CN117305460A - 一种用于人类ugt1a1联合基因位点分型的arms引物探针组合物、试剂盒及其应用和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物、试剂盒以及方法，其中，所述用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物在高抗干扰特性的Taq酶和配套缓冲体系的作用下，基于实时荧光定量PCR检测技术，实现了在一个反应体系内特异性扩增*6(c.211G>A)、*28(c.‑54_‑53ins AT)、*93(c.862‑9898G>A)和*80(c.‑364C>T)4个靶标基因和1个内标基因，其检测位点选择合理、覆盖全面，检测分辨率高、通量高、大大降低了成本。而基于上述ARMS引物探针组合物进一步开发的试剂盒，其能够有效解决现有技术中的缺陷，同时，该试剂盒能够给出罕见基因型样本检测结果准确性的提示，进一步确保用药指导的科学性。

Description

一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合 物、试剂盒及其应用和检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物、试剂盒及其应用和检测方法。

背景技术

伊立替康(Irinotecan，CPT-11)是一种水溶性喜树碱类似物，本质上是一种DNA拓扑异构酶Ι抑制剂，通过与DNA和拓扑异构酶Ι的结合，形成稳定复合物，阻碍DNA单链断裂后的修复，抑制DNA复制，引发肿瘤细胞死亡。目前，已经成为国内外治疗结直肠癌的有效药物之一。然而，其临床应用受到不良反应的限制，且个体差异明显，迟发性腹泻和中性粒细胞减少是常见的由伊立替康引起的不良反应，临床发生率分别为46％和30％，严重时可导致患者死亡。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酰转移酶(UGTs)是一大类能催化葡糖醛酸与亲核底物结合的膜结合酶，主要存在于肝脏和肝外组织内质网，UGT分为两个家族，已经发现有17种人类的基因编码不同序列的UGT，酶的表达具有明显的组织特异性，主要在肝脏中表达，其他组织包括脑、肾、胃肠道等。国内外相关研究表明，伊立替康的毒性与其代谢的关键酶尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT1A1)的基因多态性密切相关。UDP-葡萄糖醛基转移酶1A1(简称UGT1A1)，参与多种物质的葡萄糖醛基化，这一结合反应的目的在于增加底物的水溶性，增加从胆汁和尿液中的排泄量，达到物质代谢、解毒的目的，UGT1A1基因有30多个等位基因，其中一些SNP可影响酶的功能和分步。

UGT1A1常见的功能性单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点包括了UGT1A1*6、UGT1A1*28、UGT1A1*93。例如，文献号为CN101671740B的中国发明专利公开的一种UGT1A1基因多态性检测液相芯片和使用该液相芯片的检测方法，该液相芯片通过检测UGT1A1*28基因型、UGT1A1*93基因型以及UGT1A1*93基因型的变异，可实现高通量快速简便化操作，有效提高了检测效率。同时，文献号为CN101506362B的中国发明专利公开一种UGT1A1基因扩增用引物对、含有其的UGT1A1基因扩增用试剂及其用途，该专利通过同时检测UGT1A1*6，UGT1A1*27，UGT1A1*28三个位点的基因型，以准确药物副作用的发生。但上述文献资料以及现有技术产品均仅能同时检测2～3个基因检测位点，并且在基因型选择上存在欠缺，检测过程繁琐，周期长。

综上所述，开发一种能够快速检测多个基因突变位点的检测试剂盒，提供一种操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的检测方案是很有必要的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物、试剂盒及其应用和检测方法，以解决现有技术问题存在的不足。

为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：

首先，本发明提供一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，该ARMS引物探针组合物包括特异性引物组合和/或特异性探针组合，其中，所述特异性引物组合包括：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的特异性引物对；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的特异性引物对；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的特异性引物对；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性引物对；

所述特异性探针组合包括：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的探针；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的探针；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的探针；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性探针。

进一步地，所述特异性引物组合包括：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的特异性引物对，包括：反向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

正向共用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的特异性引物对，包括：

正向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

正向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

反向共用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的特异性引物对，包括：

正向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

正向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

反向共用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性引物对，包括：

正向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

正向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

反向共用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

进一步地，所述特异性探针组合包括：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：15所示；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

第二方面，本发明还提供一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面提供的ARMS引物探针组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括用于对人基因组DNA内标基因进行检测的通用引物和/或通用探针。

进一步地，所述人基因组DNA内标基因为RPPH基因。

优选地，所述通用引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；所述通用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

进一步地，所述引物探针组合物中的特异性探针和/或通用探针的5’端用FAM、TEXAS RED、HEX、Alexa Fluor 680荧光染料中的任意一种进行标记；所述引物探针组合物中的特异性探针和/或通用探针的3’端用BHQ1或BHQ3荧光染料中的任意一种进行标记。

优选地，所述试剂盒还包括Taq酶、Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTPs；

优选地，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液包括SDS、甲酰胺、HCl中的任意一种；

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，优选地，所述阳性对照为含所有目标基因靶序列多态性位点的DNA重组质粒，所述目标基因为UGT1A1*6基因、UGT1A1*28基因、UGT1A1*93基因以及UGT1A1*80基因；优选地，所述阴性对照为生理盐水。

第三方面，本发明还提供一种上述第一方面提供的用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物、或上述第二方面提供的用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒在基因分型检测方面的应用，所述应用以非诊断或非治疗为目的。

第四方面，本发明还提供一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的检测方法，具体包括步骤：

释放待测样本的基因组DNA；

使用上述第一方面提供的用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物扩增所述基因组DNA中的目标基因，所述目标基因为UGT1A1*6基因、UGT1A1*28基因、UGT1A1*93基因以及UGT1A1*80基因；

PCR结果判断。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

首先，本发明提供的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，该ARMS引物探针组合物在高抗干扰特性的Taq酶和配套缓冲体系的作用下，基于实时荧光定量PCR检测技术，实现了在一个反应体系特异性扩增*6(c.211G>A)、*28(c.-54_-53insAT)、*93(c.862-9898G>A)和*80(c.-364C>T)4个靶标基因和1个内标基因，其检测位点覆盖全面，检测分辨率高、通量高、大大降低了成本。

同时，基于上述用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，本发明还进一步提供了用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，该试剂盒能够同时对*93、*28、*93以及*80位点进行检测，由于*28位点为TA重复序列的特殊突变，且基于*28和*80位点间的突变存在高度连锁效应，当试剂盒检测结果显示*28和*80的基因型不一致时，则该样本可能存在UGT1A1野生型启动子区域5TA或8TA罕见突变，因此可提醒试验人员对具有罕见基因型的检测样本进行进一步检测，核实最终的检测结果，确保正确的用药指导。

此外，本发明上述用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒支持血液直扩，该试剂盒中的样本稀释液配合缓冲液，在抗干扰的Taq DNA聚合酶催化下，协同实现不受血液中干扰成分对PCR扩增的抑制，直接对血液样本进行扩增，免除了提取样本DNA的步骤，提高了检测效率，且体系更加稳定，抗干扰能力强，简单易于操作、便于自动化。最后，本发明的检测技术方法相对于市面上其他检测方法极大降低了操作强度，可实现1小时左右出结果，为伊立替康药物的使用提供了更完善的个性化用药参考，使患者受益。

附图说明

图1A为利用本发明的试剂盒对待测样本一进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测反应体系1所获得的结果示意图；

图1B为利用本发明的试剂盒对待测样本一进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测反应体系2所获得的结果示意图；

图2A为利用本发明的试剂盒对待测样本二进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测反应体系1所获得的结果示意图；

图2B为利用本发明的试剂盒对待测样本二进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测反应体系2所获得的结果示意图；

图3A为利用本发明的试剂盒对待测样本三进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测反应体系1所获得的结果示意图；

图3B为利用本发明的试剂盒对待测样本三进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测反应体系2所获得的结果示意图；

图4A-B为本试剂盒对已知浓度和基因型的待测样本的灵敏度检测结果示意图；

图5为利用本发明的试剂盒检测具有罕见基因型TA5/TA7样本的检测结果和基因测序检测结果对比示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

需要特别说明的是，若本发明中出现术语“大约”、“大体”，表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。

实施例1

本实施例提供一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，该引物探针组合物包括特异性引物组合，该特异性引物组合包括：

针对UGT1A1*6(c.211G>A)、UGT1A1*28(c.-54_-53ins AT)、UGT1A1*93(c.862-9898G>A)和UGT1A1*80(c.-364C>T)4个SNP位点采用突变扩增阻滞系统(amplificationrefractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法进行检测，其基本原理为：如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。

为了适应待测样本的多样性，协调扩增效率、改进扩增曲线形态、便于仪器判读，本发明在研发阶段设计一系列引物及探针，具体的，根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的UGT1A1基因的参考序列(NG_002601.2)以及dbSNP数据库公开的*6位点(G/A)多态性(SNPID：rs4148323)、*28位点(TA插入突变)多态性(SNP ID：rs3064744)、*93位点(G>A)多态性(SNP ID：rs10929302)、*80位点(C>T)多态性(SNP ID：rs887829)的信息，采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测UGT1A1基因*6位点、*28位点、*93位点和*80位点多态性的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内标引物与探针，本发明选取人基因组RPPH基因的一段序列(其GeneBank参考序列编号为：NG_009291.1)。经PCR条件及体系优化，最终筛选到一组特异性最强、扩增效率最优的引物和探针，优选的引物组如表1所示。

表1.特异性引物探针序列表

此外，在本实施例中，荧光探针采用Taqman荧光探针，序列5’端有报告基团，3’端有淬灭基团，其中，*6(c.211G>A)位点检测的探针5’端采用FAM荧光染料标记，3’端采用BHQ1荧光染料标记；*28(c.-54_-53ins AT)位点检测的探针5’端采用Texas Red荧光染料标记，3’端采用BHQ1荧光染料标记；*93(c.862-9898G>A)位点检测的探针5’端采用HEX荧光染料标记，3’端采用BHQ1荧光染料标记；*80(c.-364C>T)位点检测的探针5’端采用AlexaFluor680荧光染料标记，3’端采用BHQ1荧光染料标记。

实施例2

本实施例提供一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，该试剂盒包的组成如表2所示：

表2本实施例提供试剂盒的主要组成成分

在本实施例提供的试剂盒中，通过设置包括SDS、甲酰胺和HCl的样本稀释液，在碱性环境下，SDS能够与强碱产生更好的协同作用，保证了蛋白质与核酸充分地分离，细胞裂解更有效，由此避免了对待测样本进行DNA提取的繁琐步骤。

此外，本发明的试剂盒中包括：野生型预混体系I、突变型预混体系II、阳性对照、阴性对照以及样本稀释液；其中，野生型预混体系I和突变型预混体系II在出厂前即被预先混合，其组成如表3所示，而该阳性对照、阴性对照、样本稀释液则分别独立分装。

表3.本发明试剂盒的野生型预混体系I、突变型预混体系II构成

上述试剂盒的储存条件为：-20℃±5℃避光保存；

试剂盒适用仪器为：由西安天隆科技有限公司自主研发的全自动PCR分析系统Gentier 96E。

实施例3

本实施例提供上述实施例2提供的用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒的使用方法，具体包括步骤：

S1：释放待测样本的基因组DNA；

以全血标本作为待测样品；

S2：目标基因检测，包括：

S21：试剂盒准备

从试剂盒中取出对应数量的野生型预混体系I、突变型预混体系II、阳性对照、阴性对照以及样本稀释液，室温融化并振荡混匀，2000rpm离心10秒，做好标记转移到样本处理区。

S22：待测样品处理，具体为：

各取10μL全血标本分别加入样本稀释液中，编号，然后涡旋混匀后备用，得处理后待测样本。

S23：加样及检测，具体为

将处理后待测样本(2μL)加入至野生型预混体系I(18uL)中以构建反应体系I；将处理后待测样本(2μL)加入至突变型预混体系II(18uL)中以构建反应体系II；同时，构建阴性对照反应体系和阳性对照反应体系，具体地，阴性对照反应体系包括：取阴性对照(2μL)分别加入至野生型预混体系I(18uL)和突变型预混体系II(18uL)中；阳性对照反应体系包括：取阳性对照(2μL)分别加入至野生型预混体系I(18uL)和突变型预混体系II(18uL)中。

然后盖紧管盖，使用加热离心机6000rpm离心至上述PCR反应体系完全融化，然后涡旋3s混匀，再使用6000rpm离心5s后将PCR反应体系按一定顺序放入荧光PCR扩增仪上，各反应体系总体积均为20μL，按以下程序进行PCR扩增：

预变性反应：95℃反应3min；

扩增反应：95℃反应15s，60℃反应45s，45个循环。

S3：PCR结果判断

通过收集PCR扩增后产生的荧光信号对PCR结果进行判断，判读荧光通道的设定，具体如下：

针对UGT1A1*6(c.211G>A)基因位点的探针采用FAM通道；

针对UGT1A1*28(c.-54_-53ins AT)基因位点的探针采用TEXAS RED通道；

针对UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因位点的探针采用HEX通道；

针对UGT1A1*80(c.-364C>T)基因位点的探针采用Alexa Fluor 680通道；

所述RPPH基因位点的探针采用CY5通道。

具体结果判定方法如下：

1)试剂盒有效性判定

阳性对照：FAM、TEXAS RED、HEX、Alexa Fluor 680通道Ct值≤36.5，扩增曲线有明显指数增长期。

阴性对照：各通道均无扩增，Ct＞36.5或无Ct值。

如不符合上述条件，则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件、实验操作等。

2)样本有效性判定

内标基因：所有样本检测中CY5通道Ct值≤36.5，扩增曲线有明显指数增长期。如不符合此条件，则该样本视为无效样本。

3)基因型判定方式：

在上述PCR反应体系与PCR扩增程序条件下，内标基因信号形成正常的扩增“S”型曲线的前提下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成扩增“S”型曲线，若形成扩增“S”型曲线，则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性，并根据突变型反应体系Ct值与野生型反应体系Ct值的差值(ΔCt)对待测样本的基因型进行判读，具体基因型检测结果判定方式如表4所示。

表4.基因型检测结果判定方式表

注：1.Ct(A)表示体系1的Ct值，Ct(B)表示体系2的Ct值。

2.无Ct值表示扩增Ct值＞45。

本发明基于经过特别设计和筛选的ARMS特异性引物组合和特异性探针组合，对每个位点的野生型或者突变型进行特异性扩增。

测试样本1，其扩增结果如图1所示，具体地，图1A为利用本发明的试剂盒对待测样本一进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测时构建的反应体系I所获得的检测结果示意图；图1B为利用本发明的试剂盒对待测样本一进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测时构建的反应体系II所获得的检测结果示意图；

如图1A-B所示，反应体系1、2内的内标基因荧光信号均合格，反应体系1内检测到UGT1A1*6(FAM通道)、UGT1A1*93(HEX通道)、UGT1A1*28(TEXAS RED通道)、UGT1A1*80(AlexaFluor 680通道)形成对数扩增“S”型曲线，则可判断该样本1含有UGT1A1*6、UGT1A1*93、UGT1A1*28、UGT1A1*80野生型等位基因；在反应体系2内检测到UGT1A1*28(TEXAS RED通道)、UGT1A1*80(Alexa Fluor 680通道)形成对数扩增“S”型曲线，则可判断该样本1含有UGT1A1*28、UGT1A1*80突变型等位基因；因此，综合反应体系1、2的PCR扩增曲线结果数据，可以得出样本1UGT1A1*6位点的基因型为纯合野生型，UGT1A1*28位点的基因型为杂合型，UGT1A1*93位点的基因型为纯合野生型和UGT1A1*80位点的基因型为杂合型，最终确定待测样本一的代谢型为慢代谢型。

类似的，本实施例还进一步对待测样本二进行检测，实验结果如图2A-B所示，具体地，图2A为利用本发明的试剂盒对待测样本二进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测时构建的反应体系I所获得的检测结果示意图；图2B为利用本发明的试剂盒对待测样本二进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测时构建的反应体系II所获得的检测结果示意图；该结果显示，本实施例提供的试剂盒准确地识别出图2A和图2B对应的待检测样本2的基因型结果，结果为：该待测样本二的代谢型为慢代谢型。

类似的，本实施例还进一步对待测样本三进行检测，实验结果如图3A-B所示，具体地，图3A为利用本发明的试剂盒对待测样本三进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测时构建的反应体系I所获得的检测结果示意图；图3B为利用本发明的试剂盒对待测样本三进行UGT1A1基因4个位点和内标基因进行检测时构建的反应体系II所获得的检测结果示意图；该结果显示，本实施例提供的试剂盒准确地识别出图2A和图2B对应的待检测样本3的基因型结果，结果为：该待测样本三的代谢型为中间代谢型。

实施例4

参照实施例3中方法对20份待测样本采用本发明的试剂盒的方法与测序法对比，检测结果如表5所示：

表5.采用本发明试剂盒与测序法检测结果对比表

结合表5可知，上述所有20份检测样本的分型检测结果均经过DNA测序验证，测序结果与本发明检测试剂盒检测结果吻合率达到100％，由此可以证明本发明的检测试剂盒检测结果的可靠和准确性。

实施例5

本实施例对本发明提供的试剂盒的灵敏度进行测试，其实验结果显示，本发明提供的试剂盒的灵敏度高，白细胞含量低至1000个白细胞/μL的全血可准确检测其基因型，具体的，选择UGT1A1*6，*28，*93和*80位点均为杂合型的待测样本4，检测基因组DNA的浓度，将其稀释至0.5ng/μL，采用本发明的试剂盒进行检测，上样量为2μL，检测结果如图4A和图4B所示，结果显示，本发明的试剂盒依然能够准确地检测出目标基因，说明本发明提供的试剂盒具有极高的灵敏度。

实施例6

国内外研究资料表明，UGT1A1基因多态性导致伊立替康的活性代谢物SN-38(7-乙基-10-羟基喜树碱)失活减慢，使中性粒细胞减少、白细胞减少、血小板减少、腹泻等发生率增加。因此，治疗前检测患者基因型将有助于预测不良反应，指导临床用药、规避相关风险。本发明的试剂盒能够同时检测与伊立替康用药风险相关的4个SNP位点，UGT1A1基因位点结果输出与代谢型判定、毒性反应及伊立替康用药建议间关系如表6所示，依据该关系表，可从药物遗传学角度分析药物使用风险，为临床用药选择提供参考依据。

表6.UGT1A1基因位点结果输出与代谢型判定、毒性反应

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实施例7

利用本发明的检测试剂盒，参照实施例3方法对21例待测样本进行了检测，检测结果汇总如表7所示，值得注意的是，1-20例样本UGT1A1*28(c.-54_-53ins AT)和UGT1A1*80(c.-364C>T)位点的检测结果与sanger测序结果保持一致，第21例样本的试剂盒检测结果如图5A-B所示，试剂盒检测结果表明UGT1A1*28的基因型为突变型，UGT1A1*80的基因型为杂合型；第21例样本的sanger测序结果如图5C-D所示，结合该图5C(UGT1A1*28位点的基因测序结果)、图5D(UGT1A1*80位点的基因测序结果)可知，UGT1A1基因出现了5个TA重复的突变。因此，本发明的试剂盒能够对具有罕见基因型的样本做出提示作用，即当试剂盒检测结果显示*28和*80的基因型不一致时，则该样本可能存在UGT1A1野生型启动子区域的罕见突变，由此可提示工作人员该待测样本的基因型有待进一步确认，从而确保正确的用药指导。

表7.试剂盒针对UGT1A1*28、UGT1A1*80检测结果表

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (10)

1.一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，其特征在于，包括特异性引物组合和/或特异性探针组合，其中，所述特异性引物组合包括：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的特异性引物对；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的特异性引物对；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的特异性引物对；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性引物对；

所述特异性探针组合包括：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的探针；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的探针；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的探针；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性探针。

2.如权利要求1所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，其特征在于：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的特异性引物对，包括：

反向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

正向共用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的特异性引物对，包括：

正向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

正向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

反向共用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的特异性引物对，包括：

正向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

正向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

反向共用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性引物对，包括：

正向野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

正向突变型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

反向共用引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

3.如权利要求2所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物，其特征在于：

用于检测UGT1A1*6(c.211G>A)基因分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；

用于检测UGT1A1*28(c.-54_-53insAT)基因分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；

用于检测UGT1A1*93(c.862-9898G>A)基因分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；

以及用于检测UGT1A1*80(c.-364C>T)基因分型的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示。

4.一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1～3任意一项所述的ARMS引物探针组合物。

5.如权利要求4所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对人基因组DNA内标基因进行检测的通用引物和/或通用探针，优选地，所述人基因组DNA内标基因为RPPH基因。

6.如权利要求5所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，其特征在于：所述通用引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；所述通用探针的核苷酸序列如SEQID NO：19所示。

7.如权利要求4所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组合物中的特异性探针和/或通用探针的5’端用FAM、TEXAS RED、HEX、AlexaFluor 680荧光染料中的任意一种进行标记；所述引物探针组合物中的特异性探针和/或通用探针的3’端用BHQ1或BHQ3荧光染料中的任意一种进行标记。

8.如权利要求4所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒，其特征在于：

优选地，所述试剂盒还包括Taq酶、Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTPs；

优选地，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液包括SDS、甲酰胺、HCl中的任意一种；

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，优选地，所述阳性对照为含所有目标基因靶序列多态性位点的DNA重组质粒，所述目标基因为UGT1A1*6基因、UGT1A1*28基因、UGT1A1*93基因以及UGT1A1*80基因；优选地，所述阴性对照为生理盐水。

9.如权利要求1～3任意一项所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物或权利要求4～8任意一项所述的一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的试剂盒在基因分型检测方面的应用，所述应用以非诊断或非治疗为目的。

10.一种用于人类UGT1A1联合基因位点分型的检测方法，其特征在于，包括步骤：

释放待测样本的基因组DNA；

使用如权利要求1～3中任一项用于人类UGT1A1联合基因位点分型的ARMS引物探针组合物扩增所述基因组DNA中的目标基因，所述目标基因为UGT1A1*6基因、UGT1A1*28基因、UGT1A1*93基因以及UGT1A1*80基因；

PCR结果判断。