CN111154861A - 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒、方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒及检测方法,该检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物,包括以下至少一对引物及探针组合物:用于检测SLCO1B1位点的第一引物和第一探针;用于检测APOE位点的第二引物和第二探针;用于检测ABCB1位点的第三引物和第三探针;以及用于检测LDLR位点的第四引物和第四探针。本发明的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒具有检测全面、通量高、操作简单、检测迅速且安全无污染的优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术,特别涉及一种检测他汀类药物代谢基因多态性 的引物及探针组合物、试剂盒及方法。
背景技术
他汀类药物又称为3-羟甲基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCo A)还原酶抑制 剂,近20多年来的众多大规模临床试验结果显示,他汀类药物在ASCVD一级 和二级预防中均能显著降低心血管事件风险,是防治此类疾病最为重要的药物。 然而不同的他汀在化学结构上虽有相似之处,但它们在药代动力学(吸收、结合 血浆蛋白、代谢和溶解度)与其他药物相互作用、药物疗效以及他汀导致的不良 反应方面存在个体间的差异,而这些差异部分归因于常见药物基因的遗传与变 异,SLCO1B1、APOE、ABCB1和LDLR基因则是近年来研究比较多的热点基 因。
有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1,又称OATP-C、OATP2或LST1)特 异地表达在肝细胞基底膜上,在肝细胞摄取和清除内源性和外源性物质如胆汁 酸、非结合型胆红素、甲状腺素、他汀类药物、瑞格列奈和伊立替康活性代谢 产物SN-38等中发挥重要作用。OATP1B1由SLCO1B1基因编码,该基因具有 遗传多态性,其中388A>C和521T>C是亚洲人群中的主要遗传变异,等位基因 频率为10~15%。突变型可显著降低OATP1B1对其底物的摄取能力,使他汀类 药物,如普伐他汀、阿托伐他汀和罗苏伐他汀等的血药浓度升高,增加横纹肌 溶解症或肌病的发生风险。为降低他汀类药物严重不良反应的发生风险,建议 临床上根据SLCO1B1基因型选择他汀类药物进行治疗。
载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)是一种存在于乳糜微粒和中间密度 脂蛋白中的载脂蛋白,主要由肝脏和巨噬细胞产生,参与血脂的运输、存储和 排泄。人类APOE基因位于19号染色体19q13.2。该基因的两个功能性SNP rs429358(c.388T>C,Cys130Arg)和rs7412(c.526C>T,Arg176Cys)构成3 种单倍型,分别是E2(rs429358T-rs7412T)、E3(rs429358T-rs7412C)、E4 (rs429358C-rs7412C)。由三种单倍型构成6种不同的基因型(E2/E2、E3/E3、 E4/E4、E2/E3、E2/E4和E3/E4)。E3/E3是最常见的基因型,人群中的频率约60%。目前FDA已将APOE2列为普伐他汀药物反应相关的生物标记。基因型 为APOE E2/E2的高血脂症患者普伐他汀的降脂疗效更好。
三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ABCA1)基因所编码的ABCA1蛋白在胆固醇 的逆向转运和机体高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的形成中起到关键作用。当 ABCA1基因发生突变时,可影响其蛋白质的转录和翻译,从而影响机体血脂水 平。在已发现的ABCB1的将近50个SNP中,2677T>G和3435C>T均能够影 响P-gp的转运底物,导致阿托伐汀疗效的个体化出现差异。相关学者研究发现 ABCA1基因多态性与机体血脂异常等疾病存在相关性。
低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)由Brown等发现,认为LDLR与血脂代谢异常密切相关。LDLR基因在人类基因组位于第19号染 色体短臂末端(19p13.1~13.3),在基因组中的长度为45kb,含有18个外显子。 LDLR基因突变与血脂异常相关性疾病密切相关,LDLR基因的异常表达可导致 低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein-cholesterol,LDL-C)的清除障碍,使 LDL-C在血浆中极度升高,导致高胆固醇血症、动脉粥样硬化(atherosclero-sis, AS)等疾病。在药物基因组学权威数据库PharmGKB中显示LDLR基因突变 rs1433099(c.666T>C)和rs14158(c.52G>A)与他汀类的疗效有密切关系。
现有他汀类药物个体化基因检测的方法包括PCR-直接测序法、PCR-基因芯 片法和荧光定量PCR法等多种方法,每种方法的原理和优缺点如下:
PCR-直接测序法:也称PCR-Sanger测序,该方法基于双脱氧核糖核酸 (ddNTP)末端终止法,根据核苷酸在某一固定点开始延伸,随机在某一特定碱 基处终止,由于掺入的每个碱基都进行了荧光标记,因此产生了以A、T、C、 G结束的四组相差一个碱基的不同长度的系列核酸片段;通过毛细管电泳分离 这些片段后读取待测核酸的碱基序列。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方 法。由于该方法可直接读取DNA的序列,因此被认为是基因分型的金标准。 PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、 测序和结果分析四个主要步骤。分析时需要设置阴性对照和阳性质控品。该方 法属于定性检测,优点是测序长度较长,可发现新的变异位点。主要不足:灵 敏度不高;对试剂和仪器有特殊要求,不易普及;操作复杂,成本相对较高, 速度慢、通量低。
PCR-基因芯片法:该方法以特定的寡核苷酸片段作为探针,将其有规律地 排列固定于支持物上,然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序,按 碱基配对原理与芯片杂交,再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测 和分析,从而迅速获得个体的基因型信息。基因芯片分型法的操作过程包括PCR 核酸扩增、杂交、芯片扫描和结果分析。该方法用于DNA基因分型时属于定性 检测,灵敏度为50ng/μL。基因芯片法分析时需设置阴性对照和阳性质控品。 应用基因芯片检测试剂盒时应确保试剂在开封前按要求保存、各组分液体使用 前振荡混匀,杂交和洗片操作务必在避光条件下进行,PCR反应液和定位参照 需避光保存,芯片加样时注意使液体铺满整个反应区,但不能溢出、不能出现 气泡,以防交叉污染。其主要优点是可同时对多个待测SNP位点进行检测。
实时荧光PCR法:根据检测原理的不同,实时荧光PCR法可分为探针法和 非探针法两种,前者利用与靶序列特异杂交的探针(Taqman和分子信标)来指 示扩增产物的增加,后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增 加。Taqman探针法同时综合了5’端核酸酶活性和荧光等技术,其在反应过程 使用4条寡核苷酸链,其中两条为等位基因特异性探针,两条为PCR引物。两 条探针可分别与突变型和野生型模板互补,其两端分别应用含报告基团和淬灭 基团的染料进行标记,两条探针的报告基团荧光染料不一样。在进行SNP检测 时,PCR扩增的退火过程导致探针与模板杂交结合,当引物延伸至探针处时, DNA聚合酶的5’端外切酶活性将探针的5’端报告基团从探针上切除,使之与 淬灭基团分离,从而释放出相对应的荧光,而没有配对的探针仍然保持完整而 不会发荧光。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同,因此所发荧光信 号不同,可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。
与本申请专利相关的已经公开或者授权的部分专利参见下表1。
表1
目前,市场上厂家开发试剂盒采用的技术平台主要有2种:荧光PCR法和 PCR-基因芯片法。基于荧光PCR法技术平台开发的试剂盒主要有:人类 SLCO1B1和ApoE基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(武汉友芝友医疗科技有 限公司)、人类APOE基因ε2/ε3/ε4基因分型试剂盒(荧光PCR法)(厦门人 瑞生物医药科技有限公司)和人类ApoE基因多态性检测试剂盒(PCR-荧光探 针法)(武汉康录生物技术股份有限公司);基于PCR-基因芯片法技术平台开发 的试剂盒主要有:脂蛋白E(ApoE)基因型检测试剂盒(基因芯片法)(珠海赛 乐奇生物技术有限公司)和载脂蛋白E(ApoE)基因检测试剂盒(PCR-芯片杂 交法)(上海百傲科技股份有限公司)。
上述试剂盒具有准确性高、灵敏度高和特异性好等特点,在临床诊断中得 到了一定的推广,但是所采用的荧光PCR技术均为常规的荧光PCR法,一个通 道只能检测一个突变,多个基因需要分管检测,存在检测通量低,操作繁琐等 问题;而PCR-基因芯片法,虽然检测通量高,但存在操作时间长、步骤多和容 易污染等问题。这两种方法,均不能满足临床诊断通量高和操作简便快速的要 求,无法大规模应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种检测他汀类药物代谢基因多态性 的引物及探针组合物、试剂盒及方法,可提高检测通量以及操作简便性。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物,包括:用于检测 SLCO1B1位点的第一引物和第一探针;用于检测APOE位点的第二引物和第二 探针;用于检测ABCB1位点的第三引物和第三探针;以及,用于检测LDLR位 点的第四引物和第四探针;
其中,第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示,第一探针的核苷酸序 列如SEQ ID No.17-18所示;第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5-8所示,第 二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.19-20所示;第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9-12所示,第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.21-22所示;第四引物的核 苷酸序列如SEQ ID No.13-16所示,第四探针的核苷酸序列如SEQ ID No.23-24 所示。
本发明还涉及一种检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒,包括上述的 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物。
本发明还涉及检测他汀类药物代谢基因多态性的方法,包括以下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)采用PCR溶解曲线法,利用上述的检测他汀类药物代谢基因多态性的 试剂盒对样品DNA进行PCR扩增;
(3)通过监测整个溶解过程当中的信号值随温度的变化规律,区分靶序列 的基因型。
本发明的有益效果在于:
采用荧光PCR探针熔解曲线技术,可以在多通道实时PCR仪器上实现4个 基因8种突变(SLCO1B1:388A>G和521T>C;APOE:388T>C和526C>T; ABCB1:2677T>G和3435T>C;LDLR:666T>C和52G>A)的检测,满足突 变筛查和基因分型等多种突变检测需要。由于建立在闭管操作基础上,具有操 作简便、速度快和通量高的优点,因此能够极大的满足临床诊断的需求。
附图说明
图1为本发明实施例的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒的熔解曲 线法原理示意图;
图2为本发明实施例的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒中野生型 对照在FAM通道中熔解峰的Tm值的检测结果图;
图3为本发明实施例的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒中野生型 对照在VIC通道中熔解峰的Tm值的检测结果图;
图4为本发明实施例的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒中野生型 对照在ROX通道中熔解峰的Tm值的检测结果图;
图5为本发明实施例的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒中野生型 对照在CY5通道中熔解峰的Tm值的检测结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式并 配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于:采用荧光PCR探针熔解曲线技术,针对上述4 个基因8种突变型别设计引物及探针序列,实现多个突变位点的同时检测。
本发明提供的检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物,包括: 用于检测SLCO1B1位点的第一引物和第一探针;用于检测APOE位点的第二引 物和第二探针;用于检测ABCB1位点的第三引物和第三探针;以及用于检测 LDLR位点的第四引物和第四探针;
其中,第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示,第一探针的核苷酸序 列如SEQ ID No.17-18所示;第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5-8所示,第 二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.19-20所示;第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9-12所示,第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.21-22所示;第四引物的核 苷酸序列如SEQ ID No.13-16所示,第四探针的核苷酸序列如SEQ ID No.23-24 所示。
本发明还提供一种检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒,包括上述的 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物。
本发明还提供一种检测他汀类药物代谢基因多态性的方法,包括以下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)采用PCR溶解曲线法,利用上述的检测SLC25A13基因高频突变位 点的试剂盒对样品DNA进行PCR扩增;
(3)通过监测整个溶解过程当中的信号值随温度的变化规律,区分靶序列 的基因型。
从上述描述可知,本发明的有益效果在于:
采用荧光PCR探针熔解曲线技术,可以在多通道实时PCR仪器上实现4个 基因8种突变(SLCO1B1:388A>G和521T>C;APOE:388T>C和526C>T; ABCB1:2677T>G和3435T>C;LDLR:666T>C和52G>A)的检测,满足突 变筛查和基因分型等多种突变检测需要。由于建立在闭管操作基础上,具有操 作简便、速度快和通量高的优点,因此能够极大的满足临床诊断的需求。
本发明的技术原理为:
本发明的试剂盒采用的是荧光PCR探针熔解曲线技术。它的原理是利用特 定的探针在PCR扩增完成后,与靶序列杂交形成的熔解曲线及熔点值(Tm)进行 分析,检测探针覆盖区域是否存在碱基突变以及具体的突变类型。它包括PCR 扩增和熔解曲线分析,首先是使用不对称PCR进行扩增,富集单链靶序列,使 熔解曲线分析过程探针可以与靶序列杂交,具体实施方式是在需要检测的突变 区域探针,并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物,用该上 游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段。PCR扩增结束后进行熔解曲线 分析,如图1所示,当反应体系中没有靶序列存在时,即处于非杂交状态时,整个熔解曲线过程中,从低温到高温,探针都是处于自由卷曲的状态,使得荧 光基团和淬灭基团相互靠近,根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的原理,当一个荧光基团与一个淬灭基团的距离邻近至 一定范围内时,就会发生能量转移,淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下 的激发荧光,从而使其不发光或发出的荧光很弱。当反应体系中有互补的靶序 列存在时,在整个熔解曲线的过程中,低温时,探针与靶序列杂交,形成刚性 而稳定的双链结构,荧光基团和淬灭基团的距离很远,荧光基团发出的荧光不 会被淬灭基团吸收,因而可以检测到很强的荧光信号;随着温度的升高,双链 杂交体逐渐解链,达到熔点时荧光迅速下降,荧光变化最强的点对应的温度即 是探针与靶序列形成双链结构的熔点(Tm),探针与不同的靶序列杂交形成双链 结构的稳定性不同,因而具有不同的熔点。
本发明的具体技术方案如下:
1、引物设计
根据国内外对SLCO1B1、APOE、ABCB1和LDLR基因的研究结果,将 Genebank数据库中调取的SLCO1B1、APOE、ABCB1和LDLR基因相关序列 进行BLAST比对分析,用Primer5.0和Oligo6.0设计针对SLCO1B1、APOE、 ABCB1和LDLR基因特异扩增引物和探针。
2、引物筛选
利用正交试验方法,在同一管中同时扩增目标序列及内参序列,通过大量 实验对比筛选引物和探针,发明人通过实验结果证明引物和探针序列左右平移 或长度改变,实验结果均有很大不同。模板浓度、比例均对扩增效果有重要影 响。引物太长会有非特异扩增信号,太短则扩增效率比较低,检测灵敏度下降。
根据荧光PCR探针熔解曲线技术的特点,合理搭配各对引物和探针的浓度, 通过大量的实验优化最终确立的引物和探针组合见表2-3所示。
表2
表3
3、引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定
引物终浓度选择80nM-200nM,MgCl2终浓度选择1mM-5mM,dNTP终浓 度选择100nM-200nM,Taq酶终浓度选择2-5U/反应,利用正交试验方法,通过 大量实验对比,最终确定最优的PCR反应体系见表4。
表4
注:DNA加样量为2μL,总反应体积为25μL。
4、反应条件的确定
经过大量实验对比优化,最终确定的最佳反应条件(扩增程序)参见下表5 所示。
表5
5、结果判断
野生型对照在各通道中的熔解峰的Tm值范围如下:
FAM通道:
SLCO1B1,388A>G位点的Tm值为62℃±1℃;521T>C位点的Tm值为 54℃±1℃
VIC通道:
APOE,388T>C位点的Tm值为52℃±1℃;526C>T位点的Tm值为58℃±1℃
ROX通道:
ABCB1,2677T>G位点的Tm值为53℃±1℃;3435T>C位点的Tm值为 62℃±1℃
CY5通道:
LDLR,52G>A位点的Tm值为60℃±1℃;666T>C位点的Tm值为72℃±1℃
检测结果示意图如下图2-5。
其中,图2中,第一个箭头所示熔解峰对应SLCO1B1,521T>C位点野生 型峰,第二个箭头所示熔解峰对应SLCO1B1,388A>G位点野生型峰;图3中, 第一个箭头所示熔解峰对应APOE,388T>C位点野生型峰,第二个箭头所示熔 解峰对应APOE,526C>T位点野生型峰;图4中,第一个箭头所示熔解峰对应ABCB1,2677T>G位点野生型峰,第二个箭头所示熔解峰对应ABCB1,3435T>C 位点野生型峰;图5中,第一个箭头所示熔解峰对应LDLR,52G>A位点野生型峰,第二个箭头所示熔解峰对应LDLR,666T>C位点野生型峰。
6、检验结果的解释
本发明检测一个样本包括四个检测通道,即每个样本需要查看四个通道的 熔解峰情况综合判断样本的基因型。
FAM通道检测(SLCO1B1,388A>G)位点,野生型峰和突变型峰的熔点 差异(△Tm)为3.25±0.52;同时还检测(SLCO1B1,521T>C)位点,野生型 峰和突变型峰的熔点差异(△Tm)为4.58±0.67。
VIC通道检测(APOE,388T>C)位点,野生型峰和突变型峰的熔点差异 (△Tm)为6.38±0.48;同时还检测(APOE,526C>T)位点,野生型峰和突变 型峰的熔点差异(△Tm)为5.29±0.84。
ROX通道检测(ABCB1,2677T>G)位点,野生型峰和突变型峰的熔点差 异(△Tm)为4.86±0.37;同时还检测(ABCB1,3435T>C)位点,野生型峰和 突变型峰的熔点差异(△Tm)为3.98±0.62。
CY5通道检测(LDLR,52G>A)位点,野生型峰和突变型峰的熔点差异(△ Tm)为5.29±0.45;同时还检测(LDLR,666T>C)位点,野生型峰和突变型峰 的熔点差异(△Tm)为6.87±0.39。
本发明试剂盒采用荧光PCR探针熔解曲线技术,可以在多通道实时PCR仪 器上实现多个突变位点的同时检测,可满足突变筛查和基因分型等多种突变检 测需要。由于建立在闭管操作基础上,因此又具有操作简便、速度快、通量高 等优点,能够极大的满足临床诊断的需求。本发明试剂盒是一种可单管同时检 测4个基因8种突变型别(SLCO1B1:388A>G和521T>C;APOE:388T>C和 526C>T;ABCB1:2677T>G和3435T>C;LDLR:666T>C和52G>A)的他汀类药物个体化用药基因检测试剂盒。
本发明的试剂盒具有如下特点:
1、全面:同时包含4个他汀类药物代谢相关基因共8种突变;
2、通量高:单管检测,一次实验可检测96个样本;
3、简便快速:仅需1个小时;
4、安全:全程闭管检测。
本发明试剂盒具有通量高、操作简单,检测迅速等优点,可以弥补目前检 测方法的不足,简化操作步骤,缩短检测时间,为临床他汀类药物个体化用药 基因检测提供了新的技术平台。
实施例1
本发明试剂盒对临床样品的检测情况
使用本发明试剂盒对临床300例样本进行检测,本发明试剂盒检测临床样 本检测结果见下表6。
表6
本发明试剂盒对临床300例样本检测结果与金标准测序结果进行对比,阳 性符合率和阴性符合率均为100%,准确率达100%,本发明试剂盒检测结果和 测序结果对比统计结果下表7。
表7
注:金标准测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性,阴 性是指本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。
本产品的性能指标:
(1)测定准确性
对测定准确性进行研究,选用48例包含8个位点的临床样本,每例样本均 包含高、中、低3个浓度,每个浓度重复检测3次,均用3批产品进行检测, 分别计算该基因位点基因型的符合率。结果显示相应的位点基因型,研究结果 与测序结果结果完全符合,产品符合率为144/144。
(2)最低检测限
对最低检测限进行研究,选用16种包含8个位点全部基因型的临床样本每 种样本包含7个浓度梯度,每个浓度重复检测12次,均采用3批产品检测进行 检测。确定本试剂盒能稳定检出基因组DNA的最低浓度为2ng/μL。
(3)分析特异性
对特异性进行研究,均采用3批产品进行检测,结果如下:
通过干扰筛查试验,当全血样本中甘油三酯≤13.5mmol/L或总胆红素 ≤358.24μmol/L时,不是本试剂盒的干扰物质,溶血样本不影响本试剂盒检测结 果。
通过干扰评价试验,20IU/mL肝素抗凝剂是本品的外源性干扰物质,2mg/mL 枸橼酸钠或5mg/mL EDTA作抗凝剂不是本品的干扰物质。
用本试剂盒检测9例临床样本:包括1例G6PD突变阴性样本(野生型样 本)、3例G6PD其他突变样本(c.517T>C、c.835G>A、c.868A>G),1例缺失 型α-地贫样本(-α3.7/αα)、1例非缺失型α-地贫样本(αCSα/αα),1例弓形虫感染 DNA样本、1例巨细胞病毒感染全血样本、1例大肠杆菌DNA样本,检测结果 与核酸序列测定结果比较,前8例检测结果与测序结果完全相同,后1例无检 测出任何信号,即9例均无交叉反应。
(4)重复性
对重复性进行研究,选择16例包含8个位点基因型的临床样本,每例样本 重复检测20次,结果显示重复性较好。
实施例2
本发明试剂盒的临床应用
1、预期用途
本试剂盒用于体外定性检测人类全血基因组DNA样本,能够检测出他汀类 药物个体化用药的4种基因8个位点,如下表8所示:
表8
位点 | 通道 |
SLCO1B1c.388A>G,rs2306283) | FAM |
SLCO1B1(c.521T>C,rs4149056) | FAM |
APOE(c.388T>C,rs429358) | VIC |
APOE(c.526C>T,rs7412) | VIC |
ABCB1(2677T>G,rs2032582) | ROX |
ABCB1(3435T>C,rs1045642) | ROX |
LDLR(c.666T>C,rs1433099) | CY5 |
LDLR(c.52G>A,rs14158) | CY5 |
2、检验原理
本试剂盒产品采用改良的荧光PCR探针熔解曲线技术。
设计特异的PCR引物,扩增获得一定长度的DNA片段,该片段包含了所 要检测的多态位点。
其检测过程是使用不对称PCR进行扩增,富集单链靶序列,使熔解曲线分 析过程探针可以与靶序列杂交,具体实施方式是在需要检测的区域和正常区域 设计相应的探针,并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物, 用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段;PCR扩增结束后进行熔 解曲线分析。
根据熔点值的大小及不同通道出现的熔解峰个数对模板的基因型作出判 断。
3、主要组成成分如下表9。
表9
4、适用仪器
Bio-Rad CFX96
5、储存条件及有效期
储存条件:试剂盒避光储存于-30℃~-15℃,避免反复冻融。
有效期:6个月。
6、样本要求
(1)本试剂盒样本来源为抗凝全血,所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA,不 能使用肝素抗凝。
(2)样本采集:抽取静脉血1-5mL入含有抗凝剂的管中,标记好样本信息。
(3)血样保存:抗凝全血在室温放置不超过24小时,2-8℃保存不超过一 个月,-18℃以下保存不超过两年,-70℃可长期保存,冷冻保存时应避免反复冻 融。
(4)血样运输:抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封,应保证冰 袋不化冻,且在途时限不宜超过72小时。
7、检验方法
7.1DNA的提取
本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求,一般可用实验室常规 方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA,推荐使用深圳会众生物技 术有限公司的全血DNA提取试剂盒。若采用深圳会众生物技术有限公司的全血 DNA提取试剂盒,直接按说明书加样;若用酚-氯仿或其它方法提取DNA,则 要测定DNA浓度,必要时进行浓缩或稀释,将DNA浓度调整至2-200ng/μL后 才能进行检测实验。
7.2PCR扩增
从试剂盒中取出所有组分置于室温融化并振荡混匀,5000rpm离心5~10秒。
取出八联管或96孔PCR板,做好标识。
每人份反应体系的配制如下表10所示。
表10
组分 | 反应液I(μL/人份) | 反应液II(μL/人份) | 总量(μL/人份) |
体系 | 22.5 | 0.5 | 23 |
反应液可直接分装成23μL/份,加入2μL各待检DNA样本,盖紧管盖, 5000rpm离心5~10秒。
将上述已加模板的反应管5000rpm离心5~10秒后,置于基因扩增仪中,并 记录好样本摆放顺序,按下表11设置PCR扩增参数。
表11
8、结果判断
野生型对照在各通道中的熔解峰的Tm值范围如下:
FAM通道:
SLCO1B1,388A>G位点的Tm值为62℃±1℃;521T>C位点的Tm值为 54℃±1℃;
VIC通道:
APOE,388T>C位点的Tm值为52℃±1℃;526C>T位点的Tm值为 58℃±1℃;
ROX通道:
ABCB1,2677T>G位点的Tm值为53℃±1℃;3435T>C位点的Tm值为 62℃±1℃;
CY5通道:
LDLR,52G>A位点的Tm值为60℃±1℃;666T>C位点的Tm值为72℃±1℃。
9、检验结果的解释
本产品检测一个样本包括四个检测通道,即每个样本需要查看四个通道的 熔解峰情况综合判断样本的基因型。
FAM通道检测(SLCO1B1,388A>G)位点,野生型峰和突变型峰的熔点 差异(△Tm)为3.25±0.52;同时还检测(SLCO1B1,521T>C)位点,野生型 峰和突变型峰的熔点差异(△Tm)为4.58±0.67。
VIC通道检测(APOE,388T>C)位点,野生型峰和突变型峰的熔点差异 (△Tm)为6.38±0.48;同时还检测(APOE,526C>T)位点,野生型峰和突变 型峰的熔点差异(△Tm)为5.29±0.84。
ROX通道检测(ABCB1,2677T>G)位点,野生型峰和突变型峰的熔点差 异(△Tm)为4.86±0.37;同时还检测(ABCB1,3435T>C)位点,野生型峰和 突变型峰的熔点差异(△Tm)为3.98±0.62。
CY5通道检测(LDLR,52G>A)位点,野生型峰和突变型峰的熔点差异(△ Tm)为5.29±0.45;同时还检测(LDLR,666T>C)位点,野生型峰和突变型峰 的熔点差异(△Tm)为6.87±0.39。
10、检验方法的局限性
本试剂盒能检测4种基因8个位点,还有一些罕见的突变类型在本试剂盒 检测范围之外,可能造成漏检,这类样本可用测序法进一步验证。
11、产品性能指标
(1)测定准确性
对测定准确性进行研究,选用48例包含8个位点的临床样本,每例样本均 包含高、中、低3个浓度,每个浓度重复检测3次,均用3批产品进行检测, 分别计算该基因位点基因型的符合率。结果显示相应的位点基因型,研究结果 与测序结果结果完全符合,产品符合率为144/144。
(2)最低检测限
对最低检测限进行研究,选用16种包含8个位点全部基因型的临床样本每 种样本包含7个浓度梯度,每个浓度重复检测12次,均采用3批产品检测进行 检测。确定本试剂盒能稳定检出基因组DNA的最低浓度为2ng/μL。
(3)分析特异性
对特异性进行研究,均采用3批产品进行检测,结果如下:
通过干扰筛查试验,当全血样本中甘油三酯≤13.5mmol/L或总胆红素 ≤358.24μmol/L时,不是本试剂盒的干扰物质,溶血样本不影响本试剂盒检测结 果。
通过干扰评价试验,20IU/mL肝素抗凝剂是本品的外源性干扰物质,2mg/mL 枸橼酸钠或5mg/mL EDTA作抗凝剂不是本品的干扰物质。
用本试剂盒检测9例临床样本:包括1例G6PD突变阴性样本(野生型样 本)、3例G6PD其他突变样本(c.517T>C、c.835G>A、c.868A>G),1例缺失 型α-地贫样本(-α3.7/αα)、1例非缺失型α-地贫样本(αCSα/αα),1例弓形虫感染 DNA样本、1例巨细胞病毒感染全血样本、1例大肠杆菌DNA样本,检测结果 与核酸序列测定结果比较,前8例检测结果与测序结果完全相同,后1例无检 测出任何信号,即9例均无交叉反应。
(4)重复性
对重复性进行研究,选择16例包含8个位点基因型的临床样本,每例样本 重复检测20次,结果显示重复性较好。
综上所述,本发明提供的检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组 合物、试剂盒及检测方法,具有检测全面、通量高、操作简单、检测迅速且安 全无污染的优点。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术 领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳会众生物技术有限公司
<120> 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒、方法
<130> 2020
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtttaattc agtgatgttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgatgctct attgagtgat 20
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacactctct tatctacat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaatggatc tatgggag 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcacggctgt ccaaggag 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggcgcaccc gcagctcc 18
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgcgtaagcg gctcct 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgcggccct gttccaccag 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caatagcagg agttgttg 18
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<212> DNA
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ttactctact taattaatc 19
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ttgctgagaa cattgcctat g 21
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acttacatta ggcagtgac 19
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gcaccgagac caaactcat 19
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caggccacgt gtcctcacgg 20
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ctaatatcaa ttcatcagaa 20
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<400> 23
gcctgagtca ccggtcacc 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gacctcgccg gccttgtt 18
Claims (6)
1.检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物,其特征在于,包括:用于检测SLCO1B1位点的第一引物和第一探针;用于检测APOE位点的第二引物和第二探针;用于检测ABCB1位点的第三引物和第三探针;以及,用于检测LDLR位点的第四引物和第四探针;
其中,第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示,第一探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.17-18所示;第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5-8所示,第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.19-20所示;第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9-12所示,第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.21-22所示;第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13-16所示,第四探针的核苷酸序列如SEQ ID No.23-24所示。
2.根据权利要求1所述的检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物,其特征在于,所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的3’和5’端分别进行荧光标记。
3.检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物。
4.根据权利要求3所述的用于检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒,其特征在于,还包括MgCl2、dNTP和Tap酶;
所述MgCl2的终浓度为1-5mM;所述dNTP的终浓度为100-200nM;所述Tap酶的终浓度为2-5U。
5.检测他汀类药物代谢基因多态性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)采用PCR溶解曲线法,利用权利要求3或4所述的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒对样品DNA进行PCR扩增;
(3)通过监测整个溶解过程当中的信号值随温度的变化规律,区分靶序列的基因型。
6.根据权利要求5所述的检测他汀类药物代谢基因多态性的方法,其特征在于,步骤(2)中,利用权利要求4所述的检测他汀类药物代谢基因多态性的试剂盒对样品DNA进行PCR扩增;采用PCR溶解曲线法进行PCR扩增的反应条件为:
第一阶段:95℃,5min,1个循环;
第二阶段:95℃,15s;57℃,30s;72℃,30s;35个循环;
第三阶段:94℃,1min;40℃,2min;40-80℃,并收集荧光信号;1个循环。
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