CN107868824A - 单碱基延伸法检测ugt1a1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用 - Google Patents

单碱基延伸法检测ugt1a1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够为临床给药提供指导且有利于丰富基因多态性研究的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用。该引物系统包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法采用多重PCR扩增检测位点所在基因片段手，采用荧光标记单碱基延伸技术进行DNP位点检测，在对患者使用伊立替康前检测其体内的UGT1A1*6情况，可以预测依立替康等药物的毒性，并允许选择个体化剂量或替代疗法，为肿瘤患者使用伊立替康及其类似物化疗提供了临床指导。

Description

单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法 和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用。
背景技术
伊立替康(Irinotecan，CPT-11，也称为开普拓)对提高结直肠癌根治术后的长期生存率具有重要意义，同时也对肺癌、脑癌和乳腺癌等癌症具有有效的抗癌活性，是最普遍的化疗处方药物之一。伊立替康是一无活性的前药，在体内能够经羟酸酯酶活化转变为活性代谢产物SN-38而发挥效用。活性SN-38的主要清除途径是通过肝脏尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)的糖基化作用转变为无活性的SN-38G后经尿液、胆汁排出。
UGT1A1基因启动子区具有一定多态性。UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与CPT-11相关的严重毒副作用的发生，与国外研究相比，中国人与白种人结直肠癌患者UGT1A1家族各个基因SNP分布均存在显著性差异，中国人UGT1A1*28位点的野生型基因型(TA6/6)的分布显著偏高(72.9％对45.2％，P＝0.005)，而UGT1A1*6(211G>A，G71R)这一SNP在白种人中并未发现。这些在中国人群中分布较多的基因型，对应的UGT1A1活性均较高，对SN38的失活代谢作用较强。美国FDA建议伊立替康药品说明书标示适用基因型。中国国家卫生部在新的临床检验项目目录中也增列了“化学药品个体化用药基因检测项目”。UGT1A1基因型检测对于临床正确用药，减少毒副作用，提高疗效具有明确的临床意义。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够为临床给药提供指导且有利于丰富基因多态性研究的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:3所示。
在其中一个实施例中，所述扩增引物对和/或所述测序引物的使用浓度为5.0+0.2pmol/μl。
上述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统可应用在制备检测UGT1A1*6基因多态性试剂中。
一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，含有上述任一实施例所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统。
在其中一个实施例中，所述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂和毛细管电泳试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括基因型为A/A的纯合突变的阳性对照试剂。
一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，使用上述任一实施例所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，所述方法包括如下步骤：
使用所述扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
使用所述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；
对单碱基延伸的产物进行片段分析。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增的条件是：先95℃、5min；再依次95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，共44个循环；再72℃延伸5min。
在其中一个实施例中，所述单碱基延伸的条件是：先94℃、10s；再依次53℃、5s，58℃、30s，共30个循环；最后4℃保温。
在其中一个实施例中，所述对单碱基延伸的产物进行片段分析是对单碱基延伸的产物进行毛细管电泳，检测产物的峰值。
本发明的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法采用PCR扩增检测位点所在的基因片段，采用荧光标记单碱基延伸技术进行DNP位点检测，在对患者使用伊立替康前检测其体内的UGT1A1*6情况，可以预测依立替康等药物的毒性，并允许选择个体化剂量或替代疗法，为肿瘤患者使用伊立替康(开普拓/伊林特肯)及其类似物化疗提供了临床指导。
附图说明
图1为杂合突变的实验组的毛细管电泳峰图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，包括扩增引物对和测序引物。其中，扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，测序引物的序列如SEQ ID NO:3所示。在一个实施例中，扩增引物对和/或测序引物的使用浓度为5.0±0.2pmol/μl。
上述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统可应用在制备检测UGT1A1*6基因多态性试剂中。如一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其含有上述任一实施例的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统。
进一步，在一个实施例中，上述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂和毛细管电泳试剂中的至少一种。PCR反应试剂中含有DNA聚合酶、dNTPs、含Mg2+的缓冲液等。
更进一步，在另一个实施例中，该单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括阳性对照试剂。阳性对照试剂含有基因型为A/A的纯合突变的模板DNA。
本实施方式还提供了一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，其使用上述任一实施例的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，该方法包括如下步骤：
使用扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
使用测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；
对单碱基延伸的产物进行片段分析。
在一个实施例中，PCR扩增的条件是：先95℃、5min；再依次95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，共44个循环；再72℃延伸5min。
在一个实施例中，单碱基延伸的条件是：先94℃、10s；再依次53℃、5s，58℃、30s，共30个循环；最后4℃保温。
在一个实施例中，对单碱基延伸的产物进行片段分析是对单碱基延伸的产物进行毛细管电泳，检测产物的峰值。
本实施方式的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统特异性强，PCR扩增效率和单碱基延伸的效率都很高。该方法采用多重PCR扩增检测位点所在基因片段手，采用荧光标记单碱基延伸技术进行DNP位点检测，在对患者使用伊立替康前检测其体内的UGT1A1*6情况，可以预测依立替康等药物的毒性，并允许选择个体化剂量或替代疗法，为肿瘤患者使用伊立替康(开普拓/伊林特肯)及其类似物化疗提供了临床指导。
以下为具体实施例部分。
一、样本
本实施例接收的样本为患者的外周血，外周血采集后采用EDTA抗凝处理。
二、检测试剂及仪器
1.试剂
1.1引物
使用浓度：5.0pmol/μl。
贮存条件：干粉于-20℃保存；工作液于4℃保存。
有效期：-15～-25℃，一年；2～8℃，半年。
引物序列：
扩增引物对：UGT1A1*6-Fwd：5’-AATAGTTGTCCTAGCACCTGAC-3’(SEQ ID NO:1)
UGT1A1*6-Rev：5’-ACTCTTTCACATCCTCCCTTTG-3’(SEQ ID NO:2)
测序引物：UGT1A1*6：5’-CGCCTCGTTGTACATCAGAGAC-3’(SEQ ID NO:3)
1.2PCR反应试剂
商品名：Multiplex PCR Kit(货号：PM101-02)，其含有DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2缓冲液等；生产商：Vazyme；贮存条件：-20℃。
1.3单碱基延伸试剂
ABI公司的Multiplex Kit；贮存条件：-20℃。
1.4毛细管电泳试剂
商品名：GeneScanTM-500LizTM Size Standards(货号：4322682)；生产商：Applied Biosystems；贮存条件：2～8℃。
2.仪器，具体见下表1。
表1
3.质控品
空白对照(NTC)：采用H2O为DNA扩增模板，与基因组DNA样本平行实验。
阳性对照(POS)：以已知基因型A/A的标本DNA为模板，与基因组DNA样本平行实验。
POS质控品可存储在-15～25℃环境中，可将POS质控品分装，使用液放置在2～8℃环境中储存。
质控结果判断，见下表2。
表2
常见失控的情形及处理方法，见下表3。
表3
三、检测过程
1.获取基因组DNA样本
使用常规的外周血基因组DNA提取试剂进行基因组DNA样本提取。外周血基因组DNA提取试剂可以是但不限于QIAamp DNA Mini Kit或TIANamp Blood DNA kit等。
2.试剂准备
取出2×Multiplex Buffer，Multiplex DNA Polymerase，扩增引物对，ddH2O，室温融化后，短暂离心；准备好合适数量的PCR反应管。
配制Primers Mixer：两条扩增引物按1:1混合，震荡混匀；短暂离心后备用。
反应体系配制，按下表4进行配制。
表4
试剂 体积(μl)
Multiplex Buffer 12.5
Multiplex DNA Polymerase 0.5
ddH2O 5.0
Total 18.0
震荡混匀，短暂离心后，分装18.0μl至标记好的PCR反应管。
加入引物混合物5.0μl后转移至标本制备区。
注：本检测使用高保真热启动聚合酶，因此，在工作过程中可预先配制好18.0μl的反应体系并保存于-20℃，每次使用时取出，加入5.0μl引物即可用于检测，也可将引物直接与聚合酶混合，保存于-20℃备用。
加样：若样品及质控品保存在-20℃，使用前置室温解冻，并短暂离心；向分装好的PCR反应管中加入2.0μl(～200ng)稀释后的模板；盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，转移至PCR扩增区，进行PCR扩增。
3.PCR扩增
置PCR管放于PCR仪上，反应程序设置如下：先95℃、5min；再依次95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，共44个循环；再72℃延伸5min。
4.单碱基延伸反应
DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸存在条件下复制或转录时，如果在反应系统中分别按比例引入四种带有荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)，链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延长，只要双脱氧核苷酸掺入链端，该链就停止延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧核苷酸为3’端的一系列长度不等的核酸片段。经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。
反应终止后，可再进行毛细管电泳，以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧核苷酸，便可依次阅读合成片段的核苷酸序列。
扩增产物纯化：取2.0μl ExoSAP-IT试剂和3.0μl ddH2O配制酶混合物，加入PCR扩增产物2.0μl，混匀微离心；在PCR仪中进行酶切反应，程序：36℃,15min；78℃,15min；4℃，保温。
单碱基扩增：纯化结束后按照表5所示体系配置，加入2.0μl的测序引物至相应管，最后加入1.0μl的纯化产物，按以下程序进行PCR扩增：94℃，10s；53℃，5s；58℃，30s；30个循环；4℃保温。
表5单碱基扩增反应扩增体系
试剂 体积(μl)
SNaPshot Ready Mix 1.25
5×sequencing buffer 1.5
Primers Mixer 2.0
ddH2O 4.25
SNE产物纯化：在SNaPshot PCR产物中加入1.0μl SAP酶，按照以下程序进行反应：36℃，60min；74℃，20min；4℃，保温。反应完毕后，取出产物保存于4℃。
纯化的产物最好立即进行SNaPshot分析，如不能，则应该在不超过24小时内完成后续分析。
5.毛细管电泳
使用的分子量标准为GeneScanTM-120LizTM Size Standards，采用基因分析仪进行电泳及分析。
电泳参数如下：恒温装置温度65℃、缓冲液温度35℃、预试电压15kV、预试时间180sec、注入电压1.5kV、注入时间10sec、第一次读出时间200ms、第二次读出时间200ms、运行电压15kV、共10步，每步间隔20sec，电流30μA。
四、结果分析与解释
1.结果分析方法
实验数据采用片段分析软件GENEMAPPERID V4.1进行分析。
2.检测结果见下表6
表6
3.GT1A1基因型对伊立替康用药毒性反应及用药建议，见下表7。
表7
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州金域医学检验集团股份有限公司
广州金域医学检验中心有限公司
<120> 单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatagttgtc ctagcacctg ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actctttcac atcctccctt tg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcctcgttg tacatcagag ac 22

Claims (10)

1.一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，其特征在于，包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，其特征在于，所述扩增引物对和/或所述测序引物的使用浓度为5.0+0.2pmol/μl。
3.如权利要求1或2所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统在制备检测UGT1A1*6基因多态性试剂中的应用。
4.一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统。
5.如权利要求4所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂和毛细管电泳试剂中的至少一种。
6.如权利要求4或5所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其特征在于，还包括基因型为A/A的纯合突变的阳性对照试剂。
7.一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，其特征在于，使用如权利要求1或2所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，所述方法包括如下步骤：
使用所述扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
使用所述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；
对单碱基延伸的产物进行片段分析。
8.如权利要求7所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件是：先95℃、5min；再依次95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，共44个循环；再72℃延伸5min。
9.如权利要求7所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，其特征在于，所述单碱基延伸的条件是：先94℃、10s；再依次53℃、5s，58℃、30s，共30个循环；最后4℃保温。
10.如权利要求7～9中任一项所述的用于检测UGT1A1基因启动子区TA重复多态性的方法，其特征在于，所述对单碱基延伸的产物进行片段分析是对单碱基延伸的产物进行毛细管电泳，检测产物的峰值。
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