一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性。
这些多态性也可将两种或更多种组合起来进行分析、或与指示受试者对抗血小板剂的反应的其它多态性组合起来进行分析，包括上述列举的其余多态性。优选地、这些多态性可与一种或多种选自下列的多态性组合起来进行分析、该多态性选自：编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码细胞色素P450、家族2、亚家族C、多肽9(CYP2C9)的基因中的42614A/C(rs1057910)；或编码细胞色素P450、家族2、亚家族B、多肽6的基因中的516G＞T(rs3745274)；
优选涉及多态性的组合的试验分析，该组合包括那些负责高通量的多态性，例如使用微阵列的多态性。
相应地、本发明在一方面提供了预测或确定受试者对抗血小板剂反应的方法，该方法包括分析来自受试者样品中选自下列的一种或多种多态性的有或无，所述多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G/A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)，其中所述多态性中的一种或多种的有或无指示受试者对抗血小板剂的反应。
所述一种或多种多态性可直接检测或通过检测与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性来检测。
连锁不平衡(LD)是两个或多个变异或多态性以共遗传的方式遗传接近的遗传现象。这意味着在基因型中、如果确定有一种多态性，则可推断有其它多态性。(Reich DE等人；Linkage disequilibrium inthe human genome，Nature 2001，411：199-204.)
所述方法还可另外包括对来自所述受试者样品有选自下列的一种或多种多态性的分析，所述多态性选自：编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；编码细胞色素P450、家族2、亚家族C、多肽9(CYP2C9)的基因中的42614A/C(rs1057910)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；
此外，一种或多种另外的多态性的检测可直接进行，或通过检测与所述一种或多种另外的多态性连锁不平衡的多态性来检测。所述有一种或多种选自下列的多态性可指示对抗血小板剂的弱反应或抗性，多态性选自：编码CYP2C19的基因中的1A＞G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C＞T(rs12248560)；编码CYP2C19的基因中的19154G＞A(rs4244285)；编码CYP2C9的基因中的42614A＞C(rs1057910)；编码NR1I2的基因中的275A＞G(rs1464602)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)。
这些SNP对药物反应的抗性的作用是累加的，因此，有两种抗性多态性指示比有一种抗性多态性更强的抗性，三种比两种更强，以此类推。在同一基因中SNP的不是累加的，假设基因功能可被一种单核苷酸多态性减弱，在同一基因中添加第二种不同的SNP不进一步减弱功能。抗性多态性的有或无可从而被并入分值，所述分值将个体基于概率规类入反应者状况。例如、在本情况中，下列基因型全部被赋于+1的抗性值(应重视的一点是，也可被赋值为负值，前体是全部抗性多态性都被赋值为负值)：
编码CYP2C19的基因中的基因型1A/G(rs28399504)GG或GA(在本文中也被称为基因型CYP2C19＊4或CYP2C19＊4携带者)；
编码CYP2C19的基因中的基因型-806C/T(rs12248560)TT或CT(在本文中也被称为基因型CYP2C19＊17或CYP2C19＊17携带者)；
编码CYP2C19的基因中的基因型636G/A(rs4986893)AA或AG(在本文中也被称为基因型CYP2C19＊3或CYP2C19＊3携带者)；
编码CYP2C19的基因中的基因型19154G/A(rs4244285)AA或GA(在本文中也被称为基因型CYP2C19＊2或CYP2C19＊2携带者)；
编码CYP2C9的基因中的基因型42614A/C(rs1057910)CC或CA(在本文中也被称为基因型CYP2C9＊3或CYP2C9＊3携带者)；
编码NR1I2的基因中的基因型275A/G(rs1464602)GG或GA；
编码CYP2B6的基因中的基因型516G＞T(rs3745274)TT或GT(在本文中也被称为基因型CYP2B6＊9)；
反应者状况可更明确如以下所述。无任何上述的基因型(在例示评分中相当于总分值0)指示受试者为反应者。有一种抗性基因型(在例示评分中相当于总分值1)指示受试者有轻度减弱的反应，而有两种抗性基因型(在例示评分中相当于总分值2)指示受试者有中度减弱的反应。有三种或四种抗性基因型(在例示评分中相当于总分值3或4)指示受试者为无反应者。
值得重视的是、这样的评分系统可用于确定对于受试者合适的治疗方案。例如，得分为0指示用例如、氯吡格雷治疗，是合适的。得分为1或2指示应考虑用更高剂量的氯吡格雷或替代性抗血小板剂如普拉格雷，而当得分≥3时指示应考虑替代性抗血小板剂、如普拉格雷。有一种或多种选自下列的多态性可指示对抗血小板剂的反应性，所述多态性选自：编码CYP2C19的基因中的1G/A(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的19154A＞G(rs4244285)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)，也被称为“CYP2C19＊3”；编码CYP2C9的基因中的42614C＞A(rs1057910)；编码NR1I2的基因中的275G＞A(rs1464602)；编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)。有编码CYP2C19的基因中的-806T＞C(rs12248560)可评分为-1。
显然地、使用上文阐述的例示评分系统，上述反应性多态性可各赋值为0值。
特别是对这些多态性的组合作用的统计学分析显示，本发明的基因分析可用于确定任意受试者对治疗方案的适合性，优选用抗血小板剂的预防性或治疗性治疗，以及尤其是识别具有对抗血小板剂的弱反应或抗性的受试者。这种组合分析可以仅仅是抗性多态性的组合，仅仅是反应性多态性的组合，或两者的组合。分析也可以是分步式的，首先进行反应性多态性的有或无的分析，随后仅在无反应性多态性时进行抗性多态性的分析。
因而，通过对本文阐述的完全确定的受试者组中的这些多态性频率的系统分析，这可能会涉及对抗血小板剂的反应中的某些基因和蛋白质，并改进确定哪些受试者对抗血小板剂持有弱反应或抗性的能力，以及来确定那些将得益于特定治疗方案的受试者。
因此，本发明的另一方面提供了根据个体的药物反应基因型个性化对个体的用一种或多种药剂(优选一种或多种抗血小板剂)的预防性或治疗性治疗的方法。
抗血小板剂
如本文使用的、术语“抗血小板剂”及其语法上等同的表述指减弱或消除血小板凝集的制剂(包括药物)、化合物、生物剂或它们的组合。
抗血小板剂有多种作用机制，血小板被数个生理激动剂激活，包括血栓烷、腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、血清素和胶原蛋白。剪应力、血流的物理性质也扮演重要角色。血小板具有引发其自身凝集的能力，主要是通过凝血酶的产生，来引发扩大反应。
尽管血小板激动剂范围很大，只有四种途径被商业药物靶向以及熟知于本专业领域；如图1所示。血栓烷途径抑制剂如阿司匹林和非甾体类抗炎症药物，P2Y12受体拮抗剂如噻吩并吡啶噻氯匹定、氯吡格雷以及普拉格雷，磷酸二酯酶抑制剂如双嘧达莫和西洛他唑，以及糖蛋白IIb/IIIa抑制剂包括阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班。
在某些实施方式中，本发明涉及的抗血小板剂是被由下列组基因中的一种或多种编码的基因产物代谢或清除的抗血小板剂，所述基因选自：CYP3A5、CYP2C19、CYP2C9、CYP2B6＊9以及NR1I2。
所述噻吩并吡啶是在体内转变为活性代谢物的前体药物，所述活性代谢物与血小板P2Y12腺苷二磷酸(ADP)受体反应并不可逆性抑制该受体，其涉及血小板凝集的血小板活化和稳定(Savi，P，HerbertJM(2005)；Sugidachi，A等人(2000)；Goto，S等人(2006)和Cattaneo，M(2003))。
例示噻吩并吡啶类包括氯吡格雷和普拉格雷。氯吡格雷(经常与阿司匹林一起被开处方)已显示对降低急性冠状动脉综合征后的主要不良心血管事件的发生率有效，并且是对患该综合征的患者的临床管理的常规组分(Steinhubl，SR等人(2002)；Yusuf，S等人(2001)；Braunwald，E等人(2002)和Smith SC，Jr等人(2006))。氯吡格雷还被开处方给皮下冠状动脉介入过程中接受冠状动脉支架的个体，来预防早期和晚期支架血栓形成。
氯吡格雷
氯吡格雷(IUPAC：2-(2-氯苯基)-2-(6，7-二氢噻吩并[3，2-c]吡啶-5(4H)-基)乙酸(+)-(S)-甲酯)，商业上为氯吡格雷硫酸氢盐、使用商品名PLAVIXTM或ISCOVERTM，是广泛地被开处方在血小板凝集相关疾病的治疗中的口服抗血小板剂。甚至，氯吡格雷据报道是世界上销量居第二的药物和销量最高的抗血小板剂。
氯吡格雷硫酸氢盐通过选择性地和不可逆地抑制腺苷二磷酸(ADP)结合到其血小板受体(P2Y12嘌呤受体)及ADP-介导的糖蛋白GPIIb/IIIa复合物的随后活化来抑制血小板凝集。由于此作用是不可逆的，血小板残余寿命受到影响。
所述药物的生物利用度大约是50％，并且药物很快地在肝脏生物转化为短效硫醇酯。所述硫醇酯是药物的活性成分。在肠吸收和肝脏中的生物转化是限速步骤，该步骤最影响所述药物的效果。P-糖蛋白药物外排泵(ref)已显示对所述药物的吸收，且肝脏生物转化依赖于细胞色素P450酶系统(CYP450)的活性。细胞色素P450酶承担生物转化的原理概述如下。由于所述药物活性取决于这些限速步骤，在给药后6小时未见到峰值效果。
所述药物的消除半衰期是7.2～7.6小时并可受减低母体药物排泄的肾脏损害的影响。在其有肾脏损害或中年以上的个体中，负荷剂量通常会被警告。
下述是FDA批准的对氯吡格雷的适应症：
急性冠状动脉综合征，非ST段抬高-血栓性疾病；预防
●急性ST段抬高心肌梗塞-血栓性疾病；预防
●动脉硬化性血管疾病-血栓性疾病；预防
●脑血管意外-血栓性疾病；预防
●心肌梗塞-血栓性疾病；预防
●外周动脉闭塞性疾病-血栓性疾病；预防
下述是目前推荐的氯吡格雷的剂量方案，但在临床实践中通常开600mg的负荷剂量的处方：
●急性冠状动脉综合征，非ST段抬高-血栓性疾病；预防：最初，一次口服300mg；及口服阿司匹林75mg～325mg
●急性冠状动脉综合征，非ST段抬高-血栓性疾病；预防：维持，一日一次口服75mg及一日一次口服阿司匹林75mg～325mg
●急性ST段抬高心肌梗塞-血栓性疾病；预防：任选口服300mg负荷剂量；一日一次口服75mg，联用阿司匹林，含或不含溶血栓剂。
●动脉硬化性血管疾病-血栓性疾病；预防：一日一次口服75mg
●脑血管意外-血栓性疾病；预防：一日一次口服75mg
●心肌梗塞-血栓性疾病；预防：一日一次口服75mg
●外周动脉闭塞性疾病-血栓性疾病；预防：一日一次口服75mg
氯吡格雷的禁忌症包括：出血、活动性(如消化道溃疡或颅内出血)、对氯吡格雷或该产品的任意成分过敏。预防用氯吡格雷是阿司匹林与氯吡格雷在患最近TIA或中风的患者中的组合使用；其已显示增加大出血，择期手术，严重肝脏疾病，由外伤、手术或其它病理学疾病(特别是胃肠道和眼内)而处于加重的出血危险的患者，在经皮冠状动脉介入(PCI)患者中治疗的过早终止；可增加支架性血栓症、心肌梗塞、以及死亡、肾脏梗塞、严重血栓性血小板减少性紫癜的危险，有时可危及生命，经支气管的肺活检；出血严重加重的危险。
普拉格雷
普拉格雷，商品名EFFIENTTM(IUPAC：5-[2-环丙基-1-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基乙酸酯)是由Daiichi Sankyo Co.开发的新的第三代噻吩并吡啶，并由Ube生产、且最近与Eli Lilly and Company合作，就计划行经皮冠状动脉介入(PCI)的急性冠状动脉综合征进行临床开发。在健康志愿者和稳定的动脉粥样硬化患者中比较普拉格雷与氯吡格雷的研究已报道，比使用经批准的氯吡格雷300mg负荷剂量/75mg维持剂量的方案治疗效果更强并可造成高水平的血小板凝集抑制(IPA)作用(Asai，F，等人(2006)；Jakubowski，JA等人(2006)；Jernberg，T等人(2006)；Matsushima，N等人(2006)和Brandt，JT，Payne，CD等人(2007))。
普拉格雷可迅速被吸收和生物转化为它的活性代谢物(R-138727)，且到达峰值效应的时间是约1小时。该结果对氯吡格雷有利、因为初始效应的时间已显示与患者管理中的临床结果相关、所述患者为患急性冠状动脉综合征，接受经皮冠状动脉介入的患者。
所述药物的消除半衰期是3.7小时，且由于其作用机理类似于氯吡格雷，即不可逆地抑制腺苷二磷酸(ADP)结合到其血小板受体(P2Y12嘌呤能受体)，作用持续时间是5～10天、其接近于血小板的寿命。
导致普拉格雷和氯吡格雷转化为它们各自的活性代谢物的推荐的路径不同。普拉格雷据报道在体内由酯酶快速水解为硫代内酯，并随后被多种CYP酶(主要是CYP3A4/5和CYP2B6，少数是由CYP2C19和CYP2C9)以单一步骤代谢为其活性代谢产物(Rehmel等人(2006))。与之相比，需要两个相继的CYP-依赖性氧化步骤来将氯吡格雷转化为其活性代谢产物。第一步是引导2-氧代-氯吡格雷的形成，其随后代谢为活性代谢产物。在竞争性代谢反应中，酯酶将氯吡格雷转化为无活性的代谢产物；该失活途径估计占氯吡格雷剂量的85％[28]。参与氯吡格雷代谢的酶包括：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5[29～31]。
普拉格雷目前不推荐用于临床应用，但已申请新药评估(NDA)。现已公布了已评估普拉格雷的安全性和功效的多个临床试验。这些试验主要是JUMBO TIMI-26、TRITON TIMI-38以及PRINCIPLE-44试验与进行中的TRILOGY-TIMI试验。JUMBO-TIMI试验发现普拉格雷与氯吡格雷相比有可比的安全性。但最近的TRITON TIMI-38试验发现普拉格雷在接受PCI的急性冠状动脉综合征人群中可减少缺血事件，其代价是增加大出血的情况。他们在PCI即后或PCI期间指定接受300mg负荷剂量的氯吡格雷；但600mg现在更常用于临床因为其可能更有效。虽然这增加了对同样剂量的疑问，血小板功能分析在PRINCIPLE-TIMI 44试验中显示，用于TRITON的普拉格雷剂量导致比更高负荷剂量和维持剂量的氯吡格雷更强的血小板抑制作用。TRITON子群分析提示，在最高风险患者(患糖尿病的患者)中，普拉格雷超过氯吡格雷有最大益处。作为选择一种可能的未来方法也许是基于血小板功能试验或药物遗传学特性的个性化抗血小板治疗。
药物遗传学试验可提供成本有效的方式即将该药给予那些将最得益的如那些抗氯吡格雷的受试者。或者，药物遗传学试验可提供对患者的安全性的改善，如采用调整的策略、全部数量的出血案例将有望减少。
其它类型抗血小板剂包括凝血酶受体拮抗剂和糖蛋白IIb/IIIa抑制剂。这些药剂也可被优选于对氯吡格雷为无反应者的个体中。凝血酶受体(也被称为蛋白酶-活化的受体-1(PAR-1))拮抗剂正计入PhaseIII试验，且在不久的将来也许能用于临床。凝血酶是最强效的血小板活化激动剂，而且目前使用阿司匹林的血小板通路阻断以及氯吡格雷持续的凝血酶产生造成对血小板的相当持续的促进作用。阻断这个特殊的血小板PAR-1受体可以完善其它凝血酶-介导的止血功能，因此从理论上出血案例将不会增加。
所述糖蛋白IIb/IIIa抑制剂被认为是最强效抗血小板剂，因为它们抑制血小板凝集的最终共同通路。但它们不改变导致高危险PCI患者的血管活性物质释放的血小板活化的上游影响。临床试验建议，糖蛋白IIb/IIIa抑制剂和P2Y12受体拮抗剂的联合治疗，与单独用其中一种药物比较，可减少preiprocedural肌坏死并提高长期的缺血性结果。
血小板功能
血小板功能试验的传统方法执行起来复杂、要求有技能和有经验的放血以及实验室人员在小心控制的条件下的操作。基于实验室的LTA公认为最为“黄金标准”，但工作密集、依赖于操作者以及昂贵，这限制了其临床使用(Harrison P(2005))。这些限制因素导致研究者使用血小板功能的替代物，包括对阿司匹林活性的生化标记物如血清或尿血栓烷B2，以及用于P2Y12受体抑制的血管扩张剂刺激的磷蛋白(VASP)(表1)(Eikelbroom JW等人(2002)和Geiger J等人(1999))。
表1.例示血小板功能分析仪和临床相关性
Figure BPA00001228313800291
血小板功能分析可根据分析方法归类。生化分析使用ELISA分析(血栓烷)或流式细胞计数(VASP)其一。非生化血小板功能分析仪通常在分离的血小板或在全血中使用光透射或电阻抗来直接检测血小板凝集(Dyszkiewicz-Korpanty AM等人(2005))。所述血小板激动剂在各个分析中可有差异，使得难于制作各分析间的比较。少数分析仪合并了增加的剪应力作为血小板刺激的非生化手段(Schlammadinger A等人(2000))。
重点照护的血小板功能装置是已简化的试验以其快速的结果可利用于临床或心脏导管实验室。三种最受普遍评价的重点照护装置是Dade-Behring的PFA-100TM，其测量高剪应力下汲取血细胞穿过小孔的血小板功能以及测量血小板栓子闭塞小孔的“闭合时间”，Accumetric的VerifyNowTM分析仪使用基于光学的、全血凝集度测定系统，而血小板强度器(TEGTM)(其对血块抗张强度的测定已被最普遍评价和使用于接受心脏手术的患者)。
PFA-100已被用于血小板功能紊乱的临床诊断(Hayward CP等人(2006))。它的试剂盒含胶原蛋白以及作为激动剂的花生四烯酸或ADP。VerifyNowTM装置有三种路径特异性的测试阿司匹林、氯吡格雷和GpIIb/IIIa抑制剂的效果的试剂盒，全部经光透射凝集度测定证实(van Werkum JW等人(2006)，Coleman JL WJ and Simon DI(2004)，Wheeler GL等人(2002))。
这些设备测试血小板活化的单一路径(Gurbel PA，Bliden KP，DiChiara J等人(2007))。对700个患者的研究发现接受阿司匹林的患者中残余的花生四烯酸-引发的血小板凝集是由于ADP-依赖的而不是环加氧酶路径(Frielinger AL等人(2006))。作者得出，如通过阿司匹林特异性重点照护的血小板功能分析仪测定的“阿司匹林抗性”，是由于方法的非特异性导致该设备的限制性或是仅仅对阿司匹林的非顺从检测(Frielinger AL等人(2006))。这个假说由最近的ASPECT研究中得到支持，即血小板功能分析仪的范围的综合评价，其得出结论，即对阿司匹林的无反应性是罕见的，被一些分析仪如PFA-100抬高，且也许关系到非COX-1路径如那些由ADP介导的(Gurbel PA，Bliden KP，Di Chiara J等人(2007))。
因此显然地存在多个对血小板功能的分析仪(包括血小板抑制)，那些方法能够快速进行、更适宜使用于本发明，且优选用于快速评定的重点照护的设备的使用。
本文涉及到血小板抑制的比例，例如10％的血小板抑制，归于由VerifyNow设备测定的血小板抑制。可见源于其它分析方法或设备的血小板抑制％可被转变为，相对表示为、或参照为所述％血小板抑制。血小板功能分析间的均等性确定方法是本专业领域技术人员所熟知的。
急性冠状动脉综合征
急性冠状动脉综合征(“ACS”)是已被不同定义的复杂的疾病。参见、例如、美国专利6706689，其中ACS指受试者其患有急性心肌梗塞(MI)，还包括不稳定性绞痛(UA)，非Q波性心坏死(NQCN)以及Q波MI(QMI)，或处于发展这些病危险。如同本文阐述的、ACS的典型表现是患者有发自心脏的急性(如、突然发作)胸部疼痛，这是新的或完全不同与已存在的、慢性的、稳定性绞痛；即，ACS胸痛更剧烈、更频繁、发生在休息时，或是发作持续时长超过15分钟。使用在美国专利6706689中公布的标准，在诊断出ACS后，患者可分类为UA、NQCN和QMI。如同本文阐述的、Q波MI通常说明是冠状动脉完全闭塞的结果，但UA是由亚完全闭塞导致的。此外如同美国专利6706689阐述的，已知帮助诊断ACS的大量临床指标，包括肌钙蛋白1水平升高，肌钙蛋白T水平升高，CK-MB水平升高，以及LDH、LDH1及LDH2水平升高。MI的新定义根据心脏心电图(ECG)ST段分析和肌钙蛋白将个体分组。因此UA、NQCN和QMI目前被认为是非ST抬高(NSTE)MI，无论ST段正常还是下降。如果在两个连续的ECG导联中的J点处ST段抬高，在导联V2-3中男性断点≥0.2mV或女性≥0.15mV，和/或在其它导联中≥0.1mV，则诊断出ST抬高MI。在MI的新的普遍定义(公布在欧洲心脏期刊2007)中，任何种类的肌钙蛋白升高都被定义为心肌坏死(即梗塞)。
局部或全身炎性过程(包括促炎细胞因子产生和释放以及包括泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞的炎性细胞的定位和活化)与动脉炎症相关，且已涉及在ACS的发病机理中(见Mulvihill NT和Foley JB，2001)，并且被确信在冠状动脉斑块破裂中发挥重要的病理生理性作用。斑块破裂可转而导致尤其是血小板凝集和血栓症。其被认为血栓症引发动脉粥样硬化、明显的不稳定性绞痛和急性心肌坏死的最为急性的并发症。
相应地，如用于本文中的ACS包括动脉炎症和ACS相关的血管功能损害，其可出现在可诊断的ACS显示前。如同本文使用的，词组“ACS相关血管功能损害”意为缺血，血管收缩，冠状动脉痉挛、侵蚀、闭塞、斑块破裂、血小板凝集损害等。尽管其或许代表ACS相关的末端血管功能损害，但血栓症本身通常被认为是ACS的证据，而不是血管功能损害。
这显示与一种或多种其它多态性连锁不平衡的与提高或降低的对抗血小板剂的反应相关的多态性也将提供作为对抗血小板剂反应的生物标记物的应用。对于连锁不平衡中的SNP的频率经常很类似。因此、这些遗传上连锁的SNP可在联合的多态性分析中使用得到可与从原发SNP计算出的风险水平比较的风险水平。
因此明晰，可例如使用公共数据库鉴定与本文所述的多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
也清楚，对任意给定的多态性通常可有各种命名法。当关系到如本文描述的抗性或反应性多态性，可代替使用的命名法也被本文考虑。通常所述可代替使用的命名法可容易通过使用独特的标识(如rs编号)查找例如Genbank数据库来识别。
多态性的鉴定和分析
由此可知，在本发明中，术语“多态性”指在同一人群中以比可归因于核苷酸序列不同或具有可变数量的重复核苷酸单位的染色体座位的两种或两种以上的交替形式(如等位基因或基因标记物)的随机突变(通常高于1％)的速度更高速度的共同发生。见于www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome/publicat/97pr/09glos s.html#p。相应地，用于本文中的术语“多态性”被考虑为基因变异，包括单个核苷酸的替换，核苷酸的插入和删除，重复序列(例如微卫星)，以及基因的全部或部分缺失(如无效突变体)。如同本文使用的，术语“多态性”还包括基因型和单体型。基因型是在特异性座位或座位集上的遗传构成。单体型是存在于一条染色体上的一组紧密连锁的不容易通过重组分离的基因标记物，趋向于共同遗传，且可连锁不平衡。单元型可由多态性的形式鉴定如SNP。类似地，本发明中的术语“单核苷酸多态性”或“SNP”包括单碱基核苷酸置换和短删除及插入多态性。
本发明方法主要针对对上述与对抗血小板剂(优选氯吡格雷)反应相关的多态性的检测和鉴定。这些多态性通常为单核苷酸多态性。一般而言，单核苷酸多态性(SNP)是导致个体间基因变异的单碱基变化或点突变。SNP在人类基因组中约每100到300个碱基发生一次，且可发生在编码或非编码区域。由于遗传密码的冗余，SNP在编码区域可以改变或不改变蛋白产物的氨基酸序列。在非编码区域，SNP可通过例如修饰控制区(如启动子、转录因子结合位点、加工位点、核糖体结合位点)来例如改变基因表达，以及影响基因转录、加工和翻译。
SNP可便利于对大规模联合遗传研究，且对SNP的探索和检测近来已被广泛关注。SNP作为对表型特征(包括潜伏期特征)数的标记物显示很好的前途，例如，疾病倾向和严重性、痊愈倾向，以及药物反应(包括、如对不良药物反应的感受性)。特定SNP与表型特征相关的知识，与个体是否含有所述特定SNP的知识相联系，能够提供诊断，预防和治疗的靶向，以期得到更好的疾病管理，加强疾病状况的了解，及最终便利于发现更有效治疗、如个性化治疗方案。
的确、多个数据库已构建了已知的SNP，以及对于一些这种SNP，构建了与SNP相关的生物作用。例如，NCBI SNP数据库“dbSNP”被并入NCBI的Entrez系统，且可使用与其它Entrez数据库(如PubMed和GenBank)相同的方式查询。这个数据库已记载了超过150万的绘制在人类基因组序列上的SNP。每个dbSNP条目包括多态性的序列背景(如附近序列)，(在人群或个体中)多态性的发生频率，以及实验方法，流程，和用于分析变异的条件，以及可包括将SNP与特定表型相结合的信息。
至少部分由于对健康和痊愈的潜在影响，本文已经在并继续大量努力，以开发可靠和快速鉴定SNP的方法。这不是一项没有意义的工作，至少部分由于人类基因组DNA的复杂性，和3×109碱基对的单倍体基因组，以及相关的灵敏性和辨别要求。
本领域熟知的检测SNP的基因分型方法包括DNA测序，要求引物或探针的等位基因特异性杂交的方法，将核苷酸等位基因特异性并入接近于或邻近所述多态性的引物的方法(经常被称为“单碱基延伸”，或“微测序”)，寡核苷酸的等位基因特异性连接(接合)(连接链反应或结合锁探针)，寡核苷酸的等位基因特异性切割，由限制性内切酶(限制性片段长度多态性分析或RFLP)或化学品或其它制剂的PCR产物，用由结构特异性酶(包括侵入性结构特异酶)作用的电泳或层析迁移法中的等位基因依赖性差别分辨，或质谱法。当SNP位于编码区，并导致氨基酸变化时，氨基酸变异的分析也是可能的。
DNA测序可直接测定和鉴定SNP。用于测序目的的特异性和精确性益处一般被全部基因组(或甚至靶向的亚基因组)测序中固有的困难所超越。
微测序涉及使引物杂交到所调查的测试样品上邻近于SNP位点的DNA序列。使用全部四种不同地标记的荧光双脱氧核苷酸(A、C、G或T)和DNA聚合酶从一个核苷酸延伸引物。只并入四种核苷酸中的一种(纯合子情况)或四种核苷酸中的两种(杂合子情况)。并入的碱基与SNP位置处的核苷酸互补。
目前用于SNP检测的大量方法包括位点特异性和/或等位基因特异性杂交。这些方法很大程度上依赖于寡核苷酸与含目的SNP的靶序列的区别杂交。Affymetrix(Santa Clara，Calif.)和Nanogen Inc.(SanDiego，Calif.)的技术尤其被熟知，且利用如下事实：含单碱基错配的DNA双链体比完全碱基配对的双链更不稳定。配对的双链体的存在可由荧光检测出。
多数用位点特异性杂交来检测或鉴定SNP的方法要求用例如PCR的方法的定向扩增来增加灵敏性和特异性(参见、例如美国专利号5,679,524，专利合作条约公开号WO 98/59066，专利合作条约公开号WO 95/12607)。美国申请号20050059030(整体并入本文)阐述了用于在总人类DNA中无需预先扩增或减小复杂性而选择性地富集靶序列；及无需任何酶反应辅助地检测单核苷酸多态性的方法。该方法利用涉及两个杂交事件的单步杂交：靶序列的第一部分与捕获探针的杂交，以及的所述靶序列的第二部分与检测探针的杂交。两个杂交事件均发生在相同的反应中，且杂交的发生顺序并不重要。
美国申请号20050042608(整体并入本文)阐述了对Thorp等人(美国专利号5,871,918)的核酸杂交的电化学检测法的改进。简单来说，捕获探针是设计好的，每个都有不同的SNP碱基，且探针序列基于SNP碱基各个位点。所述探针碱基互补于邻近SNP位点的相应靶序列。各捕获探针固定在基体的导电工作表面上具有非导电外层的不同电极上。通过利用过渡金属络合物检测各电极上的氧化还原反应来检测所述各捕获探针和核酸目标之间的杂交程度。这些在不同的电极上存在的氧化速度上的差异被用于确定被选择的核酸目标是否在被选择的SNP位点上具有单核苷酸多态性。
使用MEGATYPETM技术的Lynx Therapeutics(Hayward，Calif.)技术能同时从小的或大的遗传物质库中同时基因分型大量的SNP。这种技术使用荧光标记的探针，且比较了收集自两个人群的基因组，能够无需预先SNP定位或知识而检测和复原跨越区分所述两个人群的SNP的DNA片段。
有多个其它用于检测和鉴定SNP的方法。这些方法包括质谱法的使用，如，检测杂交于SNP上的探针。这项技术在进行速度上不同，使用质量码标签，从每天几个样品到了每天40,000个SNP的高通量。一个优选例是使用质谱法检测包含本发明的多态性的核酸序列，例如，该核酸序列包含COX2基因的启动子或其互补序列。这种质谱法被本专业人员了解，且本发明的基因型测定方法能够适用于本发明的多态性的质谱法检测，例如，本发明中的COX2启动子多态性。
SNP还可使用结合位分析来检测。该分析法要求杂交到具有引物间的一个核苷酸间隔的靶的两个引物。将四种核苷酸中的每一种添加到分开的包含DNA聚合酶，连接酶，靶DNA和引物的反应混合液中。该聚合酶将核苷酸添加到与SNP互补的第一引物的3’末端，然后该连接酶将两个邻近的引物连接到一起。加热样品时，如已发生连接，更大的引物将仍旧是杂交的，且信号(如荧光)可被检测到。对这些方法的进一步讨论可见于美国专利号5,919,626；5,945,283；5,242,794；和5,952,174。
美国专利6,821,733(整体并入本文)阐述了检测两个核酸分子序列差异的方法，该方法包括以下步骤：在允许四种方式的复合体形成和分支迁移的条件下连接两个核酸；连接四种方式的复合体与追踪分子和检测分子，条件是该检测分子有结合追踪分子或四种方式的复合体的能力；以及在接触四种方式的复合体的之前或之后确定将追踪分子与检测分子的结合。四种方式的复合体与追踪分子对结合于检测分子上的竞争指示两个核酸间的差异。
基于蛋白质和蛋白质组学的方法也适用于多态性检测和分析。通过分析蛋白可直接检测导致表达的蛋白变异或与表达的蛋白变异相关的多态性。这通常要求用例如凝胶电泳法或HPLC分离样品中的各种蛋白质，并例如用NMR或蛋白测序(如化学测序)或更普遍的质谱法鉴定所述蛋白质或从此衍生的肽。蛋白质组方法学是本专业熟知的、且在自动化上具有很大潜力。举例来说，集成系统、如来自ProteomeSystems的ProteomIQTM系统，提供用于组合样品制备，蛋白分离，图像获得和分析，蛋白加工，质谱法和生物信息学技术的蛋白质组学分析的高通量平台。
多数蛋白质鉴定的蛋白质组学方法使用质谱法，包括离子阱质谱法，液相色谱法(LC)及LC/MSn质谱法，气相色谱法(GC)质谱法，傅里叶变换-离子回旋共振-质谱法(FT-MS)，MALDI-TOF质谱法，以及ESI质谱法，和它们的衍生方法。质谱法也可用于对蛋白质翻译后修饰(如磷酸化或糖基化)的测定，以及因此具有测定多肽性的用途，该多态性导致或相关于蛋白质翻译后修饰的变异。
相关技术也是被熟知，并且包括，如蛋白加工装置，如包含压电打印技术的“化学喷墨打印机”、其通过将酶或化学品直接喷射到选定蛋白斑点上来使蛋白质样品的酶或化学消化物从2-D PAGE凝胶电印迹到膜。在蛋白质的原位消化及温育后，可将该膜直接放置入质谱仪中进行肽分析。
已开发大量依赖于核酸构象变异性的方法来检测SNP。
例如，单链构象多态性(SSCP；Orita et al.，PNAS 198986：2766-2770)是依赖于单链核酸在一定条件下在溶液中形成二级结构的能力的方法。所述二级结构取决于碱基构成，并可被单核苷酸替换而改变，导致在非变性条件下电泳迁移率的差异。通常可通过放射自显影法(当经放射性标记时)；通过条带银染；通过与可检测地标记的探针片段的杂交，或使用随后例如可用自动DNA测序仪检测的荧光PCR引物来检测各种多态性。
SSCP的修饰被本专业所熟知，且包含不同凝胶运行条件(如不同温度，或添加剂的添加，以及不同凝胶基质)的使用。SSCP上的其它改变被本专业技术人员所熟知，包括RNA-SSCP，限制性内切酶指纹分析-SSCP，双脱氧指纹分析(双脱氧测序和SSCP间的组合)，双向双脱氧指纹分析(其中双脱氧终止反应用两个反向引物同时进行)，以及荧光PCR-SSCP(其中，PCR产物用多种荧光染料内部标记，可被限制性内切酶消化，并尾随着SSCP，且由能够检测该荧光染料的自动DNA测序仪来分析)。
其它利用不同核酸结构的不同迁移率的方法包括：变性梯度凝胶电泳(DGGE)，温度梯度凝胶电泳(TGGE)，异源双链体分析(HET)。在此，双链DNA的解链变异(如，由于碱基对错配)导致电泳迁移率的变化。这些迁移率转变用于检测核苷酸变异。
变性高压液相色谱法(HPLC)是更进一步的用来检测SNP的方法，其使用本领域熟知的HPLC方法作为如上所述的分离方法的替代方法来检测，例如，以不同速度从HPLC柱洗脱下来的同源双链体和异源双链体，从而促成对错配核苷酸和这种SNP的检测。
更进一步检测SNP方法依赖于区别单链和双链核酸的感受性，以用各种制剂(包括化学裂解剂和核酸裂解酶)切割。本领域熟知例如：由RNase A切割RNA:DNA异源双链体内的错配；由例如噬菌体T4核酸内切酶YII或T7核酸内切酶I切割异源双链被；由切割酶I切割单链和双链DNA间的会合点处的发夹环的5’末端，且由通常用于Maxam-Gilbert测序化学中的化学制剂修饰异源双链内的错配核苷酸。
更多实例包括蛋白翻译测试(PTT)，用于解析由导致翻译提前终止和蛋白质产物大小减少的变异，以及错配结合蛋白的使用而产生的终止密码子。变异可由，如MutS蛋白(大肠杆菌DNA错配修复系统的成分)或人类hMSH2和GTBP蛋白与包含错配碱基的双链DNA异源双链体的结合来检测。DNA双链体随后与错配结合蛋白温育，并且变异可由迁移转变分析法来检测。例如、简单分析是基于错配结合蛋白与异源双链体蛋白的结合的事实，该结合保护了异源双链体免于被核酸外切酶降解。
本专业领域技术人员会知道，特定的SNP，尤其当它存在于基因的调控区域(如启动子)时，可与基因的表达改变有关。当SNP位于蛋白-编码基因的编码区时，例如当SNP与不同使用的密码子有关，从而与不同丰度的tRNA相关时，可导致基因的改变的表达。这种改变的表达可被本专业领域熟知的方法所确定，且可从而被用于检测这种SNP。类似地，当SNP发生在基因的编码区，且导致非同义氨基酸替换时，这种替换可导致基因产物的功能变化。类似地，如果当基因产物是RNA，这种SNP可导致RNA基因产物的功能变化。可采用任何所述功能变化(例如活性或功能测定中评估的变化)检测所述SNP。
上述检测和鉴定SNP的方法是可经检验的可用于本发明的方法。
当然，为了根据本发明检测和鉴定SNP，从受试者获得含待测试物质的样品。样品可以行活检或其它组织制备、该样品可为包含靶SNP(或靶多肽，视情况而定)并取自任何体液(血液、尿液、唾液等等)活组织或其他组织制备物中的任何样品。
DNA或RNA可根据本专业领域熟知的任意多种方法从样品中分离。例如，纯化核酸的方法描述于；Tijssen；Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology：Hybridization with nucleic acidprobes Part 1：Theory and Nucleic acid preparation，Elsevier，NewYork，N.Y.1993，以及Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.，Molecular Cloning Manual 1989。
为帮助检测多态性/SNP的有或无，可提供核酸探针和/或引物。这种探针和/或引物具有特异于染色体改变的核酸序列，从而提供多态性有或无的证据，且优选使用当与靶多态性结合时发出可检测性信号的物质来标记。
核酸探针和/或引物可以为基因组DNA或cDNA或mRNA，或任何RNA样或DNA样物质，如肽核酸，分支的DNA等。所述探针可以是正义或反义的多聚核苷酸探针。当靶多聚核苷酸是双链的，探针可以是正义链或反义链。当靶多聚核苷酸是单链时，探针则是与之互补的单链。
所述探针和/或引物可由多种的合成或酶法来制备，其均被本专业领域所熟知。所述探针和/或引物可部分或全部、使用本专业领域熟知的化学方法来合成(Caruthers et al.，Nucleic Acids Res.，Symp.Ser.，215-233(1980))。作为选择，探针可部分或全部，由酶法合成。
核苷酸类似物可使用本专业领域熟知的方法掺入探针和/或引物中。唯一要求是掺入的核苷酸类似物必须与靶多聚核苷酸序列碱基配对。例如，某些鸟嘌呤核苷酸可被次黄嘌呤替代，其与胞嘧啶残基配对。但这些碱基对不如鸟嘌呤和胞嘧啶之间的碱基配对那么稳定。作为选择，腺嘌呤核苷酸可被2，6-二氨基嘌呤替代，其可形成强于腺嘌呤和胸腺嘧啶之间的碱基配对的碱基对。
另外，所述探针和/或引物可包括已经被化学的或酶法衍生的核苷酸。通常化学修饰法包括用酰基，烷基，芳基或氨基衍生化。
这些探针可被固定于基体上。优选的基体是任何适宜的刚性或半刚性支持物，包括膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、管、平板、聚合物、微粒及毛细管。所述基体可有多种表面形式，例如孔(well)、沟、针、渠和孔(pore)，多聚核苷酸探针被固定其上。优选地，该基体是光学透明的。
此外，探针不必直接固定于基体上，而是通过连接基团固定在基体上。该连接基团通常约为6到50原子长度、以使暴露给附着的探针。优选的连接基团包括：乙二醇寡聚物，二胺，二酸等。在该基体表面上的反应性基团与连接子的末端部之一发生反应，而将连接子结合在该基体上。该连接子的另一端部随后经官能化，用于结合探针。
可通过将探针合成用制分注加到基体表面，或将预形成的DNA片段或克隆分注到基体表面来将探针连接到基体上。通常的分注器包括带有控制微量移液器相对于基体的位置的机器人系统的将溶液递送到基体的微量移液器。可有多个分注器，从而可同时将制剂递送到反应区域。
可通过本领域熟知的方法设计和合成适用于检测多态性的有或无的核酸引物。例如，适用于引物延伸和/或测序的引物可被设计为直接与比邻多态性位点的上游区域结合，因此当延伸时，即可测得多态位点处核苷酸的同一性。这种引物是能用于跨越本文阐述的基因的多态性区域的例示引物。本领域技术人员会知道，合适的引物序列可来源于多态性位点的序列上游或下游，如ENTREZ数据库条目中针对各SNP提供的(通过引用独特的标识或RS编号)。例如，本文实例中阐述的，个体的基因分型可容易使用质谱法而进行。这通常利用源于“背景序列”(参见、如、www.appliedbiosystems.com)的引物的引物延伸来进行。适用于设计适用于本发明的引物的例示背景序列包括：
ATGTGGTCCAAACAGGGAAGAGATA[T/C]TGAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAG【SEQ ID NO：1】(对于编码CYP3A5的基因中的多态性6986G/A(rs776746))；
GTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCA[A/G]TGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTGCT【SEQ ID NO：2】(对于编码CYP2C19的基因中的多态性1A/G(rs28399504))；
AAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG[C/T]ATCTCTGATGTAAGAGATAATGCGC【SEQ ID NO：3】(对于编码CYP2C19的基因中的多态性-806C/T(rs12248560))；
ACGTCTCAGGGCCTCAGCTTGACCT[A/G]TCCCCCAGGTTCAGAGTGTGGGCTG【SEQ ID NO：4】(对于编码NR1I2的基因中的多态性275A/G(rs1464602))；
TTCCCACTATCATTGATTATTTCCC[A/G]GGAACCCATAACAAATTACTTAAAA【SEQ ID NO：5】(对于编码CYP2C19的基因中的多态性19154G/A(rs4244285))；及
TGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATAC[C/A]TTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGCC【SEQ ID NO：6】(对于编码CYP2C9的基因中的多态性42614A/C(rs1057910))。
ACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG[A/G]ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGC【SEQ ID NO：7】(对于编码CYP2C19的基因中的多态性636G＞A(rs4986893))。
CACCTTCCTCTTCCA[G/T]TCCATTACCGCCAAC【SEQ IDNO：8】(对于编码CYP2B6的基因中的多态性516G＞T(rs3745274))。
例如，适用于在PCR方法或类似方法中检测编码CYP2C19的基因中的多态性636G＞A(rs4986893)的引物包括：上游引物TGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG【SEQ ID NO：9】，或下游引物ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCT【SEQ IDNO：10】。
同样，适用于在PCR或类似方法中检测编码CYP2B6的基因中的多态性rs3745274的引物包括：上游引物GGCCCTCATGGACCCCACCTTCCTCTTCCA【SEQ ID NO：11】，或下游引物TCCATTACCGCCAACATCATCTGCTCCATC【SEQ IDNO：12】。
还考虑适用于本领域熟知的其它检测方法(例如PCR、TAQMAN、RTPCR等)的引物。
优选核酸微阵列。这种微阵列(包括核酸芯片)被本专业领域所熟知(参见、例如美国专利号5,578,832；5,861,242；6,183,698；6,287,850；6,291,183；6,297,018；6,306,643；以及6,308,170，均通过引用并入本文)。本领域熟知的基因型测定平台见于美国专利号7,110,585；7354389。
选择性地，可制作抗体微阵列。这种微阵列制备基本上如Schweitzer和Kingsmore的“Measuring proteins on microarrays”，Curr Opin Biotechnol 2002；13(1)：14-9；Avseekno et al.，“Immobilization of proteins in immunochemical microarraysfabricated by electrospray deposition”，Anal Chem 200115；73(24)：6047-52；Huang，“Detection of multiple proteins in an antibody-basedprotein microarray system，Immunol Methods 20011；255(1-2)：1-13中所述。
本发明也研究了根据本发明使用的试剂盒的制备。适宜的试剂盒包括在适宜的容器和包装材料(包括管、试剂瓶，以及压缩包装和吹塑包装)内的根据本发明使用的各种试剂。
适宜包含在本发明的例示试剂盒中的物质包括下述的一种或多种：退火到位于目的基因多态性侧翼的DNA或cDNA序列区域的基因特异性PCR引物对(寡核苷酸)；无需进行PCR而能够扩增位于基因组DNA或cDNA内的特异性序列区域的制剂；区分通过PCR或非PCR扩增反应扩增的序列区域中的多种可能的等位基因中需要的试剂(如，限制性核酸内切酶，优选退火到所述多态性的一个等位基因的寡核苷酸，包括被修饰而包含放大从寡核苷酸的信号并使更确定地分辨等位基因的酶或荧光化学基的寡核苷酸)；物理分离源于多种等位基因的产物中需要的试剂(如用于电泳的琼脂糖或聚丙烯酰胺和缓冲液，HPLC柱，SSCP凝胶，甲酰胺凝胶或MALDI-TOF的基质支持物)。
需知，本发明的方法可与对已知相关于受试者对抗血小板剂的可能的反应的其它非遗传因素的分析结合进行。这种因子包括相关于对抗血小板剂的弱反应或抗性的流行病风险因素。这种风险因素包括，但不限于：吸烟和/或暴露于烟雾中，年龄，性别和家族病史。当评估受试者对抗血小板剂的反应时，这些风险因素可用于加强对一种或多种本文阐述的多态性的分析。
人们认识到个体的SNP可赋予对目标疾病或表型的感受性或保护性的微弱危险。这些来自个体SNP的适度作用通常以1～3的顺序测量为优势率。所述目的表型可以是一种疾病，例如血小板凝集相关疾病或症状，或是损害性药物反应，或是基于病理、生化或生理性异常(例如，变异的ADP受体)的中间表型。如同本文阐述的，可组合超过一种的反应性或限制性多态性的作用来更精确地预测或确定受试者对抗血小板剂的反应，或他们对治疗方案的适合性。
除基于组合的遗传分值鉴定反应性个体或非反应性个体外，还可能将人群分为确定的适于接受介入的子群。这种介入可以是诊断性介入，如成像试验，其它筛查或诊断试验(如基于生化或RNA的试验)，或可以是治疗性介入，如化学预防或化学治疗，或预防性生活方式改变(如戒烟或加强锻炼)。在确定这种临床阈值中，人们可以最小化成本或最小化介入的风险的方式优先进行特定的介入(例如，基于图像的筛查或昂贵的预防性治疗的成本或药物副作用危险或放射性暴露危险)。在确定这个阈值中，可针对最大化检测多数情况的试验能力(最大化灵敏性)，但又使需要且合格于目的介入的处于低危险的人数最小化。
受试者工作曲线(ROC)分析法通过检验给定人群中对单个变量的灵敏性和假阳性率(如，1-特异性)之间的关系来分析试验的临床表现。在ROC分析中，试验变量可来源于多个因素的组合。本文提供了用于分析联合的遗传得分的ROC分析法。
相应地，本发明也提供了评估受试者对针对与血小板凝集相关的疾病和症状的诊断性或治疗性介入的适合性的方法，该方法包括：
(a)提供来自受试者样品的一种或多种基因测试的结果，和
(b)分析所述结果中一种或多种反应性多态性的有或无、或者一种或多种抗性多态性的有或无，
其中所述反应性或抗性多态性选自：编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；编码CYP3A5的基因中的31611T/C；编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或与所述多态性中的任意一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性；
其中有一种或多种反应性多态性指示受试者对所述介入的适合性，且其中无一种或多种反应性多态性，或者有一种或多种抗性多态性指示受试者对所述介入的不适合性。
所述介入可以是对疾病的诊断性试验，如血液测试或对ACS的CT扫描。作为另外一种选择，所述介入可以是对疾病的治疗，例如化学疗法或放射疗法，包括对疾病的预防性治疗，如提供动因而使受试者停止吸烟。
还考虑了本发明方法在本文阐述的电脑系统和程序中执行，这种方法产生的数据，且这种数据在预测和确定受试者对抗血小板剂的反应中，或确定受试者对血小板凝集相关疾病或症状的诊断性或治疗性介入的适合性或不适合性中的用途。
如同本文使用的，词组“评估受试者对介入的适合性”或其语法上等同的表述的含义为对给定的受试者是或应该为介入的候选者或者不是或不应该为介入的候选者的一种或多种测定。优选地，该评估涉及测定受试者的与本文阐述的SNP分值分布相关的SNP分值。
本文中的术语“介入”包括医学性的试验、分析和治疗，包括诊断性、治疗性以及预防性治疗；以及心理性或精神性的试验、分析和治疗，包括咨询等。
计算机相关的实施方式
值得重视的是，本发明的方法顺应与计算机系统、软件和程序一起使用并由计算机系统、软件和程序分析结果。鉴定和分析基因多态性的计算机系统、软件和程序被本专业领域所熟知。类似地，还考虑了在计算机系统、软件和程序中执行用于产生本文阐述的SNP分值的算法。例如，可使用计算机系统分析本文阐述的一种或多种基因分析的结果，及通过所述系统利用本文阐述的分析法的计算机可执行例子进行处理。
所述SNP和被用于本发明的SNP的分析结果均可“提供”在便利其使用的多种介质中。如同使用于本章节的，“提供”指制品、而非分离的核酸分子、其包括本发明的SNP信息。这种制品以允许本领域技术人员使用不直接可应用于检查SNP或其子集的手段检查制品的形式(如它们以天然或纯化形式存在)提供SNP信息。可以这种形式提供的SNP信息包括本发明提供的任何SNP信息，例如，多态性核酸和/或氨基酸序列信息，关于检测到的SNP等位基因的信息，备选密码子，人群，等位基因频率，SNP类型，和/或受到影响的蛋白，鉴定为反应性SNP或抗性SNP，加权(例如用于本文阐述的联合分析)，或本发明提供的任何其它信息。
在本实施方式的一个应用中，所述SNP和本发明中利用的SNP的分析结果可被记录于计算机可读取媒介。本文中的“计算机可读取媒介”指任何可被计算机直接读取和访问的媒介。这种媒介包括，但不限于：磁性存储介质、如软盘，硬盘存储介质，及磁带；光学存储介质如CD-ROM；电存储介质如RAM和ROM；以及这些种类的组合类型如磁性/光学存储介质。本专业技术人员易于了解任何目前已知的计算机可读取媒介可被用于构建制品、该制品含记录有本发明的SNP信息的计算机可读取媒介。本应用提供一种所述媒介，即本应用包含具有用于分析本发明中利用的SNP的核酸序列的计算机可读取媒介(软盘)、其上以ASCII文本格式提供/记录序列表及随附的含详细SNP和序列信息的表格。
作为本文使用的，“记录的”指在计算机可读取媒介上存储信息的过程。本专业技术人员可易于采用任何目前已知的用于在计算机可读取媒介上记录信息的方法来产生包含本发明的SNP信息的制品。
多种数据存储结构可被本专业技术人员用于构建记录有本发明的SNP信息的计算机可读取媒介。所述数据存储结构的选择通常基于所选访问存储的数据的方法。另外，多种数据处理程序和格式可被用于在计算机可读取媒介上存储本发明的SNP信息。例如，序列信息可在文字处理文本文件中显示，取商业可得到的软件格式，如WordPerfect以及Microsoft Word，在ASCII文件形式显示，或存储于数据库应用如OB2、Sybase、Oracle等中。本领域技术人员可易于采用任何数量的数据处理器构建格式(如文本文件或数据库)来获得记录有本发明的SNP信息的计算机可读取媒介。
通过提供计算机可读取形式的SNP和/或利用于本发明的SNP分析结果，本领域技术人员可常规地访问用于多种目的的SNP信息。计算机软件公众可获得，这使得本专业技术人员得以访问计算机可读取媒介中提供的序列信息。公众可获得计算机软件的例子包括BLAST(Altschul et at，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))以及BLAZE(Brutlag et at，Comp.Chem.17：203-207(1993))搜索算法。
本发明更提供了系统，尤其是基于计算机的系统，其包含本文阐述的SNP信息。这种系统可被设计来存储和/或分析如多个SNP位置的信息、或来自多个个体的SNP基因型信息。本发明的SNP信息代表有价值的信息源。在基于计算机的系统中存储/分析的本发明的SNP信息可应用于：例如预测受试者对抗血小板剂的可能反应；除了计算机密集型应用外，例如确定或分析人群中的SNP等位基因频率、疾病基因定位、基因型-表型相关研究、将SNP归组到单体型，将SNP单体型与对特定药物的反应相关联，或各种其它生物信息学、药物基因组学、药物开发、或人类鉴定/法医学应用。
本文中的“基于计算机的系统”指用于分析本发明的SNP信息的硬件、软件以及数据存储器。本发明的基于计算机的系统的最小硬件通常包含：中央处理器(CPU)，输入端，输出端，以及数据存储器。本专业领域技术人员可容易认识到，任何一种目前可用的基于计算机的系统适合用于本发明。这种系统可使用SNP信息来使其改变为本发明的系统，如附加软盘提供，或其中一个子集，无需任何实验方法。
如同以上所述，本发明的基于计算机的系统包括：含有内部存储有SNP信息的数据存储器、该SNP信息例如SNP和/或本发明中利用的SNP分析的结果，以及用于支持和执行一个或多个程序或算法的必需的硬件和软件。本文中的“数据存储器”指可存储本发明的SNP信息的存储器，或可访问已记录有本发明SNP信息的产品的存储访问设备。
一个或多个程序或算法在基于计算机的系统上执行来鉴定或分析存储于数据存储器中的SNP信息。例如，这种程序或算法可被用于确定哪个核苷酸在靶序列中的特定SNP位置上，来分析本文阐述的SNP的基因分析结果，或来获取本文阐述的SNP分值。本文中“靶序列”可以是包含待分析、搜索或查询的SNP位置的任意DNA序列。
用于输入和输出的多种结构格式可被用于输入和输出在本发明的基于计算机的系统中的信息。用于输出的例示格式是描绘SNP信息的显示，例如在所关注的特定SNP位置上的特定核苷酸(等位基因)的有或无。所述展示可同时提供针对多个SNP或受试者的快速、二进制的评分系统。值得重视的是，这种输出可被远程访问，例如通过LAN或互联网。通常，给定的SNP信息的性质种类，这种输出或计算机系统本身的这种远程访问只能由经验证的使用者可用，从而维护所述SNP信息和/或计算机系统的安全性。控制计算机系统和其中的数据的访问的方法被本专业领域所熟知，且顺应于本发明的实施方式。
可被用于实施本发明的包含本发明的SNP信息的基于计算机的系统的例示实施方式包括与总线连接的处理器。还连接于总线是主存储器(优选实施为随机访问存储器，RAM)以及多种次级存储装置(如硬盘驱动器和可移动媒介存储设备)。所述可移动媒介存储设备可代表，例如软盘驱动、CD-ROM驱动，磁带驱动等。可将包括控制逻辑和/或记录的数据的可移动存储媒介(如软盘、光盘、磁带等)嵌入到可移动媒介存储装置中。所述计算机系统包括适当的软件、用于一旦嵌入于所述可移动媒介存储装置中，即可从可移动存储媒介中读取控制逻辑和/或数据。本发明的SNP信息可以熟知的方式被存储在主存储器，任意次级存储设备和/或可移动存储媒介中。用于访问和处理SNP信息的软件(如SNP评分工具、搜索工具、比较工具等)优选在执行期间位于主存储器中。
相应地，本发明提供了发明、该发明提供了用于确定受试者对抗血小板剂的反应的系统，所述系统包括：
●计算机处理器设备，其用于接收、处理和通信数据；
●存储设备，其用于存储数据，所述数据包括：
■至少一种基因分析的结果的参照基因数据库，所述基因分析
◆关于对抗血小板剂的反应，或
◆关于与血小板凝集相关的疾病或症状，和
■任选的与血小板凝集相关的疾病或病症的非基因危险因素的参照非基因数据库；和
●计算机程序，其被嵌入所述计算机处理器，一旦接收由基因分析的结果组成或包括基因分析的结果的数据，由于所述数据被包括在被接受的所述参照基因数据库中，所述计算机程序处理所述参照数据库情景中的所述数据，以作为结果确定所述受试者对抗血小板剂的反应，一旦知道所述结果，可优选将所述结果通信给已输入所述数据的使用者。
本发明进一步提供了用于本文描述的计算机系统的计算机程序，以及这种系统和程序的结果在预测和确定受试者对抗血小板剂反应、或在确定受试者对本文阐述的治疗方案或介入的适合性中的用途。
本发明的预测方法给予多个治疗性介入和/或治疗方案来评估适合性以及实施于给定受试者中。其中最简单的可被提供给有诱因的受试者来进行生活方式的改变，例如，受试者目前是吸烟者，本发明方法可提供诱因来戒烟。
所述治疗性介入或治疗的方法将被所述多态性及所述多态性的生物学影响的特性所预测。例如，当抗性多态性相关于基因表达的变化时，介入或治疗可通过例如给予能够调整所述基因的表达的药剂导致所述基因的正常表达的恢复。当多态性相关于基因的表达下调，疗法可涉及给予能够增加所述基因的表达的药剂，相反地，当多态性相关于基因表达升高，疗法可涉及给予能减少所述基因表达的药剂。可用于调节基因表达的方法被本专业领域所熟知。如，当多态性与基因的表达上调相关的状况下，可实施利用例如RNAi或反义方法学的疗法来降低mRNA的丰度，并从而减少所述基因的表达。可选择地，疗法可包括针对例如调节所述基因产物活性，从而补偿所述基因的异常表达的方法。
当抗性多态性相关于基因产物功能的减低或基因产物的表达水平降低，治疗性介入或治疗可涉及提高或更替所述功能，或通过给予所述基因产物或其功能类似物来增补在所述受试者中的基因产物的量。例如，当多态性相关于酶作用的降低时，疗法可涉及给予受试者有活性的酶或酶类似物。类似地，当多态性相关于基因产物功能加强，治疗性介入或治疗可涉及降低所述功能，例如，通过给予所述基因产物的抑制剂或能够降低所述受试者中基因表达水平的药剂。例如，当SNP等位基因或基因型相关于酶功能加强，疗法可涉及给予受试者酶抑制剂。
同样地，当反应性多态性相关于特定基因或者酶或其它蛋白质的表达上调，疗法可被定向为模拟这种在缺乏抗性基因型的个体中的上调或表达，和/或将这种酶或其它蛋白质递送到这种个体，进一步地，当反应性多态性相关于特定基因的下调，或是相关于酶或其它蛋白质的表达减少或消除，可取的疗法可针对在缺少所述反应性基因型的个体中模拟这种状况。
在优选的实施方式中，治疗性介入可以是将一种抗血小板剂替换为另一种，如将普拉格雷替换为氯吡格雷，或剂量方案的修改，例如增加或减少剂量，包括增加或减少负荷或维持剂量。
上述鉴定的多种多态性和所述受试者对抗血小板剂的反应性之间的关系，或受试者对血小板凝集相关疾病或病症的感受性(或其它方面)也应用于候选疗法的设计和/或筛选。当抗性多态性之间的关系被基因的上调或下调表达显示时尤其如此。在这个例子中，候选疗法对这种上调或下调的作用可易于检测到。
例如，在一个实施方式中，目前的人类血管器官和细胞培养如上述阐述进行SNP基因型筛选。(人类血管器官和细胞培养的信息，参见：Clare Wise ED.，Epithelial Cell Culture Protocols，2002，ISBN0896038939，Humana Press Inc.NJ；Endothelial Cell Culture，RoyBicknell，ED.，1996，ISBN 0521550246，Cambridge University Press，UK；Cell Culture Models of Biological Barriers，Claus-Michael Lehr，ED.，2002，ISBN 0415277248，Taylor and Francis，UK；each of whichis hereby incorporated by reference in its entirety.)选择代表相关基因型组的培养物，及当多态性存在时上调或下调的基因的表达推定为“正常”的培养物。
将所述培养物样品暴露于候选治疗化合物库，并就下列(a)、(b)进行筛选：(a)在抗性基因型中通常下调的基因的下调；或(b)在抗性基因型中通常上调的基因的上调。就改变具有抗性基因型的培养物中的基因的调控和/或活性的能力选择化合物。
类似地，当多态性是当存在时导致表达的基因产物的生理学活性浓度对于受试者(调整年龄和性别的)中超出正常范围的多态性时，以及当有可用的预防性或治疗性方法来修复表达的基因产物水平使之在正常范围内时，个体受试者可被筛选来确定他们得益于康复方法的可能性。这种筛选涉及在受试者中用任意本文阐述的方法来确定所述多态性的有或无，且这些有所述多态性的受试者被鉴定为可能得益于治疗的个体。
本发明将参考以下非限制性实施例来进一步详细阐述。
实施例
实施例1：氯吡格雷反应的药物基因组学分析
引言
本实施例阐述了随机的、安慰剂对照试验来比较分次剂量1,200mg氯吡格雷负荷剂量与标准600mg氯吡格雷的效果，并测定疑似影响对氯吡格雷的反应的基因型的药物基因组学分析。
方法
患者
本研究协议经新西兰的北部地区伦理委员会批准。合适的患者是被明确为其作为选择性经皮冠状动脉介入的既往服用阿司匹林但未用过氯吡格雷的新接受者。排除标准是；出血或血小板异常，既往消化道出血史或在过去6个月内曾患胃溃疡/十二指肠溃疡/胃炎，对阿司匹林/氯吡格雷/维拉帕米敏感/过敏，肾衰(肌酐清除率eGFR＜30ml/分钟)，贫血Hb＜115mg/dL，血小板减少抑制CYP3A4的用药。服用华法林的患者中如其在研究登记中INR＜1.5可被包括，并且华法林在氯吡格雷疗程的持续时间中被抑制。
接受选择性皮下冠状动脉介入、参加随机PRINC试验的60个患者使用VerifyNow P2Y12分析仪进行了血小板功能测试。使用1200mg分次剂量比使用标准600mg氯吡格雷负荷剂量；使用150mg的日维持剂量比使用75mg的日维持剂量，具有更强的血小板抑制作用。
随机化及用药
患者被使用计算机随机数产生器随机地加入相应的组。未使用块随机，解释向治疗配置的不平衡分组。将氯吡格雷断裂为一半并重新包装入明胶胶囊，并与乳糖粉一起包装用作安慰剂。使调查者和受试者看不到治疗配置情况。120个患者的目标被预定义为完成研究。患者随机地在2×2阶乘设计中以1∶1接受处于基线的5mg动脉内维拉帕米或安慰剂，并在从基线2小时，以1∶1接受安慰剂或600mg氯吡格雷(图1)。所有受试者在PCI期间在施用维拉帕米后十分钟时接受了600mg氯吡格雷。出院患者随机接受一日一次75mg或150mg持续一周，并在此后固定使用75mg一天一次的剂量。对所述治疗规则的遵守使用电话访问和药片计数来检查。
研究设计
2×2阶乘，随机的，安慰剂对照的，双盲法研究。
血液采集
使用20G针头和注射器，经6Fr股骨鞘采集动脉血，并立即转移到2ml、3.2％柠檬酸盐的vacutainer管中(Cat.#454321 Greiner
Figure BPA00001228313800511
，Greiner，Kremsmuenster，Austria)。将鞘除去后，通过静脉穿刺将血直接放入vacutainer管中。收集后，将管倒转4次以充分混匀抗凝剂，并于测试前放置24度10分钟。从第一次给予氯吡格雷的起点、2小时、4小时和7小时及给药7天时测试血小板功能。
血小板功能分析
血小板功能使用重点照护设备、VerifyNow快速血小板功能分析仪(RPFA)和它相应的P2Y12盒(Accumetrics Ltd，San Diego，CA，U.S.A)来检测。该设备使用涂有纤维蛋白原的微珠，腺苷二磷酸(ADP)激动剂以及光透射通过全血，来检测血小板凝集。该设备的输出以专用血小板反应单元(PRU)计。该P2Y12盒的结果有利关联于光透射集合度测定，(van Werkum等人)该结果被报告在加入前列腺素E2到反应室所致的对P2Y12受体灵敏性增加(Serebruany VL等人(2005))。抑制百分比被报道自使用BASE单元的起点的比例改变。该BASE单元来自使用激动剂异TRAP(凝血酶受体活化肽)的与ADP通路并行的第二通路。从这一点，“抑制百分比”会反映这个公式：％抑制剂＝[(BASE-PRU)×100]/BASE。
氯吡格雷非反应性
已被提议的“抗性”的最佳定义是在抗血小板剂的靶通路中的残余治疗后活性。对氯吡格雷的1非反应性定义为在7小时后的最大抑制性＜10％，以及从使用PRU绝对值的起点其抑制性有＜10％的改变(Lau WC等人(2004)和Lev EI等人(2006))..
终点
一级终点是在2、4、7小时和7天时的RPFA值，并且7小时值被考虑为最大峰值效果。
次级终点是4小时时的血浆本体药物水平，7小时的肌钙蛋白和肌酸激酶以及包括股骨血肿、假性动脉瘤、其它出血事件及不良药物反应的安全性结果。通过进一步的post-hoc分析来确定对药物反应的预测性。实施受试者工作特征(ROC)分析来调查是否在2小时发生血小板抑制来预测在7小时和7天的氯吡格雷的非反应性。
药物遗传学分析
使用
Figure BPA00001228313800521
DNA血液小型试剂盒(Cat.#51104.QIAGENN.V.，荷兰)从全血提取DNA，并储存于-20摄氏度。使用
Figure BPA00001228313800522
ND-1000分光光度计(NanoDrop科技公司，威尔明顿，特拉华州，美国)评估DNA产量和品质。使用经确认的
Figure BPA00001228313800523
检验系统(应用生物系统公司，福斯特市，CA94404，美国)进行ABCB1＊2单体型(ABCB1 SNP 1236C＞T，2677G＞T＞A和3435C＞T)；CYP3A4＊1B、＊3、＊4；CYP3A5＊2＊3＞＞＊4；CYP2C9＊1、＊2、＊3和CYP2C19＊2＊3＊17的基因型分析。在
Figure BPA00001228313800531
Autoflex Mass分光光度计和三星24针纳米分注器(John Hopkins Court，圣地亚哥，加州，美国)上使用
Figure BPA00001228313800532
测定进行了P2Y12H2单体型，孕烷X受体4760G＞A，252A＞G，275A＞G和羧酸酯酶内含子SNP(IVS10-88)的基因型分析。使用
Figure BPA00001228313800533
Mass分光光度计的基因型分析在澳大利亚基因组研究设备(昆士兰大学，St Lucia QLD4072，澳大利亚)上进行。该方法的呼叫率(call rate)是96.4％，但
Figure BPA00001228313800534
的是100％。ABCB13435C＞T SNP使用两种方法检测，且两种结果间的一致性达到100％。所述SNP的相关的参考序列号和功能性影响列示于表2。
用于基因型比较的对药物反应所关注的重要时间点确定为首次负荷剂量(这一时间点上所有患者只接受了600mg)后的2小时。该时间间隔也被认为该期间对氯吡格雷效果的评估是最显著的如增长率在该时间段的药效学影响为最强并可能被限速步骤强烈影响。4小时时评估基因型组中不同剂量对反应的影响。
统计学分析
统计学功效
使用通过高剂量氯吡格雷实现的血小板抑制的数计算达到统计学功效所需的数。受试者工作特征曲线被用于分析相比7小时的2小时的血小板抑制百分比预测值。Wilcoxon秩和检验用于非参数数据而Kruskal Wallis试验用于当多于三个组群被分析时。ANOVA被用于分析各基因型间在单个基因上的差异，而ANCOVA用于评估遗传药理学对比药物剂量对血小板抑制中的变化的影响。未使用对多假设试验的统计学调整。用于分析的所述软件为SAS institute(9.1版本)和R(2.1.1版本)
结果
血小板抑制
所述600mg负荷剂量和1,200mg分次负荷剂量之间，在4小时的血小板抑制上的差异显著(23.7％和42％，p＝0.03)。该差异被持续到7小时(28.7％和48.9％，p＝0.03)时但未见于7天时(35.7％和44.5％，p＝0.43)。在一周时的血小板抑制上的显著差异见于接受75mg氯吡格雷一日一次的组和150mg一日一次的组之间(28.8％对比49.8％，p＝0.01)。
预测用表型的反应
实施受试者操作者特征分析，以调查是否2小时时的早期测试可预测晚些时候对氯吡格雷的反应。在2小时的血小板抑制显著地预测了7小时时氯吡格雷的抗性(P＝0.02)。1,200mg剂量组中的非反应者少于600mg组；在高剂量组的37人中有2人(5％)对比低剂量组的26人中有6人(26％)的7小时抑制百分比＜10％。这些ROC曲线的AUC是0.90。2小时的少于2％的血小板抑制在对7小时(灵敏性100％，及特异性88％)、无关剂量的全部患者中非反应者(抑制＜10％)的预测中最为有效(图1)。
预测用基因型的反应
所测基因型的频率与被报道人群的频率列于表3。
CYP2C19多态性
CYP2C19＊2，＊4(功能丧失携带者)和＊17(强代谢者)携带者(13+/-20％)与CYP2C19＊1＊1(功能正常)携带者(26+/-20％，p＝0.02)相比，在600mg剂量后的2小时的血小板抑制被降低(图2)。CYP2C19＊1＊1携带者在4小时时给予1200mg和600mg负荷剂量后(51+/-28％和35+/-27％，p＝0.2)(图3)以及给予150mg和75mg的日维持剂量后(51+/-25％和40+/-18％，p＝0.3)(图5)表现出类似的血小板抑制。相反，在给予更高负荷剂量的(36+/-24％和16+/-13％，p＝0.008)(图4)，以及维持剂量方案(49+/-31％和24+/-18％，p＝0.02)(图6)的CYP2C19＊2或＊4携带者中，其血小板的抑制增强。
CYP2C19＊17纯合体存在于研究组的频率比在普通人群中被预期的频率更高。其中有16(27％)CYP2C19＊17(T等位基因)杂合体和4(7％)＊17纯合体。这些受试者鉴定他们自身为欧洲人后裔。这些基因型在所述Hapmap数据库(CEU)中的频率分别为0.4和0.02。
CYP2C9多态性
CYP2C9＊1＊1携带者在对氯吡格雷的早期反应上与＊1＊2携带者相比有减少(对于2小时抑制P＝0.04，通过ANOVA比较)。但该倾向贯穿该时间间隔并未保持一致。4小时和7小时的血小板抑制在给药600mg的组中的＊1＊3携带者中也有减少(p＝0.06)。
2C19和2C9多态性的组合效果
所有个体基于他们作为反应者(CYP2C19＊1＊1，CYP2C9＊1或CYPC19＊2携带者)或弱反应者(2C19＊2，CYPC19＊4，CYPC19＊17或CYPC192C9＊3)的CYP2C19和2C9基因型状态总计。尽管所述氯吡格雷的剂量方案不同，7小时的血小板抑制均被弱反应者基因型显著影响(p＝0.03，Wilcoxon，见于图7)。两个个体同时携带2C19和2C9弱反应者基因型。7小时血小板抑制在这些个体中为8％和11％。ANCOVA被用于比较在7小时对氯吡格雷剂量的遗传学对血小板抑制的影响。F值对于剂量为7.19(p＝0.0096)而对于遗传为6.54(p＝0.013)，提示药物基因组学对最大血小板抑制中观察到的变化的影响与氯吡格雷剂量的影响具有可比性。
CYP3A5多态性
＊1＊1功能性纯合体在所有时间间隔具有对氯吡格雷的降低的反应，但该组的数量不足以确定该观察数据的统计学意义。
P-糖蛋白(ABCB1)多态性
所述ABCB1＊2的单体型不常见(n＝6)，且显示出2小时的抑制性降低的倾向，但这没有统计学意义，且这个单体型在任何其它时段均不显示对氯吡格雷的药效学反应的影响。
P2Y12H2单体型
由插入物SNPi-T744C指示的具有P2Y12H2单体型的纯合体在人群中很罕见。两个受试者为CC纯合体。高PRU值指示这些个体不显示高于血小板凝集平均起点值，但给予600mg氯吡格雷后2小时的血小板抑制在所有个体均＜2％。
NR1I2(hPXR)
如先前阐述过的孕烷X受体SNP的252A＞G，275A＞G显示处于完全LD。4760G＞A紧密连锁，但不在7个个体中。G等位基因的携带者在2小时显示较低血小板抑制(p＜0.01，Kruskal Wallis)。该趋势在晚些时段及维持剂量中保持恒定。
基因型的累积效果
影响对氯吡格雷反应的4种基因型被记分为：无是0及有是+1。当单独测试时，这些基因型中的两种在氯吡格雷的抗血小板效果上的影响未达到无统计学意义。但是，当凝集时，无、有一种、两种、三种或四种下述基因型与2小时时对氯吡格雷反应之间有清楚的剂量反应关系(图8)：
编码CYP2C19的基因中的基因型1A/G(rs28399504)GG或GA(本文中也被称为基因型CYP2C19＊4或CYP2C19＊4携带者)；或
编码CYP2C19的基因中的基因型19154G/A(rs4244285)AA或GA(本文中也被称为基因型CYP2C19＊2或CYP2C19＊2携带者)；
编码CYP2C9的基因中的基因型42614A/C(rs1057910)CC或CA(本文中也被称为基因型CYP2C9＊3或CYP2C9＊3携带者)；
编码NR1I2的基因中的基因型275A/G(rs1464602)GG或GA。
讨论
该结果显示以上所述1,200mg的分次负荷剂量和150mg的维持剂量与标准剂量方案相比有更强的抗血小板效果。进一步来说，这些结果显示，除CYP2C19＊2基因型之外，功能丧失CYP2C19＊4基因型和超代谢者CYP2C19＊17基因型在对氯吡格雷反应的影响中是非常重要的。任何这些基因型的携带者显示在负荷剂量后对氯吡格雷的早期反应减少，及一周的维持治疗后的维持反应。
CYP2C19被报道对药物本体到其活性代谢产物的第一步生物转变过程是非常重要的，且该酶系统的功能丧失据报道可导致血浆活性代谢物水平的下降(Brant JT等人)。如同本文显示的，CYP2C19＊17超代谢者也呈现对药物的药效学反应降低，提示其活性代谢物也可被作为CYP2C19的底物。
值得关注的是，研究者发现使用增加的1,200mg的分次剂量超过2小时可导致在＊2和＊4携带者中的血小板抑制强于有功能的＊1野生型携带者。这一点得到在更高维持剂量组中观察到的结果的支持。但与Fontana等人的近来观察到的研究数据相反。显然，该研究只关注于基于VASP血小板功能测试被认为弱反应者中的剂量-基因型相互作用的效果(Fontana P，Senouf D等人(2007))。
四个出版物报道了CYP2C19在氯吡格雷代谢中的重要性(Brandt，Close SL等人(2007)，Hulot JS等人(2006)，FontanaP，Senouf D等人(2007)，和Fontana P，Hulot JS等人(2007))。第一个研究报道了CYP2C19＊2杂合体者经7天的每日75mg的氯吡格雷治疗后在血小板功能上无显著改变。在该研究中，血小板功能使用10μmol/L ADP光透射凝集度测定与血管扩张剂刺激的磷酸化(VASP)来共同测定(Hulot JS等人(2006))。第二个研究重复了在给予300mg负荷剂量和一周的75mg氯吡格雷的维持剂量的正常受试者人群中的发现。血小板抑制在负荷剂量后7天经20μmol/L ADP凝集度测定来测量，据报道在携带CYP2C19＊2等位基因的受试者中显著少(Fontana P，Hulot JS等人(2007))。第三个是来自Eli Lilly实验室的研究，其报道了不仅CYP2C19＊2等位基因，还有CYP2C9＊11(＊2/＊2，＊2/＊3)也对氯吡格雷的反应有影响。CYP2C9和2C19变异型是非连锁不平衡的，但当其被一并考虑时其据报道有66.7％的弱反应者，定义为对20μmol/L ADP凝集度检测有少于20％的血小板活性抑制。
上述结果支持了对抗血小板(且尤其是氯吡格雷)治疗的药物基因组学方法。例如，2C19＊2功能丧失基因型是普遍的，且以12.7％的白种人、18.2％的非洲裔美国人及28.9％的东亚人的频率存在于普通人群中(Luo HR等人(2006))。该变异型对基于人种的个体性治疗具有直接关联，而且将问题带入基于单人种(例如COMMIT/CCS-2)的更大的研究应用中(Chen ZM等人(2005))。例如，COMMIT/CCS-2可低估在STEMI背景的氯吡格雷的效果或与之相反地低估出血危险。另外，竞争性代谢或抑制CYP2C19活性的药物可具有降低氯吡格雷活性的潜力。这些药物包括奥美拉唑，苯妥英和SSRI(如氟西汀)。奥美拉唑已被报道与氯吡格雷负性相互作用(Fontana P，Senouf D等人(2007)；Gilard M，Arnaud B，Le GalG等人(2006))。20名受试者在该研究中给予奥美拉唑，但在任何患者组中均未发现对血小板功能的影响。
本研究指出个体性治疗方案，靶向这些基因型的携带者，在弱反应性受试者中可提供与野生型携带者相比更为强大的药效学反应。
一个上述方案可解释普拉格雷的益处超过氯吡格雷的观点。普拉格雷据报道有提高的药代动力学。它可被酯酶快速水解，并随后被CYP途径代谢为它的活性代谢物，其不像氯吡格雷一样依赖于CYP2C19和2C9。这可解释减小的个体间变异和在接受该药的受试者中非反应者被报道的频率更低(Brandt JT，Close SL等人(2007))。值得重视的是，尽管普拉格雷有更多可取的药代动力学，但该药的使用也许并不被适用于所有个体。靶向携带弱反应基因变体(CYP2C19或2C9变体)的受试者的个性化治疗可更有效，并且比“万用型剂量”法更成本有效。
表2.氯吡格雷反应相关的候选SNP
Figure BPA00001228313800591
表3.相比Hapmap数据库的可检测的等位基因的频率
Figure BPA00001228313800601
工业实用性
本发明涉及用于预测或确定受试者对抗血小板剂反应的方法，以及用于确定受试者对治疗方案或介入的适合性的方法。本方法包含对本文显示的与对抗血小板剂的反应相关的多态性的分析，或对由上述分析得到的结果的分析。本文显示的与对抗血小板剂的反应相关的多态性在评估受试者对治疗方案或介入的适合性上的用途也被提供，如适用于该评估的核苷酸探针和引物，试剂盒及微阵列。对所述受试者的治疗方法也被提供，所述受试者具有本文阐述的多态性。用于筛选组合物的方法也被提供，该组合物能够调节与本文阐述的多态性相关基因的表达。
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所述已被采用的术语和表达是用于描述的术语且无限定性，并且在这种术语和表达的使用上没有意图排除任何所显示和描述的相当的特征或它的部分特征，但这意味着多种修改在本发明如权利要求的范围内是可能的。因此，将可以了解虽然本发明已被特定地由优选实施方式和选择性特征所表明，本文表明的概念的修改和变化可诉诸于那些本专业领域的技术，并且这种修改和变化可被理解为在本发明范围之内。
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Figure IPA00001228313200011
Figure IPA00001228313200021
Figure IPA00001228313200031

Claims (20)

1.预测或确定受试者对抗血小板剂的反应的方法，所述方法包括：分析自所述受试者的样品中选自下列的一种或多种多态性的有或无：
●编码细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽5(CYP3A5)的基因中的6986G/A(rs776746)；
●编码CYP3A5的基因中的31611T/C；
●编码细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽19(CYP2C19)的基因中的1A/G(rs28399504)；
●编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；
●编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；
●编码核受体亚家族1，组I，成员2(NR1I2)的基因中的275A/G(rs1464602)；或
●与所述另外的多态性中的一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性，
其中所述多态性中的一种或多种的有或无指示所述受试者对抗血小板剂的反应。
2.权利要求1的方法，还包括分析自所述受试者的样品中有选自下列的一种或多种另外的多态性：
●编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；
●编码细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽9(CYP2C9)的基因中的42614A/C(rs1057910)；
●编码细胞色素P450，家族2，亚家族B，多肽6(CYP2B6)的基因中的516G＞T(rs3745274)；或
●与所述另外的多态性中的一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述抗血小板剂是氯吡格雷。
4.预测或确定受试者对氯吡格雷的反应的方法，所述方法包括：
●提供自所述受试者的样品的一种或多种基因测试的结果，及
●分析所述结果中选自下列的一种或多种多态性的有或无：
■编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；
■编码CYP3A5的基因中的31611T/C；
■编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；
■编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；
■编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；
■编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或
■与这些多态性中的任一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性；
其中指示所述多态性中的一种或多种的有或无的结果指示所述受试者对氯吡格雷的反应性。
5.评估受试者对与血小板凝集相关的疾病的诊断性或治疗性介入的适合性的方法，所述方法包括：
(a)提供自所述受试者的样品的一种或多种基因测试的结果，及
(b)分析所述结果中一种或多种反应性多态性的有或无、或者一种或多种抗性多态性的有或无，
其中所述反应性或抗性多态性选自：
●编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；
●编码CYP3A5的基因中的31611T/C；
●编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；
●编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；
●编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；
●编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或
●与所述多态性中的任一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性；
其中有一种或多种抗性多态性指示所述受试者对所述介入的适合性或不适合性。
6.权利要求5的方法，其中有一种或多种多态性指示所述受试者对用氯吡格雷治疗的不适合性和对用普拉格雷治疗的适合性。
7.权利要求5的方法，其中所述介入是对与血小板凝集相关的疾病或病症的治疗。
8.权利要求5的方法，其中所述与血小板凝集相关的疾病或病症，冠状动脉疾病、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、包括症状性动脉粥样硬化在内的动脉粥样硬化、脑血管疾病、或血栓栓塞。
9.权利要求5的方法，包括对选自下列的一种或多种额外的反应性或抗性多态性的有或无的分析：
●编码CYP2C19的基因中的19154G/A(rs4244285)；
●编码CYP2C9的基因中的42614A/C(rs1057910)；
●编码CYP2B6的基因中的516G＞T(rs3745274)；或
●与这些多态性中的任一种或多种连锁不平衡的一种或多种多态性。
10.评估受试者对与血小板凝集相关的疾病的治疗性介入的适合性方法，所述方法包括：
(a)提供自所述受试者的样品中血小板抑制的一种或多种测试的结果；及
(b)分析所述结果；
其中指示小于约10％血小板抑制的结果指示所述受试者对所述介入的适合性或不适合性。
11.权利要求10的方法，其中所述治疗性介入是用氯吡格雷治疗。
12.权利要求11的方法，其中药物给予后至少2小时时小于约5％血小板抑制的结果指示所述受试者对高剂量氯吡格雷治疗方案的适合性，所述高剂量氯吡格雷治疗方案包括以下列剂量给予氯吡格雷：
●2个600mg剂量的重复负荷剂量，及
●约150mg的日维持剂量。
13.治疗受试者的与血小板凝集相关的疾病的方法，所述方法包括：
(a)在首个治疗日给予所述受试者负荷剂量的氯吡格雷，所述负荷剂量在从600mg以上至约1800mg的范围内，假设以600mg的重复负荷剂量给予；
(b)在随后每个治疗日给予所述受试者维持剂量的氯吡格雷，所述维持剂量在从50mg以上至约200mg的范围内。
14.治疗受试者的与血小板凝集相关的疾病的方法，所述方法包括：
(a)在首个治疗日给予所述受试者第一负荷剂量的氯吡格雷，所述第一负荷剂量在从300mg以上至约900mg的范围内；
(b)在首个治疗日给予所述受试者第二负荷剂量的氯吡格雷，所述第二负荷剂量在从300mg以上至约900mg的范围内；
(c)在随后每个治疗日给予所述受试者维持剂量的氯吡格雷，所述维持剂量在从50mg以上至约200mg的范围内；
其中所述第二负荷剂量在所述第一负荷剂量后至少约30分钟时给予。
15.权利要求14的方法，其中所述第二负荷剂量在所述第一负荷剂量后约2小时时给予。
16.产品，其含：
●含氯吡格雷的多个剂型、和
●将氯吡格雷给予患与血小板凝集相关的疾病的患者的产品说明，
其中所述产品说明提供以下列剂量给予氯吡格雷：
●在首个治疗日以约1200mg的负荷剂量，之后
●在随后每个治疗日以约150mg的维持剂量。
17.权利要求16的产品，其中所述产品说明提供：
●在首个治疗日以约600mg的第一负荷剂量给予氯吡格雷，及
●在所述第一负荷剂量后至少约30分钟时以约600mg的第二负荷剂量给予氯吡格雷，及
●在随后每个治疗日以约150mg的维持剂量给予氯吡格雷。
18.确定受试者对抗血小板剂的反应的系统，所述系统含：
●计算机处理器设备，其用于接收、处理和通信数据；
●存储设备，其用于存储数据，所述数据包括：
■至少一种基因分析的结果的参照基因数据库，所述基因分析
◆关于对抗血小板剂的反应，或
◆关于与血小板凝集相关的疾病或病症，和
■任选的与血小板凝集相关的疾病或病症的非基因危险因素的参照非基因数据库；和
●计算机程序，其被嵌入所述计算机处理器，一旦接收由基因分析的结果组成或包括基因分析的结果的数据，由于所述数据被包括在所述参照基因数据库中，所述计算机程序处理所述参照数据库情景中的所述数据，以作为结果确定所述受试者对抗血小板剂的反应，一旦知道所述结果，可优选将所述结果通信给已输入所述数据的使用者。
19.权利要求18的系统，所述至少一种基因分析是分析选自下列的一种或多种多态性：
●编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；
●编码CYP3A5的基因中的31611T/C；
●编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；
●编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；
●编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；
●编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或
●与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性。
20.评估受试者对抗血小板剂的反应的试剂盒，所述试剂盒含：
●设备，其分析自所述受试者的样品中选自下列的一种或多种多态性的有或无：
■编码CYP3A5的基因中的6986G/A(rs776746)；
■编码CYP3A5的基因中的31611T/C；
■编码CYP2C19的基因中的1A/G(rs28399504)；
■编码CYP2C19的基因中的636G＞A(rs4986893)；
■编码CYP2C19的基因中的-806C/T(rs12248560)；
■编码NR1I2的基因中的275A/G(rs1464602)；或
■与所述一种或多种多态性连锁不平衡的一种或多种多态性，及
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