CN112553321B

CN112553321B - 一种用于检测mtrr基因和mtr基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法

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Publication number: CN112553321B
Application number: CN202011546936.6A
Authority: CN
Inventors: 王丽颖; 黄茜; 陈同洋; 何犇
Original assignee: BIOSINO BIO-TECHNOLOGY AND SCIENCE Inc
Current assignee: BIOSINO BIO-TECHNOLOGY AND SCIENCE Inc
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112553321A

Abstract

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。本发明针对MTRR基因和MTR基因多态性在MTRR基因的66位点和MTR基因的2756位点设计特异性引物，并且选用看家基因GAPDH作为内参作为检测这两个位点多态性的引物组合。在检测时，将引物组合分为突变型检测体系和野生型检测体系，设置检测位点和内参的荧光值差异的阈值，通过突变型检测体系和野生型检测体系中的荧光值差异判断待测样本在MTRR基因的66位点和MTR基因的2756位点的基因型，进而可以快速、准确地判断MTRR基因的66位点和MTR基因的2756位点的多态性。

Description

一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。

背景技术

叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的一种水溶性B族维生素，由于其最早由菠菜叶中分离而得，故称为叶酸。在人体中的叶酸以活性物质四氢叶酸的形式作为一碳单位的传递者，为体内物质，如碱基的合成及核酸和蛋白质的甲基化提供甲基原料，从而参与许多化合物的生成和代谢。在叶酸-甲硫氨酸循环代谢途径中，MTR(甲硫氨酸合成酶)和MTRR(甲硫氨酸合成酶还原酶)发挥着重要作用。

MTR在代谢途径中可以催化同型半胱氨酸再甲基化形成甲硫氨酸，该催化过程需要有甲基类维生素B12的帮助，同时需要MTRR的还原作用，使其保持催化活性。MTR基因位于染色体1q43，基因全长约105.2kb，转录的mRNA全长约7122nt，含有33个外显子，编码1265个氨基酸残基组成的蛋白质。一般都将MTR基因突变作为G型甲基维生素缺乏症的主要致病原因，其中位点A2756G是最主要和研究最多的突变。

MTRR是具有电子转移作用的铁氧化还原蛋白-NADP(+)还原酶(ferredoxin-NADP(+)reductase，FNR)的家族成员。该酶在叶酸-甲硫氨酸循环代谢途径中通过还原作用使MTR重新具有功能活性。MTRR基因位于5p15.3-p15.2，基因全长约32,021kb，转录的mRNA全长3,274nt，含有15个外显子，编码726个氨基酸残基组成的蛋白。MTRR基因突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症E型的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要病因之一，其中基因突变A66G是研究最主要和最多的。

MTR和MTRR在叶酸代谢循环过程中起关键作用，如果发生基因突变，合成的酶会出现酶缺陷或酶活性下降，甲基的传递作用下降，甲硫氨酸的合成就会受到阻碍，从而引发一系列的病变。首先，甲基化作用的降低，影响体内碱基、核酸和蛋白质等物质的合成，影响很多代谢过程；其次，甲硫氨酸合成功能的降低导致了体内的同型半胱氨酸堆积，血液中高浓度的同型半胱氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的心脑血管致病因素；同时，高浓度的同型半胱氨酸作用于敏感的胚胎神经细胞，可造成无脑畸形和脊柱裂等不可逆损害；最后，同型半胱氨酸溶解性小，易于在泌尿系统形成结石。因此，MTR基因和MTRR基因突变应引起广泛的关注。

目前，对基因突变位点的检测，主要是利用特异性荧光探针法和熔解曲线法。特异性荧光探针法利用特异性的探针，对目标序列进行检测，该方法的特异性很高，但对于探针的设计要求很高，而且合成探针的费用也较高。熔解曲线的方法，虽然快速、准确，但是对于扩增仪的温控要求非常高，一般的仪器无法满足要求。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。

第一方面，本发明提供一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合，包括：

MTRR 66A上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTA-3’(SEQ ID NO.1)，

MTRR 66G上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTG-3’(SEQ ID NO.2)，

MTR 2756A上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGA-3’(SEQ ID NO.3)，

MTR 2756G上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGG-3’(SEQ ID NO.4)，

MTRR 66下游引物：5’-CACTGTAACGGCTCTAACC-3’(SEQ ID NO.5)，

MTR2756下游引物：5’-TGTGGGCATCATCGTA-3’(SEQ ID NO.6)，

内参上游引物：5’-GCCCCCGGTTTCTATAAATTG-3’(SEQ ID NO.7)，

内参下游引物：5’-CTGGCGACGCAAAAGAAGAT-3’(SEQ ID NO.8)。

进一步地，所述引物组合分为野生型检测体系和突变型检测体系；

所述野生型检测体系包括：

MTRR 66A上游引物、MTR 2756A上游引物、MTRR 66下游引物、MTR 2756下游引物、内参上游引物和内参下游引物；

所述突变型检测体系包括：

MTRR 66G上游引物、MTR 2756G上游引物、MTRR 66下游引物、MTR 2756下游引物、内参上游引物和内参下游引物。

本发明进一步提供和所述引物组合配套使用的探针组合，所述探针组合包括如下探针：

MTRR 66探针：5’-AACGGCTCTAACCTTATCGG-3’(SEQ ID NO.9)，

MTR 2756探针：5’-TCACCCAGTGAAGCCCACG-3’(SEQ ID NO.10)，

内参探针：5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’(SEQ ID NO.11)，

每条探针的5’端为荧光基团，3’端为淬灭基团。

进一步地，所述荧光基团为荧光基团FAM、VIC、ROX、HEX或Cy5；

所述淬灭基团为BHQ或MGB。

第二方面，本发明提供一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组合和探针组合。

进一步地，所述试剂盒包括如下两个PCR体系：

表1野生型PCR反应液

试剂名称	浓度
		MTRR 66A上游引物	150～200nM
MTR 2756A上游引物	150～200nM
		MTRR 66下游引物	150～200nM
MTR 2756下游引物	150～200nM
		MTRR 66探针	150～200nM
MTR 2756探针	150～200nM
		内参上游引物	150～200nM
内参下游引物	150～200nM
		内参探针	150～200nM
PCR缓冲液	1×
		dNTPs	200μM
MgCl<sub>2</sub>	400μM
		Taq酶	1U
UNG酶	1U
		超纯水	补至总体为18μL

表2突变型PCR反应液

进一步地，所述试剂盒还包括：突变型对照品和野生型对照品。

进一步地，野生型对照品是浓度为10⁵～10⁸copy/μL的MTRR A66G和MTR A2756G位点均为野生型的混合质粒，突变型对照品是浓度为10⁵～10⁸copy/μL的MTRR A66G和MTRA2756G位点均为突变型的混合质粒。

本试剂盒检测的反应体系为20μL，其分为野生型反应体系、突变型反应体系。野生型反应体系中加入18μL的野生型PCR反应液和2μL的样本或野生型对照品，突变型反应体系中加入18μL的突变型PCR反应液和2μL的样本或突变型对照品，同时，每个反应体系还需设置空白对照，即PCR反应液中加入2μL的超纯水。

第三方面，本发明提供一种检测MTRR基因和MTR基因多态性的方法，包括：

使用上述试剂盒，对待测样本进行PCR检测，根据荧光检测结果判断待测样本的MTRR基因和MTR基因分别为突变型还是野生型。

进一步地，所述PCR检测的流程为：

20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，40～50个循环，收集荧光。

进一步地，所述根据荧光检测结果判断待测样本的MTRR基因和MTR基因分别为突变型还是野生型，具体为：

以同一反应体系中目标检测位点的Ct值-同一反应体系中内参的Ct值为△Ct，针对MTRR的66位点：

当野生型体系中△Ct≤2.07，突变型体系中△Ct＞2.71或目标检测位点的Ct值为Undetermined时，判断待测样本的MTRR 66位点为野生型；

当野生型体系中△Ct＞2.07或者目标检测位点Ct值为Undetermined，突变型体系中△Ct≤2.71，判断待测样本的MTRR 66位点为纯合突变型；

当野生型体系△Ct≤2.07和突变型体系△Ct≤2.71时，判断待测样本的MTRR 66位点为杂合突变型；

针对MTR的2756位点：

当野生型体系中△Ct≤2.26，突变型体系中△Ct＞0.73或者目标检测位点Ct值为Undetermined，判断待测样本的MTR 2756位点为野生型；

当野生型体系中△Ct＞2.26或者目标检测位点Ct值为Undetermined，突变型体系中△Ct≤0.73，判断待测样本的MTR 2756位点为纯合突变型；

当野生型体系△Ct≤2.26和突变型体系△Ct≤0.73时，判断待测样本的MTR 2756位点为杂合突变型。

目前，已有的实验方法中△Ct的计算方法是将两管中的野生型Ct值-突变型Ct值，由于野生型Ct值和突变型Ct值是在两个PCR反应管中分别获得，而实际操作中不能保证两管中反应条件的完全一致，故容易引起较大的△Ct偏差，最终导致基因型的错判。而本发明针对检测位点设计ARMS野生型和突变型引物并在引物中引入错配，以提高引物的特异性，再设计Taqman探针，使用荧光PCR仪进行扩增，获得Ct值，再对同一个PCR反应管中目标扩增位点和内参基因的Ct值进行计算，即△Ct(目标扩增位点的Ct值-内参基因的Ct值)，判断该目标扩增位点是否存在扩增，综合野生型和突变型反应体系中的各△Ct结果进行基因型的判定。该检测方法提高了基因检测的特异性，能够较好的区分野生型和突变型序列，并且结果的判定方法确保了计算△Ct值的数值来源于同一个反应管中，优于对两管中Ct值进行计算△Ct(野生型Ct值-突变型Ct值)，使外界引入的误差因素一致，扩增条件一致，降低了因两个PCR反应管中Ct值的差异过大而导致基因型误判的概率。

与现有技术相比，本发明运用突变型检测体系和野生型检测体系中的荧光值差异判读方法区分野生型和突变型，具有如下有益效果：

(1)特异性高，本发明选用的ARMS引物增强了引物与模板的匹配度，使试剂盒的特异性提高，尽量避免假阳性的产生。

(2)准确性高，本发明选用同一个扩增管中的目标检测基因Ct值和内参基因Ct值，进行△Ct的计算方法，保证了外界引入因素的一致性，降低了人为误差的产生，而导致的结果误判。

(3)防污染能力强，本发明在反应体系中加入了UNG酶以及dUTP，能够消除残留的扩增产物，避免了假阳性结果的产生。

(4)检测速度快，本发明的试剂盒中是PCR预混反应液，检测时只需分装至反应管中加入样本即可。加样过程和PCR反应过程一共仅需50分钟，缩短了报告时间。

(5)节约成本，本发明试剂盒中采用的是多重荧光检测，在同一管中即可检测两个位点的基因多态性，节省了反应液的成本，提高了检测效率。

附图说明

图1为本发明实验例1提供的临床样本的扩增曲线；其中，样本的基因多态性为MTRR A66G位点野生型，MTR A2756G位点野生型。

图2为本发明实验例1提供的临床样本的扩增曲线，其中，样本的基因多态性为MTRR A66G位点杂合突变型，MTR A2756G位点杂合突变型。

图3为本发明实验例1提供的临床样本的扩增曲线；其中，样本的基因多态性为MTRR A66G位点纯合突变型，MTR A2756G位点杂合突变型。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物和探针的设计

本实验通过分析MTRR A66G和MTR A2756G位点的序列和内参基因GAPDH的基因序列，利用引物设计软件PrimePrimer5.0，设计引物和探针，并且在MTRR A66G和MTR A2765G上游引物的3’端的第3位引入一个错配碱基，序列如下：

MTRR 66A上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTA-3’,

MTRR 66G上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTG-3’,

MTRR 66下游引物：5’-CACTGTAACGGCTCTAACC-3’,

MTRR 66探针：5’-AACGGCTCTAACCTTATCGG-3’，5’端为荧光基团FAM，3’端为淬灭基团BHQ。

MTR 2756A上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGA-3’,

MTR 2756G上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGG-3’,

MTR 2756下游引物：5’-TGTGGGCATCATCGTA-3’,

MTR 2756探针：5’-TCACCCAGTGAAGCCCACG-3’，5’端为荧光基团VIC，3’端为淬灭基团BHQ。

内参上游引物：5’-GCCCCCGGTTTCTATAAATTG-3’,

内参下游引物：5’-CTGGCGACGCAAAAGAAGAT-3’,

内参探针：5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’，5’端为荧光基团ROX，3’端为淬灭基团BHQ。

实施例2试剂盒的组装

本发明采用实施例1中所示的引物和探针，对多重扩增中的各位点的引物和探针的一、PCR反应液的配制

PCR反应液分为野生型体系反应液和突变型反应液，每个反应液中包含引物、探针、PCR缓冲液、MgCl₂溶液、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、Taq酶、UNG酶、超纯水等。具体的内容如下：

表3野生型PCR反应液

试剂名称	浓度
		MTRR 66A上游引物	150nM
MTR 2756A上游引物	150nM
		MTRR 66下游引物	150nM
MTR 2756下游引物	150nM
		MTRR 66探针	150nM
MTR 2756探针	150nM
		内参上游引物	150nM
内参下游引物	150nM
		内参探针	150nM
PCR缓冲液	1×
		dNTPs	200μM
MgCl<sub>2</sub>	400μM
		Taq酶	1U
UNG酶	1U
		超纯水	补至总体为18μL

表4突变型PCR反应液

二、对照品的配制

本实验中提供了对照品的配制。野生型对照品中包含MTRR 66A质粒、MTR2756 A质粒和GAPDH质粒，突变型对照品中包含MTRR 66G质粒、MTR2756 G质粒和GAPDH质粒。

表5对照品中各组分含量

三、试剂盒的组装

本发明提供的试剂盒中包括野生型PCR反应液、突变型PCR反应液、野生型对照品、突变型对照品、超纯水。

四、PCR反应程序

本试剂盒检测的反应体系为20μL，其分为野生型反应体系、突变型反应体系。野生型反应体系中加入18μL的野生型PCR反应液和2μL的样本或野生型对照品，突变型反应体系中加入18μL的突变型PCR反应液和2μL的样本或突变型对照品，同时，每个反应体系还需设置空白对照，即PCR反应液中加入2μL的超纯水。用于检测的PCR反应程序为：20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，40～50个循环，收集荧光。

实施例3利用ROC曲线，得出基因扩增的判断标准

选取MTRR A66G野生型40例(编号为66W001～040)，纯合突变型40例(编号为66M001～040)，杂合突变型40例(编号为66H001～040)，MTR 2756野生型37例(编号为2756W001～037)，纯合突变型37例(编号为2756M001～037)，杂合突变型37例(编号为2756H001～037)。上述样本为人EDTA抗凝全血，各样本的基因型由“金标准”测序方法进行确定。使用商业用DNA提取试剂盒，提取样本的DNA，DNA需满足纯度在1.6～2.0，浓度大于10ng/μL的要求。再利用本试剂盒对上述样本DNA进行检测，分别计算野生型反应体系和突变型反应体系的△Ct_W和△Ct_M，如果Ct值为Undetermined时，则取最大循环数40代替Ct值进行△Ct的计算。统计两个反应体系中数据，使用软件分别对MTRRA66G各基因型样本和MTRA2756G各基因型样本进行ROC分析，找出约登指数最大值的点。

表6 MTRR A66G样本各反应体系△Ct值

表7 MTRR A66G样本野生型反应体系ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						<-2.99	0	0.0-4.5	100	91.2-100.0	0
≤2.07	100	95.5-100.0	100	91.2-100.0	100
						≤17	100	95.5-100.0	0	0.0-8.8	0

表8 MTRR A66G样本突变型反应体系ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						<-3.65	0	0.0-4.5	100	91.2-100.0	0
≤2.71	100	95.5-100.0	100	91.2-100.0	100
						≤16.57	100	95.5-100.0	0	0.0-8.8	0

表9 MTR A2756G样本各反应体系△Ct值

表10 MTR A2756G样本野生型反应体系ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						<-3.79	0	0.0-4.9	100	90.5-100.0	0.00
≤2.26	98.65	92.7-100.0	100	90.5-100.0	98.65
						≤3.14	98.65	92.7-100.0	97.3	85.8-99.9	95.95
≤3.21	100	95.1-100.0	97.3	85.8-99.9	97.30
						≤18.15	100	95.1-100.0	0	0.0-9.5	0.00

表11 MTR A2756G样本突变型反应体系ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						<-5.69	0	0.0-4.9	100	90.5-100.0	0.00
≤0.73	98.65	92.7-100.0	100	90.5-100.0	98.65
						≤1.68	98.65	92.7-100.0	97.3	85.8-99.9	95.95
≤3.96	100	95.1-100.0	97.3	85.8-99.9	97.30
						≤17.16	100	95.1-100.0	0	0.0-9.5	0.00

由统计结果可知，MTRR A66G野生型反应体系中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤2.07。MTRR A66G突变型反应体系中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤2.71。MTR A2756G野生型反应体系中约登指数最大值为98.65，其对应的△Ct为≤2.26。MTRA2756G突变型反应体系中约登指数最大值为98.65，其对应的△Ct为≤0.73。

综合上述实验结果，MTRR A66G和MTR A2756G基因型判断的依据如下：

表12 MTRR A66G位点基因型结果判断依据

表13 MTR A2756G位点基因型结果判断依据

对比例1

本对比例和实施例1引物设计相同，区别在于引入不同错配，具体如下：

本对比例中提供了在检测MTRR A66G位点的上游引物中，除了突变位点外另外再引入不同的错配碱基的引物。组合1为未引入错配的引物，组合2、3、4为同一位点引入不同碱基的引物，具体序列如下：

表14引入错配引物序列

除上述上游引物在PCR反应液配制中替换实施例1中的上游引物，其余PCR反应液中成分和浓度保持不变，PCR反应体系和PCR反应程序也不变。

实验结果如下表：

表15引入不同错配碱基检测结果

上述实验结果中，组合1对于野生型和纯合突变型的样本无法区分，组合2对于纯合突变的样本无法区分，组合4对于野生型的样本无法区分，只有组合3可以有效区分野生型和突变型的样本，故本发明中选择组合3的引物序列。

对比例2

本对比例选用△Ct不同的计算公式，得出判断依据，具体如下：

本对比例提供了一种不同的△Ct的计算公式。将△Ct的计算公式设定为△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值，重新计算实施例3中样本的△Ct值。将MTRR A66G野生型样本和杂合突变型样本的△Ct作为一组数据，纯合突变型样本和杂合突变型样本的△Ct作为一组数据，分别使用软件进行ROC分析，找出约登指数最大值的点，同理，对MTR A2756G样本也找出约登指数最大值的点。

表16 MTRR A66G野生型样本和杂合突变型样本ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						≥-16.87	100	91.2-100.0	0	0.0-8.8	0
>-8.53	100	91.2-100.0	100	91.2-100.0	100
						>1.72	0	0.0-8.8	100	91.2-100.0	0

表17 MTRR A66G纯合突变型样本和杂合突变型样本ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						<-1.18	0	0.0-8.8	100	91.2-100.0	0
≤1.72	100	91.2-100.0	100	91.2-100.0	100
						≤18.29	100	91.2-100.0	0	0.0-8.8	0

表18 MTR A2756G野生型样本和杂合突变型样本ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						≥-17.89	100	90.5-100.0	0	0.0-9.5	0
>-5.26	100	90.5-100.0	100	90.5-100.0	100
						>1.53	0	0.0-9.5	100	90.5-100.0	0

表19 MTR A2756G纯合突变型样本和杂合突变型样本ROC分析结果

△Ct	灵敏度(％)	95％CI	特异性(％)	95％CI	灵敏度+特异性-100
						<-1.16	0	0.0-9.5	100	90.5-100.0	0
≤1.53	100	90.5-100.0	100	90.5-100.0	100
						≤20.03	100	90.5-100.0	0	0.0-9.5	0

由统计结果可知，MTRR A66G野生型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为＞-8.53。MTRR A66G纯合突变型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤1.72。MTR A2756G野生型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为＞-5.26。MTR A2756G纯合突变型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤1.53。

MTRR A66G和MTR A2756G基因型判断的依据如下：

表20基因型结果判断依据

基因位点	野生型	纯合突变型	杂合突变型
				MTRR A66G	△Ct≤-8.53	△Ct＞1.72	-8.53＜△Ct≤1.72
MTR A2756G	△Ct≤-5.26	△Ct＞1.53	-5.26＜△Ct≤1.53

实验例1

本实验选用临床样本100例(编号001～100)，基因型别已由“金标准”测序方法确认，其中MTRR A66G野生型63例，纯合突变型5例，杂合突变型32例，MTR A2756G野生型61例，纯合突变型2例，杂合突变型37例，利用本发明涉及的检测试剂盒进行检测，通过荧光PCR仪得到的Ct值，利用实施例3和中的方法，进行计算，判断基因型，统计样本的符合率，结果如下：

表21临床样本检测结果

表22 MTRR A66G位点结果统计表

由上述结果统计MTRR A66G位点各基因型的符合率，计算如下：

MTRR A66G位点AA型符合率＝63/(63+0+0)*100％＝100％，

MTRR A66G位点GG型符合率＝5/(5+0+0)*100％＝100％，

MTRR A66G位点AG型符合率＝32/(32+0+0)*100％＝100％。

表23 MTR A2756G位点样本结果统计表

由上述结果统计MTR A2756G位点各基因型的符合率，计算如下：

MTRA2756G位点AA型符合率＝61/(61+0+0)*100％＝100％，

MTR A2756G位点GG型阳性符合率＝2/(2+0+0)*100％＝100％，

MTR A2756G位点AG型阳性符合率＝37/(37+0+0)*100％＝100％。

由上述结果可知，本发明试剂盒检测结果与“金标准”测序的结果符合率比较中MTRR A66G位点和MTR A2756G位点的各基因型的符合率均为100％，说明本试剂盒的结果准确性高。

图1-图3为部分临床样本的扩增曲线，其中图1样本的基因多态性为MTRR A66G位点野生型，MTR A2756G位点野生型。图2样本的基因多态性为MTRR A66G位点杂合突变型，MTR A2756G位点杂合突变型。图3样本的基因多态性为MTRR A66G位点纯合突变型，MTRA2756G位点杂合突变型。

从图1-图3可以看出本发明的野生型PCR体系和突变型PCR体系中各条引物均可以正常扩增，相互之间无影响。

实验例2

本发明同时采用其他多组引物对重复如本发明实施例3所示的流程，具体有：

对比引物组合1：

MTRR A66G位点：

MTRR 66A上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTA-3’(SEQ ID NO.1)，

MTRR 66G上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTG-3’(SEQ ID NO.2)，

MTRR 66下游引物：5’-CACTGTAACGGCTCTAACC-3’(SEQ ID NO.5)。

MTR A2756G位点：

MTR 2756A上游引物：5’-TGAAGATATTAGACACGA-3’(SEQ ID NO.12)，

MTR 2756G上游引物：5’-TGAAGATATTAGACACGG-3’(SEQ ID NO.13),

MTR 2756下游引物：5’-GCCCAGGTAGTCACGG-3’(SEQ ID NO.14)。

对比引物组合2：

MTRR A66G位点：

MTRR 66A上游引物：5’-CATCGCAGAAGAAAAA-3’(SEQ ID NO.15)，

MTRR 66G上游引物：5’-CATCGCAGAAGAAAAG-3’(SEQ ID NO.16)，

MTRR 66下游引物：5’-CCACTGTAACGGCTCT-3’(SEQ ID NO.17)。

MTR A2756G位点：

MTR 2756A上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGA-3’(SEQ ID NO.3)，

MTR 2756G上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGG-3’(SEQ ID NO.4),

MTR 2756下游引物：5’-TCACCCAGTGAAGCCCACG-3’(SEQ ID NO.6)。

对比引物组合3：

MTRR A66G位点：

MTRR 66A上游引物：5’-CATCGCAGAAGAAAAA-3’(SEQ ID NO.15)，

MTRR 66G上游引物：5’-CATCGCAGAAGAAAAG-3’(SEQ ID NO.16)，

MTRR 66下游引物：5’-CCACTGTAACGGCTCT-3’(SEQ ID NO.17)。

MTR A2756G位点：

MTR 2756A上游引物：5’-TGAAGATATTAGACACGA-3’(SEQ ID NO.12)，

MTR 2756G上游引物：5’-TGAAGATATTAGACACGG-3’(SEQ ID NO.13),

MTR 2756下游引物：5’-GCCCAGGTAGTCACGG-3’(SEQ ID NO.14)。

上述引物组合中的引物都已经过单体系扩增验证，均可正常扩增且区分相应的基因型别。在PCR反应液配制中除上述引物替换实施例3中的引物，其余PCR反应液中成分和浓度保持不变，PCR反应体系和PCR反应程序也不变。

实验结果如下表：

表24对比引物组合检测结果

上述实验结果中，组合1对于2756位点的野生型和纯合突变型的样本无法区分，组合2对于66位点的野生型的样本无法区分，组合3对于66位点和2756位点的野生型和纯合突变型的样本都无法区分，故本发明中不选择以上3个组合的引物序列。

其在构建多重PCR体系时，由上述结果可知，可以看出由于引物间的影响，难以使同一反应体系中的所有引物进行正常扩增。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中生北控生物科技股份有限公司

<120> 一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法

<130> KHP201119036.3

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccatcgcag aagaacta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccatcgcag aagaactg 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatatgaaga tattagacac ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatatgaaga tattagacac gg 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cactgtaacg gctctaacc 19

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgggcatc atcgta 16

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcccccggtt tctataaatt g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctggcgacgc aaaagaagat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacggctcta accttatcgg 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcacccagtg aagcccacg 19

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctctgctcc tcctgttcga cagtcagc 28

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgaagatatt agacacga 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgaagatatt agacacgg 18

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcccaggtag tcacgg 16

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catcgcagaa gaaaaa 16

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

catcgcagaa gaaaag 16

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccactgtaac ggctct 16

Claims

1.一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物组合，以及，探针组合；

所述引物组合分为野生型检测体系和突变型检测体系：

所述野生型检测体系包括：

MTRR 66 A上游引物、MTR 2756 A上游引物、MTRR 66 下游引物、MTR 2756 下游引物、内参上游引物和内参下游引物；

所述突变型检测体系包括：

MTRR 66 G上游引物、MTR 2756 G上游引物、MTRR 66 下游引物、MTR 2756 下游引物、内参上游引物和内参下游引物；

MTRR 66 A上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTA-3’，

MTRR 66 G上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTG-3’，

MTR 2756 A上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGA-3’，

MTR 2756 G上游引物：5’-AATATGAAGATATTAGACACGG-3’，

MTRR 66 下游引物：5’-CACTGTAACGGCTCTAACC-3’，

MTR 2756 下游引物：5’-TGTGGGCATCATCGTA-3’，

内参上游引物：5’-GCCCCCGGTTTCTATAAATTG-3’，

内参下游引物：5’-CTGGCGACGCAAAAGAAGAT-3’；

所述探针组合包括如下探针：

MTRR 66 探针：5’-AACGGCTCTAACCTTATCGG-3’，

MTR 2756 探针：5’-TCACCCAGTGAAGCCCACG-3’，

内参探针：5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’，

每条探针的5’端为荧光基团，3’端为淬灭基团；

所述荧光基团为荧光基团FAM、VIC、ROX、HEX或Cy5；

所述淬灭基团为BHQ或MGB。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括如下两个PCR体系：

野生型PCR反应体系，包括：

MTRR 66 A上游引物150~200nM、MTR 2756 A上游引物 150~200nM、MTRR 66 下游引物150~200nM、MTR 2756 下游引物150~200nM、MTRR 66探针 150~200nM、MTR 2756 探针150~200nM、内参上游引物 150~200nM、内参下游引物 150~200nM、内参探针 150~200nM、1×PCR缓冲液、150~250μM dNTPs、MgCl₂300~500μM、Taq酶和UNG酶；

突变型PCR反应体系，包括：

MTRR 66 G上游引物150~200nM、MTR 2756 G上游引物 150~200nM、MTRR 66 下游引物150~200nM、MTR 2756 下游引物150~200nM、MTRR 66探针 150~200nM、MTR 2756 探针150~200nM、内参上游引物 150~200nM、内参下游引物 150~200nM、内参探针 150~200nM、1×PCR缓冲液、150~250μM dNTPs、MgCl₂300~500μM、Taq酶和UNG酶。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

突变型对照品和野生型对照品。