CN105722999A - 检测遗传变体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测与疾病或障碍包括与药物不相容性相关的遗传变体的方法和试剂盒。所述方法和试剂盒使用偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，所述探针包含与遗传变体序列完全匹配的靶互补区碱基序列。

Description

检测遗传变体的方法
技术领域
本发明涉及遗传变体的检测，包括用于检测遗传变体的方法和试剂盒。
背景技术
群体中个体之间的遗传变异通常通过在一些情况下表现为疾病或障碍的表型改变而观察。有些情况下，疾病或障碍仅表现为对外部刺激诸如药物或其他化学品的不良反应。通过遗传检测进行药物不良反应(ADR)与患者遗传组成的关联研究有希望大大降低与ADR相关的发病率和死亡率。在ADR与遗传变体之间存在若干已知的联系。
氟尿嘧啶(5-FU)已被用作治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌和其他癌症患者的化疗剂达数十年。5-FU的副作用包括腹泻、口腔炎、粘膜炎、神经毒性，并在一些情况下，包括死亡。这些副作用主要是因为在遗传学上不能代谢该药物。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)(一种由DPD基因编码的酶)负责消除约80％标准剂量的5-FU。由于DPD基因突变导致的DPD缺乏已与严重的5-FU毒性相关联。已发现，约3-5％的患者具有至少部分DPD缺乏。与DPD缺乏相关的最常见突变是IVS14+1G>A，其为在内含子14(称为DPD*2A)的剪接识别序列处发生的G>A碱基改变。该单核苷酸变异导致外显子跳读，并在DPDmRNA中产生165-bp的缺失。纯合子DPD*2A基因型导致完全缺乏，而杂合的DPD*2A基因型导致DPD的部分缺乏。该代谢功能障碍的治疗前检测可通过施用替代性处理而预防严重的5-FU副作用。
类似地，已报道了在用氯吡格雷治疗的急性冠状动脉综合征(ACS)患者尤其是接受经皮冠状动脉介入(PCI)的那些患者之中CYP2G19基因型与临床预后的联系。氯吡格雷是一种经常出现在处方中的口服抗血小板剂，其用于在冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病中抑制血块。作为噻吩并吡啶前药，氯吡格雷需要肝脏生物转化以形成活性代谢物。肝CYP2C19酶是在参与氯吡格雷代谢的CYP450超家族中的一种酶。CYP2C19基因是高度多态性的，具有超过25种已知的变体等位基因。最常见的CYP2C19功能丧失性等位基因是CYP2C19*2(c.681G>A；rs4244285)，等位基因频率在高加索人和非洲人中为约15％，在亚洲人中为29-35％。然而，当前针对功能丧失的遗传检测方法通常需要昂贵的仪器和长周转时间。
另一个实例是发现卡马西平引起的斯-琼综合征/中毒性表皮坏死松解症(SJS/TEN)与人白细胞抗原(HLA)特定等位基因HLA-B*1502的密切联系。卡马西平是用于治疗患有癫痫、神经性疼痛和双相情感障碍的一线药物。然而，卡马西平治疗可导致危险的或甚至致命性的皮肤反应，诸如在具有HLA-B*1502等位变异的患者中的SJS和TEN。HLA-B*1502等位基因在亚洲人群(日本人和韩国人除外)中的出现率远高于在高加索人和非洲人群中的出现率。一些研究揭示：对卡马西平引起的SJS进行的HLA-B*1502检测的阴性预测值可接近100％。HLA-B基因是高度多态性的，具有超过2000个独特的等位基因，这使得特定等位基因的测定复杂化。Sanger测序被视为HLA分型的金标准。然而，相位多值性(ambiguity)在等位基因组合的鉴定中经常导致SBT存在问题。下一代测序(NGS)技术能够获得单个DNA分子的序列，并可排除相位多值性，但当前NGS方法的缺点包括读取长度短、文库制备工作量高和处理时间长。最近的报道将环介导等温扩增(LAMP)用于HLA-B*1502筛查(Cheng,etal.Clin.Chem.2009,55,1568.)。遗憾的是，这些方法的特异性不足以将HLA-B*1502与相当多的在一些群体中不稀有的其他等位基因区分开来。错误的测定会将SJS风险极低的患者从有效的卡马西平疗法中排除，并增加治疗成本。由于HLA-B*1502筛查的成本效益高度依赖于遗传检测的准确性和成本，因此迫切需要特异性更高且成本更低的新测定法。
美国食品药品监督管理局(FDA)和其他监管机构已要求对若干在某些基因型中可能具有副作用的药物在标签上注明。例如，对基于氟尿嘧啶(5-FU)的药物的要求是要包括在一些个体中发生超敏反应的警告。又如，美国食品药品监督管理局在2007年发出警示：建议在用卡马西平开始治疗其祖先来自存在特定等位基因的地区的患者之前对HLA-B*1502等位基因进行筛查。类似地，卡马西平标签上的黑框警告建议在具有ACS或PCI的弱代谢者中考虑使用替代抗血小板疗法。
对于一些遗传变体而言，可以得到用于基因分型检测的商业试剂盒，将这些试剂盒用于预测个体对药物是否耐受。所用的试验平台包括Sanger测序和限制性片段长度多态性(RFLP)分析。基于这些平台的测定法要么耗时要么昂贵，因此不太适于按需检测。也可以获得基于实时PCR的商业试剂盒，遗憾的是，这些方法的特异性不足以将复杂的等位变体与相当多的在一些群体中不稀有的其他等位基因区分开来。由于筛查的成本效益高度依赖于遗传检测的准确性和成本，因此迫切需要特异性更高且成本更低的新测定法。
发明内容
本发明通过在本发明第一方面中提供一种检测与疾病或障碍包括与药物不相容性相关的遗传变体的方法而满足此需求，该方法包括以下步骤：
a)提供偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体完全匹配的碱基序列；
b)在允许吗啉代核酸探针和疑似含有遗传变体的核酸杂交的条件下将包含疑似含有遗传变体的核酸的样品与第一纳米粒子合并以提供第一混合物；
c)依序加热第一混合物并测定吗啉代核酸探针与疑似含有遗传变体的核酸之间的杂交复合物的解链温度；
d)将步骤c)中测定的解链温度与标准进行比较以确定样品是否包含含有遗传变体的核酸。
本发明的另一个方面涉及一种用于执行本文所述的方法的检测试剂盒，该试剂盒包含：偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体序列完全匹配的碱基序列，遗传变体序列与疾病或障碍包括与药物不相容性相关。
参照以下附图和对多种非限制性实施方案的描述，本发明的其他方面对本领域的技术人员将显而易见。
附图说明
附图未必按比例绘制，相反，重点通常在于阐述多种实施方案的原理。在以下描述中，参照以下附图描述本发明的多种实施方案。
图1.用于DPD测试的MOR的序列。每对探针的单碱基差异带有下划线。
图2.用于DPD基因型分析的合成DNA样品的序列。单核苷酸多态性(SNP)位置带有下划线。
图3.用于DPD靶序列扩增的PCR引物。
图4.用于DPD序列PCR扩增的热循环仪方案。
图5.随着靶向DPD*2ASNP的(a)WT和(b)MUT探针的DPD靶浓度而变化的解链温度。样品为合成的单链野生型DNA(圆形)、突变型DNA(方形)及其1:1混合物(三角形，代表杂合子样品)。Tm测量误差＝±1℃。
图6.DPD合成DNA样品的Tm WT和Tm MUT的散点图。Tm测量误差＝±1℃。
图7.典型HLA-B等位基因的比对。
图8.用于HLA-B*1502等位基因测定的PCR引物和探针设计。
图9.PCR1的HLA-B等位基因中的组合多值性(ambiguities)。
图10.用于HLA-B测试的MOR的序列。
图11.用于HLA-B基因型分析的合成DNA样品的序列。核苷酸变体通过下划线突出显示。
图13.用于HLA-B测试的PCR引物的序列。
图14.用于HLA-B序列PCR扩增的热循环仪方案。
图15.随着用于HLA-B测试的纳米探针1、2和3的靶浓度而变化的解链温度。
图16.用于CYP2C19测试的MOR的序列。单碱基差异通过下划线突出显示。
图17.随着靶向CYP2C19*2SNP的(a)WT和(b)MUT探针的靶浓度而变化的解链温度。样品为合成的单链野生型DNA(圆形)、突变型DNA(方形)及其1:1混合物(三角形，代表杂合子样品)。Tm测量误差＝±1℃。
图18.用于本研究的CYP2C19合成DNA样品的序列。SNP位置通过下划线突出显示。
图19.CYP2C19合成DNA样品的Tm WT和Tm MUT的散点图。Tm测量误差＝±1℃。
图20.用于CYP2C19靶序列扩增的PCR引物。
图21.用于CYP2C19PCR扩增的热循环仪方案。
具体实施方式
本发明人开发了一种经济有效的使用偶合到特定吗啉代寡核苷酸序列的纳米探针的基因分型平台。相应的测定试剂盒可大大促进药物基因组学知识在临床实践中的转化。
本发明的第一方面涉及一种检测与疾病或障碍包括与药物不相容性相关的遗传变体的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体完全匹配的碱基序列；
b)在允许吗啉代核酸探针和疑似含有遗传变体的核酸杂交的条件下将包含疑似含有遗传变体的核酸的样品与第一纳米粒子合并以提供第一混合物；
c)依序加热第一混合物并测定吗啉代核酸探针与疑似含有遗传变体的核酸之间的杂交复合物的解链温度；
d)将步骤c)中测定的解链温度与标准进行比较以确定样品是否包含含有遗传变体的核酸。
如本文所用的术语“遗传变体(geneticvariant)”是指不同于群体的优势基因型的天然存在的基因序列，其导致与疾病或障碍相关的表型变化，包括与药物不相容性。优势基因型可定义为存在于大部分群体中的序列或最常见的基因型。在多种实施方案中，优势基因型包括在至少55％的群体中、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％的群体中相同的基因序列。在本文中，术语“优势基因型”也称为“野生型”。因此，野生型或优势序列不包括导致疾病或障碍的遗传变异。遗传变体的实例包括核酸缺失、核酸添加、单核苷酸多态性(SNP)或等位变体。如本文所用的术语“遗传变体”因此意指给定基因的碱基序列中的特定变异。
本发明的吗啉代核酸为二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(PMO)，其中糖和磷酸骨架被氨基磷酸连接的吗啉基团取代，并且诸如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶，优选腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的核碱基偶合到吗啉环。PMO通常包括以下结构的单体单元：
术语“吗啉代(morpholino)”、“吗啉代核酸”和“吗啉代(寡)核苷酸”在本文可互换使用，并指代上述二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(PMO)。
在多种实施方案中，吗啉代寡核苷酸共价偶合到纳米粒子。这可以例如经由5’-端氨基磷酸基团或3’-端环氮而实现。本文所述的吗啉代寡核苷酸的长度可包括约5个单体单元至约40个单体单元、约10个单体单元至约35个单体单元或约15个单体单元至约35个单体单元。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”涉及两条不同的DNA或RNA链上的核苷酸/碱基的关系，或吗啉代的碱基序列和DNA/RNA链的核苷酸/碱基的关系，其中碱基通过沃森-克里克碱基配对而配对，即，鸟嘌呤与胞嘧啶、腺嘌呤与胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA)。因此，如本文所述的吗啉代包括可与靶核苷酸序列(例如DNA或RNA序列)通过互补碱基之间的常规沃森-克里克碱基配对而形成氢键的碱基序列。
在此背景下，术语“杂交”是指两条不同的DNA或RNA链之间或吗啉代的碱基序列与DNA/RNA序列的核苷酸/碱基之间按照沃森-克里克DNA互补性规则通过氢键而发生的相互作用。
靶互补区是具有与给定靶序列的互补性并在使得可以发生杂交的条件下杂交到所述靶的碱基序列。就这一点而言所用的“完全匹配(perfectlymatched)”是指如下特征：碱基序列与靶核酸序列100％互补，即，给定序列(例如，靶互补区)的所有碱基与靶中的连续核苷酸序列形成沃森-克里克碱基对。
如本文所用的术语“纳米粒子”是指大小从约1至约250nm的任何粒子，只要该纳米粒子能够提供光学性质即可，例如，产生对杂交反应敏感的光信号。如本文所述的纳米粒子的直径可在从约1nm至约250nm、约1nm至约200nm、约1nm至约160nm、约1nm至约140nm、约1nm至约120nm、约1nm至约80nm、约1nm至约60nm、约1nm至约50nm、约5nm至约250nm、约8nm至约250nm、约10nm至约250nm、约20nm至约250nm、约30nm至约250nm、约40nm至约250nm、约85nm至约250nm、约100nm至约250nm或约150nm至约250nm的范围内。在一些实施方案中，纳米粒子的直径在约1nm至约100nm的范围内。
在某些实施方案中，纳米粒子为金属纳米粒子。在其他实施方案中，纳米粒子为胶体金属。
在一些实施方案中，金属为贵金属。可以使用的贵金属的非限制性实例包括银、金、铂、钯、钌、锇、铱或其混合物，这仅仅列出了一些。也可用于形成纳米粒子的其他金属可包括但不限于铝、铜、钴、铟、镍或适于形成纳米粒子的任何其他金属。如本文所述的纳米粒子还可以包含半导体(包括例如但不限于CdSe、CdS，和涂有ZnS的CdS或CdSe)或磁性(例如，铁磁体)胶态材料。可用于实践本发明的其他纳米粒子包括而不限于ZnS、ZnO、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Si、SiO2、Fe、Ag、Cu、Ni、Al、钢、钴-铬合金、Cd、钛合金、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs。
制备ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs纳米粒子的方法也是本领域已知的。参见例如Weller,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,32,41(1993)；Henglein,Top.Curr.Chem.,143,113(1988)。制备金属、半导体和磁性纳米粒子的方法也是本领域熟知的，参见例如Ahmadi,T.E.etal.,Science,272,1924(1996)；Henglein,A.etal.,J.Phys.Chem.,99,14129(1995)。合适的纳米粒子也可以从例如TedPella,Inc.(金)、AmershamCorporation(金)和NanoprobesInc(金)商购获得。包含本文所述的材料的纳米粒子可以商购获得，或者它们可通过溶液中的逐步成核(例如，通过胶体反应)或通过多种物理和化学气相沉积过程诸如溅射沉积而产生。如本文所述的纳米粒子也可以使用HAuCl4和柠檬酸盐还原剂采用本领域已知的方法产生(参见例如Grabar,K.C.etal,Anal.Chem.,1995,67,735-743)。
吗啉代寡核苷酸可通过任何合适的方式偶合到纳米粒子。偶合优选地为共价偶合。还优选的是，每个纳米粒子包含至少一个、优选地多于一个偶合到其表面的探针。偶合可例如通过用可与给定纳米粒子反应的基团使寡核苷酸功能化而完成。在纳米粒子为金纳米粒子的情况下，官能团可以为但不限于含硫基团，诸如硫化物或硫醇基团。
合并步骤可通过将样品与纳米粒子(优选地以水性介质中的分散体的形式)在使得偶合到纳米粒子的探针可以与靶核酸杂交的条件下合并而完成。这些条件可以包括使用合适的缓冲剂和温度条件，例如，加热到使现有的双链结构解离的温度并冷却到使得可以形成杂合物。这些条件可以严格避免与非靶核酸杂交。用于探针-靶杂交的典型条件(包括缓冲剂和温度条件)是本领域熟知的。
样品可以是任何合适的样品，但优选地为包含核酸分子的生物样品。这样的样品可以例如来源于组织和体液或任何其他包含细胞或细胞组分的生物样品。就这一点而言所用的术语“体液”包括血液、血浆、血清、淋巴液等。通常，生物样品是包含完整细胞的样品，诸如口腔拭子。样品可在用于所述方法之前进行处理，例如，接受多种分离/纯化步骤，所有这些步骤都是本领域技术人员已知的。
如本文所用的解链温度是吗啉代寡核苷酸与核酸的复合物解离成单链状态所处的温度。称为解链的热变性包括加热双链体以使碱基之间形成的氢键断裂，之后双链分开。由于核苷酸不同的分子几何形状，在两条链之间的单个不一致就会使得它们之间的结合在能量上不利。这将导致完全匹配的碱基在比错配链更高的温度下解链。与遗传变体完全匹配的吗啉代寡核苷酸通常被设计成使得尽管其既将会杂交到遗传变体又会杂交到野生型序列，但吗啉代寡核苷酸与遗传变体核酸序列解离所处的温度将高于吗啉代寡核苷酸与野生型核酸序列解离所处的温度。类似地，在吗啉代寡核苷酸与野生型序列完全匹配的情况下，其既会杂交到遗传变体又会杂交到野生型序列，但吗啉代寡核苷酸与遗传变体核酸序列解离所处的温度将低于吗啉代寡核苷酸与野生型核酸序列解离所处的温度。
为测定解链温度，对在吗啉代寡核苷酸探针与核酸之间形成的杂交复合物依序(sequentially)加热，例如，在给定的时间间隔内升高约一度(℃)。解链温度(Tm)通过本领域已知的方式测量，例如吸光强度的变化，诸如UV吸光度的变化，或者通过使用嵌入性荧光团并测量荧光的变化。在多种实施方案中，解链温度通过探针和样品核酸解离时的混合物的颜色变化指示。在这些实施方案中，因为信号可通过肉眼观察和/或通过数码相机记录，所以无需昂贵的检测器。因此，该方法使得可以进行快速、方便和经济有效的遗传检测。
贵金属由于局部折射率的改变而表现出等离子体共振的变化。作为溶液中的小纳米粒子，贵金属纳米粒子将表现为一种颜色，而如果它们聚集形成较大的簇，则可以观察到颜色变化。在多种实施方案中，金纳米粒子与吗啉代寡核苷酸探针一起使用，其中当吗啉代寡核苷酸杂交到核酸时，溶液表现为红色，而当吗啉代寡核苷酸与核酸在解链温度下解离时，纳米粒子聚集而溶液表现为灰色。换句话讲，颜色变化由探针-靶杂交导致，该杂交阻止粒子聚集，例如通过在空间上阻止各个粒子之间的相互作用，但是一旦靶解离后，各个粒子之间的相互作用不再被阻止，它们发生聚集。为了实现非聚集状态与聚集状态之间的这种转换，可使包含杂交到靶的探针的纳米粒子接受通常会导致粒子聚集但不足以导致与靶复合的粒子聚集的条件。这样的条件可以例如包括但不限于粒子强度增强的缓冲条件，例如通过高盐浓度而增强。通常，这样的增强的盐条件减少纳米粒子的水合，并因此促进聚集。然而，在粒子与靶复合的情况下，离子强度的增强不足以导致聚集，以致于聚集仅在纳米粒子与靶核酸解离后才发生。
一旦测定了解链温度后，即将所得的值与标准进行比较，其使得可以确定遗传变体的存在。取决于标准的类型，测得的解链温度与标准相比升高或值相等可指示存在遗传变体。如果通过解链温度的升高指示存在遗传变体，则该升高优选地足够大以使得可以进行特异性检测。例如，解链温度的增加可以为至少0.5℃，优选地至少约1℃。
在多种实施方案中，标准通过以下方式建立—测定偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子和相应的野生型核酸的复合物的解链温度，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体完全匹配的碱基序列，其中当在步骤d)中的比较显示出步骤c)中测定的解链温度高于第一纳米粒子与野生型核酸的复合物的解链温度时，这表明样品包含含有遗传变体的核酸。
在其他多种实施方案中，标准通过以下方式建立—测定偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子和野生型核酸的复合物的解链温度，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与相应野生型碱基序列完全匹配的碱基序列，其中当在步骤d)中的比较显示出步骤c)中测定的解链温度等于第二纳米粒子与野生型核酸的复合物的解链温度时，这表明样品包含含有遗传变体的核酸。
在另外的实施方案中，标准通过以下方式建立—测定偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子与包含遗传变体的核酸的复合物的解链温度，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与相应野生型碱基序列完全匹配的碱基序列，其中当在步骤d)中的比较显示出步骤c)中测定的解链温度高于第二纳米粒子与包含遗传变体的核酸的复合物的解链温度时，这表明样品包含含有遗传变体的核酸。
在多种实施方案中，通过使用遗传变体核酸或野生型核酸序列的合成序列来建立标准。
在多种实施方案中，该方法还包括通过以下方式建立标准的步骤：
a1)提供偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体的相应野生型碱基序列完全匹配的碱基序列；
b1)在允许吗啉代核酸探针和疑似含有遗传变体的核酸杂交的条件下将包含疑似含有遗传变体的核酸的样品与第二纳米粒子合并以提供第二混合物；以及
c1)依序加热第二混合物并测定吗啉代核酸探针与疑似含有遗传变体的核酸之间的杂交复合物的解链温度；并且
其中步骤d包括将步骤c)中测定的解链温度与步骤c1)中测定的解链温度进行比较，其中当步骤c)中测定的解链温度高于步骤c1)中测定的标准解链温度时，这表明样品包含含有遗传变体的核酸。
检测是比较性的并取决于特异性最高的杂交，以使得当从个体采集的样品中存在遗传变体序列时，则第一探针的完全互补的吗啉代碱基序列的杂交特异性将比与野生型序列完全互补的第二探针的吗啉代碱基序列更高，并将导致第一探针的解链温度更高。相比之下，当从个体采集的样品中不存在遗传变体序列而存在野生型遗传序列时，则第一探针的完全互补的吗啉代碱基序列的杂交特异性将比与野生型序列完全互补的第二探针的吗啉代碱基序列更低，并将导致第一探针的解链温度更低。
在多种实施方案中，遗传变体与编码二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的基因的SNP相关，所述SNP导致与药物化合物氟尿嘧啶不相容性。
编码二氢嘧啶脱氢酶的基因的SNP可包括*2A(DPD*2A)或[细胞色素P450]2C19*2基因型。
在该特定实施方案中，吗啉代核酸探针可选地包含与DPD的所述SNP相关的序列完全互补的并具有如SEQIDNO:1(CACTTATGTTGTCTGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区，而野生型吗啉代核酸探针包含与野生型序列完全互补的、具有如SEQIDNO:2(CACTTACGTTGTCTGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区。
使用DPD序列的数据分析导致明确的基因型分配。
在多种实施方案中，遗传变体与编码CYP2C19酶的基因的SNP相关，所述SNP导致与药物化合物氯吡格雷不相容性。
编码CYP2C19酶的基因的等位变体可包括CYP2C19*2(c.681G>A；rs4244285)。
在该特定实施方案中，吗啉代核酸探针可选地包含与所述SNP相关的序列完全互补的、具有如SEQIDNO:7(GTTATGGGTTCCTGGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区，而野生型吗啉代核酸探针包含与野生型序列完全互补的、具有如SEQIDNO:8(GTTATGGGTTCCCGGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区。
在多种实施方案中，遗传变体与编码人白细胞抗原的基因的等位变异相关，所述等位变体导致药物化合物卡马西平不相容性。
编码人白细胞抗原的基因的等位变体可包括人白细胞抗原-B*1502(HLA-B*1502)。
在该特定实施方案中，吗啉代核酸探针可选地包含与等位变体完全互补的、具有如SEQIDNO:3(GTGTTCCGATCCCAATTTTTTTTTT)、SEQIDNO:4(TGGTCTTGGAGATCTTTTTTTTTTT)和SEQIDNO:5(AGGTTCCGCAGGCTTTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区。
在多种实施方案中，该方法可以可选地包括进一步功能化的包含吗啉代核酸探针的纳米粒子，该探针包含与看家基因完全互补的靶互补区。在一个这样的实施方案中，看家基因为具有如SEQIDNO:6(CAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTTT)所示的吗啉代序列的GADPH。这样的具有看家基因的探针的纳米粒子可充当阳性对照。
在多种实施方案中，该方法进一步包括富集和/或扩增疑似含有遗传变体的核酸，之后再将核酸与第一或第二纳米粒子合并。富集优选地通过扩增完成，更优选地通过使用聚合酶链反应(PCR)来扩增包含靶序列(即，含有遗传变体的序列)的那段核酸。这提供以下优点：在遗传变体以低拷贝数存在于细胞中的情况下或在仅可能得到少量样品的情况下，可以生成检测所需的最低量。
已设计了两个单独的PCR反应以高度特异性方式来测定HLA-B*1502等位基因。该方法与其他可用的技术相比显示出独特的特征和优异的性能。首先，该测定法是高度特异性的，从而确保准确的检测。其次，纳米探针技术使得可以进行明显的比色检测，从而大大降低筛查成本。因此，基于纳米探针的遗传检测提供用于筛查HLA-B*1502的高度特异性且低成本的测定法。
在多种实施方案中，当遗传变体与编码二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的基因的SNP相关时，使用包括SEQIDNO:9(DPD-正向AGTGAGAAAACGGCTGCATAT)和SEQIDNO:10(DPD-反向CATTCACCAACTTATGCCAATTCTCTT)的引物对来扩增核酸。
在多种实施方案中，当遗传变体与编码人白细胞抗原的基因的等位变异相关时，通过包括SEQIDNO:11(P1-正向CGCGAGTCCGAGGATGGC)和SEQIDNO:12(P1-反向CGCAGCCATACATCCTCTGGATGA)和/或SEQIDNO:13(P2-正向GGAGTATTGGGACCGGAAC)和SEQIDNO:14(P2-反向GTTGTAGTAGCCGCGCAGGT)的引物对来扩增核酸。
在多种实施方案中，当遗传变体与编码CYP2C19酶的基因的SNP相关时，通过包括SEQIDNO:15(正向-TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG)和SEQIDNO:16(反向-CTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCA)的引物对来扩增核酸。
在多种实施方案中，该方法还包括用于扩增看家基因的引物对SEQIDNO:17(GAPDH-正向GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCCTC)和SEQIDNO:18(GAPDH-反向CCTGGAAGATGGTGATGGGATTTC)。
本发明的另一个方面涉及一种用于执行本文所述的方法的检测试剂盒，该试剂盒包含：偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体序列完全匹配的碱基序列，遗传变体序列与疾病或障碍包括与药物不相容性相关。
在多种实施方案中，该试剂盒还包含偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子，该探针包含与野生型序列完全匹配的碱基序列的靶互补区，野生型序列与疾病或障碍相关。
在多种实施方案中，第一探针的靶互补区选自如SEQIDNo.1、3-5和7所示的碱基序列。在第一探针具有SEQIDNO:1的碱基序列的情况下，第二探针的靶互补区可由如SEQIDNO:2所示的碱基序列组成。在第一探针具有SEQIDNO:7的碱基序列的情况下，第二探针的靶互补区可由如SEQIDNO:8所示的碱基序列组成。
在多种实施方案中，该试剂盒还包含功能化的包含吗啉代核酸探针的纳米粒子，该探针包含与看家基因完全互补的靶互补区。
在多种实施方案中，看家基因优选地包括具有如SEQIDNO.6(CAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTTT)所示的吗啉代序列的GADPH。
在多种实施方案中，试剂盒的纳米粒子和吗啉代核酸如上文结合本发明的方法所述。
在多种实施方案中，遗传变体与编码二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的基因的SNP相关，所述缺乏导致与药物化合物氟尿嘧啶不相容性。
编码二氢嘧啶脱氢酶的基因的SNP可包括*2A(DPD*2A)或[细胞色素P450]2C19*2基因型。
在该特定实施方案中，吗啉代核酸探针可选地包含与所述SNP相关的序列完全互补的并具有如SEQIDNO:1(CACTTATGTTGTCTGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区，而野生型吗啉代核酸探针包含与野生型序列完全互补的、具有如SEQIDNO:2(CACTTACGTTGTCTGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区。
由测定试剂盒提供的遗传信息可用于预测DPD缺乏，并因此预测氟尿嘧啶的毒性。该方法比其他基因分型技术简单且更经济有效。
在多种实施方案中，遗传变体与编码CYP2C19酶的基因的SNP相关，所述SNP导致与药物化合物氯吡格雷不相容性。
编码CYP2C19酶的基因的SNP可包括CYP2C19*2(c.681G>A；rs4244285)。
在该特定实施方案中，吗啉代核酸探针可选地包含与所述SNP相关的序列完全互补的、具有如SEQIDNO:7(GTTATGGGTTCCTGGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区，而野生型吗啉代核酸探针包含与野生型序列完全互补的、具有如SEQIDNO:8(GTTATGGGTTCCCGGTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区。
在遗传变体与编码人白细胞抗原的基因的等位变异相关的多种实施方案中，所述等位变体导致药物化合物卡马西平不相容性。
编码人白细胞抗原的基因的等位变体可包括人白细胞抗原-B*1502(HLA-B*1502)。
在该特定实施方案中，吗啉代核酸探针可选地包含与等位变体完全互补的、具有如SEQIDNO:3(TGGTCTTGGAGATCTTTTTTTTTTT)、SEQIDNO:4(TGGTCTTGGAGATCTTTTTTTTTTT)和SEQIDNO:5(AGGTTCCGCAGGCTTTTTTTTTTTT)所示的碱基序列的靶互补区。
在多种实施方案中，该试剂盒还可以包含含有吗啉代核酸探针的功能化纳米粒子，该探针与野生型序列完全互补，野生型序列与药物相容性相关。
在多种实施方案中，该试剂盒还包含用于在用纳米探针检测前扩增核酸的引物对。
在多种实施方案中，引物对选自SEQIDNO:9(DPD-正向AGTGAGAAAACGGCTGCATAT)和SEQIDNO:10(DPD-反向CATTCACCAACTTATGCCAATTCTCTT)、SEQIDNO:11(P1-正向CGCGAGTCCGAGGATGGC)和SEQIDNO:12(P1-反向CGCAGCCATACATCCTCTGGATGA)和/或SEQIDNO:13(P2-正向GGAGTATTGGGACCGGAAC)和SEQIDNO:14(P2-反向GTTGTAGTAGCCGCGCAGGT)、SEQIDNO:15(正向-TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG)和SEQIDNO:16(反向-CTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCA)。
在其中当遗传变体与编码二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的基因的SNP相关时所述SNP导致与药物化合物氟尿嘧啶不相容性的多种实施方案中，引物对包括SEQIDNO:9(DPD-正向AGTGAGAAAACGGCTGCATAT)和SEQIDNO:10(DPD-反向CATTCACCAACTTATGCCAATTCTCTT)。
在其中当遗传变体与编码人白细胞抗原的基因的等位变异相关时所述等位变体导致与药物化合物卡马西平不相容性的多种实施方案中，引物对包括SEQIDNO.11(P1-正向CGCGAGTCCGAGGATGGC)和SEQIDNO.12(P1-反向CGCAGCCATACATCCTCTGGATGA)和/或SEQIDNO.13(P2-正向GGAGTATTGGGACCGGAAC)和SEQIDNO.14(P2-反向GTTGTAGTAGCCGCGCAGGT)。
在其中当遗传变体与编码CYP2C19酶的基因的SNP相关时所述SNP导致与药物化合物氯吡格雷不相容性的多种实施方案中，引物对包括SEQIDNO.15(正向-TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG)和SEQIDNO.16(反向-CTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCA)。
在其中看家基因包括GAPDH的多种实施方案中，试剂盒还包含引物对SEQIDNO.17(GAPDH-正向GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCCTC)和SEQIDNO.18(GAPDH-反向CCTGGAAGATGGTGATGGGATTTC)。
在多种实施方案中，试剂盒还包括用于扩增看家基因GAPDH的引物对SEQIDNO.17(GAPDH-正向GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCCTC)和SEQIDNO.18(GAPDH-反向CCTGGAAGATGGTGATGGGATTTC)。
所得的试剂盒可以高度特异性且经济有效地筛查HLA-B*1502或对所用的吗啉代序列为特异性的其他遗传变体。
试剂盒还可以包含一种或多种溶液，例如杂交缓冲液。杂交缓冲液可例如包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、Hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)和PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸))缓冲液、超级溶质(hypersolute)(例如甘露糖基甘油酸盐)或任何其他缓冲溶液，可选地包含变性剂、盐、惰性聚合物、表面活性剂等。试剂盒中的所述一种或多种溶液还可以包含如本文所述的电解质中的任一种。试剂盒的所述一种或多种溶液可提供在一个或多个微孔板(例如，384孔微孔板)的孔中，或提供在随后施加到微孔板的孔中的容器中。
所谓“包含”意指包括但不限于在词语“包含”之后的任何项。因此，使用术语“包含”表示所列的要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在。
所谓“由...组成”是指包括且限于在短语“由...组成”之后的任何项。因此，短语“由...组成”表示所列的要素是必需的或强制性的，且不存在其他要素。
本文示例性描述的发明可适宜地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、任何一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应广义地且无限制地进行理解。另外，本文采用的术语和表述用作描述性而非限制性的术语，并且在此类术语和表述的使用中无意排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而是应当认识到在受权利要求书保护的本发明的范围之内可以作出多种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选的实施方案和可选的特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可得到本文公开的其中所体现的本发明的修改和变型，并且认为此类修改和变型被视为在本发明的范围内。
本文中已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入一般性公开内容中的每一较窄的种类和亚类也构成本发明的一部分。这包括由附带条件或负面限制从所述类属中排除任何主题后对本发明的一般性描述，无论被排除的材料是否在本文中明确叙述。
其他实施方案在以下权利要求书和非限制性实例的范围内。
实施例
纳米探针的制备。
用于本研究中的纳米探针的制备采用类似于之前所报道的方案。简而言之，将用二硫化酰胺(disulfideamide)在3’末端修饰的MOR(GeneTools,LLC)用二硫苏糖醇处理以还原二硫键，然后通过使用NAP-5柱(GEHealthcare)进行纯化。将金纳米粒子(40nm直径，～0.1nM，TedPella,Inc.)与～2μM巯基化MOR、10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)混合，然后在室温下温育过夜。接着，将MOR-纳米粒子缀合物用磷酸盐缓冲溶液(5mM,pH7.5)通过离心而洗涤至少5次以除去未反应的MOR。当在4℃下储存时，所得的纳米探针稳定至少6个月。在使用前，应通过涡旋将纳米探针溶液均匀分散。
gDNA提取。
从全血提取人gDNA样品。提取可通过使用以下商业试剂盒—GentraPuregeneDNA提取试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明进行。gDNA样品的数量(ng/μl)和质量可通过使用Nanodrop1000(ThermoScientific)进行吸光度测量而检查。样品的质量可通过260nm和280nm处的吸光度比率(A260/A280比率)来表征，该比率通常从1.6至2.0变化。
PCR。
最终体积为25μL的PCR溶液通常将包含～10nggDNA、12.5μL2×主混合物(MasterMix)(Fermentas或Promega)以及1μM正向引物和100nM反向引物。PCR循环可在PTC-200DNAEngine上进行。可通过在用SafeViewTM染料染色的1.5％琼脂糖凝胶上跑5μLPCR产物的等分试样来验证PCR产生特定大小的扩增子的成功性。
Tm测量。
将合成样品或PCR产物分别与特定的WT和MUT纳米探针混合，然后用热循环仪测量靶-探针杂合物的Tm值。温度以1.0℃的间隔从32℃开始增加。在每一温度下，在颜色可视化之前使溶液温育1分钟。当观察到从红色到浅灰色的清楚色变时，将温度记录为Tm。
基因型分配。
将通过合成DNA靶得到的Tm WT-Tm MUT散点图(图2)用作标准基因分型图。可将样品的实验数据点(Tm WT,Tm MUT)在图中绘出，并通过数据点所在的区域容易地确定基因型。
DPD遗传变体的检测
开发了测定DPD*2A突变的双纳米探针基因分型测定法。通过用吗啉代寡核苷酸(MOR)功能化金纳米粒子，开发了两套纳米探针，即野生型(WT)和突变型(MUT)探针。寡核苷酸序列在图1中示出。对于WT纳米探针，寡核苷酸序列与WTDPD基因片段完全匹配，而对于MUT纳米探针，寡核苷酸序列与突变型等位基因完全匹配。纳米粒子作为红色溶液(pH约8)稳定分散在5mM的磷酸盐缓冲液中至少6个月。然而，添加100mMNaCl将导致纳米粒子不可逆的聚集，且溶液颜色将在1分钟内变成无色。
靶DNA于溶液中的存在可由于在DNA附着后纳米粒子表面负电荷的增加而提高纳米探针的稳定性。如果附着的DNA的表面密度足够高，则纳米粒子将稳定分散，即使在存在100mMNaCl的情况下也是如此。为了揭露DNA-纳米探针杂合物的热力学性质，测量了解链温度(Tm)。在Tm下，将会发生DNA序列从纳米粒子表面的解离，从而使纳米粒子失稳并导致溶液颜色从红色变成浅灰色。然后将Tm数据用于测定样品的基因型。
为了表征纳米粒子，在存在100mMNaCl(最终浓度)和5nM至500nM宽浓度范围内的合成DNA样品(图2和图5)的情况下测量了Tm数据。在室温(约25℃)下，WT纳米探针通过≥20nM的WT靶稳定化但无法通过MUT靶稳定化，而MUT纳米探针通过≥10nM的MUT靶和≥200nM的WT靶稳定化。因此，WT和MUT探针分别表现出针对完全匹配的(PM)靶为约20nM和约10nM的检测限，而对于单碱基错配的(1MM)靶，两种探针的灵敏度均低得多。这可归因于靶/探针杂合物的结合热力学的差异，该差异决定靶DNA在纳米探针上的表面密度。PM靶的结合亲和力越高可以实现更灵敏的检测。在20nM至200nM的浓度范围内，纳米探针仅对其PM靶有反应。在≥200nM的靶浓度下，MUT纳米探针对PM或MUT靶有反应。因靶与探针之间的单碱基错配引起的Tm差异为约11℃。对于杂合子样品，通过PM浓度来测定Tm。
图5中所示的数据可以作为Tm WT-Tm MUT散点图表示，该散点图可充当标准基因分型图(图6)。该图根据样品的特定序列类型而分成三个区。对于未知的样品，一旦获得Tm,WT和Tm,MUT的数据后，即可基于数据点在标准基因分型图中所处的区来分配基因型。
对于人类基因组DNA(gDNA)样品，可以进行PCR扩增以产生足量的DPD基因的特定靶序列，因为测定法的检测灵敏度为约10-20nM。图3和图4显示了PCR引物和热循环参数。在PCR后，可将PCR产物的两个等分试样分别直接与WT和MUT纳米探针混合，然后可测量WT探针/扩增子和MUT探针/扩增子的杂合物的Tm值。可将所得的数据点(TmWT、TmMUT)绘制在标准基因分型图中以确定样品的基因型。
总的来说，测定DPD*2A基因型的双纳米粒子测定试剂盒只需要标准热循环仪，这使得可以进行经济有效的检测。高度特异性的等离子体纳米探针确保了基于比色信号进行准确的基因分型。
HLA-B遗传变体的检测
已将HLA-B*1502外显子2和3的五个特征(signature)序列基序用于鉴定特定的等位基因，如图7中所示。在相同的DNA分子上存在五个序列基序指明HLA-B*1502的携带状态。方法的特异性相对较高。与HLA-B*1502具有交叉反应的等位基因包括B*1588、B*15112、B*15121、B*15144、B*15170、B*15194、B*15213、B*15214和B*15223。这些等位基因非常稀少，未报道在世界人口中的等位基因频率。
将两个单独的不对称PCR(aPCR)反应用于基于引物或纳米探针的特异性来检测HLA-B*1502等位基因(图8)。在第一aPCR反应(PCR1)中，正向引物(引物F1)为序列基序1特异性的，反向引物(引物R1)为基序5特异性的，而基序2-4分别通过探针1-3测定。扩增子大小为429nt，覆盖了外显子2的一部分、整个内含子2和外显子3的一部分。所有三个纳米探针测定的阳性结果表明存在五个特征基序，但具有如图9中所示的组合多值性(ambiguities)。因此，采用第二PCR反应(PCR2)来实现明确测定。在PCR2中，正向引物(引物F2)为基序2特异性的，反向引物(引物R2)为基序4特异性的，而基序3通过探针2测定。纳米探针测定的阳性结果确保三个序列基序同相，从而排除图3中所示的多值性。将内部对照(测定GAPDH基因)包括在PCR2中以监测PCR反应的有效性。
在3’端用二硫代酰胺修饰的吗啉代寡核苷酸(MOR)在图10中示出。
纳米探针的行为
将纳米探针在该研究中用于测定三个序列基序。通过使用合成的寡核苷酸样品(图11)来检查纳米探针区分完全匹配的(PM)靶与错配的(MM)靶的能力。基于数据库，我们选择了与HLA-B*1502特征基序最相似的序列作为错配的(MM)样品。如图4中所示，大多数序列不能在高于32℃的温度下在宽浓度范围(高达500nM)内生成信号。对于纳米探针2，需要区分单碱基错配。图4显示了单碱基错配通常将Tm降低8-10℃，从而使得可以区分等位基因。
HLA-B*1502基因型测定
在三根微管中将PCR1产物的等分试样分别与探针1、2和3混合(比率1:1)。在2根微管中将PCR2产物的等分试样分别与探针2和GAPDH探针混合(比率1:1)。将混合后的溶液在40℃下温育5分钟。如果GAPDH探针溶液为红色，则PCR反应有效。在这种情况下，当所有其他4种溶液均为红色时，样品为HLA-B*1502阳性，反之，样品HLA-B*1502为阴性。如果GAPDH探针溶液变成无色，则测定无效且需要重复。测定的工作流程在图12中示出。
将纳米探针设计成在核酸靶的识别中为高度特异性的，并生成可容易观察的比色信号。该技术使得可以通过简单的工作流程和标准的设备进行准确的终点检测。基于该平台，开发了经济有效的HLA-B*1502筛查试剂盒。
已开发了用于HLA-B*1502等位基因测定的基于纳米探针的简单测定法。该方法与其他可用的技术相比显示出独特的特征和优异的性能。首先，该测定法是高度特异性的，从而确保准确的检测。由于大量在序列上与HLA-B*1502等位基因非常接近的HLA-B等位基因和高频率的相位多值性，在HLA-B*1502携带者的筛查中通常出现假阳性。其次，纳米探针技术使得可以进行明显的比色检测，从而大大降低筛查成本。方法的高特异性是非常重要的，因为这使得方法准确且经济有效。在卡马西平治疗前对HLA-B*1502筛查的成本效益进行分析表明遗传检测成本是关键性的，特别是对于具有低和中HLA-B*1502等位基因出现率的群体而言。可视化的信号使检测得以简化，并排除了对昂贵检测器的需要。因此，基于纳米探针的遗传检测提供用于筛查HLA-B*1502的特异性且低成本的测定法。
CYP2C19遗传变体的检测
通过用吗啉代寡核苷酸(MOR)功能化金纳米粒子，制备了两套纳米探针，即野生型(WT)和突变型(MUT)探针。MOR寡核苷酸序列在图16中示出。WT纳米探针序列与WTCYP2C19基因片段完全匹配，而MUT纳米探针序列与CYP2C19*2突变型等位基因完全匹配。制备好的纳米探针为红色并稳定至少6个月。然而，通过添加500mMNaCl可引起纳米探针不可逆的聚集，从而导致溶液在2分钟内从红色变成浅灰色。
当将靶DNA序列加到纳米探针溶液中时，纳米探针变得更稳定，甚至在存在500mMNaCl的情况下也是如此，因为DNA附着增加了纳米粒子的表面负电荷。随着溶液温度的升高，DNA-纳米探针杂合物将在解链温度(Tm)下解离，从而导致纳米粒子变得不稳定且溶液颜色从红色变成浅灰色。Tm的值可通过观察溶液颜色变化而获得。然后将Tm数据用于测定样品的基因型。
图17显示了响应合成的DNA序列(参见图18)的纳米探针行为。在室温(约25℃)下，WT和MUT纳米探针均通过≥10nM的靶稳定化。因靶与探针之间的单碱基错配引起的Tm差异为约5-7℃。对于杂合子样品，通过完全匹配的靶浓度测定Tm。
图19显示了作为Tm WT-Tm MUT散点图的数据，该散点图可用作标准基因分型图。图中的三个线性区对应于三种基因型，即*1/*1、*1/*2和*2/*2。对于未知的样品，一旦获得Tm WT和Tm MUT的数据后，即可基于数据点在标准基因分型图中所处的区来分配基因型。
为了检测基因组DNA(gDNA)样品，可通过使用图20中所示的引物对位于单核苷酸多态性(SNP)侧翼的基因序列片段进行PCR扩增。PCR热循环参数在图21中示出。在PCR后，将PCR产物的两个等分试样分别与WT和MUT纳米探针混合，然后可测量WT探针/扩增子和MUT探针/扩增子的杂合物的Tm值。可将所得的数据点(Tm WT、Tm MUT)绘制在标准基因分型图中以确定样品的基因型。
总的来说，开发了测定CYP2C19*2基因型的双纳米粒子测定试剂盒。该测定经济有效且准确，并将适用于床旁(point-ofcare)检测。

Claims (33)

1.一种检测与疾病或障碍包括与药物不相容性相关的遗传变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，所述探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与所述遗传变体完全匹配的碱基序列；
(ii)在允许所述吗啉代核酸探针和疑似含有所述遗传变体的所述核酸杂交的条件下将包含疑似含有所述遗传变体的核酸的样品与所述第一纳米粒子合并以提供第一混合物；
(iii)依序加热所述第一混合物并测定所述吗啉代核酸探针与疑似含有所述遗传变体的所述核酸之间的杂交复合物的解链温度；
(iv)将步骤c)中测定的解链温度与标准进行比较以确定所述样品是否包含含有所述遗传变体的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标准通过以下方式建立：
(i)测定偶合到至少一个吗啉代核酸探针的所述第一纳米粒子和相应的野生型核酸的复合物的解链温度，所述探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与所述遗传变体完全匹配的碱基序列，其中当在步骤d)中的比较显示出步骤c)中测定的所述解链温度高于所述第一纳米粒子与所述野生型核酸的所述复合物的所述解链温度时，这表明所述样品包含含有所述遗传变体的核酸；
(ii)测定偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子和野生型核酸的复合物的解链温度，所述探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与相应野生型碱基序列完全匹配的碱基序列，其中当在步骤d)中的比较显示出步骤c)中测定的所述解链温度等于所述第二纳米粒子与所述野生型核酸的所述复合物的所述解链温度时，这表明所述样品包含含有所述遗传变体的核酸；或
(iii)测定偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子和含有所述遗传变体的核酸的复合物的解链温度所述探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与相应野生型碱基序列完全匹配的碱基序列，其中当在步骤d)中的比较显示出步骤c)中测定的所述解链温度高于所述第二纳米粒子与含有所述遗传变体的所述核酸的所述复合物的所述解链温度时，这表明所述样品包含含有所述遗传变体的核酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括通过以下方式建立标准的步骤：
a1)提供偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子，所述探针包含与所述遗传变体的相应野生型碱基序列完全匹配的靶互补区碱基序列；
b1)在允许所述吗啉代核酸探针和疑似含有所述遗传变体的所述核酸杂交的条件下将包含疑似含有所述遗传变体的核酸的样品与所述第二纳米粒子合并以提供第二混合物；以及
c1)依序加热所述第二混合物并测定所述吗啉代核酸探针与疑似含有所述遗传变体的所述核酸之间的杂交复合物的解链温度；并且
其中步骤d)包括将步骤c)中测定的所述解链温度与步骤c1)中测定的所述解链温度进行比较，其中当步骤c)中测定的所述解链温度高于步骤c1)中测定的所述解链温度时，这表明所述样品包含含有所述遗传变体的核酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述解链温度通过所述探针和所述样品核酸解离时的混合物的颜色变化指示。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述吗啉代核酸探针包含与编码二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的基因的遗传变体完全互补的并具有如SEQIDNO:1所示的碱基序列的靶互补区，而野生型吗啉代核酸探针包含与野生型序列完全互补的、具有如SEQIDNO:2所示的碱基序列的靶互补区。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中CYP2C19酶吗啉代核酸探针包含与编码CYP2C19酶的基因的遗传变体相关的序列完全互补的、具有如SEQIDNO:7所示的碱基序列的靶互补区，而野生型吗啉代核酸探针包含与野生型序列完全互补的、具有如SEQIDNO:8所示的碱基序列的靶互补区。
7.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述吗啉代核酸探针可选地包含与编码人白细胞抗原的基因的等位变体完全互补的、具有如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的碱基序列的靶互补区。
8.根据权利要求7所述的方法，还包括偶合到吗啉代核酸探针的纳米粒子，所述探针包含与看家基因完全互补的靶互补区。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述看家基因为具有如SEQIDNO:6所示的吗啉代序列的GADPH。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，还包括使疑似含有所述遗传变体的所述核酸扩增，然后将所述核酸与所述第一纳米粒子或所述第二纳米粒子混合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中当所述遗传变体与编码二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的基因的SNP相关时，使用包括SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的引物对来扩增所述核酸。
12.根据权利要求10所述的方法，其中当所述遗传变体与编码人白细胞抗原的基因的等位变异相关时，使用包括SEQIDNO:11和SEQIDNO:12和/或SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的引物对来扩增所述核酸。
13.根据权利要求10所述的方法，其中当所述遗传变体与编码CYP2C19酶的基因的SNP相关时，使用包括SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物对来扩增所述核酸。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，还包括用于扩增所述看家基因的引物对SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包括金属纳米粒子。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包括胶体金属。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述金属包括贵金属。
18.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包括半导体或磁性胶体材料。
19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述吗啉代共价偶合到所述纳米粒子。
20.一种用于执行根据权利要求1至19中任一项所述的方法的检测试剂盒，所述试剂盒包含：偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第一纳米粒子，所述探针包含靶互补区，所述靶互补区含有与遗传变体序列完全匹配的碱基序列，所述遗传变体序列与疾病或障碍包括与药物不相容性相关。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，还包含偶合到至少一个吗啉代核酸探针的第二纳米粒子，所述探针包含与野生型序列完全匹配的靶互补区碱基序列，所述野生型序列与疾病或障碍相关。
22.根据权利要求20或21中任一项所述的试剂盒，其中所述第一探针的所述靶互补区选自如SEQIDNO:1、SEQIDNO:7、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的碱基序列，而所述第二探针的所述靶互补区选自如SEQIDNO:2和SEQIDNO:8所示的碱基序列。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒，还包含含有吗啉代核酸探针的功能化纳米粒子，所述探针包含与看家基因完全互补的靶互补区。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述看家基因包括具有如SEQIDNO:6所示的吗啉代序列的GADPH。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包括金属纳米粒子。
26.根据权利要求20至24中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包括胶体金属。
27.根据权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述金属包括贵金属。
28.根据权利要求20至24中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包括半导体或磁性胶体材料。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的试剂盒，其中所述吗啉代共价偶合到所述纳米粒子。
30.根据权利要求20至29中任一项所述的试剂盒，其中所述吗啉代包含含有约10个单体单元至约35个单体单元或约15个单体单元至约35个单体单元的序列。
31.根据权利要求20至30中任一项所述的试剂盒，还包含用于在用所述纳米粒子检测前扩增核酸的引物对。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述引物对选自SEQIDNO:和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、和/或SEQIDNO:13(和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。
33.根据权利要求31或32所述的试剂盒，还包含用于扩增看家基因GAPDH的引物对SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017091156A1 (en) * 2015-11-27 2017-06-01 Agency For Science, Technology And Research Determination of nucleic acid methylation
SG10201912789UA (en) * 2016-02-17 2020-02-27 Agency Science Tech & Res Determination of mtrnr1 gene mutation

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454462A (zh) * 2006-05-11 2009-06-10 中央研究院 与药物不良反应相关的hla等位基因及其检测方法
CN101978073A (zh) * 2008-01-25 2011-02-16 诊疗实验室 用于评估药物反应的方法和组合物
CN102732600A (zh) * 2011-04-13 2012-10-17 上海芯超生物科技有限公司 肿瘤个性化治疗基因测评及套组方法
CN102884204A (zh) * 2010-01-12 2013-01-16 新加坡科技研究局 利用纳米颗粒探针进行的核酸的序列选择性识别

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080085839A1 (en) * 2004-09-01 2008-04-10 Holger Klapproth Method For The Analysis Of Point Mutations
KR100702415B1 (ko) * 2006-03-03 2007-04-09 안웅식 올리고 핵산 탐침 비드 어레이를 이용한 인유두종바이러스검출 키트 및 방법
EP2984183B1 (en) * 2013-04-11 2020-03-25 Agency For Science, Technology And Research Nanoprobe-based genetic testing

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101454462A (zh) * 2006-05-11 2009-06-10 中央研究院 与药物不良反应相关的hla等位基因及其检测方法
CN101978073A (zh) * 2008-01-25 2011-02-16 诊疗实验室 用于评估药物反应的方法和组合物
CN102884204A (zh) * 2010-01-12 2013-01-16 新加坡科技研究局 利用纳米颗粒探针进行的核酸的序列选择性识别
CN102732600A (zh) * 2011-04-13 2012-10-17 上海芯超生物科技有限公司 肿瘤个性化治疗基因测评及套组方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAIN MOREL等: "Clinical relevance of different dihydropyrimidine dehydrogenase gene single nucleotide polymorphisms on 5-flurouracil tolerance", 《MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS》 *
CELESTE B.L. MAN等: "Association between HLA-B*1502 Allele and antiepileptic drug-induced cutaneous reactions in Han Chinese", 《EPILEPSIA》 *
RIKJE RUITER等: "CYP2C19*2 polymorphism is associated with increased survival in breast cancer patients using tamoxifen", 《PHARMACOGENOMICS》 *
Y. CHARLES CAO等: "A two-color-change,nanoparticle-based method for DNA detection", 《TALANTA》 *
YANBING ZU等: "Nanoprobe-based genetic testing", 《NANO TODAY》 *
YANBING ZU等: "Visualizing low-level point mutations:Enzyme-like selectivity offered by nanoparticle probes", 《SMALL》 *

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