CN117568468A - 检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用 - Google Patents
检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117568468A CN117568468A CN202311674447.2A CN202311674447A CN117568468A CN 117568468 A CN117568468 A CN 117568468A CN 202311674447 A CN202311674447 A CN 202311674447A CN 117568468 A CN117568468 A CN 117568468A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- detection system
- allele
- pcr
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 117
- 102200035776 rs6065 Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 46
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 116
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract description 12
- 101150068179 Gp1ba gene Proteins 0.000 abstract description 7
- 101150116826 LTC4S gene Proteins 0.000 abstract description 7
- 208000025870 aspirin resistance Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 abstract description 7
- 101000606878 Homo sapiens Platelet endothelial aggregation receptor 1 Proteins 0.000 abstract description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 25
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 7
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 6
- 101100189822 Homo sapiens PEAR1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 101150108374 PEAR1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 3
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 description 3
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 2
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000978210 Homo sapiens Leukotriene C4 synthase Proteins 0.000 description 1
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000605122 Homo sapiens Prostaglandin G/H synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023758 Leukotriene C4 synthase Human genes 0.000 description 1
- 102000018656 Mitogen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052006 Mitogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039710 Platelet endothelial aggregation receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100038277 Prostaglandin G/H synthase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 1
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 206010047097 Vascular purpura Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013176 antiplatelet therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006502 antiplatelets effects Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N thromboxane A2 Chemical compound OC(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N 0.000 description 1
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用，该引物探针组合物包括用于检测遗传多态性的3条等位基因特异性野生型正向引物、3条等位基因特异性突变型正向引物、3条反向引物和3条TaqMan探针。本发明基于等位基因特异性引物和TaqMan探针的qPCR法，在保证精准的基础上具有单位成本低、耗时短、操作简洁以及使用不需阳性对照的显著优点。通过检测人的PEAR1基因rs12041331、GP1BA基因rs6065、LTC4S基因rs730012的遗传多态性，本发明试剂盒可以精准指导阿司匹林用药，用于提示阿司匹林抵抗及其超敏反应。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合物、试剂盒、阿司匹林指导用药试剂盒及其在检测rs12041331、rs6065、rs730012位点多态性中的应用，属于基因检测技术领域。
背景技术
阿司匹林属于抑制血小板聚集的环氧合酶(cyclooxygenase,COX)抑制剂，为最为常见的抗血小板治疗药物，被广泛应用于降低急性心肌梗死疑似患者的发病风险；预防心肌梗死复发、中风；降低短暂性脑缺血发作TIA及其继发脑卒中的风险；降低稳定性和不稳定性心绞痛患者的发病风险等，是动脉粥样硬化ASCVD疾病预防的基石(cornerstone)药物。阿司匹林经肠道吸收后被代谢成为活性产物水杨酸，随血液分布全身。水杨酸可以与血小板内的环氧合酶活性部分丝氨酸残基发生不可逆的乙酰化反应而使酶失活，从而通过阻滞花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的代谢，抑制血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)的生成及血小板聚集。
虽然阿司匹林被广泛应用于抗血小板治疗，但是部分患者在服用常规剂量的阿司匹林后常发生阿司匹林抵抗(AR)和不良反应。我国复发性卒中及心血管疾病研究显示，阿司匹林抵抗率、半抵抗率和敏感率分别为20.4％，4.4％和75.2％。阿司匹林主要不良反应为消化系统损害、血液系统损害、泌尿系统损害和皮肤损害等，表现为消化道溃疡及出血、血管性紫癜、血小板减少、肾损害、以及皮肤过敏等。近年，越来越多的研究显示，遗传多态性是阿司匹林抵抗及其不良反应的一个重要原因。
血小板内皮细胞凝集素受体1(PEAR1)是一种血小板跨膜蛋白，在血小板聚集过程中起重要作用。研究表明，PEAR1基因rs12041331GG基因型携带者对阿司匹林抗血小板作用的应答效果好，而携带AA或AG基因型的PCI患者心肌梗死的风险显著增加。GP1BA基因多态性也与患者阿司匹林敏感性有关，rs6065 CC型的阿司匹林抵抗风险显著增加。LTC4S基因rs730012的C等位基因与阿司匹林导致的荨麻疹相关，在健康中国人群中AC和CC基因频率分别为28.9％和0.8％。
2015年，山东千佛山医院、卫计委中日友好医院和首都医科大附属北京妇产医院联合发布了“阿司匹林精准治疗指南(2015)”。之后中山大学附属第五医院根据实践结果对该指南评分表进行了修订。在上述工作的基础上，广东省药学会2020年3月发布了“基于药物基因组学的抗血小板药物个体化药学服务指引(2020年版)”，“阿司匹林相关基因检测内容建议为：PEAR1基因rs12041331、GP1BA基因rs6065、LTC4S基因rs730012，在条件允许情况下，可增加检测PTGS1的基因多态性”。
基于定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)的核酸检测是一种方便的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)识别工具，其中常用的识别分子有双链DNA染料、等位基因特异性(allele-specific,AS)引物或探针。但基于双链DNA染料的高分辨率熔解曲线法(HRM)需要特定的仪器模块且耗时；小沟结合物(Minor Groove Binder，MGB)AS探针制备费用相对较高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物，本发明使用碱基错配的AS正向引物作为多态性位点特异性结合分子，对PEAR1基因rs12041331、GP1BA基因rs6065、LTC4S基因rs730012位点进行基因分型，该引物和探针组合物适用于qPCR仪，通过两个反应管可以并行检测区分人PEAR1基因rs12041331、GP1BA基因rs6065、LTC4S基因rs730012这三个位点的所有基因型，具有简洁、低成本、检测准确度高等显著优点。
本发明采用的技术是基于等位基因特异性引物和TaqMan探针的qPCR法，在保证精准的基础上具有单位成本低、耗时短、操作简洁以及使用不需阳性对照的显著优点。通过检测人的PEAR1基因rs12041331、GP1BA基因rs6065、LTC4S基因rs730012位点的遗传多态性，本发明可以精准指导阿司匹林用药，用于提示阿司匹林抵抗及其超敏反应。
本发明的技术方案如下：
一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括3条等位基因特异性野生型正向引物(简称AS野生型正向引物或野生型正向引物)、3条等位基因特异性突变型正向引物(简称AS突变型正向引物或突变型正向引物)、3条反向引物及3条TaqMan探针。
进一步的，所述的3条AS野生型正向引物分别为扩增rs12041331的AS野生型正向引物、扩增rs6065的AS野生型正向引物、扩增rs730012的AS野生型正向引物。3条AS野生型正向引物的3’末端第2位或第5位碱基进行了碱基错配修饰，同时3’末端第1位碱基分别与rs12041331、rs6065、rs730012位点的野生型碱基互补，这3条AS野生型正向引物的核苷酸序列具体如下：
rs12041331-WF：5’-CCTTCTGCTGTCTCACCTCCG-3’；
rs6065-WF：5’-CCCCCAGGGCTCCTGCC-3’；
rs730012-WF：5’-AACAGCCTGGATGGGGATA-3’。
进一步的，所述的3条AS突变型正向引物分别为扩增rs12041331的AS突变型正向引物、扩增rs6065的AS突变型正向引物、扩增rs730012的AS突变型正向引物。3条AS突变型正向引物的的3’末端第2位或第5位碱基进行了碱基错配修饰，同时3’末端第1位碱基分别与rs12041331、rs6065、rs730012位点的突变型碱基互补，这3条AS突变型正向引物的核苷酸序列具体如下：
rs12041331-MF：5’-CCCTTCTGCTGTCTCACGTCCA-3’；
rs6065-MF：5’-CCCCCAGGGCTCGTGAT-3’；
rs730012-MF：5’-ACAGCCTGGATGGTGACC-3’。
进一步的，所述的3条反向引物的序列为：
rs12041331-R：5’-CCTCACTGTGCCCCAACC-3’；
rs6065-R：5’-CGAGATTCTCCAGCCCATTC-3’；
rs730012-R：5’-CATGCTGGAGCCAGCCC-3’。
进一步的，上述引物中，WF表示野生型正向引物，MF表示突变型正向引物，R表示反向引物。
进一步的，所述的3条TaqMan探针分别为rs12041331-TaqMan探针、rs6065-TaqMan探针、rs730012-TaqMan探针。这3条TaqMan探针的5’端均标记有荧光基团，每条TaqMan探针上的荧光基团不同。这3条TaqMan探针的3’端均标记有淬灭基团，每条TaqMan探针上的淬灭基团相同或不同。
进一步的，3条TaqMan探针的核苷酸序列具体如下：
rs12041331-TaqMan探针：5’-CCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTC-3’；
rs6065-TaqMan探针：5’-CTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGC-3’；
rs730012-TaqMan探针：5’-ATAAGGTGGGTGGAGGAGTTAGCCGGG-3’。
进一步的，所述TaqMan探针中，5’端标记的荧光基团可以是现有技术中报道的常用的荧光基团，例如FAM、VIC、NED等，3’端标记的淬灭基团可以是现有技术中报道的常用的淬灭基团，例如BHQ1、BHQ2等。
进一步的，所述各等位基因特异性野生型正向引物、各等位基因特异性突变型正向引物、各反向引物、各TaqMan探针单独包装或预混后包装。
本发明还提供了一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的试剂盒，该试剂盒中包括上述检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物。
进一步的，所述试剂盒中还包括PCR反应所必需的TaqMix(也可以称为Mix混合液)，所述TaqMix包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液。
进一步的，所述各等位基因特异性野生型正向引物、各等位基因特异性突变型正向引物、各反向引物、各TaqMan探针在遗传多态性试剂盒中单独包装或预混后包装。
本发明还提供了一种阿司匹林指导用药试剂盒，该试剂盒包括上述检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物。
进一步的，上述阿司匹林指导用药试剂盒中还包括PCR反应所必需的TaqMix(也可以称为Mix混合液)，所述TaqMix包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液。
进一步的，所述各等位基因特异性野生型正向引物、各等位基因特异性突变型正向引物、各反向引物、各TaqMan探针在阿司匹林指导用药试剂盒中单独包装或预混后包装。
本发明还提供了上述检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物、上述检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的试剂盒在人rs12041331、rs6065、rs730012基因型检测中的应用。本发明的引物和探针组合物、试剂盒能有效扩增模板、结果可靠，灵敏度高，具有很好的应用前景。
本发明还提供了一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的方法，该方包括采用上述检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物或者采用上述检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的试剂盒或者采用阿司匹林指导用药试剂盒、通过荧光PCR的方法对待测DNA样本进行检测的步骤。
进一步的，本发明方法可以准确的得到各个基因位点的具体基因型，这一结果既可以用于指导阿司匹林个性化用药，还可以用于非治疗目的的应用，例如可以进行rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的基础研究、非疾病的基因分型等。
进一步的，上述方法具体包括以下步骤：
(1)配制PCR野生型检测体系：将3条等位基因特异性野生型正向引物、3条等位基因特异性突变型正向引物、3条反向引物、3条TaqMan探针、TaqMix、待测DNA样本和水同时加入一个反应管中，得到PCR野生型检测体系；
(2)配制PCR突变型检测体系：将3条等位基因特异性突变型正向引物、3条等位基因特异性野生型正向引物、3条反向引物、3条TaqMan探针、TaqMix、待测DNA样本和水同时加入一个反应管中，得到PCR突变型检测体系；
(3)将配制好的野生型检测体系和突变型检测体系进行扩增；
(4)直接读取PCR野生型检测体系和PCR突变型检测体系的Cq，分别根据野生型检测体系Cq值和突变型检测体系Cq值的差值ΔCq来判断rs12041331、rs6065、rs730012的基因型。
进一步的，上述方法中，PCR突变型检测体系和PCR野生型检测体系中所用的引物、探针完全相同；PCR突变型检测体系与PCR野生型检测体系的不同之处在于：在PCR突变型检测体系中，所用的等位基因特异性突变型正向引物浓度大于等位基因特异性野生型正向引物浓度；在PCR野生型检测体系中，所用的等位基因特异性突变型正向引物浓度小于等位基因特异性野生型正向引物浓度。
进一步的，上述方法中，在PCR野生型检测体系中，各等位基因特异性野生型正向引物的浓度相同，各等位基因特异性突变型正向引物的浓度相同，各反向引物的浓度相同，各TaqMan探针的浓度相同。
进一步的，上述方法中，在PCR突变型检测体系中，各等位基因特异性野生型正向引物的浓度相同，各等位基因特异性突变型正向引物的浓度相同，各反向引物的浓度相同，各TaqMan探针的浓度相同。
优选的，PCR野生型检测体系和PCR突变型检测体系中，每条引物的终浓度可选范围均为0.005-1.2μM，例如0.005μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.5μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM，优选0.01μM或0.2μM。
优选的，PCR野生型检测体系和PCR突变型检测体系中，每条TaqMan探针的终浓度可选范围均为0.05-1μM，例如0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.5μM、0.8μM、1.0μM，优选0.1μM。
进一步的，上述方法中，步骤(3)中，扩增的反应程序如下：
第一阶段：37℃，2分钟；
第二阶段：95℃，5分钟；
第三阶段：95℃，10秒；60℃35秒，45个循环；60℃时收集荧光信号；
进一步的，上述方法中，步骤(4)中，采用如下标准通过ΔCq来判断这三个位点的具体基因型，其中wCq为野生型PCR检测体系的Cq值，mCq为突变型PCR检测体系的Cq值：
对于rs12041331，ΔCq＝(mCq－wCq)>2时判定检测结果为野生型，ΔCq＝(wCq－mCq)>2时判定检测结果为突变型，ΔCq＝∣wCq－mCq∣为0-2时、即-2≤ΔCq≤2时判定检测结果为杂合型。
对于rs6065，ΔCq＝(mCq－wCq)>1时判定检测结果为野生型，ΔCq＝(wCq－mCq)>1时判定检测结果为突变型，ΔCq＝∣wCq－mCq∣为0-1、即-1≤ΔCq≤1时时判定检测结果为杂合型。
对于rs730012，ΔCq＝(mCq－wCq)>1时判定检测结果为野生型，ΔCq＝(wCq－mCq)>1时判定检测结果为突变型，ΔCq＝∣wCq－mCq∣为0-1、即-1≤ΔCq≤1时时判定检测结果为杂合型。
进一步的，上述方法中，所述待测DNA样本为人类口腔拭子DNA样本。
进一步的，上述方法中，在进行PCR扩增时，对野生型检测体系、突变型检测体系分别设置阴性对照，阴性对照是将DNA样本替换为无菌水。
本发明包括以下有益效果：
(1)本发明利用AS PCR和TaqMan探针两种技术设计了配套qPCR仪使用的人rs12041331(PEAR1)、rs6065(GP1BA)、rs730012(LTC4S)遗传多态性检测的引物探针组合物和试剂盒。AS特异性引物3'末端碱基与多态性碱基完全匹配时，模板能有效扩增；在不完全匹配时，扩增受到阻滞。本发明试剂盒使用方便、操作简单、单位成本低、结果可靠、不需阳性对照，可以用于指导阿司匹林个性化给药，也可以用于人rs12041331(PEAR1)、rs6065(GP1BA)、rs730012(LTC4S)位点多态性的基础研究。
(2)本发明试剂盒使用方便，通过2管扩增反应即可判定rs12041331、rs6065、rs730012位点的基因型，用于人rs12041331(PEAR1)、rs6065(GP1BA)、rs730012(LTC4S)位点多态性的基因分型。使用时，根据两管Cq值的差值(ΔCq)可以准确判断每个多态位点的基因型。
(3)本发明通过引物和探针序列的组合搭配，试剂盒的检测限约为1.25ng/测试，具有高灵敏度的特性，满足使用要求。
附图说明
图1为使用本发明试剂盒及方法检测rs12041331(PEAR1)、rs6065(GP1BA)、rs730012(LTC4S)的三重qPCR扩增曲线图。从图中可以判断出基因分型结果及各条扩增线均起峰(无阴性结果)。Wt gDNA:野生型基因组DNA；Mut gDNA:突变型基因组DNA；Het gDNA:杂合型基因组DNA；WF primer:AS野生型正向引物；MF primer:AS突变型正向引物。
图2为所述试剂盒的鲁棒性评估结果图。从图中可见，rs12041331(PEAR1)杂合型(A)、rs730012(LTC4S)杂合型(B)、rs6065(GP1BA)杂合型(C)的gDNA样本在野生型检测体系和突变型检测体系中的扩增效率(EFF.)均在0.9至1之间，且不同浓度的gDNA样本的Cq值呈现剂量依赖性，这说明本发明试剂盒的鲁棒性良好。数据表示为：平均值±标准误差，WFprimer:AS野生型正向引物；MF primer:AS突变型正向引物。
图3为批内不精密度评估结果图。两个操作者使用两批号试剂，每批号每天8复管、连续5天检测10ng(A)和2.5ng(B)杂合子gDNA，结果显示：野生型(a)和突变型(b)PCR体系检测PEAR1(rs12041331)、GP1BA(rs6065)、LTC4S(rs730012)位点的批内变异系数(CV)均<2％.图中数据表示为变异系数均值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步解释和说明，下述说明仅是示例性的，为了本领域技术人员更好的理解本发明的方案和优势，并不对本发明保护范围进行限制。在下述实施例中，对于没有细述的操作、步骤，均为本领域中已有报道的技术，本领域技术人员根据现有技术可以实现。
如无特别说明，下述引物、TaqMan探针均为委托相应的设计公司合成。Taqmix购自南京诺唯赞公司。
实施例1检测体系的建立及优化
1、提取人类口腔拭子gDNA，通过Sanger测序确定rs12041331(PEAR1)野生型、杂合型、突变型人类样本；rs6065(GP1BA)野生型、杂合型人类样本；rs730012(LTC4S)野生型、杂合型、突变型人类样本，rs6065(GP1BA)突变质粒由上海生工合成备用。
2、根据基因的序列特点，设计样本检测所用的引物和探针，并使用单重PCR筛选错配AS正向引物：
(1)根据遗传多态性位点的序列特点，设计样本检测所用的引物和探针，得到下述PCR检测体系所用的错配AS修饰正向引物、反向引物、TaqMan探针，包括:
rs12041331-WF-2-2：CCTTCTGCTGTCTCACTTCTG；
rs12041331-WF-2-3：CCTTCTGCTGTCTCACTTCGG；
rs12041331-WF-5-2：CCTTCTGCTGTCTCACCTCCG；
rs12041331-WF-5-3：CCTTCTGCTGTCTCACGTCCG；
rs12041331-MF-2-2：CCCTTCTGCTGTCTCACTTCTA；
rs12041331-MF-2-3：CCCTTCTGCTGTCTCACTTCGA；
rs12041331-MF-5-2：CCCTTCTGCTGTCTCACCTCCA；
rs12041331-MF-5-3：CCCTTCTGCTGTCTCACGTCCA；
rs12041331-R：CCTCACTGTGCCCCAACC；
rs12041331-TaqMan探针：
FAM-5’CCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTC3’-BHQ1；
rs6065-WF-2-2：CCCCCAGGGCTCCTGCC；
rs6065-WF-2-3：CCCCCAGGGCTCCTGGC；
rs6065-WF-5-2：CCCCCAGGGCTCTTGAC；
rs6065-WF-5-3：CCCCCAGGGCTCGTGAC；
rs6065-MF-2-2：CCCCCAGGGCTCCTGCT；
rs6065-MF-2-3：CCCCCAGGGCTCCTGGT；
rs6065-MF-5-2：CCCCCAGGGCTCTTGAT；
rs6065-MF-5-3：CCCCCAGGGCTCGTGAT；
rs6065-R：CGAGATTCTCCAGCCCATTC；
rs6065-TaqMan探针：VIC-5’CTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGC3’-BHQ1；
rs730012-WF-2-2：AACAGCCTGGATGGGGATA；
rs730012-WF-2-3：AACAGCCTGGATGGGGAGA；
rs730012-WF-5-2：AACAGCCTGGATGGTGACA；
rs730012-WF-5-3：AACAGCCTGGATGGCGACA；
rs730012-MF-2-2：ACAGCCTGGATGGGGATC；
rs730012-MF-2-3：ACAGCCTGGATGGGGAGC；
rs730012-MF-5-2：ACAGCCTGGATGGTGACC；
rs730012-MF-5-3：ACAGCCTGGATGGCGACC；
rs730012-R：CATGCTGGAGCCAGCCC；
rs730012-TaqMan探针：
NED-5’ATAAGGTGGGTGGAGGAGTTAGCCGGG3’-BHQ2；
上述引物中，划线处碱基为：错配碱基；WF表示：野生型正向引物；MF表示：突变型正向引物；R表示：反向引物；
(2)分别配制rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的单重PCR检测体系，筛选错配AS正向引物，单重PCR检测体系总体积均为20μL，单重PCR野生型检测体系在一个反应管中，单重PCR突变型检测体系在另一个反应管中，单重PCR野生型检测体系组成如下表1所示:
表1
单重PCR突变型检测体系组成如下表2所示:
表2
其中，DNA样本分别为rs12041331野生型、杂合型、突变型人类gDNA；rs6065野生型、杂合型人类gDNA及突变型质粒；rs730012野生型、杂合型、突变型人类样本gDNA，引物和探针分别为步骤2.(1)中所示的引物和探针。
每个单重PCR突变型检测体系中固定反向引物和探针，每次加入一条突变型正向引物；每个单重PCR野生型检测体系中固定反向引物和探针，每次加入一条野生型正向引物，直到步骤2.(1)中所有的引物和探针组合均得到检测结果，以此筛选正向引物。每个单重PCR突变型检测体系和单重PCR野生型检测体系中，加入的DNA样本分别为相应的野生型、或杂合型、或突变型基因的gDNA样本，DNA样本的终浓度为10ng/测试。
(3)将配制好的单重PCR野生型检测体系和单重PCR突变型检测体系进行PCR扩增，PCR反应程序如下：
第一阶段：37℃，2分钟；
第二阶段：95℃，5分钟；
第三阶段：95℃，10秒；60℃35秒，45个循环；60℃时收集荧光信号；
(4)实验结果
对上述引物和探针分别进行单重PCR，直接读取单重PCR野生型检测体系和单重PCR突变型检测体系的Cq值，各组实验结果如下表3所示：
表3
/>
根据Cq结果，首先选择无阴性检出结果(undetermined)的引物，在都无阴性检出结果的情况下优先选择Cq值在32-35之间的引物进行后续实验，以便于在后续的实验过程中无需阳性对照设置。根据上述规则可以看出，正向引物对rs12041331:WF-5-2/MF-5-3；rs6065:WF-2-2/MF-5-3；rs730012:WF-2-2/MF-5-2组成的单重扩增体系可以通过ΔCq正确区分基因型，因此优选上述正向引物对对rs12041331、rs6065、rs730012多态性位点的基因型可进行良好的检测区分。
3、基于单重PCR筛选的正向引物，建立三重PCR检测体系：
(1)配制三重PCR检测体系，体系总体积为20μL，其中三重PCR野生型检测体系成分组成如下表4所示：
表4
三重qPCR突变型检测体系成分组成如下表5所示：
表5
其中，三重qPCR野生型检测体系和三重qPCR突变型检测体系中的DNA样本分别为rs12041331(PEAR1)野生型、杂合型、突变型人类样本gDNA；rs6065(GP1BA)野生型、杂合型人类样本gDNA及突变型质粒；rs730012(LTC4S)野生型、杂合型、突变型人类样本gDNA。
(2)将配制好的三重qPCR野生型检测体系和三重qPCR突变型检测体系进行扩增，PCR反应程序如上述步骤2.(3)中所示。
(3)实验结果
实验结果如下表6所示：
表6
/>
从表中可以看出，三重qPCR野生型检测体系和三重qPCR突变型检测体系中出现了阴性结果，依然需要引入阳性对照。
4、利用正向引物叠加优化三重PCR检测体系：
(1)为了避免阴性结果的产生，对检测体系继续进行优化。配制错配AS野生型正向引物与错配AS突变型正向引物叠加的三重PCR检测体系，体系总体积为20μL，AS野生型正向引物和AS突变型正向引物叠加的三重PCR野生型检测体系组成成分如下表7所示：
表7
/>
正向引物叠加的三重PCR突变型检测体系成分如下表8所示：
表8
/>
其中，在正向引物叠加的三重PCR野生型检测体系和正向引物叠加的三重PCR突变型检测体系中，DNA样本分别为rs12041331(PEAR1)野生型、杂合型、突变型人类样本gDNA；rs6065(GP1BA)野生型、杂合型人类样本gDNA及突变型质粒；rs730012(LTC4S)野生型、杂合型、突变型人类样本gDNA。
(2)PCR反应程序如上述步骤2.(3)中所示。
(3)实验结果
实验结果如下表9所示：
表9
从表9和图1可以看出，经过引物叠加优化，已消除阴性结果，根据PCR野生型检测体系与PCR突变型检测体系两管Cq值的差值(ΔCq)，可以在使用时无需设置阳性对照而准确的对rs12041331、rs6065、rs730012位点进行基因分型。
实施例2试剂盒基因型判定标准的确定
本发明利用AS PCR和TaqMan探针两种技术，以错配AS正向引物对多态性位点进行扩增，若AS特异性正向引物3'末端碱基与多态性碱基匹配时，模板能有效扩增；在不匹配时，扩增受到阻滞。同时使用TaqMan探针对扩增产物进行检测，在实时荧光PCR平台上实现对样品DNA的人PEAR1基因rs12041331、GP1BA基因rs6065、LTC4S基因rs730012位点的并行检测，并依据△Cq的大小分别判断检测结果的基因型。此外，通过引物叠加，避免阴性结果，使用时能省去阳性对照设置。该试剂盒使用方便、操作简单、单位成本低、结果可靠。
使用本发明试剂盒检测样本rs12041331、rs6065、rs730012基因型的方法如下：
(1)使用德国凯杰公司(QIAamp DNA Mini Kit，货号：51304)人类口腔拭子DNA提取试剂盒提取人类口腔拭子gDNA样本，并进行桑格测序以确定3个多态性位点的基因型。
(2)样本检测所用的AS正向引物、反向引物、TaqMan探针包括：
rs12041331-WF：5’-CCTTCTGCTGTCTCACCTCCG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
rs6065-WF：5’-CCCCCAGGGCTCCTGCC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
rs730012-WF：5’-AACAGCCTGGATGGGGATA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
rs12041331-MF：5’-CCCTTCTGCTGTCTCACGTCCA-3’，如SEQ ID NO.4所示；
rs6065-MF：5’-CCCCCAGGGCTCGTGAT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
rs730012-MF：5’-ACAGCCTGGATGGTGACC-3’，如SEQ ID NO.6所示。
rs12041331-R：5’-CCTCACTGTGCCCCAACC-3’，如SEQ ID NO.7所示；
rs6065-R：5’-CGAGATTCTCCAGCCCATTC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
rs730012-R：5’-CATGCTGGAGCCAGCCC-3’，如SEQ ID NO.9所示；
rs12041331-TaqMan探针：FAM-5’-CCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTC-3’-BHQ1，如SEQID NO.10所示；
rs6065-TaqMan探针：VIC-5’CTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGC3’-BHQ1，如SEQ IDNO.11所示；
rs730012-TaqMan探针：NED-5’ATAAGGTGGGTGGAGGAGTTAGCCGGG3’-BHQ2，如SEQ IDNO.12所示。
(3)PCR扩增：
配制样本检测所用的野生型PCR检测体系，体系总体积为20μL，组成如下表10所示：
表10
配制样本检测PCR突变检测体系，体系总体积为20μL，组成如下表11所示：
表11
(4)PCR反应程序：
第一阶段：37℃，2分钟；
第二阶段：95℃，5分钟；
第三阶段：95℃，10秒；60℃35秒，45个循环；60℃时收集荧光信号；
在进行PCR扩增时，同时对野生检测体系、突变检测体系分别设置阴性对照，阴性对照是将DNA样本替换为无菌水。
(5)检测结果
直接读取PCR检测体系的Cq值，根据PCR野生检测体系和PCR突变检测体系的Cq差值△Cq来判断基因型。综合约200例人口腔拭子gDNA样本的本试剂盒检测结果，比对桑格测序结果，得出本试剂盒基于△Cq值的基因型判定标准：对于rs12041331(PEAR1)，ΔCq＝(mCq－wCq)>2判定检测结果为野生，ΔCq＝(wCq－mCq)>2判定检测结果为突变，ΔCq＝∣wCq－mCq∣为0-2判定检测结果为杂合。对于rs6065(GP1BA)，ΔCq＝(mCq－wCq)>1判定检测结果为野生，ΔCq＝(wCq－mCq)>1判定检测结果为突变，ΔCq＝∣wCq－mCq∣为0-1判定检测结果为杂合。对于rs730012(LTC4S)，ΔCq＝(mCq－wCq)>1判定检测结果为野生，ΔCq＝(wCq－mCq)>1判定检测结果为突变，ΔCq＝∣wCq－mCq∣为0-1判定检测结果为杂合。其中wCq为PCR野生型检测体系的Cq值，mCq为PCR突变型检测体系的Cq值。
本试剂盒既可以用于诊断目的rs12041331、rs6065、rs730012基因分型，用来指导阿司匹林精准用药，也可以用于非诊断和治疗目的的rs12041331、rs6065、rs730012基因分型，例如用于基础研究。
实施例3试剂盒鲁棒性的评估
鲁棒性参考品为rs12041331杂合子、rs6065杂合子、rs730012杂合子的gDNA样本。按照实施例2的方法提取杂合子gDNA、分别制备40ng、20ng、10ng、5ng、2.5ng、1.25ng的杂合子gDNA样本，每个浓度样品三批号、双复管检测，以gDNA样本浓度的对数值为横坐标、Cq值为纵坐标，绘制校准曲线，将校准曲线的斜率带入公式：10-1/斜率–1，得扩增效率。结果显示，由校准曲线计算而得的扩增效率均在0.9至1之间，且野生型和突变型检测体系中每个基因位点的Cq值均呈现剂量依赖性，这说明本发明试剂盒的鲁棒性良好(如图2所示)。
实施例4试剂盒精密度的评估
不精密度样本参考品含rs12041331、rs6065、rs730012位点的杂合型和纯合型gDNA，分别评估高、低浓度(10ng、2.5ng/test)样本的精密度。每样本测5日，每日2批号，每个批号重复测一个样本8次，共80个数据，从所有80个结果计算出批内和批间不精密度的CV值，计算结果显示，试剂盒的批内和批间不精密度CV值均小于5％。其中，批内不精密度检测结果如图3所示。
Claims (10)
1.一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物，其特征是：包括3条等位基因特异性野生型正向引物、3条等位基因特异性突变型正向引物、3条反向引物及3条TaqMan探针；所述3条等位基因特异性野生型正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示，所述3条等位基因特异性突变型正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4-SEQ ID NO.6所示，所述3条反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示，所述3条TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征是：所述3条TaqMan探针的5’端均修饰有荧光基团，3’端均修饰有淬灭基团；优选的，每条TaqMan探针上的荧光基团不同，每条TaqMan探针上的淬灭基团相同或不同；优选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、NED，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2。
3.一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的试剂盒，其特征是：包括权利要求1或2所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括TaqMix，所述TaqMix包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液。
5.一种阿司匹林指导用药试剂盒，其特征是：包括下列组合中的任意一种：
组合一：权利要求1或2所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物；
组合二：权利要求1或2所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物以及TaqMix，所述TaqMix包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液。
6.权利要求1或2所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物、权利要求3或4所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的试剂盒在人rs12041331、rs6065、rs730012基因型检测中的应用。
7.一种检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的方法，其特征是：包括采用权利要求1或2所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物和探针组合物或采用权利要求3或4所述的检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的试剂盒、通过荧光PCR的方法对待测DNA样本进行检测的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)配制PCR野生型检测体系：将3条等位基因特异性野生型正向引物、3条等位基因特异性突变型正向引物、3条反向引物、3条TaqMan探针、TaqMix、待测DNA样本和水同时加入一个反应管中，得到PCR野生型检测体系；
(2)配制PCR突变型检测体系：将3条等位基因特异性突变型正向引物、3条等位基因特异性野生型正向引物、3条反向引物、3条TaqMan探针、TaqMix、待测DNA样本和水同时加入一个反应管中，得到PCR突变型检测体系；
(3)将配制好的野生型检测体系和突变型检测体系进行扩增；
(4)直接读取PCR野生型检测体系和PCR突变型检测体系的Cq，分别根据野生型检测体系和突变型检测体系Cq值的差值ΔCq来判断rs12041331、rs6065、rs730012的基因型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是：在PCR突变型检测体系中，3条等位基因特异性突变型正向引物的浓度大于3条等位基因特异性野生型正向引物的浓度；在PCR野生型检测体系中，3条等位基因特异性突变型正向引物的浓度小于3条等位基因特异性野生型正向引物；
优选的，在PCR野生型检测体系中，各等位基因特异性野生型正向引物的浓度相同，各等位基因特异性突变型正向引物的浓度相同，各反向引物的浓度相同，各TaqMan探针的浓度相同；在PCR突变型检测体系中，各等位基因特异性野生型正向引物的浓度相同，各等位基因特异性突变型正向引物的浓度相同，各反向引物的浓度相同，各TaqMan探针的浓度相同；
优选的，PCR野生型检测体系中，每条引物的终浓度均为0.005-1.2μM，每条TaqMan探针的终浓度均为0.05-1μM；PCR突变型检测体系中，每条引物的终浓度均为0.005-1.2μM，每条TaqMan探针的终浓度均为0.05-1μM。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征是：
步骤(3)中，扩增的反应程序如下：
第一阶段：37℃，2分钟；
第二阶段：95℃，5分钟；
第三阶段：95℃，10秒；60℃35秒，45个循环；60℃时收集荧光信号；
优选的，步骤(4)中，对于rs12041331，ΔCq＝(mCq-wCq)>2时判定检测结果为野生型，ΔCq＝(wCq-mCq)>2时判定检测结果为突变型，ΔCq＝∣wCq-mCq∣为0-2时判定检测结果为杂合型；对于rs6065，ΔCq＝(mCq-wCq)>1时判定检测结果为野生型，ΔCq＝(wCq-mCq)>1时判定检测结果为突变型，ΔCq＝∣wCq-mCq∣为0-1时判定检测结果为杂合型；对于rs730012，ΔCq＝(mCq-wCq)>1时判定检测结果为野生型，ΔCq＝(wCq-mCq)>1时判定检测结果为突变型，ΔCq＝∣wCq-mCq∣为0-1时判定检测结果为杂合型；
优选的，所述待测DNA样本为人类口腔拭子DNA样本。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311674447.2A CN117568468A (zh) | 2023-12-07 | 2023-12-07 | 检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311674447.2A CN117568468A (zh) | 2023-12-07 | 2023-12-07 | 检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117568468A true CN117568468A (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=89893808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311674447.2A Pending CN117568468A (zh) | 2023-12-07 | 2023-12-07 | 检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117568468A (zh) |
-
2023
- 2023-12-07 CN CN202311674447.2A patent/CN117568468A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104232781B (zh) | 一种检测HLA‑B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法 | |
| CN106929591A (zh) | 一种人类hla‑b*5801基因多态性检测试剂盒 | |
| CN106701987A (zh) | 人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增系统和检测试剂盒 | |
| CN113046424B (zh) | 一种用于pcr检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和pcr检测方法 | |
| CN112280848A (zh) | 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒 | |
| CN111118138A (zh) | 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法 | |
| JP5290957B2 (ja) | 免疫関連遺伝子の多型の検出用プローブおよびその用途 | |
| CN105886606A (zh) | 焦磷酸测序法快速检测华法林代谢酶基因多态性的试剂盒及其应用 | |
| US9879314B2 (en) | Method for detecting HLA-A*31:01 allele | |
| Tranah et al. | Multiple displacement amplification prior to single nucleotide polymorphism genotyping in epidemiologic studies | |
| JP4446014B2 (ja) | 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法 | |
| CN114410811A (zh) | 检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法、引物探针组合物、应用、试剂盒及使用方法 | |
| CN105624315A (zh) | 一种ALDH2基因c.1510位点多态性检测的引物和试剂盒 | |
| CN105018490A (zh) | 用于检测人类mthfr基因多态性的引物对、探针及试剂盒 | |
| CN117305437A (zh) | 一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN113249459A (zh) | 用于精神分裂症患者用药指导的基因群检测的引物组及相关用途、相应的试剂盒和使用方法 | |
| CN110819709A (zh) | 用于荧光定量pcr检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法 | |
| CN114592054B (zh) | 用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法 | |
| CN106520948B (zh) | 一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针、试剂盒及其检测方法 | |
| CN117568468A (zh) | 检测人rs12041331、rs6065、rs730012遗传多态性的引物探针组合及其应用 | |
| CN116004775A (zh) | 一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN112553321B (zh) | 一种用于检测mtrr基因和mtr基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法 | |
| Shi et al. | Application of kinetic polymerase chain reaction and molecular beacon assays to pooled analyses and high‐throughput genotyping for candidate genes | |
| CN106399565A (zh) | 一种rs12979860基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒 | |
| CN112899361A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |