CN109055553A - 用于检测rs4244285的引物探针组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测rs4244285的引物探针组及其应用。本发明首先保护一种引物探针组，由引物MF、引物WF、引物R和探针P组成；引物MF为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物WF为序列表的序列2所示的单链DNA分子；引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，DNA分子的核苷酸序列为序列表的序列4所示。本发明可用于检测rs4244285，判断待测样本基于该位点的基因型，从而指导用药，具有重大的应用推广价值。

Description

用于检测rs4244285的引物探针组及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测rs4244285的引物探针组及其应用。
背景技术
细胞色素P450（Cytochrome P450或CYP450,简称CYP450）代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。细胞色素P450酶系统可缩写为CYP，其中家族以阿拉伯数字表示，亚家族以大写英文字母表示，酶个体以阿拉伯数字表示，如CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4等。人类肝细胞色素P450酶系中至少有9种P450与药物代谢相关。
肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素P450是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，可以使人产生血药浓度的显著个体差异。
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，在肝脏中有很多表达。CYP2C19基因位于人类10号染色体上,cDNA全长1940bp,共编码490个氨基酸。CYP2C19具有很多SNP位点，至少存在14种突变基因和18种等位基因突变，主要包括CYP2C19*1，CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1。CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上，其编码的酶无活性。CYP2C19*2是由于第5位外显子第681位碱基发生G→A突变,形成一个异常剪切位点,使得在转录时第5位外显子起始端丢失40个碱基对(643-682bp)，从而在核糖体翻译时丢失了第215-227位氨基酸,导致第215位氨基酸起始阅读框架发生移动,由此在第215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生1个终止密码子,使得蛋白合成过早被终止,导致这一截短的含234个氨基酸的蛋白质丧失了催化活性。由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为30%。
根据CYP2C19基因基因型,人群中对药物氧化代谢能力可分为2种表型,一种为强代谢者(extensive metabolizer,EM),另一种为弱代谢者(poor metabolizer,PM)。正常人群对某一类药物的代谢一般表现为强代谢,弱代谢则主要是由于2个等位基因的突变和(或)缺失引起的表型改变。由于不同个体存在药物代谢方面的差异,因而给药后可能会出现严重的毒副作用或药物剂量不足,从而导致治疗的失败。CYP2C19主要参与代谢的药物谱也较为广泛,其大致有质子泵抑制剂、三环类抗抑郁药、抗癫痫药、抗精神病药、降糖药、抗凝药、抗疟疾药以及一些抗癌药物等。
CYP2C19的遗传多态性影响着许多临床药物的代谢,其活性存在明显的个体差异,对不同个体的药物治疗作用和不良反应及药物的毒性具有重要影响。据统计，CYP2C19*2和CYP2C19*3两个突变位点能解释几乎100%的东亚人和85%的高加索人种的相关弱代谢遗传缺陷，CYP2C19*2和CYP2C19*3在亚洲发生突变的频率较高,在中国人群中约占30%,与药物代谢关系最为密切。
加强对CYP2CI9基因多态性的研究，有助于提高对个体肿瘤易感性的预测水平,预防和减少肿瘤的发生。通过对CYP2C19酶研究的不断深入，了解更多药物受CYP2CI9酶基因多态性的影响及药物之间的相互作用，明确CYP2CI9酶与肿瘤等疾病发生的相关性，对指导临床合理用药，提高肿瘤等疾病的预测水平有重要意义。故进一步开展CYP2C19酶的相关研究有重要的临床价值和实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测rs4244285的引物探针组及其应用。
本发明首先保护一种引物探针组，由引物MF、引物WF、引物R和探针P组成；
引物MF为如下（a1）或（a2）：
（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；
（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
引物WF为如下（b1）或（b2）：
（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；
（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
引物R为如下（c1）或（c2）：
（c1）序列表的序列3所示的单链DNA分子；
（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，DNA分子的核苷酸序列为如下（d1）或（d2）：
（d1）序列表的序列4所示；
（d2）将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
探针P为5’末端具有FAM荧光基团且3’末端具有BHQ1荧光淬灭基团的单链DNA分子。
具体来说，所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
所述引物探针组中，引物MF、引物WF、引物R、探针P的摩尔配比为：10：10：2.5：7.5。
本发明还保护所述引物探针组在制备用于检测rs4244285的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种用于检测rs4244285的试剂盒，包括所述引物探针组。
本发明还保护组件甲和组件乙在制备用于检测rs4244285的试剂盒中的应用；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2 g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7 g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。
本发明还保护一种用于检测rs4244285的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2 g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7 g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。
本发明还保护一种试剂盒，包括裂解液。所述试剂盒的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。所述裂解液为1.5-2 g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7 g/100ml的NaCl水溶液。所述试剂盒还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。
本发明还保护一种用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，包括如下步骤：
（1）取抗凝血，加入所述裂解液，颠倒混匀，离心弃上清；
（2）完成步骤（1）后，加入所述保存液，先60-70℃（具体可为65℃）水浴，再80-90℃（具体可为85℃）水浴，然后离心，使用时取上清，即为模板样本。
所述用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，具体包括如下步骤：
（1）取65μL EDTA抗凝血，加入500μL所述裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清；
（2）完成步骤（1）后，加入120μL所述保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm 离心4min，然后置于4℃保存备用，使用时取上清，即为模板样本。
本发明还保护特异探针在进行荧光定量PCR检测中的应用；所述特异探针为Taqman荧光探针。
以上任一所述rs4244285为人基因组DNA中序列表的序列5所示核苷酸的第24位核苷酸。
以上任一所述rs4244285为人基因组中的CYP2C19基因中序列表的序列5所示核苷酸的第24位核苷酸。
本发明旨在检测CYP2C19基因中最主要的单核苷酸多态性位点的基因分型，判定患者的药物代谢速率类型，从而帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，并降低毒副作用。
本发明提供的引物探针组，采用Taqman荧光探针。Taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。本发明采用的是FAM荧光基团。
本发明提供的引物探针组的使用方法：用血液样本制备模板样本，然后采用引物探针组进行不平衡的荧光定量PCR扩增，利用ARMS-PCR突变扩增技术，通过观察熔解曲线判断基因型。不平衡扩增：加入过量的与探针反向的引物，少量的与探针同向的引物，以及适量的探针P，经过扩增后，由于一侧引物过量存在，其参与扩增得到的模板链远远多于与另一侧引物扩增得到的链，多余的模板链未形成双链，在体系中单独存在。ARMS-PCR突变扩增技术：(amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification，ASA),其基本原理是如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸DNA链。因此根据已知点突变设计2条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。本发明基本构思是设计2个引物MF与WF，使之与另一引物R构成PCR反应体系。这2个引物3’端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻。如果待测样本为野生型，则WF与R参与扩增反应；如果待测样本为突变型，则MF与R参与扩增反应，如果待测样本为杂合型，则WF与MF均参与扩增反应。
本发明提供的用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，操作简便，其产物可以实现作为模板进行有效的荧光定量PCR扩增。
本发明提供的用于荧光定量PCR检测的特异Taqman探针，在PCR扩增完成后，进行熔解曲线反应。熔解曲线反应阶段开始温度较低，探针与扩增得到的核酸链完全结合。此时探针荧光基团与淬灭基团相隔较远，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，荧光信号被仪器检测到。待温度升高到Tm值，探针与核酸链解离，其荧光基团与淬灭基团相互靠近，荧光基团的荧光信号部分被淬灭基团吸收，造成荧光信号降低。此阶段的荧光信号改变被仪器检测到，经数据处理后形成荧光曲线改变峰值图谱。根据峰值对应的Tm值，可以判定样本的SNP分型。野生型在WF对应的Tm值处有一高峰；突变型在MF对应的Tm值处有一高峰；杂合型在WF与MF对应的Tm值处有两个高峰。通过数据分析得到荧光曲线改变对应的峰值图谱可以很好地区分野生型和突变型。另外，对于杂合型样本，在熔解曲线的峰值图谱中会出现两个峰值，避免了一般PCR两次扩增确定结果的繁琐。
本发明可用于检测rs4244285，判断待测样本基于该位点的基因型，从而指导用药，具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为示例性样本的熔解曲线（GG纯合型）。
图2为示例性样本的熔解曲线（AA纯合型）。
图3为示例性样本的熔解曲线（GA杂合型）。
图4为示例性样本的熔解曲线（GG纯合型）。
图5为示例性样本的熔解曲线（AA纯合型）。
图6为示例性样本的熔解曲线（GA杂合型）。
图7为示例性样本的熔解曲线（GG纯合型）。
图8为示例性样本的熔解曲线（AA纯合型）。
图9为示例性样本的熔解曲线（GA杂合型）。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，引物、探针以及靶序列中的各个核苷酸均为常规意义上的核苷酸。
实施例1、用于检测rs4244285的引物探针组的设计
经过大量设计、预实验、效果比较，获得一组用于检测rs4244285的引物探针组。
引物MF：5'- CCCACTATCATTGATTATTTCACA-3'；
引物WF：5'- CCACTATCATTGATTATTTCTCG-3'；
引物R：5'- CGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTC-3'；
探针P：5'-FAM- AGTAATTTGTTATGGGTTCCCGA-BHQ1-3'。
引物MF为序列表的序列1所示的单链DNA分子。引物WF为序列表的序列2所示的单链DNA分子。引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。探针P为5’末端具有FAM荧光基团且3’末端具有BHQ1荧光淬灭基团的单链DNA分子，DNA分子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
引物MF、引物WF和引物R的靶序列如序列表的序列5所示。
实施例2、用于检测rs4244285的引物探针组的应用
一、血液样本处理（单个血液样本的处理方法）
1、取65μL EDTA抗凝血，加入500μL裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清。
裂解液为：1.7g/100ml NaCl水溶液。
2、完成步骤1后，加入120μL保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm 离心4min，然后置于4℃保存备用，使用时取上清，即为模板样本。
保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。
FG缓冲液：血液基因组DNA提取系统（0.1-20ml）(DP319)试剂盒内的Buffer FG。蛋白酶K溶液：血液基因组DNA提取系统（0.1-20ml）(DP319)试剂盒内的Proteinase K，浓度为20mg/ml。血液基因组DNA提取系统（0.1-20ml）(DP319)的厂家为天根生化科技（北京）有限公司。
二、PCR的扩增及荧光信号的采集
1、取EP管，加入各个组分，制备反应体系。
反应体系：7.5μL 2×Reaction Buffer、0.12μL Taq DNA聚合酶溶液（含0.6U TaqDNA聚合酶）、0.09μL dNTP溶液（dNTP溶液中含有dATP、dCTP和dGTP，dATP、dCTP和dGTP在dNTP溶液中的浓度均为33mmol/L）、0.06μL dUTP溶液（dUTP溶液中，dUTP的浓度为100mmol/L）、0.06μL UDG酶溶液（含0.12U UDG酶）、3μL 5×PCR Enhancer、0.3μL引物MF溶液、0.3μL引物WF溶液、0.3μL引物R溶液、0.3μL探针P溶液、1μL步骤一得到的模板样本，加入ddH2O至15μL。反应体系中，引物MF的浓度为10μM，引物WF的浓度为10μM，引物R的浓度为2.5μM，探针P的浓度为7.5μM。
2×Reaction Buffer：菲鹏生物股份有限公司。Taq DNA聚合酶溶液即AnstartTaqDNA Polymerase, 5U/μL，菲鹏生物股份有限公司。UDG酶溶液即Uracil-DNA Glycosylase，2U/μL，菲鹏生物股份有限公司。5×PCR Enhancer：天根生化科技有限公司，货号RP202。
2、取完成步骤1的EP管，加入25μL石蜡。
3、取完成步骤2的EP管，进行荧光定量PCR。
①50℃ 2min、95℃ 10min；
②95℃ 15s、55℃ 15s、72℃ 20s，50个循环；
③95℃ 5min、20℃ 5min；45℃ 1s、然后从45℃开始以0.3℃为间隔升温直至75℃（每个温度采集荧光，获得熔解曲线）、然后75℃ 15s。
如果熔解曲线中显示为单峰，且峰值对应的Tm值为59.70℃-60.60℃，样本基于rs4244285的基因型为GG纯合型。
如果熔解曲线中显示为单峰，且峰值对应的Tm值为52.42℃-53.60℃，样本基于rs4244285的基因型为AA纯合型。
如果熔解曲线中显示为双峰，且两个峰的峰值分别对应59.70℃-60.60℃和52.42℃-53.60℃，样本基于rs4244285的基因型为GA杂合型。
对500位知情同意的志愿者采集EDTA抗凝血，然后按照上述步骤进行检测，220位志愿者的基因型为GG纯合型、25位志愿者的基因型为AA纯合型、255位志愿者的基因型为GA杂合型。提取EDTA抗凝血的基因组DNA并进行测序验证，测序结果表明，上述步骤鉴定的准确率为100%。
500位知情同意的志愿者采集EDTA抗凝血中，3个示例性样本的结果见图1、图2和图3。图1中示例性样本的熔解曲线中显示为单峰，峰值对应的Tm值为60.05℃，该志愿者的基因型为GG纯合型。图2中示例性样本的熔解曲线中显示为单峰，峰值对应的Tm值为52.58℃，该志愿者的基因型为AA纯合型。图3中示例性样本的熔解曲线中显示为双峰，峰值对应的Tm值分别为52.85℃和60.27℃，该志愿者的基因型为GA杂合型。
对比例1、
一、血液样本处理
同实施例2的步骤一。
二、PCR的扩增及荧光信号的采集
1、取EP管，加入各个组分，制备反应体系。
用探针DP代替探针P，其他同实施例2的步骤二的1。
探针DP：5'-FAM-AGTAATTTGTTATGGGTT-BHQ1-3'。
2、取完成步骤1的EP管，加入25μL石蜡。
3、取完成步骤2的EP管，进行荧光定量PCR。
反应程序同实施例2的步骤一的3。
对实施例2中的500份EDTA抗凝血，然后按照上述步骤进行检测。
各个基因型的样本均无有效峰显示。
3个示例性样本的结果见图4（GG纯合型）、图5（AA纯合型）和图6（GA杂合型）。
对比例2、
一、血液样本处理
同实施例2的步骤一。
二、PCR的扩增及荧光信号的采集
1、取EP管，加入各个组分，制备反应体系。
用引物DWF代替引物WF，用引物DMF代替引物MF，并且用引物DR代替引物R，其他同实施例2的步骤二的1。
DWF：5'-TAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG-3'；
DMF: 5'-TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA-3'；
DR：5'-CTTGGTGTTCTTTTACTTTCTC-3'。
2、取完成步骤1的EP管，加入25μL石蜡。
3、取完成步骤2的EP管，进行荧光定量PCR。
反应程序同实施例2的步骤一的3。
对实施例2中的500份EDTA抗凝血，然后按照上述步骤进行检测。
各个基因型的样本均无有效峰显示。
3个示例性样本的结果见图7（GG纯合型）、图8（AA纯合型）和图9（GA杂合型）。
序列表
<110> 山东德诺生物科技有限公司
<120> 用于检测rs4244285的引物探针组及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccactatca ttgattattt caca 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccactatcat tgattatttc tcg 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgattcttgg tgttctttta ctttctc 27
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtaatttgt tatgggttcc cga 23
<210> 5
<211> 105
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)
<223> v= a or g
<400> 5
cccactatca ttgattattt cccvggaacc cataacaaat tacttaaaaa ccttgctttt 60
atggaaagtg atattttgga gaaagtaaaa gaacaccaag aatcg 105

Claims (10)

1.引物探针组，由引物MF、引物WF、引物R和探针P组成；
引物MF为如下（a1）或（a2）：
（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；
（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
引物WF为如下（b1）或（b2）：
（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；
（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
引物R为如下（c1）或（c2）：
（c1）序列表的序列3所示的单链DNA分子；
（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，DNA分子的核苷酸序列为如下（d1）或（d2）：
（d1）序列表的序列4所示；
（d2）将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.权利要求1或2所述引物探针组在制备用于检测rs4244285的试剂盒中的应用。
4.一种用于检测rs4244285的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物探针组。
5.组件甲和组件乙在制备用于检测rs4244285的试剂盒中的应用；组件甲为权利要求1或2所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。
6.一种用于检测rs4244285的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲为权利要求1或2所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。
7.一种用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的试剂盒，包括裂解液；所述裂解液为所述裂解液为1.5-2 g/100ml的NaCl水溶液。
8.一种用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，包括如下步骤：
（1）取抗凝血，加入权利要求7中所述的裂解液，颠倒混匀，离心弃上清；
（2）完成步骤（1）后，加入保存液，先60-70℃水浴，再80-90℃水浴，然后离心，使用时取上清，即为模板样本。
9.特异探针在进行荧光定量PCR检测中的应用；所述特异探针为Taqman探针。
10.一种用于荧光定量PCR检测的特异探针，为Taqman探针。
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