CN112646869A - 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒 - Google Patents

阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112646869A
CN112646869A CN202011584168.3A CN202011584168A CN112646869A CN 112646869 A CN112646869 A CN 112646869A CN 202011584168 A CN202011584168 A CN 202011584168A CN 112646869 A CN112646869 A CN 112646869A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
primer pair
kit
extension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011584168.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112646869B (zh
Inventor
陈涛
张静
王珊霞
林金飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd filed Critical Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Priority to CN202011584168.3A priority Critical patent/CN112646869B/zh
Publication of CN112646869A publication Critical patent/CN112646869A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112646869B publication Critical patent/CN112646869B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒，具体的本发明筛选出了与阿托伐他汀个体化用药相关基因的SNP位点的组合，利用核酸质谱仪对阿托伐他汀相关的遗传学标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验。通过本发明的方法检出成功率高、技术重现性好、性价比高，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用；本发明的方法具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，提高了检测阳性率。

Description

阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒。
背景技术
他汀类药物是临床心血管疾病治疗一线用药，属于临床一类广泛使用的口服降脂药物。目前，随着临床应用指南的不断更新，在治疗代谢性疾病、脑血管疾病、心血管疾病中均有应用。但是，对这些药物的反应显示出较高的个体差异，而且部分患者出于对不良反应的担忧而拒绝或停用他汀。因此，研究他汀类药物在临床用药中用药指导方法以及确认其使用安全性具有重要的意义。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)是一种遗传标记，是指基因组水平上由于单核苷酸的变异，而引起的DNA序列的多态性。在人群中的发生频率大于1％，包括单碱基的转换、颠倒以及单碱基的插入或缺失等形式表现，是一种新的遗传标志，可以为疾病的预测、诊断、治疗以及新型药物的研制提供可靠的有效的科学根据。
SNP发生在编码区，能够影响蛋白功能，从而影响人体健康或药物代谢，主要表现在疾病易感性方面的个体差异、同一药物治疗疗效的个体差异、同一药物的不良反应的个体差异。药物遗传学或药物基因组学方法对于解决药物疗效的个体差异非常重要，尤其是在精密医学时代。
他汀类药物是降低血浆胆固醇水平的一线治疗药物。尽管安全并且显示出几种有益的非胆固醇依赖性多效性作用，但有关他汀类药物治疗目标的重大差异已有大量文献报道。降脂治疗在临床反应中显示出高度的变异性，并且有证据表明，个体之间药物反应的变异性是由于遗传因素引起的。参考基因检测的结果，医生可以在开处方时，在药品选择、剂量控制及联合用药等方面提出适合每个患者自己的个体化用药方案，最终达到提高药物疗效、降低药物毒，让患者走出用药盲区，用准药，用好药，把握最佳治疗时期。目前临床尚未有十分有效的阿托伐他汀用药指导方法，因此亟需建立一种高灵敏，经济，简单的分子技术筛查方法，填补国内空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒。
本发明的第一方面，提供了一种阿托伐他汀个体化用药基因的指导试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增引物对组，所述PCR扩增引物对组包括特异性扩增选自下组的SNP位点的引物对：rs2032582、rs662799、rs2266788、rs320、rs708272、rs8192870和rs4148222。
在另一优选例中，所述试剂盒基于多重PCR飞行时间质谱检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括单碱基延伸引物组。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs2032582的引物对如SEQID NO.1至SEQ ID NO.2所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs662799的引物对如SEQID NO.3至SEQ ID NO.4所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs2266788的引物对如SEQID NO.5至SEQ ID NO.6所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs320的引物对如SEQ IDNO.7至SEQ ID NO.8所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs708272的引物对如SEQID NO.9至SEQ ID NO.10所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs8192870的引物对如SEQID NO.11至SEQ ID NO.12所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs4148222的引物对如SEQID NO.13至SEQ ID NO.14所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs2032582的延伸引物如SEQ IDNO.15所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs662799的延伸引物如SEQ IDNO.16所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs2266788的延伸引物如SEQ IDNO.17所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs320的延伸引物如SEQ IDNO.18所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs708272的延伸引物如SEQ IDNO.19所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs8192870的延伸引物如SEQ IDNO.20所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs4148222的延伸引物如SEQ IDNO.21所示。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述PCR扩增引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述单碱基延伸引物组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内含有PCR预混液，所述PCR预混液主要包括热启动Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内含有虾碱性磷酸酶(SAPEnzyme)。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内含有SAP缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内含有延伸酶(iPLEXEnzyme)。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器，所述第七容器内含ddNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第八容器，所述第八容器内含延伸反应缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括纯水。
本发明的第二方面，提供了一种基于多重PCR飞行时间质谱检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点的方法，包括以下步骤：
(1)以待测样品外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
(2)应用虾碱式磷酸酶对步骤(1)的扩增产物进行SAP处理；
(3)使用延伸引物对步骤(2)纯化后的产物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
(4)脱盐树脂纯化延伸产物；
(5)质谱平台检测分析，判断是否存在基因变异。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，特异性扩增选自下组的SNP位点：rs2032582、rs662799、rs2266788、rs320、rs708272、rs8192870、rs4148222。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，使用所述扩增引物对组进行PCR扩增。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，使用所述单碱基延伸引物组进行单碱基延伸反应。
本发明的第三方面，提供了PCR扩增引物对组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.14所示的引物。
本发明的第四方面，提供了单碱基延伸引物组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述单碱基延伸引物组包括序列如SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.21所示的延伸引物。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明提供了一种阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒，本发明筛选出了阿托伐他汀个体化用药相关基因的7个SNP位点，进而能够利用核酸质谱仪对阿托伐他汀相关的遗传学标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验。通过多轮筛选，获得了能够对该7个SNP位点进行高效多重扩增，且适合MassARRAY核酸质谱检测的多重PCR扩增引物对，并筛选获得了适合的延伸引物，因而实现了对该7个SNP位点的高准确性、高灵敏性检测，检测结果稳定，提高了检测阳性率。
本申请的测定方法基于多重PCR技术和MassARRAY核酸质谱技术对阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点进行检测，能够对7个位点同时检测。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
多重PCR-飞行时间质谱检测技术虽然能够进行超高通量的检测，但是其对PCR扩增产物的质量要求较高。本发明人在研究中发现，现有的能够进行多重荧光PCR法检测的扩增引物和延伸引物，直接应用于多重PCR-飞行时间质谱检测中，存在很多缺陷，比如无法进行单碱基延伸反应导致质谱检测的假阴性，灵敏度较低且重复性差难以满足临床应用。因此，本发明人针对每个检测位点，重新设计了多对扩增引物和延伸引物，在单位点检测能够满足要求的情况下，进行多重组合检测验证，经过大量试验筛选，最终获得了灵敏度高、特异性好，且检测结果稳定的适用于飞行时间质谱检测的多重PCR检测体系和延伸引物。
本发明采用多重PCR法对靶序列进行扩增，人工设计多对引物，再对其进行优化选择并验证，最终确定包含如下扩增引物的检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点的共计7个位点的核酸检测试剂盒。
表1扩增引物
Figure BDA0002865099780000041
Figure BDA0002865099780000051
其中，F为上游引物，R为下游引物。
延伸引物如表2所示：
表2延伸引物
Figure BDA0002865099780000052
表1和表2列出的引物序列，均可采用常规的多核苷酸合成方法合成。
除上面提到的扩增引物和延伸引物外，本发明还提供了检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点的试剂盒，所述检测试剂盒中各组分的具体含量如下：
表3试剂盒组分
Figure BDA0002865099780000053
本发明还提供了基于多重PCR飞行时间质谱检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点的方法，包括以下步骤：
(1)以待测样品外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
(2)应用虾碱式磷酸酶对步骤(1)的扩增产物进行SAP处理；
(3)使用延伸引物对步骤(2)纯化后的产物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
(4)脱盐树脂纯化延伸产物；
(5)质谱平台检测分析，判断是否存在基因变异。
进一步地，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，特异性扩增选自下组的SNP位点：rs2032582、rs662799、rs2266788、rs320、rs708272、rs8192870、rs4148222。
进一步地，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，使用所述扩增引物对组进行PCR扩增。
进一步地，所述步骤(3)中，使用延伸引物组进行单碱基延伸反应。
进一步地，所述步骤(1)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，52℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。
进一步地，所述步骤(2)的SAP处理条件为：57℃40min，65℃5min。
进一步地，所述步骤(3)的延伸反应的条件为：95℃、30s；95℃、5s，(51℃、5s，72℃、5s，5个循环)，35个循环；72℃保持5min。
本发明的主要优点在于：
本发明提供的阿托伐他汀个体化用药基因的核酸质谱指导方法考虑了不同患病人群阿托伐他汀用药的差异性，检测的个体化用药基因更前沿，并纳入了多个与阿托伐他汀个体化用药SNP位点，这些位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高；
本发明提供的检测技术，价格优势明显，改变传统单碱基检测价格昂贵、耗时长、操作繁琐等劣势。在阿托伐他汀个体化用药基因指导检测方面的灵敏度更高，通量更大，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用。
本发明提供的基于MassARRAY核酸质谱技术检测一组阿托伐他汀个体化用药基因指导的核酸质谱方法具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，较Sanger测序发具有明显优势，提高了检测阳性率。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
人类阿托伐他汀个体化用药相关基因的SNP位点筛选的可行性分析
通过搜索NCBI国内外全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)在大规模病理对照组临床研究中得到验证的阿托伐他汀个体化用药相关位点，本发明人对其做出筛选和评估，选择了与阿托伐他汀个体化用药显著相关的7个单核苷酸多态性位点，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于指导患阿托伐他汀的个体化用药。
筛选出的SNP位点如下：
rs2032582、rs662799、rs2266788、rs320、rs708272、rs8192870、rs4148222。
实施例2体系验证
体系验证包括准确性、特异性、灵敏性、精密度和人员间对比等。
准确性验证方案：各位点检测20例，与Sanger测序比较，预期目标95％。
特异性验证方案：包含在准确性中，预期目标95％。
灵敏验证方案：以人基因组DNA阳性样本为模板，标定样本DNA含量分别为1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL进行灵敏度考察。
精密度验证方案(含批内、批间、人员比对，不涉及仪器间比对)，预期目标95％。
批内精密度：每一例样本同一批次重复3次，比较批内精密度。
批间精密度：同一操作者分多批次检验同样样本，比较批间精密度。
人员间比对：2位操作者检测同样样本，比较人员间结果的差异。
具体试验步骤如下：
1、DNA提取：根据南芯医疗自主研发的血液DNA提取试剂盒(为市售的快速高效抽提基因组DNA的试剂盒)说明书提供的操作步骤，制备人外周血基因组DNA，50μLddH2O洗脱；
2、PCR流程
(1)样本稀释至20ng/μL；
(2)按下表配制PCR反应体系(以下为单个样本量，样本DNA共需40ng)
表4 PCR反应体系
试剂 W1(μL) W2(μL)
水，ddH<sub>2</sub>O 0.8 0.8
10PCR Buffer with 20mM 0.5 0.5
25mM MgCl<sub>2</sub> 0.4 0.4
25mM dNTP混合液 0.1 0.1
25μM扩增引物混合液 1 1
5U/μL PCR Taq酶 0.2 0.2
20ng/μL DNA 2 2
总体积 5.00 5.00
(3)封膜，vortex混匀30秒，500g离心1分钟；
(4)将板放上PCR仪进行以下热循环：
95℃3分钟
45个循环：
(95℃15秒
52℃15秒
72℃1分钟)
72℃5分钟
4℃保温
2、SAP流程
(1)取出PCR板，500g离心3分钟；
(2)按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量)；
表5 SAP反应体系
试剂 每孔加样(μL) ×2
ddH<sub>2</sub>O 1.53 3.06
SAP缓冲液 0.17 0.34
SAP酶(1.7U/μL) 0.3 0.6
总体积 2.00 4.00
(3)每孔加2μLSAP混液；
(4)封膜，vortex混匀30秒，500g离心1分钟；
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环：
57℃40分钟
65℃5分钟
4℃保温
3、EXT(单碱基延伸)流程
(1)取出PCR板，500g离心3分钟；
(2)按下表配制EXT反应体系(以下为单个样本量)；
表6 EXT反应体系
试剂 W1(μL) W2(μL)
ddH<sub>2</sub>O 0.62 0.62
iPLEX缓冲液 0.2 0.2
ddNTP混合液 0.2 0.2
延伸引物混合液 0.94 0.94
iPLEX酶 0.04 0.04
总体积 2.00 2.00
(3)加入2μL iPLEX延伸混液；
(4)封膜，vortex混匀30秒，500g离心1分钟；
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环：
95℃30s
35个循环：
(95℃、5s
5个循环：
(51℃5s
72℃5s))
72℃5min
4℃保温
4、树脂脱盐
取出PCR板，500g离心3分钟；把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上，风干最少10分钟；样本板每一个有样本的孔里加入10uL水；封板，vortex10秒，500g离心1分钟；轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里；取下dimple plate，样本板封板，旋转器上颠倒摇匀3分钟；2000g离心5分钟。
5、Dispensing点样
使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据各位点聚类图(均聚类清晰)。
试验结果：以其中1例样本举例，其准确性验证结果如表7所示。
表7准确性验证(一代测序与MassARRAY结果对比)
SNP_ID 一代测序结果 MassARRAY结果
rs2032582 AC AC
rs662799 GG GG
rs2266788 GG GG
rs320 TG TG
rs708272 GG GG
rs8192870 TT TT
rs4148222 CC CC
以该例样本rs4148222位点举例，其精密度验证结果见表5。
表8 rs4148222位点精密度验证结果
重复1 重复2 重复3
批次1 CC CC CC
批次2 CC CC CC
批次3 CC CC CC
批次4 CC CC CC
批次5 CC CC CC
整体上，本申请所有位点聚类清晰，基本无灰区，误检可能小。本申请的各位点检测准确性(包含灵敏度及特异性)及精密度验证，见表9。
表9准确性、灵敏度、特异性验证结果
SNP_ID 准确性 灵敏度 特异性 批内精密度 批间精密度 人员对比
rs2032582 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs662799 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs2266788 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs320 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs708272 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs8192870 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs4148222 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
上表中，准确性100％表明所有的阳性样本均被正确的检出，且与Sanger测序结果一致；特异性100％表明所检测的样本中，没有出现假阳性的结果；批内精密度100％表明各样本同一批次重复检测的结果均能保持一致；批间精密度100％表明同一操作者多批次检验同一样本的检测结果均能保持一致；人员对比100％表明2位操作者检测同样样本的检测结果均能保持一致。
综上所述，本发明提供的阿托伐他汀个体化用药基因的核酸质谱指导方法考虑了不同患病人群阿托伐他汀用药的差异性，检测的个体化用药基因更前沿，并纳入了多个与阿托伐他汀个体化用药SNP位点，这些位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高。
对比例1 PCR扩增引物对和延伸引物的筛选
针对各位点，本发明人设计了数对至十余对扩增引物和延伸引物，再对其进行验证优化，最终确立了能够用于MassARRAY核酸质谱技术检测的多重PCR扩增引物和延伸引物组合。
本对比例以rs662799位点为例，例举部分效果不理想的扩增引物和延伸引物。
对照引物对1：
F-1：ACGTTGGATGGAACAAGCAAGGGAAGC(SEQ ID NO.:22)
R-1：ACGTTGGATGTGGTAGTGGAAATGGAGG(SEQ ID NO.:23)
对照引物对2：
F-2：ACGTTGGATGTGGAACAAGCAAGGGAA(SEQ ID NO.:3)
R-2：ACGTTGGATGTGGTAGTGGAAATGGAGG(SEQ ID NO.:23)
对照引物对3：
F-3：ACGTTGGATGGAACAAGCAAGGGAAGC(SEQ ID NO.:22)
R-3：ACGTTGGATGGGACCAAGAATCGGGAG(SEQ ID NO.:24)
对照延伸引物1：
Y-1：GGAACTGGAGCGAAAGT(SEQ ID NO.:25)
对照延伸引物2：
Y-2：CAGGAACTGGAGCGAAAGT(SEQ ID NO.:26)
本发明引物对：SEQ ID NO.3和4
本发明延伸引物：SEQ ID NO.16
具体方法同上述实施例，在单重筛选实验中，单重PCR扩增后使用不同延伸引物进行单碱基延伸，再对延伸产物进行质谱检测，单重检测结果发现对照引物对2、3在单重体系中检测能够正常工作，但是无法在多重体系中获得阳性结果。
多重体系中，对照引物对1和对照延伸引物1、2的组合，检测灵敏度分别为50ng/μL、50ng/μL；对照引物对1和SEQ ID NO.16所示的延伸引物组合，检测灵敏度为5ng/μL；SEQID NO.3和4所示引物对和对照延伸探针1的组合，检测灵敏度仅有50ng/μL。而SEQ ID NO.3和4所示引物对和SEQ ID NO.16所示延伸引物的组合，检测灵敏度能够达到1ng/μL。
结果表明，对照引物对2、3在检测系统中，无法有效扩增靶核酸序列，因此不能够在检测体系中工作；对照引物对1可以在多重检测体系中工作，但是灵敏度较差；对照延伸探1、2虽然也可以在延伸过程中工作，但是同样灵敏度较差。而本发明引物对(SEQ ID NO.3和4)和本发明延伸探针(SEQ ID NO.16)的组合能够在多重检测体系中正常工作，且灵敏度较高，达到1ng/μL。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广东南芯医疗科技有限公司
<120> 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒
<130> 200511
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
acgttggatg tagtaagcag tagggagt 28
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
acgttggatg agcaaatctt gggac 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gtttgactca ccttcccag 19
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
acgttggatg tggaacaagc aagggaa 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
acgttggatg ggaccaagaa tcgggag 27
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
aggaactgga gcgaaagt 18
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
acgttggatg gcaaagcctg gtgaatgt 28
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
acgttggatg tgggtggagg gtggaa 26
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
tcgcaggagg ctggat 16
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
acgttggatg gagatgctac ctggat 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
acgttggatg tgtttgcttc tttgg 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
gagatcgcta taggatttaa agc 23
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
acgttggatg cctgacctcg ccttca 26
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
acgttggatg acaccaacct cctaatcttt 30
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
ccagaatcac tggggttc 18
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
acgttggatg tgagccaatt agaagtt 27
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
acgttggatg aaggatacaa gtagcaag 28
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
tcaccacagt tgattaacat t 21
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
acgttggatg cttcagcaat gccctctac 29
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
acgttggatg aatcgacctg gctcacag 28
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
tgctttcatc tggagatgga 20
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
acgttggatg gaacaagcaa gggaagc 27
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
acgttggatg tggtagtgga aatggagg 28
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
acgttggatg ggaccaagaa tcgggag 27
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
ggaactggag cgaaagt 17
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
caggaactgg agcgaaagt 19

Claims (10)

1.一种阿托伐他汀个体化用药基因的指导试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增引物对组，所述PCR扩增引物对组包括特异性扩增选自下组的SNP位点的引物对：rs2032582、rs662799、rs2266788、rs320、rs708272、rs8192870和rs4148222。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括单碱基延伸引物组。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增引物对组中：
特异性扩增rs2032582的引物对如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示；
特异性扩增rs662799的引物对如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4所示；
特异性扩增rs2266788的引物对如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；
特异性扩增rs320的引物对如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8所示；
特异性扩增rs708272的引物对如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.10所示；
特异性扩增rs8192870的引物对如SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.12所示；和/或
特异性扩增rs4148222的引物对如SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.14所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸引物组中：
针对rs2032582的延伸引物如SEQ ID NO.15所示；
针对rs662799的延伸引物如SEQ ID NO.16所示；
针对rs2266788的延伸引物如SEQ ID NO.17所示；
针对rs320的延伸引物如SEQ ID NO.18所示；
针对rs708272的延伸引物如SEQ ID NO.19所示；
针对rs8192870的延伸引物如SEQ ID NO.20所示；和/或
针对rs4148222的延伸引物如SEQ ID NO.21所示。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述PCR扩增引物对组；和/或
所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述单碱基延伸引物组。
6.一种基于多重PCR飞行时间质谱检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
(2)应用虾碱式磷酸酶对步骤(1)的扩增产物进行SAP处理；
(3)使用延伸引物对步骤(2)纯化后的产物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
(4)脱盐树脂纯化延伸产物；
(5)质谱平台检测分析，判断是否存在基因变异。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，特异性扩增选自下组的SNP位点：rs2032582、rs662799、rs2266788、rs320、rs708272、rs8192870、rs4148222。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，使用所述扩增引物对组进行PCR扩增；和/或
所述步骤(3)中，使用所述单碱基延伸引物组进行单碱基延伸反应。
9.PCR扩增引物对组的用途，其特征在于，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.14所示的引物。
10.单碱基延伸引物组的用途，其特征在于，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测阿托伐他汀个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述单碱基延伸引物组包括序列如SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.21所示的延伸引物。
CN202011584168.3A 2020-12-28 2020-12-28 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒 Active CN112646869B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011584168.3A CN112646869B (zh) 2020-12-28 2020-12-28 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011584168.3A CN112646869B (zh) 2020-12-28 2020-12-28 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112646869A true CN112646869A (zh) 2021-04-13
CN112646869B CN112646869B (zh) 2023-05-23

Family

ID=75363859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011584168.3A Active CN112646869B (zh) 2020-12-28 2020-12-28 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112646869B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120101736A1 (en) * 2010-10-25 2012-04-26 Dudley Joel T Method and System for Computing and Integrating Genetic and Environmental Health Risks for a Personal Genome
CN102935076A (zh) * 2012-11-29 2013-02-20 康普药业股份有限公司 一种含阿托伐他汀钠的胶囊及其制备方法
AU2019100355A4 (en) * 2019-04-04 2019-05-09 Ding, Haozhen Mr A targeted sequencing data analysis method for risk assessment of atorvastatin-induced ADRs
CN110241197A (zh) * 2019-05-28 2019-09-17 南京派森诺基因科技有限公司 用于指导阿托伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用
CN111154861A (zh) * 2020-01-17 2020-05-15 深圳会众生物技术有限公司 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒、方法
CN111909996A (zh) * 2020-07-08 2020-11-10 广西医大睿谷医学检验有限公司 一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120101736A1 (en) * 2010-10-25 2012-04-26 Dudley Joel T Method and System for Computing and Integrating Genetic and Environmental Health Risks for a Personal Genome
CN102935076A (zh) * 2012-11-29 2013-02-20 康普药业股份有限公司 一种含阿托伐他汀钠的胶囊及其制备方法
AU2019100355A4 (en) * 2019-04-04 2019-05-09 Ding, Haozhen Mr A targeted sequencing data analysis method for risk assessment of atorvastatin-induced ADRs
CN110241197A (zh) * 2019-05-28 2019-09-17 南京派森诺基因科技有限公司 用于指导阿托伐他汀药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用
CN111154861A (zh) * 2020-01-17 2020-05-15 深圳会众生物技术有限公司 检测他汀类药物代谢基因多态性的引物及探针组合物、试剂盒、方法
CN111909996A (zh) * 2020-07-08 2020-11-10 广西医大睿谷医学检验有限公司 一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXY ROSALES AND MARYSOL ALVEAR AND ALEJANDRO CUEVAS AND NICOLÁS SAAVEDRA AND TOMÁS ZAMBRANO AND LUIS A. SALAZAR: "Identification of pharmacogenetic predictors of lipid-lowering response to atorvastatin in Chilean subjects with hypercholesterolemia", 《CLIN CHIM ACTA.》 *
KOYA等: "ABCB1 polymorphism is associated with atorvastatin-induced liver injury in Japanese population", 《BMC GENET.》 *
SHA等: "Influence of APOA5 Locus on the Treatment Efficacy of Three Statins: Evidence From a Randomized Pilot Study in Chinese Subjects", 《FRONT PHARMACOL. 》 *
X.-Y.JIANG PHD等: "CYP7A1 polymorphism influences the LDL cholesterol-lowering response to atorvastatin", 《CLINICAL PHARMACY THERAPEUTICS》 *
YUN-HUA YUE等: "Gene Polymorphisms Affect the Effectiveness of Atorvastatin in Treating Ischemic Stroke Patients", 《CELL PHYSIOL BIOCHEM.》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112646869B (zh) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113025701B (zh) 非酒精性脂肪性肝病易感基因的早筛方法及试剂盒
CN112080563A (zh) 一种检测慢性病精准用药基因的试剂盒
CN110541033A (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
CN111808944A (zh) 一种儿童个体化用药基因检测方法
WO2016165591A1 (zh) 基于焦磷酸测序技术的mgmt基因启动子甲基化检测
CN111118145A (zh) 基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN110846408A (zh) 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用
CN112280849B (zh) 一种抗抑郁症个体化用药基因分型检测的复合扩增体系及试剂盒
CN113549686A (zh) 一种钙离子拮抗剂代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113584161A (zh) 一种芬太尼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN111944912A (zh) 一种肤质基因检测方法
CN111635944A (zh) 一种检测肝癌易感性位点rs73613962的特异性引物、试剂盒和PCR方法
CN112501283A (zh) 卡马西平个体化用药基因的指导方法及试剂盒
CN109355377B (zh) 华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用
CN113025702B (zh) 强直性脊柱炎易感基因的早筛方法及试剂盒
CN112553325A (zh) 舒芬太尼个体化用药基因的指导方法及试剂盒
CN112592972B (zh) 弥漫性毒性甲状腺肿易感基因的早筛方法及试剂盒
CN112646869B (zh) 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒
CN107868824A (zh) 单碱基延伸法检测ugt1a1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用
CN113981072A (zh) 用于hla-a*29基因检测的引物、探针、试剂盒和方法
CN112831558B (zh) 克罗恩病易感基因的早筛方法及试剂盒
CN112680517B (zh) 奥沙利铂个体化用药基因的指导方法及试剂盒
CN113549681A (zh) 一种他莫昔芬代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN112779322A (zh) 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用
CN112553339A (zh) 伊立替康个体化用药基因的指导方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant