CN111705121A - 一种全预混cyp2c9和vkorc1多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

一种全预混CYP2C9和VKORC1多重PCR基因多态性检测试剂盒和方法。本发明提供用于检测华法林相关CYP2C9基因*3与VKORC1基因‑1639两个位点核苷酸多态性的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒和方法，根据“等位基因特异PCR”原理，设计多重引物特异性PCR，在实时荧光定量PCR技术平台上实现两管反应同时检测华法林相关CYP2C9基因*3与VKORC1基因‑1639两个多态性位点的核苷酸类型。并采用修饰的Taq DNA聚合酶及在反应体系中加入二聚糖PCR保护剂，增加反应体系的稳定性，实现全预混检测体系保存的长期稳定性。

Description

一种全预混CYP2C9和VKORC1多重PCR基因多态性检测试剂盒 和方法
技术领域
本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于CYP2C9基因*3型与VKORC1基因-1639两个位点核苷酸多态性检测的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒和检测方法。
背景技术
华法林(Warfarin)属香豆素类口服抗凝血药，是用于治疗血液栓塞性疾病(如心脏瓣膜置换术后、心房颤动、静脉血栓形成及肺梗塞等)的一线药物。CYP2C9是华法林的主要代谢酶，其SNP的某些基因型会造成CYP2C9的酶活下降，以致华法林在体内的清除减慢。华法林是通过抑制维生素环氧化物还原酶(VKOR)，使维生素K参与的凝血因子II、W、IX、 X合成受阻，从而发挥抗凝作用，因此VKOR的一个重要亚单位基因(VKORCl)的SNP亦会造成个体对华法林的敏感性存在明显差异。加之华法林的治疗窗较窄，很少的剂量变化也可能导致血栓或出血，因此在临床应用上，相关基因的单核苷酸多态性检测可作为个性化治疗的给药依据。
目前研究发现，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林治疗剂量的影响逐渐被认识，其中VKORC1(-1639G/A)，CYP2C9*2(430C/T)和 CYP2C9*3(1075A/C)多态性位点与华法林治疗剂量关系最为密切，这些位点多态性都与华法林代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。目前，国际华法林实施协会根据VKORC1和CYP2C9基因多态性制定了详细的华法林剂量计算公式，从而可以实现患者个体化给药。
人CYP2C9基因具有遗传多态性，其中与亚洲人群最为密切的是CYP2C9基因的第c.1075位核苷酸存在A/C多态性。多态性位点为C时，其编码的多肽链第359位氨基酸Ile 被Leu取代，酶活性比野生型降低了80％。研究表明，临床常用的抗凝药华法林由CYP2C9 代谢，而其突变体使华法林代谢速率大大降低，用药个体在使用初期就有较高的出血危险性。人VKORC1基因具有遗传多态性，其编码的维生素K环氧化物还原酶是华法林的作用靶点。VKORC1启动子的基因多态性(-1639G/A)是影响华法林需求剂量个体差异的最主要因素。GG基因型的个体VKORC1启动子活性增高，引起VKORC1 mRNA表达增加，酶量的增多导致有活性的氢醌型维生素K生成和凝血因子生成也增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果；而启动子区域-1639G＞A的突变可引起VKORC1 mRNA的表达下降，从而使肝脏中酶的生成也相应地减少，进而引起环氧化型维生素K还原成氢醌型维生素K减少，此时只需要很少剂量的华法林就能达到抗凝效果，过量的华法林会导致溶血等严重副反应。
对CYP2C9*3和VKORC1多态性基因型进行分析，大多采用PCR-PFLP检测技术和 DNA直接测序法。由于PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。
发明内容
本发明针对现有技术检测CYP2C9*3型和VKORC1基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的CYP2C9*3 型和VKORC1全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒及方法。
本发明针对单重引物特异性PCR检测一个位点的基因多态性需要两管反应才能完成，应用多重引物特异性PCR检测基因多态性，两管反应体系能够同时检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性；本发明中将修饰的Taq DNA聚合酶与含PCR稳定剂的反应液预混，且预混后Taq酶活性及反应液稳定性不受影响，具有操作简便、反应快速、成本低的优点，具有广泛推广价值。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，根据CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
CYP2C9 1075A：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAT-3′(SEQ ID No.1)；
CYP2C9 1075C：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAG-3′(SEQ ID No.2)；
正向引物：
CYP2C9 1075F：5′-AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3′(SEQ ID No.3)；
荧光探针：
TM-CYP2C9 1075：5′荧光基团-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3′淬灭基团(SEQ IDNo.4)。
本发明还提供了一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，根据VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
VKORC1 1639G：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCC-3′(SEQ ID No.5)；
VKORC1 1639A：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCT-3′(SEQ ID No.6)；
正向引物：
VKORC1 1639F：5′-AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3′(SEQ ID No.7)；
荧光探针：
TM-VKORC1 1639：5′荧光基团-CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3′淬灭基团 (SEQ IDNo.8)。
本发明还提供了一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的内控引物对及相应荧光探针，序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F：5′-CTTAGATTTGGTCGTATTGGGC-3′(SEQ ID No.9)；
反向引物：GAPDH R：5′-GAGCTCACCATGTAGCACTCAC-3′(SEQ ID No.10)；
内控荧光探针：
TM-GAPDH：5′荧光基团-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3′淬灭基团(SEQ ID No.11)。
本发明提供了一种含PCR保护剂二聚糖的缓冲液，可以保证全预混试剂的稳定性。采用的二聚糖，可以为海藻糖或蔗糖。
本发明提供了将修饰的Taq聚合酶与引物探针和反应缓冲液预混的方法，可以保证全混试剂的-20度长期储存稳定性和4度条件下8个星期的储存稳定性。Taq聚合酶的修饰方式可以为Taq单克隆抗体修饰和化学修饰。
上述检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性的探针、检测人VKORC1基因- 1639位点(G/A)多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5′端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3′端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ-1、BHQ-2、 Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性检测荧光探针的5′端连有的荧光基团为ROX，3′端连有的淬灭基团为BHQ1；VKORC1基因-1639 位点(G/A)多态性检测荧光探针的5′端连有的荧光基团为FAM，3′端连有的淬灭基团为 BHQ1；内控荧光探针的5′端连有的荧光基团为HEX，3′端连有的淬灭基团为BHQ2。
本发明还提供了一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒，包括本发明所述检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和 /或人VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包括检测人CYP2C9基因*3位点A等位基因和VKORC1基因-1639位点G等位基因的特异性反应液：CYP2C9和VKORC1 A PCR反应液，和/或检测人CYP2C9基因*3位点C等位基因和VKORC1基因-1639位点A等位基因的特异性反应液：CYP2C9和VKORC1 B PCR反应液；其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针以及修饰的Taq聚合酶，及PCR反应保护剂二聚糖。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下：
(1)CYP2C9和VKORC1 A PCR反应液
CYP2C9 1075A：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAT-3′；
CYP2C9 1075F：5′-AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3′；
TM-CYP2C9 1075：5′荧光基团-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3′淬灭基团；
VKORC1 1639G：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCC-3′；
VKORC1 1639F：5′-AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3′；
TM-VKORC1 1639：5′荧光基团-CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3′淬灭基团；
(2)CYP2C9和VKORC1 B PCR反应液
CYP2C9 1075C：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAG-3′；
CYP2C9 1075F：5′-AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3′；
TM-CYP2C9 1075∶5′荧光基团-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3′淬灭基团；
VKORC1 1639A：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCT-3′2
VKORC1 1639F：5′-AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3′2
TM-VKORC1 1639：5′荧光基团-CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3′淬灭基团。
上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和/或人VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如下：
内控引物：
GAPDH F：5′-CTTAGATTTGGTCGTATTGGGC-3′；
GAPDH R：5′-GAGCTCACCATGTAGCACTCAC-3′；
内控荧光探针：
TM-GAPDH：5′荧光基团-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3′淬灭基团。
上述试剂盒中检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性的探针、检测人VKORC1 基因-1639位点(G/A)多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5′端的荧光基团可以为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或 ROX，3′端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ-2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性检测荧光探针的5′端连有的荧光基团为ROX，3′端连有的淬灭基团为BHQ1； VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性检测荧光探针的5′端连有的荧光基团为FAM，3′端连有的淬灭基团为BHQ1；内控荧光探针的5′端连有的荧光基团为HEX，3′端连有的淬灭基团为BHQ2。
上述试剂盒使用说明书包合对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火延伸：温度为60℃，时间为30秒；
第二阶段由35次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火延伸：温度为60℃，时间为30秒；(设置荧光信号采集)
本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述合有的检测CYP2C9*3型和 VKORC1基因多态性的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒进行CY92C9*3型和VKORC1基因多态性检测的方法，步骤包括：
(1)待测样品处理和模板提取
a.从待检测者抽取血液样本；
b.从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
c.测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μl；OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0；
(2)荧光PCR扩增：
将待检测模板DNA加入合有本发明所述检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和/或人VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模板DNA加入合有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方案的PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，用以监测反应有效性。
上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：
预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火延伸：温度为60℃，时间为30秒；
第二阶段由35次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火延伸：温度为60℃，时间为30秒；(设置荧光信号采集)
(3)分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增″S″型曲线，如果形成对数扩增″S″型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
本发明还提供了一种检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和/或人VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人CYP2C9*3型和VKORC1基因多态性中的应用。
本发明还提供了一种合有检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和/或人 VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人CYP2C9*3型和VKORC1基因多态性中的应用。
本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
1.本发明工作原理是：等位基因特异PCR(Allele Specific PCR，ASPCR)，又称为等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification，ASA)或者扩增受阻突变系统(Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3′端形成错配，链延伸反应就会因为3′，5′-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内，不会检测出特异的扩增产物；反之，3′端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的多态性位点，将其多态性碱基设计于检测引物的3′端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断多态性位点的碱基类型。
荧光定量PCR是(Real-time PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针被称″TaqMan探″，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在 DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测″等位基因特异PCR″反应体系的产物，根据形成扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数(Ct值)的大小可判断相应检测体系内模板相应目的位点的碱基类型。
2.本发明所述技术方案中的引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的CYP2C9基因的参考序列(NG_008385.1)以及 dbSNP数据库公开的*3位点(A/C)多态性(SNP ID：rs1057910)的信息，VKORC1基因的参考序列(NG_011564.1)以及dbSNP数据库公开的-1639位点(G/A)多态性(SNP ID： rs9923231)采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测CYP2C9基因*3位点 (A/C)多态性与VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列 (其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2)，采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针。
本发明所述技术方案中，所述引物(primer)是指由一定数量的dNTP构成的寡核苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3′-OH必须是游离的。DNA聚合酶可由其3′端开始进行延伸，合成新的核酸链。
本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5′末端，而淬灭基团则在3′末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX，ROX 等。淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA等。
本发明所述技术方案中，所述修饰的Taq DNA聚合酶，通常有两种修饰方法，以帮助提高酶的稳定性：(1)使用Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰，TaqDNA聚合酶与抗体结合后形成非常稳定的聚合物，在常温或低温保存条件下非常稳定，当反应启动时，在高温条件下(95度)，Taq DNA聚合酶与抗体分离，启动DNA链式聚合反应。
3.本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应有效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的情况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为″S″型扩增曲线，表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增″S″型曲线时，为多态性类型的阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增″S″型曲线，检测结果为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阴性结果，但也有可能是模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增″S″型曲线，而内控信号形成正常对数扩增″S″型曲线时，可以验证多态性类型的阴性结果的准确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增″S″型曲线，且内控信号也未形成正常对数扩增″S″型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结果，而非多态性类型的阴性结果。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1.本发明技术方案中的检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和/或人VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针，其PCR检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判读容易；
2、本发明为多重引物特异性PCR检测基因多态性，两管反应体系能够同时检测人CYP2C9 基因*3位点(A/C)多态性和VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性；同时本发明反应酶为抗体包被的Taq DNA聚合酶或化学修饰的TaqDNA聚合酶，支持将反应酶与反应液预混，且预混后Taq酶活性及反应液稳定性不受影响；
3、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序，采用实时荧光PCR技术平台，可实现高通量检测，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
附图说明
附图1为某样本CYP2C9和VKORC1 A PCR反应检测图；
附图2为某样本CYP2C9和VKORC1 B PCR反应检测图；
附图3为某样本CYP2C9基因*3位点测序图；
附图4为某样本VKORC1基因-1639位点测序图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI 7500。
实施例1.引物和探针的设计：
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的CYP2C9基因的参考序列(NG_008385.1)以及dbSNP数据库公开的*3位点(A/C)多态性(SNP ID：rs1057910)的信息，VKORC1基因的参考序列(NG_011564.1)以及dbSNP数据库公开的 -1639位点(G/A)多态性(SNP ID：rs9923231)采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性与VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列(其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2)，采用 ABI公司的PrimerExpress 3.0软件设计检测引物及探针。
检测CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性引物及探针的序列如下所示：
反向引物：
CYP2C9 1075A：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAT-3′；
CYP2C9 1075C：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAG-3′；
正向引物：
CYP2C9 1075F：5′-AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3′；
荧光探针：
TM-CYP2C9 1075：5′ROX-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3′BHQ1。
检测VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性引物及探针的序列如下所示：
反向引物
VKORC1 1639G：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCC-3′；
VKORC1 1639A：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCT-3′；
正向引物
VKORC1 1639F：5′-AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3′；
荧光探针
TM-VKORC1 1639：5′FAM-CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3′BHQ1；
为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因 GAPDH的一段序列(其参考序列编号为：NG_007073.2)，采用ABI公司的PrimerExpress 3.0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示：
内控引物：
GAPDH F：5′-CTTAGATTTGGTCGTATTGGGC-3′；
GAPDH R：5′-GAGCTCACCATGTAGCACTCAC-3′；
内控荧光探针：
TM-GAPDH：5′HEX-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3′BHQ2。
实施例2.引物的制备
将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
实施例3：一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒的准备
制备检测人CYP2C9基因*3位点A等位基因和VKORC1基因-1639位点G等位基因的特异性反应液：CYP2C9和VKORC1 A PCR反应液；检测人CYP2C9基因*3位点C等位基因和 VKORC1基因-1639位点A等位基因的特异性反应液：CYP2C9和VKORC1 B PCR反应液；其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了检测引物与探针和内控引物与探针以及抗体修饰的TaqDNA聚合酶和PCR保护剂海藻糖。上述各特异性检测的PCR反应液组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下：
表1.PCR反应液组分
Figure BDA0001998317260000151
Figure BDA0001998317260000161
(1)CYP2C9和VKORC1 A PCR反应液
CYP2C9 1075A：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAT-3′；
CYP2C9 1075F：5′-AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3′
TM-CYP2C9 1075：5′ROX-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3′BHQ1；
VKORC1 1639G：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCC-3′；
VKORC1 1639F：5′-AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3′；
TM-VKORC1 1639：5′FAM-CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3′BHQ1。
GAPDH F：5′-CTTAGATTTGGTCGTATTGGGC-3′；
GAPDH R：5′-GAGCTCACCATGTAGCACTCAC-3′；
TM-GAPDH：5′HEX-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3′BHQ2。
(2)CYP2C9和VKORC1 B PCR反应液
CYP2C9 1075C：5′-CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAG-3′；
CYP2C9 1075F：5′-AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3′
TM-CYP2C9 1075：5′ROX-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3′BHQ1；
VKORC1 1639A：5′-TAGGCGTGAGCCACCGCATCT-3′；
VKORC1 1639F：5′-AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3′；
TM-VKORC1 1639：5′FAM-CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3′BHQ1。
GAPDH F：5′-CTTAGATTTGGTCGTATTGGGC-3′；
GAPDH R：5′-GAGCTCACCATGTAGCACTCAC-3′；
TM-GAPDH：5′HEX-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3′BHQ2。
实施例4：一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的方法
第一步：准备DNA
(1).从待检测者抽取血液样本；
(2).从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
(3).测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μl；OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0。
第二步：PCR反应体系配制
在荧光定量PCR专用的管子内按照下表配制PCR反应体系
表2.PCR反应体系组成
PCR反应液 23μl
基因组DNA 约80ng
上述PCR反应液采用实施例3制备的试剂盒中的CYP2C9和VKORC1 A PCR反应液、
CYP2C9和VKORC1 B PCR反应液，也可以按照实施例3表1提供的配制方法制备含有检测人CYP2C9基因*3位点(A/C)多态性和检测人VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性的检测引物与探针并合有内控引物和探针的PCR反应液；
第三步：上机检测
按照下表设置温度循环及信号采集程序
表3.PCR反应程序
Figure BDA0001998317260000181
注：″*″处设置FAM、ROX、HEX三通道采集荧光信号。
第四步：分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，在内控信号形成正常对数扩增″S″型曲线的前提条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增″S″型曲线，如果形成对数扩增″S″型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。例如：某待检样本在CYP2C9和VKORC1 A反应体系和CYP2C9和VKORC1 B反应体系检测荧光信号(ROX通道)均形成对数扩增″S″型曲线，则提示该样本为CYP2C9*3 位点A/C杂合突变型。
附图1为某样本CYP2C9和VKORC1 A反应体系检测图，检测图显示CYP2C9和 VKORC1A反应体系内的内控荧光信号均合格，而CYP2C9*3 A反应体系内检测荧光信号 (ROX通道)形成对数扩增″S″型曲线，则判断该样本含有CYP2C9*3 A等位基因；在 VKORC1-1639 G反应体系内检测荧光信号(FAM通道)未形成扩增曲线，则判断该样本不含VKORC1-1639 G等位基因。
附图2为某样本CYP2C9和VKORC1 B反应体系检测图，检测图显示CYP2C9和 VKORC1B反应体系内的内控荧光信号均合格，而CYP2C9*3 C反应体系内检测荧光信号 (ROX通道)未形成扩增曲线，则判断该样本不含CYP2C9*3 C等位基因；在VKORC1- 1639 A反应体系内检测荧光信号(FAM通道)形成对数扩增″S″型曲线，则判断该样本含有VKORC1-1639 A等位基因。
附图3为附图1和附图2中样本CYP2C9基因*3位点测序图，测序结果显示该样本未CYP2C9*3A/A野生型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
附图4为附图1和附图2中样本VKORC1基因-1639位点测序图，测序结果显示该样本为VKORC1-1639A/A纯合突变型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
注意：
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> OrganizationName : 苏州旷远生物分子技术有限公司
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种全预混CYP2C9和VKORC1多重PCR基因多态性检测试剂盒和方法
<130> AppFileReference :
<140> CurrentAppNumber :
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> SEQ ID No.1
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.1
o 60
oreequence tring 17
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<212> 000
<212> 000
<210> SEQ ID No.2
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.2
o 60
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<212> Type : DNA
<212> 000
<212> 000
<212> 000
<210> SEQ ID No.3
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.3
o 60
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<212> Type : DNA
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<212> 000
<212> 000
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<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.4
o 60
oreequence tring 17
<212> Type : DNA
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<212> 000
<212> 000
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o 60
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<212> 000
<212> 000
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o 60
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oreequence tring 17
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o 60
oreequence tring 17
<212> Type : DNA
<212> 000

Claims (11)

1.一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据CYP2C9基因c.1075位点(A/C)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
CYP2C9 1075A: 5’- CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAT-3’；
CYP2C9 1075C: 5’- CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCCAG-3’；
正向引物：
CYP2C9 1075F: 5’- AAGTCCAGGAAGAGATTGAACGT-3’；
荧光探针：
TM-CYP2C9 1075: 5’荧光基团-TGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTA-3’淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据VKORC1基因-1639位点(G/A)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
VKORC1 1639G: 5’-TAGGCGTGAGCCACCGCATCC-3’；
VKORC1 1639A: 5’-TAGGCGTGAGCCACCGCATCT-3’；
正向引物：
VKORC1 1639F: 5’- AGCAGGAGAGGGAAATATCACAGA-3’；
荧光探针：
TM-VKORC1 1639: 5’荧光基团- CCAGAGGAAGAGAGTTCCCAGAAGGGT-3’淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’- CTTAGATTTGGTCGTATTGGGC-3’；
反向引物：GAPDH R: 5’-GAGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒的修饰反应酶和含二聚糖成分的PCR缓冲液预混方式。
5.如权利要求1-3所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX，3’端的淬灭基团为BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、或TAMRA。
6.一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的检测引物及其相应探针和/或括权利要求2所述的检测引物及其相应探针。
7.如权利要求6所述的一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如权利要求3所述内控引物对及相应荧光探针。
8.一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性的检测方法，所述方法包括使用权利要求1和/或权利要求2所述的引物及探针。
9.如权利要求8所述的一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性的检测方法，其特征在于所述方法还包括使用权利要求3所述的引物及探针。
10.一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性的检测方法，所述方法包括使用权利要求6-7所述的试剂盒。
11.权利要求1-3所述的引物及探针在一种全预混华法林相关CYP2C9*3型和VKORC1多重引物特异性PCR基因多态性检测中的应用。
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