CN112592958A

CN112592958A - 利用fad依赖型d-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测d-2-羟基戊二酸的方法

Info

Publication number: CN112592958A
Application number: CN202011431947.XA
Authority: CN
Inventors: 张文
Original assignee: Second Hospital of Shandong University
Current assignee: Second Hospital of Shandong University
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112592958B

Abstract

本发明公开了利用FAD依赖型D‑2‑羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D‑2‑羟基戊二酸的方法，涉及酶法检测技术领域，该方法利用FAD依赖型D‑2‑羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D‑2‑羟基戊二酸的检测；所述FAD依赖型D‑2‑羟基戊二酸脱氢酶为AX‑F‑D2HGDH蛋白或P‑D2HGDH蛋白；本发明的检测方法组成成分更加简单，成本更低，操作更为简便；由于无需添加辅因子、辅酶或心肌黄酶，因此引入的干扰少，灵敏度更高，并且仅需制备一种酶，无需添加外源辅因子NAD等，同时缓冲液可采用成本更低且易于获取的PBS缓冲液，因此成本更加低廉。

Description

利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法

技术领域

本发明涉及酶法检测技术领域，具体说是利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法。

背景技术

2-羟基戊二酸(2-Hydroxyglutarate，2-HG)一般是2-酮基戊二酸的还原产物，2-HG分子中含有一个不对称碳原子，按其旋光性分为D-2-羟基戊二酸(D-2-HG或R-2-HG)和L-2-羟基戊二酸(L-2-HG或S-2-HG)，生物体内负责催化D-2-HG氧化成2-酮基戊二酸的酶为D-2-羟基戊二酸脱氢酶(D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase；D2HGDH)。

有文献报道，70kg的成人其D2HGDH每天可分解40毫摩尔D-2-HG。D2HGDH编码基因突变会引起D-2-HG浓度升高，造成D-2-羟基戊二酸酸血症(D-2-HGA)，D-2-HGA是一种常染色体隐形遗传疾病，患者早年即出现癫痫、张力减退、发育迟缓及神经功能损害等，预后不良；D-2-HGA分为I型和II型，D2HGDH编码基因突变和异柠檬酸脱氢酶(IDH)编码基因突变分别是I型和II型D-2-HGA发生的分子机理。人体D2HGDH共价结合FAD作为辅因子，能够以D-2-HG及D-乳酸为底物，以电子转移黄素蛋白(electron transferring flavoprotein；简称为ETF)为自然电子受体。在本申请中将这种共价结合FAD为辅因子D2HGDH称之为FAD-依赖型的D2HGDH，简称为F-D2HGDH。

D-2-HGA患者体液D-2-HG含量比健康人高出30-840倍(约26-757μM)。D-2-HG是病理发生的关键，且疾病严重性与D-2-HG浓度密切相关。研究显示，高浓度D-2-HG具有细胞和神经毒力；D-2-HG的积累可下调肌酸激酶、复合体IV和复合体V的表达；诱导氧化应激，破坏线粒体能量代谢等。同时在酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、二氢硫辛酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶缺乏症等多种代谢障碍性疾病中，D-2-HG浓度也有升高。血液或尿液中含高浓度的D-2-HG是D-2-HGA的生化标志，因此开发灵敏准确的D-2-HG检测方法对于此类疾病诊断具有重要意义。

另外，近年来在急性髓细胞样白血病、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤等多种肿瘤中检测到异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变，IDH突变可导致该蛋白产生催化2-酮戊二酸还原生成D-2-HG的活力，造成D-2-HG积累。D-2-HG是包括组蛋白脱甲基化酶在内的众多2-酮戊二酸依赖的双加氧酶的竞争性抑制剂，其积累可导致基因组范围内的组蛋白和DNA改变、阻止细胞分化，最终导致癌症的发生。D-2-HG作为IDH突变导致瘤发生的关键因素，也因此被认为是一种促癌发生物。因此D-2-HG作为标志物的临床应用价值引起人们广泛重视，例如D-2-HG可作为替代标志物，预测IDH突变，同时相比于下一代测序方法，检测D-2-HG灵敏且快速，且可防止基因测序方法造成IDH突变假阴性，D-2-HG可以作为胶质瘤分型标志物，在急性髓性细胞白血病、乳腺癌中作为诊断、预后及治疗监测性指标等。

目前对于组织及体液中D-2-HG浓度的测定，主要通过液相色谱-质谱连用(LC-MS)或者气相色谱-质谱连用(GC-MS)来实现；核磁方法主要用于非侵入性检测胶质瘤等组织内D-2-HG。另外，测量两种代谢物的总量可能会导致错误的结论，因此在临床与科学研究中，分别测定D-2-HG与L-2-HG是准确诊断2-HG相关疾病的前提，比测定两者的总量更加具有说服力，目前采用方法主要是采用手性分离柱或者通过手性衍生化样品来实现D-2-HG和L-2-HG的分离。上述检测方法面临着成本较高、耗费大量劳动、步骤繁琐、难以高通量等缺点。

与F-D2HGDH不同的是，在某些厌氧菌中，例如Acidaminococcus fermentans，存在NAD依赖型的D-2-羟基戊二酸脱氢酶(NAD-dependent D-2-hydroxyglutaratedehydrogenase；命名为HgdH)，HgdH有时候也被人称做D2HGDH，为避免与传统概念常说的F-D2HGDH混淆，因此在本申请中HgdH也被命名为N-D2HGDH。生物体内N-D2HGDH的主要功能为还原2-KG为D-2-HG，同时氧化NADH为NAD。但在体外，如果存在其他酶偶联反应推动的情况下，N-D2HGDH反应也可以朝着D-2-HG向2-酮基戊二酸转变的方向进行。

发明专利CN201380011978.1测定(D)2羟基戊二酸(D2HG)或(D)2羟基己二酸的工具和方法，利用NAD依赖型脱氢酶-心肌黄酶-刃天青的组合开发了一种检测D-2-HG的方法，具体是利用N-D2HGDH和心肌黄酶的偶联反应才能实现最终将电子传递给刃天青产生荧光，实现D-2-HG的检测。但是该方法由于是两步反应(第一步反应为N-D2HGDH催化D-2-HG氧化，同时还原NAD产生NADH；第二步反应为心肌黄酶氧化NADH，同时还原刃天青)，检测时影响结果的因素较多，两者催化两步反应偶联才能实现最终电子传递给刃天青产生荧光，引入的干扰多，灵敏度偏低；检测体系需要使用两种酶，并需要添加价格较高的辅因子NAD，检测成本较高；另外，该NAD依赖型脱氢酶除了对D-2-HG有活性外，对D-2-羟基己二酸也有活性，检测用酶的底物专一性不好，检测中有面临干扰的风险。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青一步法检测D-2-羟基戊二酸的方法及应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D-2-羟基戊二酸的检测，原理如图1所示；其中FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶共价结合FAD作为辅因子，直接以刃天青为电子受体，不需要任何外源电子介体；

所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白或P-D2HGDH蛋白；

其中AX-F-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO：1；

AX-F-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；

P-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO：3；

P-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

优选的，所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白。

优选的，利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，包括以下步骤：

㈠FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的外源表达及分离纯化

⑴结合序列比对分析手段，选择FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的编码基因通过全基因合成目的基因，得到FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的基因；

⑵将步骤⑴所得FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的基因连入pETDuet-1，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，酶切验证，然后接入LB液体培养基，待OD600达到0.5-0.9时，加入1mM IPTG，22℃，180rpm诱导表达8-16小时；

⑶蛋白纯化：采用超声、高压破碎菌体，得到含有FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的蛋白的粗酶液；采用快速蛋白纯化仪及镍亲和柱，分离纯化蛋白，50％Buffer B洗脱，超滤管浓缩得到蛋白至1-20mg/ml，然后将得到的蛋白-80℃冻存保存；

㈡利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液检测D-2-羟基戊二酸

①配制工作液：

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至0.2～10μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.01～0.03mg/ml，得到工作液；

②样品准备

血清、尿液、脑脊液、细胞培养基、组织液或细胞胞内液，需要经过除蛋白处理后，才可以得到待测样品；

③标准品准备

配制一系列浓度在0～50μM之间的D-2-羟基戊二酸标准品溶液；

用于检测血清、尿液或细胞培养基样品时，标准品需对应溶解在健康人的血清、尿液或新鲜的培养基中；

用于检测脑脊液、组织液或细胞胞内液样品时，标准品溶解于三蒸水中；

在用于检测去蛋白样品时，这些配制的标准品亦需经过相同的去蛋白操作后才能使用；

④检测

将25μl标准品和待测样品，分别加入到黑色96孔板，各三个重复孔，再向其中加入75μL工作液，避光反应20-30min；使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm；

待测样品和标准曲线一起进行测定，这样结果比较准确，防止因外界条件波动造成不同条件下标曲的波动；

⑤制作标准曲线以不含D-2-羟基戊二酸的标准品液作为对照组，计算对照组平均荧光强度；各标准品孔减去对照组平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各标准品浓度的平均值，然后以D-2-HG标准品浓度为纵坐标，以平均荧光强度为横坐标，作标准曲线；

⑥样品D-2-羟基戊二酸含量计算以不含D-2-羟基戊二酸的标准品溶液作为对照组，计算对照组平均荧光强度；各重复孔减去对照组的平均荧光强度得到实际的荧光强度，并求得重复孔的平均值，代入上述标准曲线中，得到待测样品的D-2-羟基戊二酸浓度。

优选的，全基因合成目的基因的上游带有EcoRI酶切位点，下游带有HindIII酶切位点。

优选的样品处理操作为：

收集静脉血然后用血清分离胶促凝采血管得到待测血清，去蛋白得到待测血清样品；

或取脑脊液后离心取上清，去蛋白得到待测样品；

或取尿液后离心取上清，去蛋白得到待测样品；

或取细胞进行培养后，取细胞培养基，离心后收集上清液，去蛋白得到待测样品，备用；或取细胞裂解后的上清，去蛋白得到待测样品，备用；

或取组织样品，加入细胞裂解液后超声匀浆，加入蛋白酶K，孵育后用试剂盒测定蛋白浓度A，然后去蛋白后得到待测样品，备用；

或者其他蛋白浓度不高(低于0.2mg/ml)的样品，可以直接使用或者适当稀释后使用。

进一步的，工作液为：采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至10μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.03mg/ml，得到工作液。

进一步的，当待测样品的D-2-HG浓度为0～5μM时，对待测样品的D-2-HG浓度再进行精确检测，具体的，工作液为：

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至1μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.013mg/ml，得到工作液；制备标准曲线时，配制D-2-HG标准品溶液的系列浓度在0～5μM之间。

当待测样品的D-2-HG浓度为0～0.5μM时，工作液为：

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至0.2μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.01mg/ml，得到工作液；制备标准曲线时，配制D-2-HG标准品溶液的系列浓度在0～0.5μM之间。

优选的，FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶采用以下编码基因序列：

第一，与FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的编码基因序列一致性大于70％，且编码蛋白具有D-2-羟基戊二酸脱氢酶活性；

第二，与FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的氨基酸序列一致性大于50％，且编码蛋白具有D-2-羟基戊二酸脱氢酶活性。

本发明还包括利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法用于开发D-2-羟基戊二酸检测试剂盒的应用。

优选的，所述试剂盒包括缓冲液瓶、标准品管、刃天青液、酶液和说明书；其中缓冲液瓶装有配制工作液的PBS缓冲液，标准品管装有D-2-HG标准品，刃天青液装有三蒸水配制的刃天青，酶液装有D-2-羟基戊二酸脱氢酶。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶(F-D2HGDH)和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，以FAD为辅因子，能够催化D-2-HG转化为2-KG，同时该酶将电子传递给刃天青，无需额外电子传递介体，即底物脱氢和电子传递给刃天青产生荧光这两个过程由FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶单独完成；

本发明的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法的检测体系仅仅包括缓冲液、F-D2HGDH和刃天青，无需添加昂贵的辅因子、辅酶或心肌黄酶等，第一，该组成成分更加简单，成本更低，操作更为简便；第二，由于无需添加辅因子、辅酶或心肌黄酶，因此引入的干扰少，灵敏度更高，常规检测限为0.14μM，定量限为0.47μM；第三，对于低浓度和超低浓度D-2-羟基戊二酸的样本，通过调整检测体系中的组分，可以实现精准的检测，检测限最低可以达到0.010μM，定量限可以达到0.034μM；第四，仅需制备一种酶，无需添加外源辅因子NAD等，同时缓冲液可采用成本更低且易于获取的PBS缓冲液，因此成本更加低廉。

附图说明

图1为利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法的检测原理示意图；

图2为酶切验证BL21(DE3)-pETDuet-1-AX-F-D2HGDH的结果图；

图3为SDS-PAGE分析制备的AX-F-D2HGDH结果示意图；

图4为AX-F-D2HGDH蛋白催化底物脱氢时以刃天青为电子受体产生荧光对电子介体的选择结果示意图；

图5为高浓度范围D-2-HG(0-50μM)的标准曲线；

图6为低浓度范围D-2-HG(0-5μM)的标准曲线；

图7为超低浓度范围D-2-HG(0-0.5μM)的标准曲线。

图8为细胞培养基配制的D-2-HG(0-50μM)的标准曲线。

具体实施方式

本发明的目的是提供利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，通过以下技术方案实现：

FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶AX-F-D2HGDH蛋白或P-D2HGDH蛋白能够将催化D-2-HG脱氢产生的电子，直接传递给刃天青从而产生荧光，不需要任何电子传递剂(包括电子转移黄素蛋白ETF、N-甲基吩嗪甲基硫酸盐、心肌黄酶)的存在即能实现。荧光信号的产生是由D-2-羟基戊二酸脱氢酶一个酶催化产生的，而非两酶催化反应的偶联。由于采用的是D-2-羟基戊二酸脱氢酶本身即共价结合有FAD，所以检测体系中也不需要外源加入FAD，检测体系含有F-D2HGDH和刃天青即可，更为简单。

利用了一种新的细菌(Achromobacter xylosoxidans ATCC27061；木糖氧化无色杆菌)来源的F-D2HGDH(命名为AX-F-D2HGDH)，该AX-F-D2HGDH相对于其他来源的F-D2HGDH，尤其是对于假单胞菌(Pseudomonas stutzeriA1501)来源的P-D2HGDH来说，具有较高的底物特异性，对D-苹果酸、D-乳酸无催化活性，仅对D-2-HG有活性，可以满足检测所需高特异性的要求。

利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，包括以下步骤：

1.AX-F-D2HGDH蛋白的制备

1.1基因序列的获取

Achromobacter无色杆菌比较常见的模式菌株，Achromobacter xylosoxidansATCC27061，从这种无色杆菌来源的A-F-D2HGDH命名为AX-F-D2HGDH。

NCBI数据库输入Gene ID：29509945，即可获取Achromobacter xylosoxidansATCC27061中AX-F-D2HGDH的基因序列(SEQ ID NO：1，1413bp)及氨基酸序列(SEQ ID NO：2，470aa)。

利用本领域研究者熟知的序列比对工具(例如NCBI中Nucleotide Blast等)，以AX-F-D2HGDH的基因序列进行比对，得到一致性大于70％的序列，且编码蛋白具有D-2-羟基戊二酸脱氢酶活性。利用本领域研究者熟知的序列比对工具(例如NCBI中Protein Blast等)，以AX-F-D2HGDH的氨基酸序列进行比对，得到一致性大于50％的序列，且蛋白具有D-2-羟基戊二酸脱氢酶活性。这些序列亦可适用于下列实验。

1.2基因表达

委托生物公司全基因合成目的基因，采用常规分子克隆手段(酶切、连接、转化等)连入大肠杆菌高效表达载体pETDuet-1，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，接入LB液体培养基，采用IPTG诱导表达，待OD600达到0.5～0.9时，加入1mM IPTG，22℃，180rpm诱导表达8～12小时。

1.3蛋白纯化

常规方法(超声、高压)破碎上述菌体，得到含有目的蛋白的粗酶液；采用快速蛋白纯化仪及镍亲和柱，按照常规方案分离纯化蛋白。50％Buffer B即可洗脱，超滤管浓缩得到蛋白AX-F-D2HGDH至1-20mg/ml，得到的蛋白-80℃冻存。

1.4按照下述论文方法制备并纯化Pseudomonas stutzeri A1501来源的P-D2HGDHZhang W,Zhang M,Gao C,Zhang Y,Ge Y,Guo S,Guo X,Zhou Z,Liu Q,Zhang Y,Ma C,TaoF,Xu P(2017)Coupling betweend-3-phosphoglycerate dehydrogenase and d-2-hydroxyglutarate dehydrogenase drives bacterial l-serine synthesis.ProcNatlAcad SciU S A114:E7574-E7582

2.利用AX-F-D2HGDH蛋白(P-D2HGDH蛋白)和刃天青检测D-2-羟基戊二酸

2.1配制工作液

2.1.1配制缓冲液，pH范围为7.4的0.067M的PBS缓冲溶液

2.1.2用双蒸水配制0.1mM到5mM的刃天青作为母液，-80℃保存；

2.1.3新鲜配制适用于检测高浓度D-2-HG(0-50μM)的工作液：将AX-F-D2HGDH(P-D2HGDH)加入到缓冲液中至终浓度0.01-0.05mg/ml；刃天青终浓度5-15μM，本实施例采用10μM；冰浴或4℃；

2.1.4新鲜配制适用于检测低浓度D-2-HG(0-5μM)的工作液：将A-F-D2HGDH加入到缓冲液中至终浓度0.01-0.03mg/ml；刃天青终浓度0.5-1μM，冰浴或4℃；

2.1.5新鲜配制适用于检测超低浓度D-2-HG(0-0.5μM)的工作液：将A-F-D2HGDH加入到缓冲液中至终浓度0.01-0.03mg/ml；刃天青终浓度0.1-0.25μM，冰浴或4℃。

2.2制作标准曲线

准备D-2-HG标准品。

配制适用于检测高浓度D-2-HG(0-50μM)的标准品：0、0.5、1、2.5、5、10、25、50μM。

配制适用于检测低浓度D-2-HG(0-5μM)的标准品：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.75、1、2.5、5μM。

配制适用于检测超低浓度D-2-HG(0-0.5μM)的标准品：0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5μM。

2.3检测步骤

加入10-50μl样品至黑色96孔板，再向其中加入75μL工作液，避光反应10-30min。使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长500-560nm，发射波长570-610nm，优选激发波长540nm，发射波长590nm。然后以荧光强度为纵坐标，TMAO标准品浓度为横坐标绘制标准曲线。其他更小体积的孔板(如384孔板)亦可将体积比例缩小。

3.检测样品的制备

3.1血清、尿液、脑脊液等生物液体样品及细胞培养基上清样品

3.1.1血清、尿液、脑脊液等生物液体样品常规取样操作

3.1.2将细胞培养基样品13000g离心5min后，取上清；

3.1.3去蛋白操作

采用商品化的基于高氯酸的去蛋白试剂盒，对血液、尿液、脑脊液等生物液体样品，及相关配制在这些液体中的标准品，按照试剂盒步骤进行去蛋白操作，得到的样品可以用于检测。

或者采用商品化的超滤管(10kDa)，离心将大于10kDa的蛋白去除，从而得到去蛋白样品。

或者采用乙醇沉淀法：按照0.5ml样品加入1ml无水乙醇的比例，混合，4000g离心10分钟，将一定体积上清取出用烘箱或者旋转浓缩仪蒸干，加入适量三蒸水溶解。

3.1.4蛋白含量不高的生物液体样品可以用稀释10-20倍，不用去蛋白步骤即可检测。

3.2细胞胞内液样品贴壁细胞：去除培养基，轻轻地用预冷的PBS洗2次。然后加入商品化的细胞裂解液，反复冻融3次，裂解贴壁细胞，13000g离心5min以去除细胞碎片，上清用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。之后按照上述去蛋白方法操作。

悬浮细胞：细胞培养物用500g离心5min，细胞沉淀用预冷的PBS洗2次，然后加入商品化的细胞裂解液，反复冻融3次，13000g离心5min以去除细胞碎片，上清用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。之后按照上述去蛋白方法操作。

3.3细胞培养基样品

对于贴壁细胞来说：取细胞培养基，13000g离心5min，收集上清，进行PCA去蛋白操作。

对于悬浮细胞：细胞培养物用500g离心5min，取上清继续13000g离心5min，收集上清，进行PCA去蛋白操作。

3.4组织样品

新鲜组织样品：按照100mg组织样品加入500μL商品化的细胞裂解液比例混合，常规方法超声匀浆，加入10μL商品化的蛋白酶K，37℃孵育2h。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。之后按照上述去蛋白方法操作。

石蜡包埋组织样品：利用二甲苯脱蜡的常规方案进行脱蜡。脱蜡后的组织按照上述新鲜组织样品进行处理。

将25μl待测样品(血清、尿液、脑脊液、细胞胞内液样品、细胞培养基样品、组织样品)加入到黑色96孔板，再向其中加入75μL工作液，避光反应30min；使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm；每个待测样品检测3次；

计算对照组平均荧光强度，各孔减去标准品为0的对照组的平均荧光强度得到实际的荧光强度，并求得各孔的平均值，带入上述标准曲线中，得到待测样品的D-2-HG浓度。

本发明中全基因合成生物公司为生工生物工程(上海)股份有限公司；

镍亲和柱购于GE Healthcare公司HisTrap HP；

脱盐柱购于GE Healthcare公司Hitrap Desalting；

N-甲基吩嗪甲基硫酸盐购于Sigma-Aldrich公司，货号P9625；

心肌黄酶购于Sigma-Aldrich公司，货号D5540；

电子转移黄素蛋白(ETF)按照论文Zhang W,Zhang M,Gao C,Zhang Y,Ge Y,GuoS,Guo X,Zhou Z,Liu Q,Zhang Y,Ma C,Tao F,Xu P(2017)Coupling betweend-3-phosphoglycerate dehydrogenase and d-2-hydroxyglutarate dehydrogenase drivesbacterial l-serine synthesis.Proc Natl Acad Sci U S A 114:E7574-E7582获得。

D-2-HG标准品从Sigma-Aldrich购买；

荧光酶标仪生产厂家和型号为Cytation5，BioTek；

基于高氯酸的去蛋白试剂盒生产厂家为Biovision公司Deproteinizing SamplePreparation Kit，货号K808；

细胞裂解液生产厂家为碧云天公司，货号P0013；

蛋白酶K生产厂家为碧云天公司，货号ST533；

SW1353细胞和HT1080细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例

1.AX-F-D2HGDH蛋白的制备

1.1基因序列的获取

利用本领域研究者熟知的序列比对工具(例如NCBI中Nucleotide Blast等)，以AX-F-D2HGDH的基因序列进行比对，得到一致性大于70％的序列，且编码蛋白具有D-2-羟基戊二酸脱氢酶活性，且具有较高的底物特异性，仅对D-2-HG有活性。利用本领域研究者熟知的序列比对工具(例如NCBI中ProteinBlast等)，以AX-F-D2HGDH的氨基酸序列进行比对，得到一致性大于50％的序列，且蛋白具有D-2-羟基戊二酸脱氢酶活性，且具有较高的底物特异性，仅对D-2-HG有活性。这些序列亦可适用于下列实验。

1.2基因表达

(1)委托生物公司进行全基因合成AX-F-D2HGDH的编码基因；合成时基因的上游带有EcoRI酶切位点，下游带有HindIII酶切位点；

(2)常规方案利用EcoRI和HindIII将基因连入pETDuet-1，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中；酶切验证，如图2所示，克隆命名为BL21(DE3)-pETDuet-1-AX-F-D2HGDH。

(3)将BL21(DE3)-pETDuet-1-AX-F-D2HGDH菌株接入LB液体培养基，待OD600达到0.5-0.9时，加入1mM IPTG，22℃，180rpm诱导表达12-16小时；

(4)8000g离心10min收集菌体，每1000mL菌体用100mL缓冲液A(pH 7.4，20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠)悬浮，采用高压破碎机破碎菌体，8000g离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤，得到含有目的蛋白的粗酶液；

(5)采用快速蛋白纯化仪及镍亲和柱(5ml)进行纯化。常规的平衡及上样过程后，经过10％的缓冲液B(pH 7.4，20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠)、20％的缓冲液B、30％的缓冲液B冲洗后，收集50％的缓冲液B洗脱的组分，该组分含有目的蛋白，如图3所示。

(6)对该组分用超滤管浓缩，将浓缩的蛋白经过脱盐柱(5ml)置换脱盐缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.4)后，继续浓缩至13mg/ml，置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存。

另外，按照下述论文方法制备Pseudomonas stutzeri A1501来源的P-D2HGDHZhang W,Zhang M,Gao C,Zhang Y,Ge Y,Guo S,Guo X,Zhou Z,Liu Q,Zhang Y,Ma C,TaoF,Xu P(2017)Coupling between d-3-phosphoglycerate dehydrogenase and d-2-hydroxyglutarate dehydrogenase drives bacterial l-serine synthesis.Proc NatlAcad Sci U S A114:E7574-E7582。

1.3.AX-F-D2HGDH蛋白和P-D2HGDH蛋白的底物特异性实验

AX-D2HGDH和P-D2HGDH的酶活测定均在800μL反应体系中进行，该反应体系均包括50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，200μM N-甲基吩嗪甲基硫酸盐，100μM 2,6-二氯酚靛酚，1mM下述底物，以及0.025mg/ml的D2HGDH蛋白和P-D2HGDH蛋白。反应温度30℃，检测波长600nm下吸光度的变化。结果如表1所示，AX-F-D2HGDH和P-D2HGDH对D-2-HG具有很高的底物特异性，不同之处在于，D2HGDH蛋白对D-苹果酸无活性，P-D2HGDH蛋白对D-苹果酸有活性。

表1AX-F-D2HGDH和P-D2HGDH的底物特异性实验结果表

由表1的结果可以看出，AX-F-D2HGDH蛋白仅对D-2-羟基戊二酸有活性，与P-D2HGDH相比，对D-苹果酸无活性，底物特异性更高。

1.4AX-F-D2HGDH蛋白和P-D2HGDH蛋白在与刃天青产生荧光中对电子介体的选择

对于AX-F-D2HGDH和P-D2HGDH蛋白催化D-2-HG脱氢时，是否需要通过添加电子传递介体，促进电子传给刃天青，我们进行了如下实验：

选择的电子介体为N-甲基吩嗪甲基硫酸盐、心肌黄酶或电子转移黄素蛋白(ETF)；

配制工作液：

1/15M PBS(pH 7.4)，0.02mg/ml的AX-FD-D2HGDH(或P-D2HGDH蛋白)，10μM的刃天青，以及电子介体(8μM的N-甲基吩嗪甲基硫酸盐，或者1U/ml的心肌黄酶，或者0.1mg/ml的电子转移黄素蛋白ETF)。

将25μl的三蒸水(即为对照)和25μl的D-2-HG(5μM、50μM)加入到黑色96孔板，再向其中加入75μL工作液，避光反应20min。使用荧光酶标仪(Cytation5,BioTek)测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

AX-F-D2HGDH蛋白的结果如图4所示，N-甲基吩嗪甲基硫酸盐严重抑制了刃天青荧光信号的产生；心肌黄酶和电子转移黄素蛋白(ETF)对刃天青荧光信号的产生无太大影响。采用P-D2HGDH也出现了类似的结果：N-甲基吩嗪甲基硫酸盐抑制了70％荧光信号的产生；心肌黄酶和电子转移黄素蛋白(ETF)的加入并不会明显增加荧光信号的产生。这更加凸显了AX-F-D2HGDH(或者P-D2HGDH)和刃天青之间反应的自发性，证明了AX-F-D2HGDH(或者P-D2HGDH)催化底物脱氢时能够直接以刃天青为电子受体产生荧光，不需要电子介体。

2.利用AX-F-D2HGDH蛋白和刃天青检测D-2-羟基戊二酸

2.1常规浓度范围(0-50μM)下D-2-HG的检测体系及标准曲线

2.1.1配制标准品

D-2-HG标准品用三蒸水配制D-2-HG的标准品：0、0.5、1、2.5、5、10、25、50μM。

2.1.2配制工作液

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至10μM，加入AX-F-D2HGDH至终浓度分别为0.03mg/ml，得到工作液。

2.1.3检测

将25μl的三蒸水(即为对照)及上述D-2-HG标准品加入到黑色96孔板，重复3次，再向其中加入75μL工作液，避光反应20min。使用荧光酶标仪，测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2.1.4标准曲线绘制

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各浓度的平均值。以D-2-HG浓度为纵坐标，以平均荧光强度为横坐标，作标准曲线y＝0.0006x-0.7433(R²＝0.9903)，如图5所示。本部分仅作为例子展示此浓度范围的检测体系的组成及标准曲线制作方法，后续每次测定样品的时候需同时制作标准曲线。此方法制作的标准曲线适用于不需要去除蛋白的样品。

2.2低浓度(0-5μM)范围下D-2-HG的检测体系及标准曲线

2.2.1配制标准品

D-2-HG标准品用三蒸水配制D-2-HG的标准品：0、0.1、0.2、0.4、0.75、1、2.5、5μM。

2.2.2配制工作液

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至1μM，加入AX-F-D2HGDH至终浓度分别为0.013mg/ml，得到工作液。

2.2.3检测

将25μl的三蒸水(即为对照)及上述D-2-HG标准品加入到黑色96孔板，重复3次。再向其中加入75μL工作液，避光反应20min。使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2.2.4标准曲线绘制

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各浓度的平均值。以D-2-HG浓度(μM)为纵坐标(y)，以平均荧光强度为横坐标(x)，得到标准曲线y＝0.0006x(R²＝0.9974)，如图6所示。本部分仅作为例子展示此浓度范围的检测体系的组成及标准曲线制作方法，后续每次测定样品的时候需同时制作标准曲线。此方法制作的标准曲线适用于不需要去除蛋白的样品。

2.3超低浓度(0-0.5μM)范围下D-2-HG的检测体系及标准曲线

2.3.1配制标准品

D-2-HG标准品用三蒸水配制D-2-HG的标准品：0、0.025、0.05、0.1、0.4、0.5μM。

2.3.2配制工作液

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至0.2μM，加入AX-F-D2HGDH至终浓度分别为0.01mg/ml，得到工作液。

2.3.3检测

将25μl的三蒸水(即为对照)及上述D-2-HG标准品加入到黑色96孔板，3重复。再向其中加入75μL工作液，避光反应20min。使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2.3.4标准曲线绘制

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各浓度的平均值。以D-2-HG浓度(μM)为纵坐标(y)，以平均荧光强度为横坐标(x)，得到标准曲线y＝0.0008x(R²＝0.9963)，如图7所示。本部分仅作为例子展示此浓度范围的检测体系的组成及标准曲线制作方法，后续每次测定样品的时候需同时制作标准曲线。此方法制作的标准曲线适用于不需要去除蛋白的样品。

由上述曲线可以看出，D-2-HG浓度和AX-F-D2HGDH蛋白检测体系荧光强度的线性关系均很好，该方法可以用于D-2-HG检测中，同样的P-D2HGDH蛋白也得到了相同的结果；

在检测过程中如出现样品中D-2-HG浓度大于50μM，则可以把待测样品用缓冲液稀释后重新进行检测，然后根据稀释倍数计算待测样品中D-2-HG的含量；如在0-5μM之间(尤其是0～0.5之间)，需要重新配置检测体系并重新测定后计算，这样的检测数据可以更准确，如对数据准确度没有很高要求，则可以直接用0～50μM标准曲线的检测结果。

本部分仅以三蒸水溶解的D-2-HG标准品作为例子展示常规浓度、低浓度、超低浓度范围的标准曲线制作方法。其他介质(健康人的血清、尿液等)溶解的D-2-HG标准品也可以照此在常规浓度、低浓度、超低浓度范围制作标准曲线，但这些标准品需经过与样品相同的处理操作。大多数应用只需要采用常规浓度范围的标准曲线即可满足要求。

2.4利用AX-F-D2HGDH蛋白检测血清中的D-2-HG的含量

2.4.1血清收集

常规方法收集静脉血，用常见的血清分离胶促凝采血管得到血清。

2.4.2配制标准品

用健康人A的血清配制D-2-HG的标准品：0、1、2.5、5、10、25、50μM。

(血清等需要除蛋白操作，在除蛋白操作过程中，一个是可能造成样品稀释，另一个除蛋白过程中会产生一些抑制酶反应的因素。因此，对于去除蛋白的样品，应该制作标准曲线时，标准品也要经过除蛋白操作)。

2.4.3制备待测样品

用健康人B的血清中添加D-2-HG至终浓度为0μM、2.5μM、10μM、50μM，分别命名为S1、S2、S3、S4。

2.4.4去蛋白操作

采用基于高氯酸的去蛋白试剂盒，按照试剂盒步骤进行去蛋白操作。待检测样品及上述配制的标准品均要经过相同的去蛋白操作。

2.4.5工作液配制

2.4.6检测

将25μl的经过去蛋白处理的标准品及待测样品(重复2次)，加入到黑色96孔板。再向其中加入75μL工作液，避光反应30min。使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2.4.7计算浓度

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组(即标准品为0的血清)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。以D-2-HG浓度为纵坐标(y)，以平均荧光强度为横坐标(x)，得到标准曲线y＝0.0007x(R²＝0.9984)。根据样品的荧光强度，代入标准曲线，即可得到样品的浓度。测得S1样品浓度为0μM，测得S2样品浓度为2.34μM，测得S3样品浓度10.06μM，测得S4样品浓度为50.25μM。

2.4.8更加精确地测定样品S2的浓度

样品S2浓度在0-5μM之间，因此为了更加精确地测定S2的浓度，需按照2.2方法配制检测体系和标准品，并重新进行检测。具体为：

2.4.8.1配制标准品

用上述健康人A的血清配制D-2-HG的标准品：0、0.1、0.2、0.4、0.75、1、2.5、5μM。

2.4.8.2去蛋白

按照2.4.4的方法对标准品进行去蛋白操作。

2.4.8.3配制工作液

同2.2.2，采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至1μM，加入AX-F-D2HGDH至终浓度分别为0.013mg/ml，得到工作液。

2.4.8.4检测

将25μl的经过去蛋白处理的上述标准品及待测样品(重复2次)，加入到黑色96孔板。再向其中加入75μL工作液，避光反应30min。使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2.4.8.5计算浓度

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组(即标准品为0的血清)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。以D-2-HG浓度为纵坐标(y)，以平均荧光强度为横坐标(x)，得到标准曲线y＝0.0007x(R²＝0.9903)。根据样品的荧光强度，代入标准曲线，即可得到样品S2的浓度为2.52μM，与实际值(2.5μM)更为接近，结果更为精确。

2.5利用P-D2HGDH蛋白检测尿液中D-2-HG的含量

2.5.1尿液收集

常规方法收集尿液，并进行常规预处理；

2.5.2配制标准品

用健康人A的尿液配制D-2-HG的标准品：0、5、10、25、50、100μM。(血清等需要除蛋白操作，在除蛋白操作过程中，一个是可能造成样品稀释，另一个除蛋白过程中会产生一些抑制酶反应的因素。因此，对于去除蛋白的样品，应该制作标准曲线时，标准品也要经过除蛋白操作。)

2.5.3制备待测样品

用健康人B的尿液中添加D-2-HG至终浓度为0μM、20μM、60μM，分别命名为U1、U2、U3。

2.5.4去蛋白操作

采用商品化的基于高氯酸的去蛋白试剂盒，按照试剂盒步骤进行去蛋白操作。待检测样品及上述配制的标准品均要经过相同的去蛋白操作。

2.5.5工作液配制

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至10μM，加入P-D2HGDH至终浓度分别为0.04mg/ml，得到工作液。

2.5.6检测

2.5.7计算浓度

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组(即标准品为0的尿液)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。以D-2-HG浓度为纵坐标(y)，以平均荧光强度为横坐标(x)，得到标准曲线y＝0.0015x(R²＝0.983)。根据样品的荧光强度，代入标准曲线，即可得到样品的浓度。测得U1样品浓度为0μM，测得U2样品浓度为20.92μM，测得U3样品浓度61.14μM。

2.6检测新鲜冻存组织中D-2-HG含量

2.6.1样品处理

按照伦理规范取得6个胶质瘤病人(携带IDH1R132H突变)的组织样品。取100mg胶质瘤组织样品，加入500μL商品化的细胞裂解液比例混合，常规方法超声匀浆，加入10μL商品化的蛋白酶K(20mg/ml)，37℃孵育2h。

用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度A(mg protein/ml)。

采用商品化的基于高氯酸的去蛋白试剂盒，按照试剂盒步骤进行去蛋白操作，得到去蛋白的样品。

2.6.2配制工作液和标准品

按照上述2.1方法配制工作液和标准品。

2.6.3检测

将25μl的经过去蛋白处理的标准品及待测样品(2重复)，加入到黑色96孔板。再向其中加入75μL工作液，避光反应30min。使用荧光酶标仪(Cytation 5,BioTek)测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2.6.4计算浓度

按照2.1制作标准曲线，得到y＝0.0006x-0.7349(R²＝0.993)。

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组(即标准品为0的三蒸水)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。根据样品的荧光强度，代入标准曲线，得到处理后样品的浓度B(μM)。通过归一化处理(B除以A)，即可得到D-2-HG的组织含量(pmol/mgprotein)，测得6个胶质瘤样品中D-2-HG的平均组织含量为132pmol/mg protein。

2.7检测细胞培养基中的D-2-HG含量

2.7.1细胞培养

SW1353细胞携带IDH2R172S突变。HT1080细胞携带IDH1R132C突变。根据报道，两个细胞均能产生D-2-HG并在培养基中积累。按照厂家介绍的培养方法在6孔板中进行培养，两者各3孔。

2.7.2样品收集

SW1353细胞和HT1080细胞均为贴壁细胞。培养48h后，取细胞培养基，13000g离心5min，收集上清。

2.7.3去蛋白操作

采用商品化的基于高氯酸的去蛋白试剂盒，按照试剂盒步骤进行待检测样品和标准品的去蛋白操作。

2.7.4配制标准品

用含10％FBS的MEM培养基(均从Thermo公司购买获得)，配制0、1、2.5、5、10、25、50μM的标准品溶液。

2.7.5配制工作液

2.7.6检测

2.7.7计算浓度

计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组(即标准品为0的培养基)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。以D-2-HG浓度为纵坐标(y)，以平均荧光强度为横坐标(x)，得到标准曲线y＝0.0008x(R2＝0.999)，如图8所示。

各孔减去对照组(即标准品为0的血清)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。根据样品的荧光强度，代入标准曲线，即可得到样品的浓度。

测得SW1353细胞培养基中D-2-HG的平均浓度为22.3μM；HT1080细胞培养基中D-2-HG的平均浓度为92.9μM。

HT1080细胞培养基中D-2-HG的平均浓度为92.9μM，数值不在0～50μM，因此将HT1080细胞培养基待测样品稀释2倍，重新检测，计算对照组平均荧光强度，各孔减去对照组(即标准品为0的血清)平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各孔的平均值。根据样品的荧光强度，代入标准曲线，乘以2后，得到HT1080细胞培养基中D-2-HG的平均浓度为98.3μM。

序列表

<110> 山东大学第二医院

<120> 利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法

<141> 2020-12-07

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 木糖氧化无色杆菌ATCC27061(Achromobacter xylosoxidans ATCC27061)

<400> 1

atgaccacaa ccgacatcgc ccagcgcctg gtccaggctt tgggccccga caccgtcttc 60

accgccagcg acgacatcgc gccctggctg tccgactggc gcggcttgta caacggccac 120

gcccaggcgg tggtccgccc gcgcaccacc gccgaggtcg ccacctgcct ggcgctctgc 180

aacgaggccg gcgtgccggt ggtgccgcgc ggcggcaaca ccggcctgtg tggcggcgcc 240

acgcccgatg ccgcgcccat caacgtggtc ctcagcctgg accgcatgaa cgccgtgcgc 300

gccatcgaca ccgtcgccaa cacgatggtc gccgaagccg gctgcatcct cggcaacctg 360

cgccgcgcgg cgcaggacgc cggccggctg ctgcccttga gcctggccgc cgaggactcc 420

agccagatcg gcggcaacgt cgccaccaat gccggcggcg tcaacgtggt gcgctacggc 480

atggcgcgcg aactggtgct gggcctggaa gcggtgctgc ccaacggcga gatcttcaac 540

ggcctgcgca ccctgcgcaa ggacaacacc ggctacgacc tcaagcagct gctgatcggc 600

tccgagggca cgctcggcgt catcaccgcc gtggcgctgc gcctgttccc gcgcaccgac 660

gtgcgttccg tggtgctggc cgctgtcgaa tccccggccc aggccctgca attgttcgaa 720

atcctgttcg aacaatgcgg cgcccgcttg caggccttcg agtatttttc cggcgactgc 780

ctcgacctgg tcctggccca tgccgcgggc gtgcaagagc cgttcggcca acgttatccg 840

gcctacgtgc tggtcgaact ggccgacacg gccgacgaag ccgccctgac cgcgctgctg 900

gagaacgtga tcggcaccgc gctcgaccgc ggcctgtgcc tggatgccgc cgtctcggcc 960

tcgctggccc agttgcaggc gctgtggaaa ctgcgcgagg aaatctccga agcgcagcgc 1020

gccgacggtc cgcatctcaa gcatgacgtg tcgctgccga tcgaacgcat ccccgacttc 1080

atggtttccg ccgaagcgcg cgtacgcgcg ctgtacccgg acatccgccc cttcatcttc 1140

ggccacttcg gcgacggcaa cctgcattac aacctctcgc gtcccgccgg cgccgaccgc 1200

ggctgggtgg ccgaacacgg tgccgcgatc accgacgcgg tgctcgacga ggtcaaccgg 1260

tacgggggca gcatcagcgc ggaacacggc atcgggcagc tcaagcgcga ccacttcctg 1320

catagcaagg atgcggtgga gttgcggttg atgcgggaga tcaagcgggt gctggatccc 1380

aaggggatca tgaatcccgg aaagctgctg tag 1413

<210> 2

<211> 470

<212> PRT

<213> 木糖氧化无色杆菌ATCC27061(Achromobacter xylosoxidans ATCC27061)

<400> 2

Met Thr Thr Thr Asp Ile Ala Gln Arg Leu Val Gln Ala Leu Gly Pro

1 5 10 15

Asp Thr Val Phe Thr Ala Ser Asp Asp Ile Ala Pro Trp Leu Ser Asp

20 25 30

Trp Arg Gly Leu Tyr Asn Gly His Ala Gln Ala Val Val Arg Pro Arg

35 40 45

Thr Thr Ala Glu Val Ala Thr Cys Leu Ala Leu Cys Asn Glu Ala Gly

50 55 60

Val Pro Val Val Pro Arg Gly Gly Asn Thr Gly Leu Cys Gly Gly Ala

65 70 75 80

Thr Pro Asp Ala Ala Pro Ile Asn Val Val Leu Ser Leu Asp Arg Met

85 90 95

Asn Ala Val Arg Ala Ile Asp Thr Val Ala Asn Thr Met Val Ala Glu

100 105 110

Ala Gly Cys Ile Leu Gly Asn Leu Arg Arg Ala Ala Gln Asp Ala Gly

115 120 125

Arg Leu Leu Pro Leu Ser Leu Ala Ala Glu Asp Ser Ser Gln Ile Gly

130 135 140

Gly Asn Val Ala Thr Asn Ala Gly Gly Val Asn Val Val Arg Tyr Gly

145 150 155 160

Met Ala Arg Glu Leu Val Leu Gly Leu Glu Ala Val Leu Pro Asn Gly

165 170 175

Glu Ile Phe Asn Gly Leu Arg Thr Leu Arg Lys Asp Asn Thr Gly Tyr

180 185 190

Asp Leu Lys Gln Leu Leu Ile Gly Ser Glu Gly Thr Leu Gly Val Ile

195 200 205

Thr Ala Val Ala Leu Arg Leu Phe Pro Arg Thr Asp Val Arg Ser Val

210 215 220

Val Leu Ala Ala Val Glu Ser Pro Ala Gln Ala Leu Gln Leu Phe Glu

225 230 235 240

Ile Leu Phe Glu Gln Cys Gly Ala Arg Leu Gln Ala Phe Glu Tyr Phe

245 250 255

Ser Gly Asp Cys Leu Asp Leu Val Leu Ala His Ala Ala Gly Val Gln

260 265 270

Glu Pro Phe Gly Gln Arg Tyr Pro Ala Tyr Val Leu Val Glu Leu Ala

275 280 285

Asp Thr Ala Asp Glu Ala Ala Leu Thr Ala Leu Leu Glu Asn Val Ile

290 295 300

Gly Thr Ala Leu Asp Arg Gly Leu Cys Leu Asp Ala Ala Val Ser Ala

305 310 315 320

Ser Leu Ala Gln Leu Gln Ala Leu Trp Lys Leu Arg Glu Glu Ile Ser

325 330 335

Glu Ala Gln Arg Ala Asp Gly Pro His Leu Lys His Asp Val Ser Leu

340 345 350

Pro Ile Glu Arg Ile Pro Asp Phe Met Val Ser Ala Glu Ala Arg Val

355 360 365

Arg Ala Leu Tyr Pro Asp Ile Arg Pro Phe Ile Phe Gly His Phe Gly

370 375 380

Asp Gly Asn Leu His Tyr Asn Leu Ser Arg Pro Ala Gly Ala Asp Arg

385 390 395 400

Gly Trp Val Ala Glu His Gly Ala Ala Ile Thr Asp Ala Val Leu Asp

405 410 415

Glu Val Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Ile Ser Ala Glu His Gly Ile Gly

420 425 430

Gln Leu Lys Arg Asp His Phe Leu His Ser Lys Asp Ala Val Glu Leu

435 440 445

Arg Leu Met Arg Glu Ile Lys Arg Val Leu Asp Pro Lys Gly Ile Met

450 455 460

Asn Pro Gly Lys Leu Leu

465 470

<210> 3

<211> 1395

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)

<400> 3

atgaccgacc ccgccctgat cgatgagctg aaaaccctgg tcgagcccgg caaagtgctg 60

accgacgccg attcgctgaa cgcctacggc aaggactgga ccaagcattt cgctcccgcg 120

ccgtcggcca tcgtgttccc caagagcatc gagcaggtgc aggccatcgt gcgctgggcc 180

aacgcccaca aggtcgcgct ggtgccgtcg ggcggtcgca ccggactctc ggccgccgcc 240

gtggcagcca atggcgaggt ggtggtgtct ttcgactaca tgaaccagat tctcgaattc 300

aacgagatgg atcgcaccgc cgtctgccag cccggcgtgg tcaccgcgca gctgcagcag 360

ttcgccgagg acaagggcct gtactacccg gtggacttcg cctccgccgg ctccagtcag 420

atcggcggca acatcggcac caatgccggt ggcatcaagg tgatccgcta cggcatgacc 480

cgcaactggg tcgccggcat gaaggtggta accggcaagg gcgacctgct ggagctgaac 540

aaggacctga tcaagaacgc caccggctac gacctgcgcc agctgttcat cggcgccgag 600

ggcacgctgg gcttcgttgt cgaggccacc atgcgcctgg agcgtcagcc gaccaacctc 660

accgcgctgg tgctgggcac ccccgatttc gattcgatca tgccggtgct gcacgcgttc 720

caggacaagc tggacctgac cgccttcgaa ttcttctccg acaaggcgct ggccaaggtg 780

ctcggccgcg gtgacgtgcc ggcgccgttc gagaccgact gcccgttcta cgcgctgctg 840

gaattcgagg ccaccaccga ggagcgtgcc gagcaggcgc tggcgacctt cgaacattgc 900

gtcgagcagg gctgggtgct cgacggcgtg atgagccaga gcgagcagca gctgcagaac 960

ctgtggaagc tgcgcgagta catctccgag accatcagtc actggacacc gtacaagaac 1020

gacatctcgg tcaccgtcgg caaggtgccg gccttcctca aggaaatcga tgcgatcgtc 1080

ggcgaacact acccggactt cgagatcgtc tggttcggcc atatcggcga cggcaacctg 1140

cacctgaaca tcctcaagcc cgacgccatg gacaaggacg agttcttcgg caagtgcgcg 1200

acggtgaaca aatgggtgtt cgagaccgtg cagaagtaca acggctcgat ctccgccgaa 1260

cacggcgtcg gcatgaccaa acgtgactac ctcgagtaca gccgctcgcc ggcggaaatc 1320

gaatacatga aagcggtcaa ggcggtgttc gatccgaacg gcatcatgaa ccccggcaag 1380

atcttcgcgg cctga 1395

<210> 4

<211> 464

<212> PRT

<213> 施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)

<400> 4

Met Thr Asp Pro Ala Leu Ile Asp Glu Leu Lys Thr Leu Val Glu Pro

1 5 10 15

Gly Lys Val Leu Thr Asp Ala Asp Ser Leu Asn Ala Tyr Gly Lys Asp

20 25 30

Trp Thr Lys His Phe Ala Pro Ala Pro Ser Ala Ile Val Phe Pro Lys

35 40 45

Ser Ile Glu Gln Val Gln Ala Ile Val Arg Trp Ala Asn Ala His Lys

50 55 60

Val Ala Leu Val Pro Ser Gly Gly Arg Thr Gly Leu Ser Ala Ala Ala

65 70 75 80

Val Ala Ala Asn Gly Glu Val Val Val Ser Phe Asp Tyr Met Asn Gln

85 90 95

Ile Leu Glu Phe Asn Glu Met Asp Arg Thr Ala Val Cys Gln Pro Gly

100 105 110

Val Val Thr Ala Gln Leu Gln Gln Phe Ala Glu Asp Lys Gly Leu Tyr

115 120 125

Tyr Pro Val Asp Phe Ala Ser Ala Gly Ser Ser Gln Ile Gly Gly Asn

130 135 140

Ile Gly Thr Asn Ala Gly Gly Ile Lys Val Ile Arg Tyr Gly Met Thr

145 150 155 160

Arg Asn Trp Val Ala Gly Met Lys Val Val Thr Gly Lys Gly Asp Leu

165 170 175

Leu Glu Leu Asn Lys Asp Leu Ile Lys Asn Ala Thr Gly Tyr Asp Leu

180 185 190

Arg Gln Leu Phe Ile Gly Ala Glu Gly Thr Leu Gly Phe Val Val Glu

195 200 205

Ala Thr Met Arg Leu Glu Arg Gln Pro Thr Asn Leu Thr Ala Leu Val

210 215 220

Leu Gly Thr Pro Asp Phe Asp Ser Ile Met Pro Val Leu His Ala Phe

225 230 235 240

Gln Asp Lys Leu Asp Leu Thr Ala Phe Glu Phe Phe Ser Asp Lys Ala

245 250 255

Leu Ala Lys Val Leu Gly Arg Gly Asp Val Pro Ala Pro Phe Glu Thr

260 265 270

Asp Cys Pro Phe Tyr Ala Leu Leu Glu Phe Glu Ala Thr Thr Glu Glu

275 280 285

Arg Ala Glu Gln Ala Leu Ala Thr Phe Glu His Cys Val Glu Gln Gly

290 295 300

Trp Val Leu Asp Gly Val Met Ser Gln Ser Glu Gln Gln Leu Gln Asn

305 310 315 320

Leu Trp Lys Leu Arg Glu Tyr Ile Ser Glu Thr Ile Ser His Trp Thr

325 330 335

Pro Tyr Lys Asn Asp Ile Ser Val Thr Val Gly Lys Val Pro Ala Phe

340 345 350

Leu Lys Glu Ile Asp Ala Ile Val Gly Glu His Tyr Pro Asp Phe Glu

355 360 365

Ile Val Trp Phe Gly His Ile Gly Asp Gly Asn Leu His Leu Asn Ile

370 375 380

Leu Lys Pro Asp Ala Met Asp Lys Asp Glu Phe Phe Gly Lys Cys Ala

385 390 395 400

Thr Val Asn Lys Trp Val Phe Glu Thr Val Gln Lys Tyr Asn Gly Ser

405 410 415

Ile Ser Ala Glu His Gly Val Gly Met Thr Lys Arg Asp Tyr Leu Glu

420 425 430

Tyr Ser Arg Ser Pro Ala Glu Ile Glu Tyr Met Lys Ala Val Lys Ala

435 440 445

Val Phe Asp Pro Asn Gly Ile Met Asn Pro Gly Lys Ile Phe Ala Ala

450 455 460

Claims

1.利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D-2-羟基戊二酸的检测；

其中AX-F-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO：1；

AX-F-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；

P-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO：3；

P-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

2.根据权利要求1所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白。

3.根据权利要求1所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

㈠FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的外源表达及分离纯化

①配制工作液：

②样品准备

血清、尿液、脑脊液、细胞培养基、组织液或细胞胞内液需要经过除蛋白处理后，才可以得到待测样品；

③标准品准备

配制一系列浓度在0～50μM之间的D-2-羟基戊二酸标准品溶液；

在用于检测去蛋白样品时，配制的标准品也需经过相同的去蛋白操作后才能使用；

④检测

⑤制作标准曲线

以不含D-2-羟基戊二酸的标准品液作为对照组，计算对照组平均荧光强度；各标准品孔减去对照组平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各标准品浓度的平均值，然后以D-2-HG标准品浓度为纵坐标，以平均荧光强度为横坐标，作标准曲线；

⑥样品D-2-羟基戊二酸含量计算

以不含D-2-羟基戊二酸的标准品溶液作为对照组，计算对照组平均荧光强度；各重复孔减去对照组的平均荧光强度得到实际的荧光强度，并求得重复孔的平均值，代入上述标准曲线中，得到待测样品的D-2-羟基戊二酸浓度。

4.根据权利要求3所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：全基因合成目的基因的上游带有EcoRI酶切位点，下游带有HindIII酶切位点。

5.根据权利要求3所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：

配制工作液为：采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至10μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.03mg/ml，得到工作液。

6.根据权利要求3所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：

样品处理操作为：

或取脑脊液后离心取上清，去蛋白得到待测样品；

或取尿液后离心取上清，去蛋白得到待测样品；

或取细胞进行培养后，取细胞培养基，离心后收集上清液，去蛋白得到待测样品，备用；

或取细胞裂解后的上清，去蛋白得到待测样品，备用；

或者其他蛋白浓度小于0.2mg/ml的样品，可以直接使用或者适当稀释后使用。

7.根据权利要求3所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：

当待测样品的D-2-HG浓度为0～5μM时，对待测样品的D-2-HG浓度再进行精确检测，具体的，采用的工作液为：

采用pH 7.4的0.067M PBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至1μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.013mg/ml，得到工作液；制备标准曲线时，配制D-2-HG标准品溶液的系列浓度在0～5μM之间；

当待测样品的D-2-HG浓度为0～0.5μM时，采用的工作液为：

8.根据权利要求1所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：

FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶采用以下编码基因序列：

9.权利要求1～8所述的任一种利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法的应用，其特征在于：用于开发D-2-羟基戊二酸检测试剂盒。

10.根据权利要求9所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法的应用，其特征在于：

所述试剂盒包括缓冲液瓶、标准品管、刃天青液、酶液和说明书；其中缓冲液瓶装有配制工作液的PBS缓冲液，标准品管装有D-2-HG标准品，刃天青液装有三蒸水配制的刃天青，酶液装有D-2-羟基戊二酸脱氢酶。