CN112695094A - 表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒，具体的本发明考虑不同癌症患者用药疗效的差异性，筛选出与表柔比星个体化用药相关基因的SNP位点的组合，利用核酸质谱仪对表柔比星相关的遗传学标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验。通过本发明的方法检出成功率高、技术重现性好、性价比高，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用；本发明的方法具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，提高了检测阳性率。

Description

表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒。
背景技术
表柔比星(法玛新)被CFDA批准的适应症有十四种之多，可以治疗恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、白血病和浅表性膀胱癌(膀胱局部灌注)。在以上批准的适应症中都进行了大型临床研究并提供了有效性和安全性的数据。由于蒽环类药物共同的副反应，心脏毒性，往往限制其在临床上应用，但是可以管理的，在治疗前充分评估治疗的获益及潜在风险，全面了解患者的器官功能和肿瘤情况下，严密监控心功能(LVFE降低程度和动态监测肌钙蛋白)，可以充分发挥表柔比星的有效性。因此，研究表柔比星在临床用药中用药指导方法以及确认其使用安全性具有重要的意义。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)是一种遗传标记，是指基因组水平上由于单核苷酸的变异，而引起的DNA序列的多态性。在人群中的发生频率大于1％，包括单碱基的转换、颠倒以及单碱基的插入或缺失等形式表现，是一种新的遗传标志，可以为疾病的预测、诊断、治疗以及新型药物的研制提供可靠的有效的科学根据。
SNP发生在编码区，能够影响蛋白功能，从而影响人体健康或药物代谢，主要表现在疾病易感性方面的个体差异、同一药物治疗疗效的个体差异、同一药物的不良反应的个体差异。药物遗传学或药物基因组学方法对于解决药物疗效的个体差异非常重要，尤其是在精密医学时代。
乳腺癌是现今发病率最高的女性恶性肿瘤，并且其发病率呈逐年升高的趋势，年发病率达(30～40)/10万，其中，>60岁人群发病率达70/10万。20世纪70年代以来乳腺癌化疗的应用极大地提高了乳腺癌的治疗效果，但化疗是一把双刃剑，化疗所带来的不良反应是限制化疗应用的重要因素。蒽环类药物是乳腺癌化疗中的一线选择药物，众多的临床试验证实了其在乳腺癌化疗中的基石地位。但蒽环类药物的不良反应，特别是随剂量累积的心脏毒性限制了蒽环类的用药总量。阿霉素因为对心脏影响较大，剂量控制比较严格。后期表柔比星上市，两者相比表柔比星对心脏的损伤大大降低。标准剂量表柔比星增加乳腺癌新辅助化疗的病理完全缓解率。
虽然药物治疗显著提高了患者的总体生存，但是肿瘤耐药仍然是治疗失败的常见原因。现有的研究表明乳腺癌肿瘤细胞的耐药机制复杂，主要有以下几方面：肿瘤细胞中包括P-gp、Mrp、BCRP等行使转运功能的ABC转运体过表达；细胞中大量代谢酶如细胞色素酶P450(CYP450)或者谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)家族等；细胞中DNA的转录及翻译即基因表达的改变等。
已有研究表明，核苷酸切除修复(NER)途径基因中的遗传变异(XPG、XPC、WRN)可能会改变基因组完整性。基于表柔比星的化疗在乳腺癌中的疗效，参考基因检测的结果，医生可以在开处方时，在药品选择、剂量控制及联合用药等方面提出适合每个患者自己的个体化用药方案，最终达到提高药物疗效、降低药物毒，让患者走出用药盲区，用准药，用好药，把握最佳治疗时期。目前临床尚未有十分有效的表柔比星用药指导方法，因此亟需建立一种高灵敏，经济，简单的分子技术筛查方法，填补国内空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒。
本发明的第一方面，提供了一种表柔比星个体化用药基因的指导试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增引物对组，所述PCR扩增引物对组包括特异性扩增选自下组的SNP位点的引物对：rs7668258、rs915927、rs2854501、rs1143684和rs2279744。
在另一优选例中，所述试剂盒基于多重PCR飞行时间质谱检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括单碱基延伸引物组。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs7668258的引物对如SEQID NO.1至SEQ ID NO.2所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs915927的引物对如SEQID NO.3至SEQ ID NO.4所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs2854501的引物对如SEQID NO.5至SEQ ID NO.6所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs1143684的引物对如SEQID NO.7至SEQ ID NO.8所示。
在另一优选例中，所述PCR扩增引物对组中，特异性扩增rs2279744的引物对如SEQID NO.9至SEQ ID NO.10所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs7668258的延伸引物如SEQ IDNO.11所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs915927的延伸引物如SEQ IDNO.12所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs2854501的延伸引物如SEQ IDNO.13所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs1143684的延伸引物如SEQ IDNO.14所示。
在另一优选例中，所述单碱基延伸引物组中，针对rs2279744的延伸引物如SEQ IDNO.15所示。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述PCR扩增引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述单碱基延伸引物组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内含有PCR预混液，所述PCR预混液主要包括热启动Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内含有虾碱性磷酸酶(SAP Enzyme)。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内含有SAP缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第六容器，所述第六容器内含有延伸酶(iPLEXEnzyme)。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第七容器，所述第七容器内含ddNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第八容器，所述第八容器内含延伸反应缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括纯水。
本发明的第二方面，提供了一种基于多重PCR飞行时间质谱检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点的方法，包括以下步骤：
(1)以待测样品外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
(2)应用虾碱式磷酸酶对步骤(1)的扩增产物进行SAP处理；
(3)使用延伸引物对步骤(2)纯化后的产物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
(4)脱盐树脂纯化延伸产物；
(5)质谱平台检测分析，判断是否存在基因变异。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，特异性扩增选自下组的SNP位点：rs7668258、rs915927、rs2854501、rs1143684、rs2279744。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，使用所述扩增引物对组进行PCR扩增。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，使用所述单碱基延伸引物组进行单碱基延伸反应。
本发明的第三方面，提供了PCR扩增引物对组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10所示的引物。
本发明的第四方面，提供了单碱基延伸引物组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述单碱基延伸引物组包括序列如SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.15所示的延伸引物。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明提供了一种表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒，本发明通过对比不同癌症患者用药疗效的差异性，筛选出与表柔比星个体化用药相关基因的5个SNP位点，进而能够利用核酸质谱仪对表柔比星相关的遗传学标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验。通过多轮筛选，获得了能够对该5个SNP位点进行高效多重扩增，且适合MassARRAY核酸质谱检测的多重PCR扩增引物对，并筛选获得了适合的延伸引物，因而实现了对该5个SNP位点的高准确性、高灵敏性检测，检测结果稳定，提高了检测阳性率。
本申请的测定方法基于多重PCR技术和MassARRAY核酸质谱技术对表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点进行检测，能够对5个位点同时检测。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
多重PCR-飞行时间质谱检测技术虽然能够进行超高通量的检测，但是其对PCR扩增产物的质量要求较高。本发明人在研究中发现，现有的能够进行多重荧光PCR法检测的扩增引物和延伸引物，直接应用于多重PCR-飞行时间质谱检测中，存在很多缺陷，比如无法进行单碱基延伸反应导致质谱检测的假阴性，灵敏度较低且重复性差难以满足临床应用。因此，本发明人针对每个检测位点，重新设计了多对扩增引物和延伸引物，在单位点检测能够满足要求的情况下，进行多重组合检测验证，经过大量试验筛选，最终获得了灵敏度高、特异性好，且检测结果稳定的适用于飞行时间质谱检测的多重PCR检测体系和延伸引物。
本发明采用多重PCR法对靶序列进行扩增，人工设计多对引物，再对其进行优化选择并验证，最终确定包含如下扩增引物的检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点的共计5个位点的核酸检测试剂盒。
表1扩增引物
Figure BDA0002868050760000041
Figure BDA0002868050760000051
其中，F为上游引物，R为下游引物。
延伸引物如表2所示：
表2延伸引物
Figure BDA0002868050760000052
表1和表2列出的引物序列，均可采用常规的多核苷酸合成方法合成。
除上面提到的扩增引物和延伸引物外，本发明还提供了检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点的试剂盒，所述检测试剂盒中各组分的具体含量如下：
表3试剂盒组分
Figure BDA0002868050760000053
本发明还提供了基于多重PCR飞行时间质谱检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点的方法，包括以下步骤：
(1)以待测样品外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
(2)应用虾碱式磷酸酶对步骤(1)的扩增产物进行SAP处理；
(3)使用延伸引物对步骤(2)纯化后的产物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
(4)脱盐树脂纯化延伸产物；
(5)质谱平台检测分析，判断是否存在基因变异。
进一步地，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，特异性扩增选自下组的SNP位点：rs7668258、rs915927、rs2854501、rs1143684、rs2279744。
进一步地，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，使用所述扩增引物对组进行PCR扩增。
进一步地，所述步骤(3)中，使用延伸引物组进行单碱基延伸反应。
进一步地，所述步骤(1)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，60℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。
进一步地，所述步骤(2)的SAP处理条件为：57℃40min，65℃5min。
进一步地，所述步骤(3)的延伸反应的条件为：95℃、30s；95℃、5s，(49℃、5s，72℃、5s，5个循环)，35个循环；72℃保持5min。
本发明的主要优点在于：
本发明提供的表柔比星个体化用药基因的核酸质谱指导方法考虑了不同癌症患者用药疗效的差异性，检测的个体化用药基因更前沿，并纳入了多个与表柔比星个体化用药SNP位点，这些位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高。
本发明提供的检测技术，价格优势明显，改变传统单碱基检测价格昂贵、耗时长、操作繁琐等劣势。在表柔比星个体化用药基因指导检测方面的灵敏度更高，通量更大，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用。
本发明提供的基于MassARRAY核酸质谱技术检测一组表柔比星个体化用药基因指导的核酸质谱方法具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，较Sanger测序发具有明显优势，提高了检测阳性率。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
人类表柔比星个体化用药相关基因的SNP位点筛选的可行性分析
通过搜索NCBI国内外全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)在大规模病理对照组临床研究中得到验证的表柔比星用药安全性和有效性相关位点，本发明人对其做出筛选和评估，选择了与表柔比星个体化用药显著相关的5个单核苷酸多态性位点，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于指导表柔比星的个体化用药。
筛选出的SNP位点如下：
rs7668258、rs915927、rs2854501、rs1143684、rs2279744。
实施例2体系验证
体系验证包括准确性、特异性、灵敏性、精密度和人员间对比等。
准确性验证方案：各位点检测20例，与Sanger测序比较，预期目标95％。
特异性验证方案：包含在准确性中，预期目标95％。
灵敏验证方案：以人基因组DNA阳性样本为模板，标定样本DNA含量分别为1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL进行灵敏度考察。
精密度验证方案(含批内、批间、人员比对，不涉及仪器间比对)，预期目标95％。
批内精密度：每一例样本同一批次重复3次，比较批内精密度。
批间精密度：同一操作者分多批次检验同样样本，比较批间精密度。
人员间比对：2位操作者检测同样样本，比较人员间结果的差异。
具体试验步骤如下：
1、DNA提取：根据南芯医疗自主研发的血液DNA提取试剂盒(为市售的快速高效抽提基因组DNA的试剂盒)说明书提供的操作步骤，制备人外周血基因组DNA，50μLddH2O洗脱；
2、PCR流程
(1)样本稀释至20ng/μL；
(2)按下表配制PCR反应体系(以下为单个样本量，样本DNA共需40ng)
表4.PCR反应体系
试剂 W1(μL) W2(μL)
水，ddH<sub>2</sub>O 0.8 0.8
10PCR Buffer with 20mM 0.5 0.5
25mM MgCl<sub>2</sub> 0.4 0.4
25mM dNTP混合液 0.1 0.1
25μM扩增引物混合液 1 1
5U/μL PCR Taq酶 0.2 0.2
20ng/μL DNA 2 2
总体积 5.00 5.00
(3)封膜，vortex混匀30秒，500g离心1分钟；
(4)将板放上PCR仪进行以下热循环：
95℃3分钟
45个循环：
(95℃15秒
60℃15秒
72℃1分钟)
72℃5分钟
4℃保温
2、SAP流程
(1)取出PCR板，500g离心3分钟；
(2)按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量)；
表5SAP反应体系
试剂 每孔加样(μL) ×2
ddH<sub>2</sub>O 1.53 3.06
SAP缓冲液 0.17 0.34
SAP酶(1.7U/μL) 0.3 0.6
总体积 2.00 4.00
(3)每孔加2μL SAP混液；
(4)封膜，vortex混匀30秒，500g离心1分钟；
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环：
57℃40分钟
65℃5分钟
4℃保温
3、EXT(单碱基延伸)流程
(1)取出PCR板，500g离心3分钟；
(2)按下表配制EXT反应体系(以下为单个样本量)；
表6EXT反应体系
试剂 W1(μL) W2(μL)
ddH<sub>2</sub>O 0.62 0.62
iPLEX缓冲液 0.2 0.2
ddNTP混合液 0.2 0.2
延伸引物混合液 0.94 0.94
iPLEX酶 0.04 0.04
总体积 2.00 2.00
(3)加入2μL iPLEX延伸混液；
(4)封膜，vortex混匀30秒，500g离心1分钟；
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环：
95℃30s
35个循环：
(95℃、5s
5个循环：
(49℃5s
72℃5s))
72℃5min
4℃保温
4、树脂脱盐
取出PCR板，500g离心3分钟；把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上，风干最少10分钟；样本板每一个有样本的孔里加入10uL水；封板，vortex 10秒，500g离心1分钟；轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里；取下dimple plate，样本板封板，旋转器上颠倒摇匀3分钟；2000g离心5分钟。
5、Dispensing点样
使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据各位点聚类图(均聚类清晰)。
试验结果：以其中1例样本举例，其准确性验证结果如表7所示。
表7准确性验证(一代测序与MassARRAY结果对比)
SNP_ID 一代测序结果 MassARRAY结果
rs7668258 TT TT
rs915927 TT TT
rs2854501 AG AG
rs1143684 CC CC
rs2279744 TT TT
以该例样本rs915927位点举例，其精密度验证结果见表5。
表8 rs915927位点精密度验证结果
重复1 重复2 重复3
批次1 TT TT TT
批次2 TT TT TT
批次3 TT TT TT
批次4 TT TT TT
批次5 TT TT TT
整体上，本申请所有位点聚类清晰，基本无灰区，误检可能小。本申请的各位点检测准确性(包含灵敏度及特异性)及精密度验证，见表9。
表9准确性、灵敏度、特异性验证结果
SNP_ID 准确性 灵敏度 特异性 批内精密度 批间精密度 人员对比
rs7668258 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs915927 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs2854501 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs1143684 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
rs2279744 100％ 1ng/μL 100％ 100％ 100％ 100％
上表中，准确性100％表明所有的阳性样本均被正确的检出，且与Sanger测序结果一致；特异性100％表明所检测的样本中，没有出现假阳性的结果；批内精密度100％表明各样本同一批次重复检测的结果均能保持一致；批间精密度100％表明同一操作者多批次检验同一样本的检测结果均能保持一致；人员对比100％表明2位操作者检测同样样本的检测结果均能保持一致。
综上所述，本发明提供的表柔比星个体化用药基因的核酸质谱指导方法考虑了不同癌症患者用药疗效的差异性，检测的个体化用药基因更前沿，并纳入了多个与表柔比星个体化用药SNP位点，这些位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高。
对比例1PCR扩增引物对和延伸引物的筛选
针对各位点，本发明人设计了数对至十余对扩增引物和延伸引物，再对其进行验证优化，最终确立了能够用于MassARRAY核酸质谱技术检测的多重PCR扩增引物和延伸引物组合。
本对比例以rs2854501位点为例，例举部分效果不理想的扩增引物和延伸引物。
对照引物对1：
F-1：ACGTTGGATGGCAAGGACCCTGACTG(SEQ ID NO.:16)
R-1：ACGTTGGATGGCCAAGGTGGGAGAAT(SEQ ID NO.:17)
对照引物对2：
F-2：ACGTTGGATGAAGGACCCTGACTGACC(SEQ ID NO.:18)
R-2：ACGTTGGATGTGAGCTATGATCGCACC(SEQ ID NO.:19)
对照引物对3：
F-3：ACGTTGGATGGGGCAAGGACCCTGACT(SEQ ID NO.:20)
R-3：ACGTTGGATGGCCAAGGTGGGAGAAT(SEQ ID NO.:17)
对照延伸引物1：
Y-1：CTCATGTTGGTAGTTTGTC(SEQ ID NO.:21)
对照延伸引物2：
Y-2：CACTCATGTTGGTAGTTTGTC(SEQ ID NO.:22)
本发明引物对：SEQ ID NO.5和6
本发明延伸引物：SEQ ID NO.13
具体方法同上述实施例，在单重筛选实验中，单重PCR扩增后使用不同延伸引物进行单碱基延伸，再对延伸产物进行质谱检测，单重检测结果发现对照引物对1、3在单重体系中检测能够正常工作，但是无法在多重体系中获得阳性结果。
多重体系中，对照引物对2和对照延伸引物1、2的组合，检测灵敏度分别为50ng/μL、50ng/μL；对照引物对2和SEQ ID NO.13所示的延伸引物组合，检测灵敏度为10ng/μL；SEQID NO.5和6所示引物对和对照延伸引物1、2的组合，检测灵敏度分别为10ng/μL、10ng/μL。而SEQ ID NO.5和6所示引物对和SEQ ID NO.13所示延伸引物的组合，检测灵敏度能够达到1ng/μL。
结果表明，对照引物对1、3在多重检测系统中，无法有效扩增靶核酸序列，因此不能在多重检测体系中正常工作；对照引物对2可以在多重检测体系中正常工作，但是灵敏度较差；对照延伸引物1、2虽然也可以在延伸过程中工作，但是同样灵敏度较差。而本发明引物对(SEQ ID NO.5和6)和本发明延伸引物(SEQ ID NO.13)的组合能够在多重检测体系中正常工作，且灵敏度较高，达到1ng/μL。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广东南芯医疗科技有限公司
<120> 表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒
<130> 200513
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
acgttggatg ctcataaaca taaaagggaa 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
acgttggatg agaaccgatt aaatagaaac 30
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tcatttacct tcatttgtct c 21
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
acgttggatg cccaccaaag tctgatgat 29
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
acgttggatg agtgaggata gataccctgt g 31
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gcatagctag gtcctgc 17
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
acgttggatg cctgcggttg cttct 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
acgttggatg taagagggtg gaaccg 26
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
actcatgttg gtagtttgtc 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
acgttggatg ccaggaaccc aagtc 25
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
acgttggatg atcgtgaccc taatagtg 28
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
tgatttgtat gccatgaac 19
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
acgttggatg agttcagggt aaaggtcacg g 31
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
acgttggatg cacccgtcca actgagtcg 29
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
ggacctcccg cgccg 15
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
acgttggatg gcaaggaccc tgactg 26
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
acgttggatg gccaaggtgg gagaat 26
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
acgttggatg aaggaccctg actgacc 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
acgttggatg tgagctatga tcgcacc 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
acgttggatg gggcaaggac cctgact 27
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
ctcatgttgg tagtttgtc 19
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
cactcatgtt ggtagtttgt c 21

Claims (10)

1.一种表柔比星个体化用药基因的指导试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增引物对组，所述PCR扩增引物对组包括特异性扩增选自下组的SNP位点的引物对：rs7668258、rs915927、rs2854501、rs1143684和rs2279744。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括单碱基延伸引物组。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增引物对组中：
特异性扩增rs7668258的引物对如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示；
特异性扩增rs915927的引物对如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4所示；
特异性扩增rs2854501的引物对如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；
特异性扩增rs1143684的引物对如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8所示；和/或
特异性扩增rs2279744的引物对如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.10所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸引物组中：
针对rs7668258的延伸引物如SEQ ID NO.11所示；
针对rs915927的延伸引物如SEQ ID NO.12所示；
针对rs2854501的延伸引物如SEQ ID NO.13所示；
针对rs1143684的延伸引物如SEQ ID NO.14所示；和/或
针对rs2279744的延伸引物如SEQ ID NO.15所示。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述PCR扩增引物对组；和/或
所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内含有所述单碱基延伸引物组。
6.一种基于多重PCR飞行时间质谱检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物；
(2)应用虾碱式磷酸酶对步骤(1)的扩增产物进行SAP处理；
(3)使用延伸引物对步骤(2)纯化后的产物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
(4)脱盐树脂纯化延伸产物；
(5)质谱平台检测分析，判断是否存在基因变异。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，特异性扩增选自下组的SNP位点：rs7668258、rs915927、rs2854501、rs1143684、rs2279744。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增过程中，使用所述扩增引物对组进行PCR扩增；和/或
所述步骤(3)中，使用所述单碱基延伸引物组进行单碱基延伸反应。
9.PCR扩增引物对组的用途，其特征在于，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10所示的引物。
10.单碱基延伸引物组的用途，其特征在于，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测表柔比星个体化用药基因SNP基因突变位点；
所述单碱基延伸引物组包括序列如SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.15所示的延伸引物。
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