CN111118145A

CN111118145A - 基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法

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Publication number: CN111118145A
Application number: CN202010074366.9A
Authority: CN
Inventors: 方闪闪; 梁瑶; 李丽琼; 张喆; 蔡从利
Original assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: CN111118145B

Abstract

本发明公开了一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法，涉及基因检测技术领域。本发明公开的核酸组合物包括用于进行多重PCR扩增心血管疾病用药相关基因的扩增引物组以及用于进行单碱基延伸反应的延伸引物组。使用本发明提供的核酸组合物、试剂盒或检测方法，采用核酸质谱技术可以检测心血管疾病用药相关基因的16个位点的基因型，其具有灵敏度高，特异性强，结果易于识别，并提高了准确性，操作方便等特点，本发明为心血管疾病用药相关基因的检测提供了更为可靠的检测手段，也为心血管疾病的个体化用药提供了更为合理的用药指导。

Description

基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

基于MassARRAY平台的iPLEX技术利用单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，可以实现多重扩增反应基因型检测。主要特点为进行单管多重PCR，在PCR扩增产物中加入序列特异延伸引物，延伸引物设计位于突变位点前一个碱基，在突变位点处可延伸一个碱基。然后将制备的样用品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测，离子质量越小，就越快达到。MassARRAY SNP检测的质谱范围为4000到8500Dalton，检测过程大体可分为分子生物学反应、质谱阵列的点样和质谱检测三个过程。

2007年，美国FDA首次批准了采用药物基因组学检测方法判断常用抗凝药物-华法林的用量及敏感性。美国FDA已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，用于预测不同基因型患者在应用药物时的疗效和不良反应。

2015年国家卫生计生委医政医管局发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》(以下简称“指南”)列出了药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导，共包含26个靶点。

国家卫生计生委印发的《医疗机构临床检验项目目录2013年版》中“五、临床分子生物学及细胞遗传学检目录下4、用药指导的分子生物学检验”推荐进行CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G>C)、AGTR1(1166A>C)、ACE(I/D)、CYP2C19、CYP2C9、VKORC1、MTHFR(C677T)以及APOE基因检测。

目前单类药物用药相关基因检测产品已有获批，考虑到临床上心血管疾病多伴有其他并发症，患者常有多药物联用的情况，但由于药物间的相互作用、患者自身情况等多方面因素的影响，易导致不良反应的发生。所以针对心血管常用药，基因检测能更有效地指导患者用药。

血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统的重要体液因子，其90％以上的效应通过血管紧张素Ⅱ的1型受体(AGTR1)介导。AGTR1的1166A>C基因多态性可影响ARB类药物的治疗效果，A/A基因型个体对ARB类药物更加敏感，降压效果更好。

血管紧张素转换酶(angio tensin converting enzyme，ACE)是肾素-血管紧张素系统的关键酶，由ACE基因编码，是ACEI类药物的作用靶点。ACE基因的第16号内含子中存在插入(Insertion,I)/缺失(Deletion,D)序列，会导致ACE基因呈现I/D多态性，从而影响ACEI类药物的疗效。2015年国家卫生计生委医政医管局发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》(以下简称“指南”)中建议临床上在选择ACEI类药物进行治疗前对ACE I/D多态性进行检测，以指导选择合适的ACEI类药物。

β肾上腺素受体是β受体阻滞剂类药物的作用靶点，由ADRB1基因编码。该受体属于G蛋白偶联受体超家族，通过与Gs蛋白偶联调节细胞内cAMP和L型钙通道的开放频率。ADRB1的1165G>C多态性可影响β受体阻滞剂的疗效。“指南”中建议临床医师在应用β1受体阻滞药前进行ADRB1多态性检测，并根据其基因型调整用药剂量，以提高疗效。

CYP2D6是CYP450家族成员之一，已知经其催化代谢的药物多达80余种，CYP2D6基因多态性直接影响其酶活性，进而影响药物的代谢效率。不同个体CYP2D6活性最大可相差1000倍。中国人群中CYP2D6常见的导致酶活性降低的等位基因是CYP2D6*10，该等位基因导致中间代谢(IM)表型，美托洛尔药物代谢效率降低。FDA建议在使用美托洛尔药物前先检测CYP2D6基因多态性，再根据基因型调整用药剂量，以提高疗效。

CYP2C9是CYP450家族成员之一，占肝微粒体P450总量的20％，该酶催化约12％的临床常用药物。中国人群中主要存在的遗传变异为CYP2C9*3，导致酶活性降低。“指南”中建议CYP2C9*1/*3基因型个体中洛沙坦的降压作用下降，需适当增加用药剂量以增强降压疗效。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)能催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成，是叶酸代谢过程中的关键酶。中国高血压患者通常伴有同型半胱氨酸增高，在叶酸缺乏的情况下极大地增加了心血管事件的发生概率。通过基因筛查找出高危人群，叶酸治疗降低同型半胱氨酸浓度，减少脑卒中等心血管事件发生率。降压药物联合叶酸补充治疗可更有效地降低MTHFR677CC基因型H型高血压患者血压水平。

由中华医学会心血管病学分会、中国老年学学会心脑血管病专业委员会共同制定的《华法林抗凝治疗的中国专家共识》指出，华法林相关的药物基因(P450 2C9和VKORC1)多态性可导致对华法林的需求量减少，还与副作用增加有关。

美国FDA提醒应用氯吡格雷后出现心血管不良事件与CYP2C19功能缺失的等位基因有关，结合中国人的临床证据，建议如果ACS/PCI患者携带CYP2C19强代谢或超强代谢基因型(*1/*1、*1/*17和*17/*17)，推荐使用氯吡格雷标准剂量，如果患者携带CYP2C19功能缺失基因型，建议使用其他抗血小板药物(如普拉格雷、替格瑞洛)。

目前，基于核酸质谱技术检测多种心血管疾病用药相关基因仍然具有一些缺点，例如特异性不好，效率低，灵敏度低，峰值图不便于识别等。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法。使用本发明提供的核酸组合物、试剂盒或检测方法，采用核酸质谱技术可以检测心血管疾病用药相关基因的16个位点的基因型，其具有灵敏度高，特异性强，结果易于识别，并提高了准确性，操作方便等特点，本发明为心血管疾病用药相关基因的检测提供了更为可靠的检测手段，也为心血管疾病的个体化用药提供了更为合理的用药指导。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物，其包括用于进行多重PCR扩增心血管疾病用药相关基因的扩增引物组以及用于进行单碱基延伸反应的延伸引物组；

其中，所述扩增引物组包括如下引物对：

第1引物对：其包括SEQ ID NO.1-2所示的引物；

第2引物对：其包括SEQ ID NO.3-4所示的引物；

第3引物对：其包括SEQ ID NO.5-6所示的引物；

第4引物对：其包括SEQ ID NO.7-8所示的引物；

第5引物对：其包括SEQ ID NO.9-10所示的引物；

第6引物对：其包括SEQ ID NO.11-12所示的引物；

第7引物对：其包括SEQ ID NO.13-14所示的引物；

第8引物对：其包括SEQ ID NO.15-16所示的引物；

第9引物对：其包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；

第10引物对：其包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；

第11引物对：其包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；

第12引物对：其包括SEQ ID NO.23-24所示的引物；

第13引物对：其包括SEQ ID NO.25-26所示的引物；

第14引物对：其包括SEQ ID NO.27-28所示的引物；

第15引物对：其包括SEQ ID NO.29-30所示的引物；

第16引物对：其包括SEQ ID NO.31-33所示的引物；

所述延伸引物组包括SEQ ID NO.34-49所示的引物。

上述PCR引物对和延伸引物各自对应检测的基因名称和SNP位点见下表。

使用本发明提供的核酸组合物、试剂盒或检测方法，采用核酸质谱技术可以检测10种心血管疾病用药相关基因的16个变异位点包括：SLCO1B1基因c.388A>G和c.521T>C位点，APOE基因c.388T>C和c.526C>T位点，CYP2C19基因c.681G>A、c.636G>A和c.-806C>T位点，VKORC1基因c.1173C>T和c.-1639G>A位点，CYP2C9基因c.430C>T和c.1075A>C位点；CYP2D6基因c.100C>T位点，ADRB1基因c.1165G>C位点，ACE基因I/D位点，AGTR1基因c.1166A>C位点，MTHFR基因C677T位点，这些位点覆盖了对他汀、氯吡格雷、华法林和高血压治疗药物共四大类一线心血管用药基因的常见变异位点。通过本发明提供的核酸组合物，结合基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术，可对上述变异位点实现高效、准确、低成本、快速的检测，减少了在进行多重PCR易出现的非特异性扩增问题，提高检测的特异性和灵敏度。

本发明提供的核酸组合物通过对检测各基因的PCR引物对的科学合理设计和优化，减少了多重PCR时易出现的非特异性扩增问题，另外，通过对检测CYP2D6基因的第1引物对的设计和优化，使得在该基因的c.100C>T位点的基因型检测结果清晰可辨；通过对ACE基因第16引物对的设计和优化，使得在针对杂合型样本检测时，I型(插入型)峰值与D型(缺失型)峰值保持一致，结果清晰可辨；还有，通过对检测VKORC1基因c.1173C>T位点的延伸引物的设计和优化，使用I碱基代替A碱基，使得延伸引物能够更好地与模板匹配，实现了更为准确的检测结果。

本发明为心血管疾病用药相关基因的检测提供了更为可靠的检测手段，也为心血管疾病的个体化用药提供了更为合理的用药指导。

第二方面，本发明实施例提供一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的试剂盒，其包括前述实施方式所述的核酸组。

在可选的实施方式中，所述试剂盒包括多重PCR预混液。

在可选的实施方式中，所述扩增引物组存在于所述多重PCR预混液中。

当然，在其他的实施方式中，所述扩增引物组也可以是独立以粉末形式存在于试剂盒中，无论以何种形式的存在，其都是属于本发明的保护范文。

在可选的实施方式中，所述多重PCR预混液中还含有：UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。

现有核酸质谱技术需要开管操作，扩增产物还要逐步进行消化、延伸、点样，这些过程都容易产生扩增产物气溶胶，可能对环境、试剂等造成污染，可能出现假阳性检测结果。本发明针对这一问题，多重PCR预混液中用dUTP替换dTTP，使扩增产物含U碱基，同时加入UNG酶，这样，在样本扩增前将含U产物消化酶切，防止含U扩增产物形成气溶胶干扰正常检测。

在可选的实施方式中，所述多重PCR预混液中还含有Mg²⁺。

在可选的实施方式中，所述Mg²⁺以MgCl₂的形式添加至所述多重PCR预混液中。

需要说明的是，Mg²⁺并不限于以MgCl₂的形式添加至多重PCR预混液中，也可以是其他的盐形式加入，无论将其以何种形式添加至预混液中，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述多重PCR预混液中还含有DMSO。

在预混液加入二甲基亚砜(DMSO)可以增强PCR反应以及稳定性，有利于提高扩增效率和检测的特异性。

当然，为了增强PCR反应和稳定性，在其他的实施方式中也可以加入其他的与DMSO作用相似的化合物，其也是属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述多重PCR预混液中含有PCR缓冲液和DNA聚合酶。

需要说明的是，本发明对DNA聚合酶的类型不作特别限定，其可以是选自如下聚合酶中的一种：Taq、Tac、Sso、Poc、Bst、Tne、Tma、Pab、Tih、Kod、Vent、Sac、Mth、Pho、Tf1、Pfu、Tru、Tth、Phi29、Tl1和Pwo。无论使用何种DNA聚合酶，其均是属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述DNA聚合酶为Taq酶。

在可选的实施方式中，所述试剂盒包括iPLEX延伸预混液；

优选地，所述延伸引物组存在于所述iPLEX延伸预混液中。

在可选的实施方式中，所述iPLEX延伸预混液中还含有如下组分中的至少一种：iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液和iPLEX酶。

在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括SAP消化预混液，所述SAP消化预混液含有SAP缓冲液和SAP酶。

第三方面，实施例提供一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的方法，使用前述实施方式所述的核酸组或前述实施方式任一项所述的试剂盒进行检测。

在可选的实施方式中，所述方法包括：进行多重PCR；所述多重PCR的PCR反应体系中含有所述核酸组。

在可选的实施方式中，所述PCR反应体系中，所述核酸组中的每条引物的浓度为0.1-0.4μM。

在可选的实施方式中，所述PCR反应体系中，所述核酸组中的每条引物浓度0.1-0.4μM，其中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.19、SEQID NO.20、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.32为0.2μM，SEQ ID NO.33为0.4μM，其余均为0.1μM。

在可选的实施方式中，在所述PCR反应体系中含有的DNA聚合酶的浓度为1U/反应。

在可选的实施方式中，所述PCR反应体系中含有UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。

在可选的实施方式中，在所述PCR反应体系中，dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度比为：0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1，更优选为：1:1:1:1。

在可选的实施方式中，所述PCR反应体系中，Mg²⁺浓度为2.4-2.6mM，更优选为2.5mM。

在可选的实施方式中，所述PCR反应体系中，Mg²⁺浓度为2.5mM。

本发明的研究发现，由于底物组成复杂，各位点的扩增和延伸容易受其他条件改变的影响，且用dUTP替换dTTP后，碱基结合效率降低，导致多个位点效率明显降低。针对该问题，本发明过对延伸引物的设计和优化，避免引物3’端出现连续的A碱基，减少A/U碱基结合效率降低而带来的影响。另外，为了增加引物的扩增效率，在扩增过程中优化Mg²⁺的浓度为2.4-2.6mM，更优选为2.5mM，以及dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度比为0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1，更优选为：1:1:1:1，这样使得16个位点的扩增效率和延伸效果更好。

在可选的实施方式中，在所述PCR反应体系中，dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度为500μM：500μM：500μM：500μM。

在所述PCR反应体系中UNG酶的浓度为0.5U/反应。

在可选的实施方式中，所述PCR反应体系含有DMSO。

在可选的实施方式中，在所述PCR反应体系中DMSO的浓度为0.1μL/反应。

在可选的实施方式中，在进行所述多重PCR后，所述方法包括：将得到的多重PCR产物进行单碱基延伸反应；所述单碱基延伸反应的延伸反应体系中含有所述延伸引物组；

在可选的实施方式中，所述延伸反应体系中，所述延伸引物组中的每条引物浓度根据分子量而不同，浓度范围为1.55-3.15μM。

在可选的实施方式中，所述延伸反应体系中含有的iPLEX酶的浓度为1U/反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为采用对比例1的方法检测空白质控品部分位点(MTHFR C677T)出现的假阳性质谱结果。

图2为实验例2中的YZY-A0102样本的SLCO1B1c.521T>C的测序结果。

图3为实验例2中的YZY-A0102样本的SLCO1B1c.388A>G的测序结果。

图4为实验例2中的YZY-A0102样本的APOE c.526C>T的测序结果。

图5为实验例2中的YZY-A0102样本的APOE c.388T>C的测序结果。

图6为实验例2中的YZY-A0102样本的CYP2C19c.-806C>T的测序结果。

图7为实验例2中的YZY-A0102样本的CYP2C19c.681G>A的测序结果。

图8为实验例2中的YZY-A0102样本的CYP2C19c.636G>A的测序结果。

图9为实验例2中的YZY-A0102样本的CYP2C9c.430C>T的测序结果。

图10为实验例2中的YZY-A0102样本的CYP2C9c.1075A>C的测序结果。

图11为实验例2中的YZY-A0102样本的VKORC1c.1173C>T的测序结果。

图12为实验例2中的YZY-A0102样本的VKORC1c.-1639G>A的测序结果。

图13为实验例2中的YZY-A0102样本的ACE I/D的测序结果。

图14为实验例2中的YZY-A0102样本的ADRB1c.1165G>C的测序结果。

图15为实验例2中的YZY-A0102样本的AGTR1c.1166A>C的测序结果。

图16为实验例2中的YZY-A0102样本的CYP2D6c.100C>T的测序结果。

图17为实验例2中的YZY-A0102样本的MTHFR C677T的测序结果。

图18为采用对比例1的方法检测样本，APOE基因c.526C>T位点的质谱结果。

图19为采用对比例2的方法检测样本，APOE基因c.526C>T位点的质谱结果。

图20为采用对比例1的方法检测样本，CYP2C19基因c.-806C>T位点的质谱结果。

图21为采用对比例2的方法检测样本，CYP2C19基因c.-806C>T位点的质谱结果。

图22为采用实施例2的方法检测样本，APOE基因c.526C>T位点的质谱结果。

图23为采用实施例2的方法检测样本，CYP2C19基因c.-806C>T位点的质谱结果。

图24为采用对比例3的方法检测YZY-A0210样本，VKORC1c.1173C>T位点的质谱结果。

图25为YZY-A0210样本在VKORC1c.1173C>T位点的测序结果。

图26为采用实施例2的方法检测样本，VKORC1c.1173C>T位点的质谱结果。

图27为采用对比例4的方法检测样本，ACE I/D位点的质谱结果。

图28为采用实施例2的方法检测样本，ACE I/D位点的质谱结果。

图29为采用实施例2的方法检测样本，CYP2D6c.100C>T位点的基因分型结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物，其包括用于进行多重PCR扩增心血管疾病用药相关基因的扩增引物组以及用于进行单碱基延伸反应的延伸引物组；

其中，扩增引物组包括如下引物对：

第1引物对：其包括SEQ ID NO.1-2所示的引物；

第2引物对：其包括SEQ ID NO.3-4所示的引物；

第3引物对：其包括SEQ ID NO.5-6所示的引物；

第4引物对：其包括SEQ ID NO.7-8所示的引物；

第5引物对：其包括SEQ ID NO.9-10所示的引物；

第6引物对：其包括SEQ ID NO.11-12所示的引物；

第7引物对：其包括SEQ ID NO.13-14所示的引物；

第8引物对：其包括SEQ ID NO.15-16所示的引物；

第9引物对：其包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；

第10引物对：其包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；

第11引物对：其包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；

第12引物对：其包括SEQ ID NO.23-24所示的引物；

第13引物对：其包括SEQ ID NO.25-26所示的引物；

第14引物对：其包括SEQ ID NO.27-28所示的引物；

第15引物对：其包括SEQ ID NO.29-30所示的引物；

第16引物对：其包括SEQ ID NO.31-33所示的引物。

上述各引物对的序列和对应检测的基因位点如下表1所示：

表1

延伸引物组包括SEQ ID NO.34-49所示的延伸引物；各延伸引物的序列和对应检测的基因位点下表2所示。

表2

本实施例提供的核酸组合物可以通过常规的化学合成方式合成得到。

实施例2

本实施例提供了使用实施例1提供的核酸组合物基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的方法，包括如下步骤：

(1)样本制备

标本采集：根据实际情况不同，可采集不同的样本类型，可以是全血、口腔脱落细胞、干血片和唾液等含有完整细胞的样本组织。

基因组DNA的提取：提取后DNA的吸光度OD260/280在1.7-2.0之间，然后将样本稀释至10ng/μL，以用于下一步PCR反应。

(2)引物稀释

多重PCR扩增的引物干粉后用超纯水溶解制备成100μM贮存液，混合使每一条扩增引物的终浓度为0.5-2μM。

延伸引物的干粉用超纯水溶解制备成500μM的贮存液，混合配制后在质谱仪上调整至每一个引物峰高相对均一为止，即最低峰高大于最高峰高的二分之一。

(3)检测

(a)配制如下PCR多重反应体系：

需要说明的是：所述PCR反应体系中，所述核酸组中的每条引物浓度0.1-0.4μM，其中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.32为0.2μM，SEQ ID NO.33为0.4μM，其余均为0.1μM。

(b)PCR扩增程序：37℃孵育10min；95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸5min。

(c)碱性磷酸酶消化

SAP酶消化处理，酶切反应体系如下：

试剂名称	试剂体积(μL)
		Water,HPLC grade	1.53
SAP Buffer	0.17
		SAP Enzyme(1.7U/ul)	0.3
总体积(uL)	2.0

将其加入至第一轮5μL的PCR多重反应产物中，共7μL，进行如下反应：37℃保温40min；85℃保温5min。

(d)单碱基延伸反应

单碱基延伸反应，配制如下反应体系：

试剂名称	试剂体积(μL)
		Water,HPLC grade	0.62
iPLEX Buffer	0.2
		iPLEX Termination mix	0.2
Extend Primer mix	0.94
		iPLEX Enzyme	0.04
总体积(uL)	2.0

将其加入至上一轮7μL的反应产物中，共9μL，进行如下反应：95℃预变性30s；95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。

(4)产物脱盐纯化

样本板的每孔加入41μL的HPLC水，短暂离心后加入树脂，进行去离子交换处理。涡旋震荡和离心。

(5)产物点样、质谱检测

根据对应关系，将纯化产物点在芯片上，再将芯片放入质谱仪，待真空度达到后，就可以进行样本飞行检测。飞行结束后，在机器自带的Typer软件分析数据。

实施例3

本实施例提供的基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的试剂盒，其采用反应预混液设计，包含多重PCR扩增、SAP消化、iPLEX延伸三管反应预混液，以及阳性对照和空白对照共5管组成，具体组成见下表3。

表3

本实施例提供的试剂盒采用预混液方式设计，方便使用者操作，样品提取DNA后可直接扩增，缩短处理时间，提高工作效率，可高通量检测。该预混液不只是将各组份进行简单的混合，还加入了PCR反应的增强剂和稳定剂如DMSO(当然，在其他的实施例中可以不添加DMSO)，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。

对比例1

本对比例1所用引物组与实施例1的基本相同，仅部分基因位点的引物与实施例1不同，如下表3.1和3.2所示。

表3.1

表3.2

本对比例选择63例已知基因型的全血样本，采用实施例2中的样本提取和16个位点的引物稀释方法。另外，本对比例的检测方法与实施例2稍有不同的是，PCR多重反应采用常规核酸质谱体系，如下表所示：

试剂名称	试剂体积(uL)
		Water,HPLC grade	0.8
10x PCR Buffer with 20mM MgCl<sub>2</sub>	0.5
		25mM MgCl<sub>2</sub>	0.4
25mM dNTP Mix	0.1
		0.5μM Primer Mix(各引物浓度0.5μM)	1.0
5U/μl PCR Enzyme	0.2
		10ng/μL DNA	2.0
总体积(μL)	5.0

其余步骤如SAP消化和延伸，以及产物脱盐纯化、产物点样、质谱检测等过程均与实施例2相同。

经过与测序结果比对，63例样本的各位点结果全部符合。且基因分型清晰可辨，不同样本同一基因型的结果很集中，说明检测体系较稳定。

但由于核酸质谱技术需要多次开管操作，对扩增产物逐步进行消化、延伸、点样，这些过程中都很容易产生扩增产物气溶胶，对环境、试剂等造成污染，例如对比例1的空白质控品出现部分位点(MTHFR C677T)的阳性结果，如图1。最终可能导致待测样本出现假阳性结果，或者整体数据不可信。

对比例2

针对对比例1存在的问题，本对比例2将多重反应体系使用的dNTP中dTTP用dUTP替换，浓度不变，并加入UNG酶，其余实验条件和引物序列与对比例1完全相同。与对比例1结果相比，本对比例多个位点效率明显降低，如APOE基因c.526C>T位点，见图18(按对比例1的方法的检测结果)和图19(按对比例2的方法的检测结果)，或因扩增延伸受抑制，导致检测失败，如CYP2C19基因c.-806C>T位点，见图20(按对比例1的方法的检测结果)和图21(按对比例2的方法的检测结果)。

针对以上问题，本发明实施例1改变延伸引物的设计，避免引物3’端出现连续的A碱基，减少A/U碱基结合效率降低而带来的影响。引物组从对比例1的序列组合更换为实施例1的引物组合。同时，为了增加引物的扩增效率，在扩增过程中优化MgCl₂的浓度，以及dUTP/dNTP Mix的比例浓度，优化后方法即为实施例2中的方法，按实施例2的方法进行检测，使得该产品中16个位点的扩增效率和延伸效果达到最优。在加入dUTP和UNG酶的扩增反应中，APOE基因c.526C>T和CYP2C19基因c.-806C>T的检测结果特异性好，且效率提高，见图22和图23。

对比例3

针对VKORC1c.1173C>T位点的检测，本对比例3使用常规延伸引物CCCATCCTAGTCCAAG检测，其余检测引物和条件同实施例1和实施例2。本对比例检测YZY-A0210样本的结果如图24所示，该结果与该位点的测序结果(见图25)不符。

发明人认为原因在于：针对VKORC1c.1173C>T位点，在常规延伸引物序列覆盖范围内，两侧都有其他SNP位点的存在，根据该技术的原理，常规延伸引物很难完全正确匹配所有样本。

针对此问题，在实施例1的引物组中，将常规延伸引物CCCATCCTAGTCCAAG的第9位的A碱基更换为I碱基，使用实施例1的引物组按实施例2的方法检测YZY-A0210样本，结果显示临近位点出现突变也不会影响延伸引物的配对与延伸，最终使得该样本在该位点的检测得到理想的结果，如图26。

对比例4

针对ACE I/D位点，本对比例4使用单对引物(SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32)检测，其余检测引物和条件同实施例1和实施例2。检测效果如图27所示，杂合型样本的I型(插入型)峰值较D峰很低，难以判断杂合型。

发明人认为原因在于：ACE I/D位点，与一般的单核苷酸多态性位点不同，该位点为289bp的缺失，且缺失的序列中有14bp与野生型相同，引物设计难度大。对此，在实施例1的引物组中，使用了双R端引物策略，即使用SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33的组合策略，通过实施例2的方法检测，测结果如图28所示，其结果清晰可辨。

实验例1

CYP2D6基因与CYP2D7基因同源性较高，特异性引物设计难度较大，且CYP2D6基因的结构变异种类很多，100C>T位点的杂合型在不同样本中两种峰的相对峰高表现各异，并不是所有杂合样本都有等高的两种峰高。针对此问题，采用实施例1的引物组，按实施例2的方法进行检测，该位点有四种基因型且清晰可辨，如图29所示，分别是野生、突变、杂合，位点缺失，杂合型又聚类分开，分别代表了CYP2D6基因的不同结构变异，这对拷贝数变异(Copy number variation,CNV)检测具有重要的借鉴意义。

实验例2

选择已知基因型的100例全血样本，覆盖待测位点的所有基因型，使用实施例1的引物组和参照实施例2的方法进行检测，与金标准sanger测序法进行比对验证，结果表明实施例2方法检测结果与sanger测序法(委托送第三方检测机构(武汉擎科生物技术有限公司)进行所有16个位点的100例全血基因组DNA检测)结果100％符合。

以其中1例样本结果为例，采用实施例2的质谱法检测的结果如下表4所示：

表4.实施例2的质谱法检测YZY-A0102样本结果

将100例样本送至武汉擎科生物技术有限公司进行测序，其中一例样本的测序结果见表5。

表5.测序结果

样本编号	检测位点	测序结果	测序图谱
				YZY-A0102	SLCO1B1 c.521T>C	T	图2
YZY-A0102	SLCO1B1 c.388A>G	A	图3
				YZY-A0102	APOE c.526C>T	C	图4
YZY-A0102	APOE c.388T>C	CT	图5
				YZY-A0102	CYP2C19 c.-806C>T	C	图6
YZY-A0102	CYP2C19 c.681G>A	G	图7
				YZY-A0102	CYP2C19 c.636G>A	G	图8
YZY-A0102	CYP2C9 c.430C>T	C	图9
				YZY-A0102	CYP2C9 c.1075A>C	C	图10
YZY-A0102	VKORC1 c.1173C>T	T	图11
				YZY-A0102	VKORC1 c.-1639G>A	T	图12
YZY-A0102	ACE I/D	DI	图13
				YZY-A0102	ADRB1 c.1165G>C	C	图14
YZY-A0102	AGTR1 c.1166A>C	A	图15
				YZY-A0102	CYP2D6 c.100C>T	CT	图16
YZY-A0102	MTHFR C677T	A	图17

结果分析：sanger测序法检测结果与采用实施例2的方法的核酸质谱检测结果完全一致，但本发明的方法优势在于一孔反应检测所有16个位点，而测序方法需要16孔反应，工作量和成本都远高于本发明的方法。

实验例3

灵敏度检测

选取五份基因组DNA(gDNA)样本，覆盖了表1中所有的位点的杂合型，DNA样本进行梯度稀释：DNA浓度分别为10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.2ng/μL、0.1ng/μL、0.05 ng/μL。采用实施例2的方法进行检测，结果统计见下表6：

表6.不同浓度的gDNA检测结果

结果显示，在DNA浓度0.1ng/μL时，五个样本的16个位点均能正确检出，在0.05ng/μL时，个别位点未能检出。说明实施例2的方法在低至0.1ng/μL的基因组DNA的情况下，可以将10个基因的16个位点一次性全部检出，具有非常高的灵敏度，也适合复杂样本或稀有样本的研究。

实验例4

防污染能力验证

由于核酸质谱检测的灵敏度较高，0.2ng DNA即可正常检测，如果扩增产物在开管操作中一旦产生气溶胶，而气溶胶浓度远高于该检测限浓度，那么极易出现假阳性检测结果。而体系中加入dUTP和UNG酶，则可以减少中间产物污染对检测带来的影响。

本实验例中，选择两个样本的质谱检测产物(基因组DNA经过实施例2的多重扩增、消化、延伸、加水脱盐、质谱分析后的产物)，10倍梯度分别稀释10⁴倍～10¹⁰倍，将各浓度产物用荧光探针试剂进行定量检测，同时将各浓度产物用实施例2的方法进行检测，两个样本的质谱结果统计见下表7。

荧光探针法对质谱产物的定量方法：采用武汉友芝友医疗科技股份有限公司生产的AGTR1、ACE、ADRB1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A5和NPPA基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，用试剂盒中的CYP2D6反应液进行产物定量。因为该试剂盒的CYP2D6位点与本项目的CYP2D6c.100C>T是同一个位点，且上述试剂盒扩增该位点区域落在质谱扩增该位点的片段范围内。

定量方法：将全血gDNA浓度依次进行梯度稀释，分别为300ng/μL、60ng/μL、12ng/μL、2.4ng/μL、0.48ng/μL五个浓度。

将质谱产物10倍梯度分别稀释10⁴倍～10¹⁰倍。

配制PCR反应体系，每孔中依次加入全血gDNA梯度模板与稀释相应数量级的质谱产物(gDNA标曲模板及待检测模板均进行2个复孔)，勾选ROX校正，收集VIC通道荧光信号值。

根据制作的标准曲线，计算出稀释10⁴倍～10¹⁰倍之后的质谱产物浓度，进而推算出质谱产物中CYP2D6c.100C>T位点的产物浓度。

表7稀释后的质谱产物用实施例2检测的结果

荧光探针法定量结果表明，质谱产物中不同位点的产物浓度在10¹⁰～10¹³copies/ul范围内，各位点因扩增效率不同，产物浓度也不尽相同。稀释后的质谱产物进行实施例2检测，不同的位点分别在稀释10⁵～10¹⁰倍后不能检出，提示体系在加入dUTP和UNG酶后最多可抗10⁸拷贝产物气溶胶污染。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司

<120> 基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检

测方法

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttggatg ccatttggta gtgaggcagg t 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgttggatg gccatgtata aatgcccttc tc 32

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgttggatg tcacaaagcg gaagaatgtg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttggatg ctttgaggct gacctgaagc 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttggatg ctgcggaatt ttgggatgg 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgttggatg cagtgatatg gagtagggtc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgttggatg ctgcagcact ccactaccaa 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgttggatg tcagagcttt agaaaagtcg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgttggatg agtgacatgg aatcctgacg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgttggatg acctgggcta tcctctgttc 30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acgttggatg ggtctccgtg ggtcgcgtg 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgttggatg aaccccatca tctactgccg 30

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acgttggatg ctgtccaagg agctgcagg 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acgttggatg gagcatggcc tgcacctcg 29

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgttggatg atgcaagaca ggagccacat 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

acgttggatg tgtcacaggt cactgcatgg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acgttggatg gttggccagg cttgtcttaa 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acgttggatg gtcaagcaag agaagacctg 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgttggatg caataaagtc ccgagggttg 30

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acgttggatg gatatgcaat aattttccca c 31

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acgttggatg gactgtaagt ggtttctcag 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

acgttggatg aacatcagga ttgtaagcac 30

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgttggatg aacaaagttt tagcaaacg 29

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgttggatg ggatttgagc tgaggtcttc 30

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acgttggatg attaaacaag tggataagg 29

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acgttggatg gatgttctta cagttacagg 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

acgttggatg acctgcgcaa gctgcgtaag 30

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

acgttggatg gccccggcct ggtacactg 29

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgttggatg aatctgggtc atacatgtgg 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acgttggatg tatgggagtc tcccctattc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

acgttgatgt ggccatcaca ttcgtcagat 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acgttggact ggagaccact cccatccttt 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

acgttggatg cgacagagcg agactccgtc 30

<210> 34

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgggctgcac gctac 15

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaggagaagg tgtctgcggg ag 22

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gaggagcatt gaggac 16

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tccactacca aatgagc 17

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cccatcctig tccaag 16

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccgcgcagca gagcagtc 18

<210> 40

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cgacatggag gacgtg 16

<210> 41

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gaggagcatt gaggac 16

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ccctcgtgag ccaccgcacc 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

agtaatttgt tatgggttcc 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cacacttggc cttacctgga t 21

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cccgtgtctt ctgttctcaa ag 22

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gatgttgaat tttctgatga at 22

<210> 47

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ctggtacact gccaggc 17

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cttggtcata catgtggata tatg 24

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gacctgctgc ctatacagtc actttt 26

Claims

1.一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物，其特征在于，其包括用于进行多重PCR扩增心血管疾病用药相关基因的扩增引物组以及用于进行单碱基延伸反应的延伸引物组；

其中，所述扩增引物组包括如下引物对：

第1引物对：其包括SEQ ID NO.1-2所示的引物；

第2引物对：其包括SEQ ID NO.3-4所示的引物；

第3引物对：其包括SEQ ID NO.5-6所示的引物；

第4引物对：其包括SEQ ID NO.7-8所示的引物；

第5引物对：其包括SEQ ID NO.9-10所示的引物；

第6引物对：其包括SEQ ID NO.11-12所示的引物；

第7引物对：其包括SEQ ID NO.13-14所示的引物；

第8引物对：其包括SEQ ID NO.15-16所示的引物；

第9引物对：其包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；

第10引物对：其包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；

第11引物对：其包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；

第12引物对：其包括SEQ ID NO.23-24所示的引物；

第13引物对：其包括SEQ ID NO.25-26所示的引物；

第14引物对：其包括SEQ ID NO.27-28所示的引物；

第15引物对：其包括SEQ ID NO.29-30所示的引物；

第16引物对：其包括SEQ ID NO.31-33所示的引物；

所述延伸引物组包括SEQ ID NO.34-49所示的引物。

2.一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的核酸组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多重PCR预混液；

优选地，所述扩增引物组存在于所述多重PCR预混液中；

优选地，所述多重PCR预混液中还含有：UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR预混液中还含有Mg²⁺；

优选地，所述Mg²⁺以MgCl₂的形式添加至所述多重PCR预混液中。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR预混液中还含有DMSO。

6.根据权利要求3-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR预混液中含有PCR缓冲液和DNA聚合酶；

优选地，所述DNA聚合酶选自如下聚合酶中的一种：Taq、Tac、Sso、Poc、Bst、Tne、Tma、Pab、Tih、Kod、Vent、Sac、Mth、Pho、Tf1、Pfu、Tru、Tth、Phi29、Tl1和Pwo；

优选地，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括iPLEX延伸预混液；

优选地，所述延伸引物组存在于所述iPLEX延伸预混液中；

优选地，所述iPLEX延伸预混液中还含有如下组分中的至少一种：iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液和iPLEX酶；

优选地，所述试剂盒还包括SAP消化预混液，所述SAP消化预混液含有SAP缓冲液和SAP酶。

8.一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的核酸组或权利要求2-7任一项所述的试剂盒进行检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：进行多重PCR；所述多重PCR的PCR反应体系中含有所述核酸组；

优选地，所述PCR反应体系中，所述核酸组中的每条引物的浓度为0.1-0.4μM；

优选地，所述PCR反应体系中含有UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP；

优选地，在所述PCR反应体系中，dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度比为：0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1，更优选为：1:1:1:1；

优选地，所述PCR反应体系中，Mg²⁺浓度为2.4-2.6mM，更优选为2.5mM；

优选地，在所述PCR反应体系中，dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度为500μM：500μM：500μM：500μM；

优选地，所述PCR反应体系含有DMSO。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在进行所述多重PCR后，所述方法包括：将得到的多重PCR产物进行单碱基延伸反应；所述单碱基延伸反应的延伸反应体系中含有所述延伸引物组；

优选地，所述延伸反应体系中，所述延伸引物组中的每条引物浓度为1.55-3.15μM。