CN108507984A - 一种酶法检测氧化三甲胺tmao的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法及其应用，该检测方法利用TMAO脱甲基酶tdm、甲醛脱氢酶fadh、甲酸脱氢酶fdh和黄递酶的多酶组合体系，实现TMAO的荧光测定，该方法可用于开发TMAO检测试剂盒；本发明的酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法克服了TMAO代谢途径中没有NAD依赖性脱氢酶参与，无法直接基于脱氢酶‑黄递酶耦合测定的缺点，通过tdm‑fadh‑fdh‑黄递酶多酶耦合，构建了荧光测定TMAO的体系，在该体系中，1个TMAO分子分解成两个荧光信号，灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及酶法检测技术领域，具体说是一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法及其应用。
背景技术
目前检测氧化三甲胺TMAO的方法主要有分光光度法、气相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、气相色谱-质谱连用法等。毛细管电泳法重复性相对较差，气质联用法分析灵敏度高，适合低分子挥发性化合物的分析，分离效率较高，可用于定量分析复杂混合物，但需对样品进行衍生化、固相微萃取等前处理，操作繁琐。有研究者采用高效液相色谱串联质谱法，利用氘代TMAO作为内标，选择多反应监测模式测定。基于NMR的TMAO检测方法无需对样品过多处理，快速准确测定血液及尿液中TMAO水平。质谱及NMR方法检测TMAO非常灵敏，但仪器昂贵、属于劳动密集型工作、耗时成本高且不适用于高通量分析及筛选。
基于刃天青的传统荧光酶法测定体系具有灵敏度高，操作简便，成本低，检测迅速的优点，但是由于TMAO的代谢途径中没有脱氢酶NAD依赖性参与，目前尚无以TMAO为底物的脱氢酶，因此不能直接基于脱氢酶-黄递酶耦合测定方案，这限制了直接利用脱氢酶开展荧光酶法测定TMAO的可能性。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法及其应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，利用TMAO脱甲基酶tdm、甲醛脱氢酶fadh、甲酸脱氢酶fdh和黄递酶的多酶组合体系，实现TMAO的荧光测定；
其中TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列为：
ATGAATGTTAATGCGGCGGCCCCAAAGGGGTCGTTCGACCTGGACGCGCCCCGGCGCGTCCAGACCCTTTCGGCGGCGGGCGGCGGCGGGGTTCAGTTCGACCTTTCGGCCGGCGACGAAGCGATCATTACAAATCTCGAGGGGGGCCAGGCCGGCGAATTGCTGACCGCCTCCGGCGAGCCACTCCGGCTCACGCCGGGGTCGGCGCCGACCGACGAGGCCGGCGTCCGCGCCGTCGCGGGCGATCTCGCCGCCGCGTTCCTCGCCGCGCGGCAGGGAACCGAACGGTTTCTGGCGACGCCGCTTTTTCATGCCGCCGCGGAGCCGGGCGAAACCTTCCGCTTCAAGGCCGAGGCCGATATGCGCTGCCTTCTATTGGCGCCCGGCGAGCCGATGGCCCCCGACGCGCAGAATCCACCGACGGAACTGCGCCTCGATATTTTCTCAAGCCGGCCGACGGGCGGCGCCGCGCCGCCTTCGCTTGCCCCAGTAAAGCTCGATCTCAGGGTCGACGCCGCAACCGCGCGCGCTTATCGCGTCAGCGCCGGCGATTATATCCAGATCATCGACGTGGACGGCCGGCAATGCTCCGATCTCGTCGCCTTCGACGCCAGGGCCCTGGCTGAGGGCCGCGAGCTTGGCGTCGATCCGACAGTAACGCGCACGCTGATGGGCTCGGCGACGCCGGGCCCCGGCCTCCACGCGAAATATTTCGACCAGGACATGAATCCTCTCTTTGAGATCGTCCGCGACACCGTCGGGCGGCACGACACATTCATGCTCGCCTGCAACGCGAAATATTACGACGACATGGGCTATCCCGGCCACGCCAATTGCACCGACAATTTCAACGCCGCGCTTGCGCCCTTTGGCGTCGCGCCGCGTCGCGGCTGGCCGGCAATCAATTTTTTCTACAACACCTTCGTCGCCGAAGACAACACGATCGGCCTTGACGAGCCCTGGTCGCGACCGGGCGACTATGTGTTGCTGCGCGCTTTGACCGACCTCGTCTGCGCGTCCTCGTCCTGCGCCGACGACATTGATCCGGCCAATGGTTGGATGCCGACCGACATACATGTGCGCGTCTATGACGCCGCCGCCAGCTTCTCCAAAGGGATCGCTCATCGCATGACCGCTGACGCCGCCCCCCGATTGACGCGTGAATCCGGTTTCCATTCAAGGACTTCCGCGCTGACTCGGTCCTTCGCCGACTATCGCGGCTTCTGGACGCCGCAATGCTACGCCTCCGAGGGACCCATCGCCGAATATTGGGCCTGTCGCGAGCGCGCCGTCCTCATCGATCTGTCGGCGCTGCGCAAGTTCGAGATCACCGGACCGGACGCCGAAATCCTGTTGCAAAGCGCCGTCACGCGCAACATTCGCAAGCTTGCGGTGGGTCAGATCGTCTACACAGCGATTTGCCACGAACATGGCGGCATGCTGGATGACGGAACGGTGTTCCGTCTCGGCGACAATAACTTCCGGCTCGTCTGCGGCGAGGATTATTGCGGCGTCTTTCTGCGCGAGCTCGCGGCGCGTCAGGGTTTGAGGGCCTTTGTCAGATCCTCGACCGATCAGCTGCATAATGTCGCCCTGCAAGGCCCAAAATCGCGCGACATCCTGCGCGAAATATTGGTCACGCCGCCCCATCGCGCCTCAGCCGACGAGTTAAAATGGTTCCGCTTTACCGTCGGCAAGATCGCGGGCCTGCCTGTGCTTGTTTCCCGCACGGGCTACACCGGCGAGCTCGGATATGAGATCTGGCTGCACCCTGGCTCCGCCGTGGCGGTCTGGGACGCGCTTATGGCGGCGGGGAAGCCCTATGGGATCGCGCCCTTCGGTTTCGCCGCGCTTGACATGGTGCGCATCGAGGCCGGCCTGATCTTCGCCCATCACGAGTTTTGTGACGAGACCGATCCCTTCGAGGCCGGCATCGGCTTTGCCGTTCCCGCCGAGAAGGCGGACCCCTATGTCGGGTCGGAGGCGCTGGCGCGCCGGCGCGCCAGCCCGATTCGCCGGCTCGCCGGGCTCGACGTCGCCGGCAATGAAGCGGTCGCCCATGGCGATCCGGTCTTTGCCGGCCGCGCCCAGGTGGGAGTCGTCACCAGCGCGATGCGCTCGCCTGTCCTCGGCCGCACCATCGCCCTCGCCCGCCTCGACGCCGCTTGCGCCTCGATCGGGACCGACCTCGAGATCGGCAAGCTGGACGGACGTCAAAAGCGCATCGCCGCAACTGTGGCGCGATTCCCACACTATGATCCAGAAAAGGCGCGAGTCAGGGCATAG；
TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列为：
MNVNAAAPKGSFDLDAPRRVQTLSAAGGGGVQFDLSAGDEAIITNLEGGQAGELLTASGEPLRLTPGSAPTDEAGVRAVAGDLAAAFLAARQGTERFLATPLFHAAAEPGETFRFKAEADMRCLLLAPGEPMAPDAQNPPTELRLDIFSSRPTGGAAPPSLAPVKLDLRVDAATARAYRVSAGDYIQIIDVDGRQCSDLVAFDARALAEGRELGVDPTVTRTLMGSATPGPGLHAKYFDQDMNPLFEIVRDTVGRHDTFMLACNAKYYDDMGYPGHANCTDNFNAALAPFGVAPRRGWPAINFFYNTFVAEDNTIGLDEPWSRPGDYVLLRALTDLVCASSSCADDIDPANGWMPTDIHVRVYDAAASFSKGIAHRMTADAAPRLTRESGFHSRTSALTRSFADYRGFWTPQCYASEGPIAEYWACRERAVLIDLSALRKFEITGPDAEILLQSAVTRNIRKLAVGQIVYTAICHEHGGMLDDGTVFRLGDNNFRLVCGEDYCGVFLRELAARQGLRAFVRSSTDQLHNVALQGPKSRDILREILVTPPHRASADELKWFRFTVGKIAGLPVLVSRTGYTGELGYEIWLHPGSAVAVWDALMAAGKPYGIAPFGFAALDMVRIEAGLIFAHHEFCDETDPFEAGIGFAVPAEKADPYVGSEALARRRASPIRRLAGLDVAGNEAVAHGDPVFAGRAQVGVVTSAMRSPVLGRTIALARLDAACASIGTDLEIGKLDGRQKRIAATVARFPHYDPEKARVRA；
甲醛脱氢酶fadh的编码基因序列为：
ATGTCTGGCAATCGTGGAGTGGTGTATCTCGGCGCTGGCAAGGTCGAAGTACAGAAGATCGACTACCCGAAAATGCAGGACCCGCGCGGCAAGAAAATCGAACACGGCGTCATCCTGAAGGTGGTCTCCACCAACATCTGCGGTTCTGACCAGCACATGGTCCGTGGCCGCACTACTGCCCAGGTCGGCCTGGTCCTGGGCCACGAAATCACCGGTGAAATCGTCGAGAAGGGCCGCGACGTCGAGCGCATGCAGATCGGCGACCTGGTATCGGTCCCGTTCAACGTCGCCTGCGGCCGCTGCCGCTCCTGCAAAGAGATGCACACCGGTGTCTGCCTCACCGTCAACCCGGCCCGCGCCGGCGGTGCCTACGGCTACGTCGACATGGGCGACTGGACCGGTGGCCAGGCCGAATACGTGCTGGTGCCATACGCCGACTTCAACCTGCTGAAGCTGCCTGAGCGCGACAAGGCCATGGAAAAGATCCGTGACCTGACCTGCCTGTCCGACATCCTGCCCACCGGCTATCACGGTGCCGTGACTGCTGGCGTTGGTCCAGGCAGCACTGTCTACGTTGCCGGTGCTGGCCCGGTCGGCCTGGCCGCCGCTGCCTCGGCGCGCCTGCTGGGCGCCGCCTGTGTAATCGTCGGTGACCTGAACCCGGCCCGCCTGGCCCACGCCAAGTCGCAAGGCTTCGAAGTGGTCGACCTGTCCAAGGACACCCCGCTGCACGAGCAGATCGTCGACATTCTCGGCGAGCCGGAAGTGGACTGCGCTGTCGACGCCGTCGGCTTCGAGGCCCGTGGCCATGGCCACGAAGGTGCCAAGCACGAGGCCCCGGCCACCGTGCTGAACTCGCTGATGCAAGTGACCCGCGTGGCCGGCAACATCGGTATCCCGGGCCTGTACGTGACCGAAGACCCGGGCGCGGTGGATGCCGCTGCCAAGATCGGCGCGCTGAGCATCCGCTTCGGCCTGGGCTGGGCGAAATCGCACAGCTTCCACACCGGCCAGACCCCGACCATGAAATACAACCGCCAGCTGATGCAGGCGATCATGTGGGACCGCATCAACATTGCTGAAGTGGTAGGTGTGCAGGTGATCAACCTGGATCAGGCGCCGGAAGGGTATGGCGAGTTTGATGCAGGTGTGCCGAAGAAATTCGTTATCGACCCGCACAAAATGTGGGGTGCGGCGTAA；
甲酸脱氢酶fdh的编码基因序列为：
ATGAAGGTTGTACTAGTTCTCTACGACGCAGGAAAACACGCCCAAGACGAGGAAAGACTCTACGGTTGCACCGAAAACGCCCTTGGTATCAGGGACTGGCTTGAGAAGCAGGGCCACGAGCTCGTTGTCACCAGTGACAAGGAGGGCGAGAATTCTGTGCTCGAGAAGAACATCCCGGACGCAGATGTCATCATCTCCACTCCTTTCCACCCGGCCTACATCACTAAGGAAAGAATTGACAAGGCCAAGAAGCTCAAGTTGCTGGTGGTTGCCGGAGTGGGATCCGACCACATCGACCTTGACTACATCAACCAGTCCGGCAGAGACATTTCTGTGCTGGAGGTGACCGGTTCGAACGTGGTTTCCGTTGCCGAGCACGTCGTGATGACGATGCTGGTGCTGGTCAGAAACTTTGTTCCTGCCCACGAGCAAATCATCTCTGGCGGCTGGAACGTGGCCGAGATTGCCAAGGACTCCTTCGATATCGAGGGTAAGGTCATTGCCACCATCGGAGCAGGCAGAATCGGCTACCGTGTGTTGGAGAGACTTGTCGCCTTCAACCCTAAGGAGCTGCTCTACTACGACTACCAGTCGCTGTCCAGAGAGGCCGAGGAGAAAGTCGGAGCCCGCAGAGTTCACGACATCAAGGAGCTGGTTGCCCAGGCCGACATTGTCACAATCAACTGTCCACTGCACGCCGGCTCGAAGGGCCTGGTCAACGCAGAGTTGCTCAAGCACTTCAAGAAGGGTGCCTGGCTCGTTAACACCGCCAGAGGTGCCATTTGTGTGGCCGAGGACGTTGCAGCAGCCGTCAAGAGCGGACAGCTCAGAGGATACGGTGGAGATGTGTGGTACCCACAGCCAGCTCCAAAGGACCACCCATGGAGATCTATGGCCAACAAGTACGGTGCTGGTAATGCCATGACTCCGCACTACTCGGGCTCTGTCATTGACGCCCAGGTCAGATACGCCCAGGGTACCAAGAACATCCTGGAGTCATTCTTCACTCAGAAGTTCGACTACAGACCTCAGGACATCATTCTGCTGAACGGTAAGTACAAGACCAAGTCGTACGGTGCCGACAAATGA。
优选的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，包括以下步骤：
(一)蛋白的外源表达及分离纯化：
⑴结合序列比对分析手段，选择TMAO脱甲基酶tdm的编码基因、甲醛脱氢酶fadh的编码基因和甲酸脱氢酶fdh的编码基因，然后分别通过全基因合成目的基因，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因；
⑵将步骤⑴所得的TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因分别采用分子克隆连入pETDuet-1表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，待OD600＝0.6时，加入1mM IPTG，20℃，180rpm诱导表达8～12小时，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
⑶分离纯化目的蛋白：采用快速蛋白纯化仪及镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤⑵所得的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
(二)多酶耦合的荧光酶法检测TMAO：
①配制混合液：
配制5mM的刃天青，20mM的NAD+，100mM HEPES溶液，备用；
根据上述溶液配制混合液，其中每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，40～60μl；刃天青，10～20μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，180～220μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，240～260μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，240～260μl；黄递酶，2～4mg；添加HEPES溶液补足至10ml；
②制作标准曲线：
配制一系列浓度在0～50μM之间的TMAO标准品溶液，每个浓度分别取25μl滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm，然后以荧光强度为纵坐标，TMAO标准品浓度为横坐标绘制标准曲线；
(三)尿液或血液的TMAO检测：
⒈尿液的处理及检测：
使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25μl尿液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定尿液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据尿液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到尿液的TMAO浓度；
⒉血液的处理及检测
血液分离血清，使用时，100ul血清中加入1ul浓度为40mg/ml的蛋白酶K溶液孵育10～12小时，然后利用去蛋白试剂盒除去蛋白，得到血液样本；检测时取25μl血液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定血液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据血液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到血液的TMAO浓度。
优选的，步骤(三)中，离心获得上清液的速率是14000～16000g，尿液样本保存于-80℃。
优选的，步骤(三)中，血液分离血清后，置于-80℃保存。
优选的，每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，50μl；刃天青，15μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，200μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，250μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，250μl；黄递酶，3mg；添加HEPES溶液补足至10ml；
优选的，分离纯化目的蛋白的步骤为：
A.将目的蛋白11000～13000rpm离心5分钟，去除上清液，收集菌体，重悬于BufferA中，调节菌体浓度OD600＝30～40，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；其中Buffer A的pH为7.4，组成为20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠和10％甘油；所述目的蛋白为TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
B.使用超声波破碎仪或高压细胞破碎仪破碎细胞后，11000～13000rpm离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤；
C.利用快速蛋白纯化仪及镍柱，通过改变Buffer B的浓度及仪器监测280nm下的紫外吸收，收集含目的蛋白的流出液；其中Buffer B的pH为7.4，组成为20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠和10％甘油；
D.将脱盐柱用脱盐缓冲液平衡后，将步骤C所得的含目的蛋白的流出液上样收集脱盐后含目的蛋白的流出液；然后置于超滤浓缩管中，以3900g离心，至超滤浓缩管上方液体中的目的蛋白浓度≥20mg/ml；然后用脱盐缓冲液将目的蛋白浓度调节为20mg/ml，分装后置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存；所述的脱盐缓冲液为pH为8.0的100mM的HEPES。
优选的，所述的酶法检测氧化三甲胺TMAO采用以下编码基因序列：第一，与TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列同源相似性大于50％，且编码蛋白具有TMAO脱甲基酶活性的基因序列；第二，与TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列一致性大于40％，且编码蛋白具有TMAO脱甲基酶活性。
本发明还包括一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法的应用，用于开发TMAO检测试剂盒。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法克服了TMAO代谢途径中没有NAD依赖性脱氢酶参与，无法直接基于脱氢酶-黄递酶耦合测定的缺点，创造性的通过TMAO脱甲基酶tdm将TMAO转化为二甲胺和甲醛，甲醛脱氢酶fadh催化甲醛转变为甲酸，同时转变NAD为NADH；甲酸可在甲酸脱氢酶fdh作用下转变为CO2，同时亦可产生NADH；黄递酶将NADH重新转变为NAD，同时传递电子给刃天青产生荧光信号，通过tdm-fadh-fdh-黄递酶多酶耦合，构建了荧光测定TMAO的体系，在该体系中，1个TMAO分子分解成两个荧光信号，灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低；
本发明的酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，可基于微孔板实现高通量，结合液体处理工作站可实现自动化操作，进一步降低了检测成本，基于荧光酶法检测D-2-HG和TMAO，后期易于开发成诊断试剂盒，或者作为自动化生化分析配套试剂，产业化优势明显，市场化前景好，此方法拓展了用于检测二甲胺(二甲胺单加氧酶催化二甲胺生成甲胺和甲醛)、甲胺(甲胺单加氧酶催化甲胺生成甲醛)及其他可产生甲醛的底物的检测。
附图说明
图1为酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法的原理示意图；
图2为0～50μM TMAO浓度下的标准曲线。
具体实施方式
一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，利用TMAO脱甲基酶tdm、甲醛脱氢酶fadh、甲酸脱氢酶fdh和黄递酶的多酶组合体系，实现TMAO的荧光测定；
其中TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列为：
ATGAATGTTAATGCGGCGGCCCCAAAGGGGTCGTTCGACCTGGACGCGCCCCGGCGCGTCCAGACCCTTTCGGCGGCGGGCGGCGGCGGGGTTCAGTTCGACCTTTCGGCCGGCGACGAAGCGATCATTACAAATCTCGAGGGGGGCCAGGCCGGCGAATTGCTGACCGCCTCCGGCGAGCCACTCCGGCTCACGCCGGGGTCGGCGCCGACCGACGAGGCCGGCGTCCGCGCCGTCGCGGGCGATCTCGCCGCCGCGTTCCTCGCCGCGCGGCAGGGAACCGAACGGTTTCTGGCGACGCCGCTTTTTCATGCCGCCGCGGAGCCGGGCGAAACCTTCCGCTTCAAGGCCGAGGCCGATATGCGCTGCCTTCTATTGGCGCCCGGCGAGCCGATGGCCCCCGACGCGCAGAATCCACCGACGGAACTGCGCCTCGATATTTTCTCAAGCCGGCCGACGGGCGGCGCCGCGCCGCCTTCGCTTGCCCCAGTAAAGCTCGATCTCAGGGTCGACGCCGCAACCGCGCGCGCTTATCGCGTCAGCGCCGGCGATTATATCCAGATCATCGACGTGGACGGCCGGCAATGCTCCGATCTCGTCGCCTTCGACGCCAGGGCCCTGGCTGAGGGCCGCGAGCTTGGCGTCGATCCGACAGTAACGCGCACGCTGATGGGCTCGGCGACGCCGGGCCCCGGCCTCCACGCGAAATATTTCGACCAGGACATGAATCCTCTCTTTGAGATCGTCCGCGACACCGTCGGGCGGCACGACACATTCATGCTCGCCTGCAACGCGAAATATTACGACGACATGGGCTATCCCGGCCACGCCAATTGCACCGACAATTTCAACGCCGCGCTTGCGCCCTTTGGCGTCGCGCCGCGTCGCGGCTGGCCGGCAATCAATTTTTTCTACAACACCTTCGTCGCCGAAGACAACACGATCGGCCTTGACGAGCCCTGGTCGCGACCGGGCGACTATGTGTTGCTGCGCGCTTTGACCGACCTCGTCTGCGCGTCCTCGTCCTGCGCCGACGACATTGATCCGGCCAATGGTTGGATGCCGACCGACATACATGTGCGCGTCTATGACGCCGCCGCCAGCTTCTCCAAAGGGATCGCTCATCGCATGACCGCTGACGCCGCCCCCCGATTGACGCGTGAATCCGGTTTCCATTCAAGGACTTCCGCGCTGACTCGGTCCTTCGCCGACTATCGCGGCTTCTGGACGCCGCAATGCTACGCCTCCGAGGGACCCATCGCCGAATATTGGGCCTGTCGCGAGCGCGCCGTCCTCATCGATCTGTCGGCGCTGCGCAAGTTCGAGATCACCGGACCGGACGCCGAAATCCTGTTGCAAAGCGCCGTCACGCGCAACATTCGCAAGCTTGCGGTGGGTCAGATCGTCTACACAGCGATTTGCCACGAACATGGCGGCATGCTGGATGACGGAACGGTGTTCCGTCTCGGCGACAATAACTTCCGGCTCGTCTGCGGCGAGGATTATTGCGGCGTCTTTCTGCGCGAGCTCGCGGCGCGTCAGGGTTTGAGGGCCTTTGTCAGATCCTCGACCGATCAGCTGCATAATGTCGCCCTGCAAGGCCCAAAATCGCGCGACATCCTGCGCGAAATATTGGTCACGCCGCCCCATCGCGCCTCAGCCGACGAGTTAAAATGGTTCCGCTTTACCGTCGGCAAGATCGCGGGCCTGCCTGTGCTTGTTTCCCGCACGGGCTACACCGGCGAGCTCGGATATGAGATCTGGCTGCACCCTGGCTCCGCCGTGGCGGTCTGGGACGCGCTTATGGCGGCGGGGAAGCCCTATGGGATCGCGCCCTTCGGTTTCGCCGCGCTTGACATGGTGCGCATCGAGGCCGGCCTGATCTTCGCCCATCACGAGTTTTGTGACGAGACCGATCCCTTCGAGGCCGGCATCGGCTTTGCCGTTCCCGCCGAGAAGGCGGACCCCTATGTCGGGTCGGAGGCGCTGGCGCGCCGGCGCGCCAGCCCGATTCGCCGGCTCGCCGGGCTCGACGTCGCCGGCAATGAAGCGGTCGCCCATGGCGATCCGGTCTTTGCCGGCCGCGCCCAGGTGGGAGTCGTCACCAGCGCGATGCGCTCGCCTGTCCTCGGCCGCACCATCGCCCTCGCCCGCCTCGACGCCGCTTGCGCCTCGATCGGGACCGACCTCGAGATCGGCAAGCTGGACGGACGTCAAAAGCGCATCGCCGCAACTGTGGCGCGATTCCCACACTATGATCCAGAAAAGGCGCGAGTCAGGGCATAG；
TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列为：
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甲醛脱氢酶fadh的编码基因序列为：
ATGTCTGGCAATCGTGGAGTGGTGTATCTCGGCGCTGGCAAGGTCGAAGTACAGAAGATCGACTACCCGAAAATGCAGGACCCGCGCGGCAAGAAAATCGAACACGGCGTCATCCTGAAGGTGGTCTCCACCAACATCTGCGGTTCTGACCAGCACATGGTCCGTGGCCGCACTACTGCCCAGGTCGGCCTGGTCCTGGGCCACGAAATCACCGGTGAAATCGTCGAGAAGGGCCGCGACGTCGAGCGCATGCAGATCGGCGACCTGGTATCGGTCCCGTTCAACGTCGCCTGCGGCCGCTGCCGCTCCTGCAAAGAGATGCACACCGGTGTCTGCCTCACCGTCAACCCGGCCCGCGCCGGCGGTGCCTACGGCTACGTCGACATGGGCGACTGGACCGGTGGCCAGGCCGAATACGTGCTGGTGCCATACGCCGACTTCAACCTGCTGAAGCTGCCTGAGCGCGACAAGGCCATGGAAAAGATCCGTGACCTGACCTGCCTGTCCGACATCCTGCCCACCGGCTATCACGGTGCCGTGACTGCTGGCGTTGGTCCAGGCAGCACTGTCTACGTTGCCGGTGCTGGCCCGGTCGGCCTGGCCGCCGCTGCCTCGGCGCGCCTGCTGGGCGCCGCCTGTGTAATCGTCGGTGACCTGAACCCGGCCCGCCTGGCCCACGCCAAGTCGCAAGGCTTCGAAGTGGTCGACCTGTCCAAGGACACCCCGCTGCACGAGCAGATCGTCGACATTCTCGGCGAGCCGGAAGTGGACTGCGCTGTCGACGCCGTCGGCTTCGAGGCCCGTGGCCATGGCCACGAAGGTGCCAAGCACGAGGCCCCGGCCACCGTGCTGAACTCGCTGATGCAAGTGACCCGCGTGGCCGGCAACATCGGTATCCCGGGCCTGTACGTGACCGAAGACCCGGGCGCGGTGGATGCCGCTGCCAAGATCGGCGCGCTGAGCATCCGCTTCGGCCTGGGCTGGGCGAAATCGCACAGCTTCCACACCGGCCAGACCCCGACCATGAAATACAACCGCCAGCTGATGCAGGCGATCATGTGGGACCGCATCAACATTGCTGAAGTGGTAGGTGTGCAGGTGATCAACCTGGATCAGGCGCCGGAAGGGTATGGCGAGTTTGATGCAGGTGTGCCGAAGAAATTCGTTATCGACCCGCACAAAATGTGGGGTGCGGCGTAA；
甲酸脱氢酶fdh的编码基因序列为：
ATGAAGGTTGTACTAGTTCTCTACGACGCAGGAAAACACGCCCAAGACGAGGAAAGACTCTACGGTTGCACCGAAAACGCCCTTGGTATCAGGGACTGGCTTGAGAAGCAGGGCCACGAGCTCGTTGTCACCAGTGACAAGGAGGGCGAGAATTCTGTGCTCGAGAAGAACATCCCGGACGCAGATGTCATCATCTCCACTCCTTTCCACCCGGCCTACATCACTAAGGAAAGAATTGACAAGGCCAAGAAGCTCAAGTTGCTGGTGGTTGCCGGAGTGGGATCCGACCACATCGACCTTGACTACATCAACCAGTCCGGCAGAGACATTTCTGTGCTGGAGGTGACCGGTTCGAACGTGGTTTCCGTTGCCGAGCACGTCGTGATGACGATGCTGGTGCTGGTCAGAAACTTTGTTCCTGCCCACGAGCAAATCATCTCTGGCGGCTGGAACGTGGCCGAGATTGCCAAGGACTCCTTCGATATCGAGGGTAAGGTCATTGCCACCATCGGAGCAGGCAGAATCGGCTACCGTGTGTTGGAGAGACTTGTCGCCTTCAACCCTAAGGAGCTGCTCTACTACGACTACCAGTCGCTGTCCAGAGAGGCCGAGGAGAAAGTCGGAGCCCGCAGAGTTCACGACATCAAGGAGCTGGTTGCCCAGGCCGACATTGTCACAATCAACTGTCCACTGCACGCCGGCTCGAAGGGCCTGGTCAACGCAGAGTTGCTCAAGCACTTCAAGAAGGGTGCCTGGCTCGTTAACACCGCCAGAGGTGCCATTTGTGTGGCCGAGGACGTTGCAGCAGCCGTCAAGAGCGGACAGCTCAGAGGATACGGTGGAGATGTGTGGTACCCACAGCCAGCTCCAAAGGACCACCCATGGAGATCTATGGCCAACAAGTACGGTGCTGGTAATGCCATGACTCCGCACTACTCGGGCTCTGTCATTGACGCCCAGGTCAGATACGCCCAGGGTACCAAGAACATCCTGGAGTCATTCTTCACTCAGAAGTTCGACTACAGACCTCAGGACATCATTCTGCTGAACGGTAAGTACAAGACCAAGTCGTACGGTGCCGACAAATGA。
优选的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，包括以下步骤：
(一)蛋白的外源表达及分离纯化：
⑴结合序列比对分析手段，选择TMAO脱甲基酶tdm的编码基因、甲醛脱氢酶fadh的编码基因和甲酸脱氢酶fdh的编码基因，然后分别通过全基因合成目的基因，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因；
根据文献“Zhu Y,et al.(2014)Identification and characterization oftrimethylamine N-oxide(TMAO)demethylase and TMAO permease in Methylocellasilvestris BL2.Environmental Microbiology16(10):3318-3330.”报道Methylocellasilvestris BL2菌株中存在TMAO脱甲基化酶(Tdm；Msil_3603)，在NCBI的Gene数据库中搜索Msil_3603即可获取基因序列；
根据文献“Roca A,et al.(2009)Redundancy of enzymes for formaldehydedetoxification in Pseudomonas putida.Journal of bacteriology 191(10):3367-3374.”报道Pseudomonas putida KT2440中PP_0328基因编码FADH，在NCBI的Gene数据库中搜索PP_0328即可获取基因序列；
根据文献“Yu S,et al.(2014)Promising properties of a formatedehydrogenase from a methanol-assimilating yeast Ogataea parapolymorpha DL-1in His-tagged form.Applied microbiology and biotechnology 98(4):1621-1630.”报道Ogataea parapolymorpha DL-1中HPODL_03145基因编码FDH，在NCBI的Gene数据库中搜索HPODL_03145即可获取基因序列；
通过全基因合成目的基因委托生物公司完成；
⑵将步骤⑴所得的TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因分别采用分子克隆连入pETDuet-1表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，待OD600＝0.6时，加入1mM IPTG，20℃，180rpm诱导表达8～12小时，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
⑶分离纯化目的蛋白：采用快速蛋白纯化仪及镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤⑵所得的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
(二)多酶耦合的荧光酶法检测TMAO：
①配制混合液：
配制5mM的刃天青，20mM的NAD+，100mM HEPES溶液，备用；
根据上述溶液配制混合液，其中每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，40～60μl；刃天青，10～20μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，180～220μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，240～260μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，240～260μl；黄递酶，2～4mg；添加HEPES溶液补足至10ml；
②制作标准曲线：
配制一系列浓度在0～50μM之间的TMAO标准品溶液，每个浓度分别取25μl滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm，然后以荧光强度为纵坐标，TMAO标准品浓度为横坐标绘制标准曲线；
(三)尿液或血液的TMAO检测：
⒈尿液的处理及检测：
使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25μl尿液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定尿液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据尿液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到尿液的TMAO浓度；
⒉血液的处理及检测
血液分离血清，使用时，100ul血清中加入1ul浓度为40mg/ml的蛋白酶K溶液孵育10～12小时，然后利用去蛋白试剂盒除去蛋白，得到血液样本；检测时取25μl血液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定血液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据血液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到血液的TMAO浓度。
优选的，步骤(三)中，离心获得上清液的速率是14000～16000g，尿液样本保存于-80℃。
优选的，步骤(三)中，血液分离血清后，置于-80℃保存。
优选的，每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，50μl；刃天青，15μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，200μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，250μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，250μl；黄递酶，3mg；添加HEPES溶液补足至10ml；
优选的，分离纯化目的蛋白的步骤为：
A.将目的蛋白11000～13000rpm离心5分钟，去除上清液，收集菌体，重悬于BufferA中，调节菌体浓度OD600＝30～40，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；其中Buffer A的pH为7.4，组成为20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠和10％甘油；所述目的蛋白为TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
B.使用超声波破碎仪或高压细胞破碎仪破碎细胞后，11000～13000rpm离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤；
C.利用快速蛋白纯化仪及镍柱，通过改变Buffer B的浓度及仪器监测280nm下的紫外吸收，收集含目的蛋白的流出液；其中Buffer B的pH为7.4，组成为20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠和10％甘油；
D.将脱盐柱用脱盐缓冲液平衡后，将步骤C所得的含目的蛋白的流出液上样收集脱盐后含目的蛋白的流出液；然后置于超滤浓缩管中，以3900g离心，至超滤浓缩管上方液体中的目的蛋白浓度≥20mg/ml；然后用脱盐缓冲液将目的蛋白浓度调节为20mg/ml，分装后置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存；所述的脱盐缓冲液为pH为8.0的100mM的HEPES。
优选的，所述的酶法检测氧化三甲胺TMAO采用以下编码基因序列：第一，与TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列同源相似性大于50％，且编码蛋白具有TMAO脱甲基酶活性的基因序列；第二，与TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列一致性大于40％，且编码蛋白具有TMAO脱甲基酶活性。
本发明还包括一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法的应用，用于开发TMAO检测试剂盒。例如，根据本专利申请多酶耦合荧光法测定TMAO的原理，将按照本申请步骤制备的Tdm、FADH、FDH，连同diaphorase、Resazurin、NAD、缓冲液等组分置于试剂盒内，按照本专利申请步骤制作使用说明书等即可容易地开发试剂盒。
如图1所示的酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法的原理示意图，TMAO在TMAO脱甲基酶(TMAO demethylase，tdm)的作用下转变为二甲胺和甲醛；甲醛脱氢酶(Formaldehydedehydrogenase，fadh)催化甲醛转变为甲酸，同时转变NAD为NADH；甲酸可在甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，fdh)作用下转变为CO2，同时亦可产生NADH；黄递酶将NADH重新转变为NAD，同时传递电子给刃天青产生荧光信号；本发明的检测方法，首先除了黄递酶通过商品化购买外，构建荧光酶法检测TMAO的反应体系，还需制备tmd、fadh和fdh，根据文献报道，结合序列比对分析手段，确定tmd、fadh和fdh的编码基因，通过PCR克隆活全基因合成目的基因，连接表达载体(带组氨酸标签)，转入专用于蛋白表达的大肠杆菌或其他表达宿主，实现蛋白的大量外源化表达和分离提纯；
其次构建含tdm、fadh、fdh、黄递酶、TMAO、NAD及Resazurin(刃天青)的反应体系；优化缓冲液、pH、温度、各酶浓度及配比等因素对荧光信号的影响，以信噪比为指标筛选合适的resazurin浓度。估算检测限及定量限，确定合适的底物检测范围，制作标准曲线；
最后，采用相应的动物模型，细胞株或者收集临床样本(包括血液、尿液、脑脊液等体液或者组织等)制备样品，利用该荧光检测体系检测TMAO含量；需要注意的是TMAO和心血管病、肾病、肺炎等疾病均有相关度，检测该数值很有必要，但是该数值只是一个中间值，不能确诊某种疾病，要确诊其中某种疾病还需要到相应的专业科室进行检查，比如糖尿病需要检测完血糖含量后才可确诊，而和心血管有关的疾病也需要做心电图等专业检测。
本发明的操作步骤全基因合成目的基因委托交给生物公司合成，本实施例的该步骤均由生工生物工程股份有限公司来合成；
刃天青英文名为resazurin，CAS号62758-13-8；
黄递酶英文名为Diaphorase；
本发明采用的去蛋白试剂盒为Biovision。
tdm(Tdm)蛋白的外源表达和分离纯化包括以下步骤：
(1)Zhu Y,et al.(2014)Identification and characterization oftrimethylamine N-oxide(TMAO)demethylase and TMAO permease in Methylocellasilvestris BL2.Environmental Microbiology 16(10):3318-3330.
上面这个文献报道Methylocella silvestris BL2菌株中存在TMAO脱甲基化酶(Tdm；Msil_3603)，在NCBI的Gene数据库中搜索Msil_3603即可获取基因序列tdm；
(2)将tdm序列送往生工生物工程股份有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点EcoRI和HindIII；
(3)利用EcoRI和HindIII酶切上述合成的tdm，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000c测定浓度；
(4)利用EcoRI和HindIII酶切pETDuet-1载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000c测定浓度；
(5)利用T4 DNA ligase(连接酶)将步骤3和4的片段构建连接反应体系，22℃连接1h；
(6)常规方法化学将连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB平板；
(7)挑取8个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
(8)将提取的质粒EcoRI和HindIII酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
(9)测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于15％的甘油中。
(10)将步骤9中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600＝0.6时，加入1mM IPTG诱导蛋白表达，20℃，180rpm过夜；
(11)将菌液12000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，重悬于Buffer A(pH 7.4，20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠，10％甘油)中，调节菌体浓度OD600＝30-40，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度1mM；
(12)利用超声波破碎仪或者高压细胞破碎仪破碎细胞，之后12,000rpm离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤；
(13)利用快速蛋白纯化仪及镍柱(HisTrap HP 5ml，GE Healthcare公司)，基于亲和层析的原理纯化蛋白。通过改变Buffer B(pH 7.4，20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠，10％甘油)的浓度，确定Tdm的纯化条件为：先用10％Buffer B去除杂蛋白，之后用50％Buffer B洗脱；收集50％Buffer B条件下的流出液组分；
(14)将脱盐柱(Hitrap Desalting 5ml，GE Healthcare公司)用脱盐缓冲液(pH8.0，100mM HEPES)平衡后，将步骤13的收集液上样；收集含Tdm蛋白的流出液组分；
(15)将步骤14流出液置于超滤浓缩管中，以3900g离心，离心至超滤浓缩管上方液体中的蛋白浓度达到或超过20mg/ml为止；
(16)利用脱盐缓冲液将步骤15蛋白浓度调节至20mg/ml，分装后置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存。
fadh(FADH)蛋白的外源表达和分离纯化包括以下步骤：
(1)Roca A,et al.(2009)Redundancy of enzymes for formaldehydedetoxification in Pseudomonas putida.Journal of bacteriology 191(10):3367-3374.
上面这个文献报道Pseudomonas putida KT2440中PP_0328基因编码FADH，在NCBI的Gene数据库中搜索PP_0328即可获取基因序列fadh。
(2)将fadh序列送往生工生物工程股份有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点EcoRI和HindIII；
(3)利用EcoRI和HindIII酶切上述合成的fadh，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000c测定浓度；
(4)利用EcoRI和HindIII酶切pETDuet-1载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000c测定浓度；
(5)利用T4 DNA ligase将步骤3和4的片段构建连接反应体系，22℃连接1h；
(6)常规方法化学将连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB平板；
(7)挑取8个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
(8)将提取的质粒EcoRI和HindIII酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
(9)测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于15％的甘油中。
(10)将步骤9中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600＝0.6时，加入1mM IPTG诱导蛋白表达，20℃,180rpm过夜；
(11)将菌液12,000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，重悬于Buffer A(pH 7.4，20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠，10％甘油)中，调节菌体浓度OD600＝30-40，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度1mM；
(12)利用超声波破碎仪或者高压细胞破碎仪破碎细胞，之后12000rpm离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤；
(13)利用快速蛋白纯化仪及镍柱(HisTrap HP 5ml，GE Healthcare公司)，基于亲和层析的原理纯化蛋白。通过改变Buffer B(pH 7.4，20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠，10％甘油)的浓度，确定Tdm的纯化条件为：先用15％Buffer B去除杂蛋白，之后用50％Buffer B洗脱；收集50％Buffer B条件下的流出液组分；
(14)将脱盐柱(Hitrap Desalting 5ml，GE Healthcare公司)用脱盐缓冲液(pH8.0，100mM HEPES)平衡后，将步骤13的收集液上样；收集含FADH蛋白的流出液组分；
(15)将步骤14流出液置于超滤浓缩管中，以3900g离心，离心至超滤浓缩管上方液体中的蛋白浓度达到或超过20mg/ml为止；
(16)利用脱盐缓冲液将步骤15蛋白浓度调节至20mg/ml，分装后置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存。
fdh(FDH)蛋白的外源表达和分离纯化包括以下步骤：
(1)Yu S,et al.(2014)Promising properties of a formate dehydrogenasefrom a methanol-assimilating yeast Ogataea parapolymorpha DL-1in His-taggedform.Applied microbiology and biotechnology 98(4):1621-1630.
上面这个文献报道Ogataea parapolymorpha DL-1中HPODL_03145基因编码FDH，在NCBI的Gene数据库中搜索HPODL_03145即可获取基因序列fdh。
(2)将fdh序列送往生工生物工程股份有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点EcoRI和HindIII；
(3)利用EcoRI和HindIII酶切上述合成的fdh，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000c测定浓度；
(4)利用EcoRI和HindIII酶切pETDuet-1载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000c测定浓度；
(5)利用T4 DNA ligase将步骤3和4的片段构建连接反应体系，22℃连接1h；
(6)常规方法化学将连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB平板；
(7)挑取8个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
(8)将提取的质粒EcoRI和HindIII酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
(9)测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于15％的甘油中。
(10)将步骤9中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600＝0.6时，加入1mM IPTG诱导蛋白表达，20℃，180rpm过夜；
(11)将菌液12,000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，重悬于Buffer A(pH 7.4，20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠，10％甘油)中，调节菌体浓度OD600＝30-40，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度1mM；
(12)利用超声波破碎仪或者高压细胞破碎仪破碎细胞，之后12000rpm离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤；
(13)利用快速蛋白纯化仪及镍柱(HisTrap HP 5ml，GE Healthcare公司)，基于亲和层析的原理纯化蛋白；通过改变Buffer B(pH 7.4，20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠，10％甘油)的浓度，确定Tdm的纯化条件为：先用10％Buffer B去除杂蛋白，之后用40％Buffer B洗脱；收集40％Buffer B条件下的流出液组分；
(14)将脱盐柱(Hitrap Desalting 5ml，GE Healthcare公司)用脱盐缓冲液(pH8.0，100mM HEPES)平衡后，将步骤13的收集液上样；收集含FDH蛋白的流出液组分；
(15)将步骤14流出液置于超滤浓缩管中，以3900g离心，离心至超滤浓缩管上方液体中的蛋白浓度达到或超过20mg/ml为止；
(16)利用脱盐缓冲液将步骤15蛋白浓度调节至20mg/ml，分装后置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，利用TMAO脱甲基酶tdm、甲醛脱氢酶fadh、甲酸脱氢酶fdh和黄递酶的多酶组合体系，实现TMAO的荧光测定；
其中TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列为：
ATGAATGTTAATGCGGCGGCCCCAAAGGGGTCGTTCGACCTGGACGCGCCCCGGCGCGTCCAGACCCTTTCGGCGGCGGGCGGCGGCGGGGTTCAGTTCGACCTTTCGGCCGGCGACGAAGCGATCATTACAAATCTCGAGGGGGGCCAGGCCGGCGAATTGCTGACCGCCTCCGGCGAGCCACTCCGGCTCACGCCGGGGTCGGCGCCGACCGACGAGGCCGGCGTCCGCGCCGTCGCGGGCGATCTCGCCGCCGCGTTCCTCGCCGCGCGGCAGGGAACCGAACGGTTTCTGGCGACGCCGCTTTTTCATGCCGCCGCGGAGCCGGGCGAAACCTTCCGCTTCAAGGCCGAGGCCGATATGCGCTGCCTTCTATTGGCGCCCGGCGAGCCGATGGCCCCCGACGCGCAGAATCCACCGACGGAACTGCGCCTCGATATTTTCTCAAGCCGGCCGACGGGCGGCGCCGCGCCGCCTTCGCTTGCCCCAGTAAAGCTCGATCTCAGGGTCGACGCCGCAACCGCGCGCGCTTATCGCGTCAGCGCCGGCGATTATATCCAGATCATCGACGTGGACGGCCGGCAATGCTCCGATCTCGTCGCCTTCGACGCCAGGGCCCTGGCTGAGGGCCGCGAGCTTGGCGTCGATCCGACAGTAACGCGCACGCTGATGGGCTCGGCGACGCCGGGCCCCGGCCTCCACGCGAAATATTTCGACCAGGACATGAATCCTCTCTTTGAGATCGTCCGCGACACCGTCGGGCGGCACGACACATTCATGCTCGCCTGCAACGCGAAATATTACGACGACATGGGCTATCCCGGCCACGCCAATTGCACCGACAATTTCAACGCCGCGCTTGCGCCCTTTGGCGTCGCGCCGCGTCGCGGCTGGCCGGCAATCAATTTTTTCTACAACACCTTCGTCGCCGAAGACAACACGATCGGCCTTGACGAGCCCTGGTCGCGACCGGGCGACTATGTGTTGCTGCGCGCTTTGACCGACCTCGTCTGCGCGTCCTCGTCCTGCGCCGACGACATTGATCCGGCCAATGGTTGGATGCCGACCGACATACATGTGCGCGTCTATGACGCCGCCGCCAGCTTCTCCAAAGGGATCGCTCATCGCATGACCGCTGACGCCGCCCCCCGATTGACGCGTGAATCCGGTTTCCATTCAAGGACTTCCGCGCTGACTCGGTCCTTCGCCGACTATCGCGGCTTCTGGACGCCGCAATGCTACGCCTCCGAGGGACCCATCGCCGAATATTGGGCCTGTCGCGAGCGCGCCGTCCTCATCGATCTGTCGGCGCTGCGCAAGTTCGAGATCACCGGACCGGACGCCGAAATCCTGTTGCAAAGCGCCGTCACGCGCAACATTCGCAAGCTTGCGGTGGGTCAGATCGTCTACACAGCGATTTGCCACGAACATGGCGGCATGCTGGATGACGGAACGGTGTTCCGTCTCGGCGACAATAACTTCCGGCTCGTCTGCGGCGAGGATTATTGCGGCGTCTTTCTGCGCGAGCTCGCGGCGCGTCAGGGTTTGAGGGCCTTTGTCAGATCCTCGACCGATCAGCTGCATAATGTCGCCCTGCAAGGCCCAAAATCGCGCGACATCCTGCGCGAAATATTGGTCACGCCGCCCCATCGCGCCTCAGCCGACGAGTTAAAATGGTTCCGCTTTACCGTCGGCAAGATCGCGGGCCTGCCTGTGCTTGTTTCCCGCACGGGCTACACCGGCGAGCTCGGATATGAGATCTGGCTGCACCCTGGCTCCGCCGTGGCGGTCTGGGACGCGCTTATGGCGGCGGGGAAGCCCTATGGGATCGCGCCCTTCGGTTTCGCCGCGCTTGACATGGTGCGCATCGAGGCCGGCCTGATCTTCGCCCATCACGAGTTTTGTGACGAGACCGATCCCTTCGAGGCCGGCATCGGCTTTGCCGTTCCCGCCGAGAAGGCGGACCCCTATGTCGGGTCGGAGGCGCTGGCGCGCCGGCGCGCCAGCCCGATTCGCCGGCTCGCCGGGCTCGACGTCGCCGGCAATGAAGCGGTCGCCCATGGCGATCCGGTCTTTGCCGGCCGCGCCCAGGTGGGAGTCGTCACCAGCGCGATGCGCTCGCCTGTCCTCGGCCGCACCATCGCCCTCGCCCGCCTCGACGCCGCTTGCGCCTCGATCGGGACCGACCTCGAGATCGGCAAGCTGGACGGACGTCAAAAGCGCATCGCCGCAACTGTGGCGCGATTCCCACACTATGATCCAGAAAAGGCGCGAGTCAGGGCATAG；
TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列为：
MNVNAAAPKGSFDLDAPRRVQTLSAAGGGGVQFDLSAGDEAIITNLEGGQAGELLTASGEPLRLTPGSAPTDEAGVRAVAGDLAAAFLAARQGTERFLATPLFHAAAEPGETFRFKAEADMRCLLLAPGEPMAPDAQNPPTELRLDIFSSRPTGGAAPPSLAPVKLDLRVDAATARAYRVSAGDYIQIIDVDGRQCSDLVAFDARALAEGRELGVDPTVTRTLMGSATPGPGLHAKYFDQDMNPLFEIVRDTVGRHDTFMLACNAKYYDDMGYPGHANCTDNFNAALAPFGVAPRRGWPAINFFYNTFVAEDNTIGLDEPWSRPGDYVLLRALTDLVCASSSCADDIDPANGWMPTDIHVRVYDAAASFSKGIAHRMTADAAPRLTRESGFHSRTSALTRSFADYRGFWTPQCYASEGPIAEYWACRERAVLIDLSALRKFEITGPDAEILLQSAVTRNIRKLAVGQIVYTAICHEHGGMLDDGTVFRLGDNNFRLVCGEDYCGVFLRELAARQGLRAFVRSSTDQLHNVALQGPKSRDILREILVTPPHRASADELKWFRFTVGKIAGLPVLVSRTGYTGELGYEIWLHPGSAVAVWDALMAAGKPYGIAPFGFAALDMVRIEAGLIFAHHEFCDETDPFEAGIGFAVPAEKADPYVGSEALARRRASPIRRLAGLDVAGNEAVAHGDPVFAGRAQVGVVTSAMRSPVLGRTIALARLDAACASIGTDLEIGKLDGRQKRIAATVARFPHYDPEKARVRA；
甲醛脱氢酶fadh的编码基因序列为：
ATGTCTGGCAATCGTGGAGTGGTGTATCTCGGCGCTGGCAAGGTCGAAGTACAGAAGATCGACTACCCGAAAATGCAGGACCCGCGCGGCAAGAAAATCGAACACGGCGTCATCCTGAAGGTGGTCTCCACCAACATCTGCGGTTCTGACCAGCACATGGTCCGTGGCCGCACTACTGCCCAGGTCGGCCTGGTCCTGGGCCACGAAATCACCGGTGAAATCGTCGAGAAGGGCCGCGACGTCGAGCGCATGCAGATCGGCGACCTGGTATCGGTCCCGTTCAACGTCGCCTGCGGCCGCTGCCGCTCCTGCAAAGAGATGCACACCGGTGTCTGCCTCACCGTCAACCCGGCCCGCGCCGGCGGTGCCTACGGCTACGTCGACATGGGCGACTGGACCGGTGGCCAGGCCGAATACGTGCTGGTGCCATACGCCGACTTCAACCTGCTGAAGCTGCCTGAGCGCGACAAGGCCATGGAAAAGATCCGTGACCTGACCTGCCTGTCCGACATCCTGCCCACCGGCTATCACGGTGCCGTGACTGCTGGCGTTGGTCCAGGCAGCACTGTCTACGTTGCCGGTGCTGGCCCGGTCGGCCTGGCCGCCGCTGCCTCGGCGCGCCTGCTGGGCGCCGCCTGTGTAATCGTCGGTGACCTGAACCCGGCCCGCCTGGCCCACGCCAAGTCGCAAGGCTTCGAAGTGGTCGACCTGTCCAAGGACACCCCGCTGCACGAGCAGATCGTCGACATTCTCGGCGAGCCGGAAGTGGACTGCGCTGTCGACGCCGTCGGCTTCGAGGCCCGTGGCCATGGCCACGAAGGTGCCAAGCACGAGGCCCCGGCCACCGTGCTGAACTCGCTGATGCAAGTGACCCGCGTGGCCGGCAACATCGGTATCCCGGGCCTGTACGTGACCGAAGACCCGGGCGCGGTGGATGCCGCTGCCAAGATCGGCGCGCTGAGCATCCGCTTCGGCCTGGGCTGGGCGAAATCGCACAGCTTCCACACCGGCCAGACCCCGACCATGAAATACAACCGCCAGCTGATGCAGGCGATCATGTGGGACCGCATCAACATTGCTGAAGTGGTAGGTGTGCAGGTGATCAACCTGGATCAGGCGCCGGAAGGGTATGGCGAGTTTGATGCAGGTGTGCCGAAGAAATTCGTTATCGACCCGCACAAAATGTGGGGTGCGGCGTAA；
甲酸脱氢酶fdh的编码基因序列为：
ATGAAGGTTGTACTAGTTCTCTACGACGCAGGAAAACACGCCCAAGACGAGGAAAGACTCTACGGTTGCACCGAAAACGCCCTTGGTATCAGGGACTGGCTTGAGAAGCAGGGCCACGAGCTCGTTGTCACCAGTGACAAGGAGGGCGAGAATTCTGTGCTCGAGAAGAACATCCCGGACGCAGATGTCATCATCTCCACTCCTTTCCACCCGGCCTACATCACTAAGGAAAGAATTGACAAGGCCAAGAAGCTCAAGTTGCTGGTGGTTGCCGGAGTGGGATCCGACCACATCGACCTTGACTACATCAACCAGTCCGGCAGAGACATTTCTGTGCTGGAGGTGACCGGTTCGAACGTGGTTTCCGTTGCCGAGCACGTCGTGATGACGATGCTGGTGCTGGTCAGAAACTTTGTTCCTGCCCACGAGCAAATCATCTCTGGCGGCTGGAACGTGGCCGAGATTGCCAAGGACTCCTTCGATATCGAGGGTAAGGTCATTGCCACCATCGGAGCAGGCAGAATCGGCTACCGTGTGTTGGAGAGACTTGTCGCCTTCAACCCTAAGGAGCTGCTCTACTACGACTACCAGTCGCTGTCCAGAGAGGCCGAGGAGAAAGTCGGAGCCCGCAGAGTTCACGACATCAAGGAGCTGGTTGCCCAGGCCGACATTGTCACAATCAACTGTCCACTGCACGCCGGCTCGAAGGGCCTGGTCAACGCAGAGTTGCTCAAGCACTTCAAGAAGGGTGCCTGGCTCGTTAACACCGCCAGAGGTGCCATTTGTGTGGCCGAGGACGTTGCAGCAGCCGTCAAGAGCGGACAGCTCAGAGGATACGGTGGAGATGTGTGGTACCCACAGCCAGCTCCAAAGGACCACCCATGGAGATCTATGGCCAACAAGTACGGTGCTGGTAATGCCATGACTCCGCACTACTCGGGCTCTGTCATTGACGCCCAGGTCAGATACGCCCAGGGTACCAAGAACATCCTGGAGTCATTCTTCACTCAGAAGTTCGACTACAGACCTCAGGACATCATTCTGCTGAACGGTAAGTACAAGACCAAGTCGTACGGTGCCGACAAATGA。
实施例2
一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，包括以下步骤：
(一)蛋白的外源表达及分离纯化：
⑴结合序列比对分析手段，选择TMAO脱甲基酶tdm的编码基因、甲醛脱氢酶fadh的编码基因和甲酸脱氢酶fdh的编码基因，然后分别通过全基因合成目的基因，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因；
⑵将步骤⑴所得的TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因分别采用分子克隆连入pETDuet-1表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，待OD600＝0.6时，加入1mM IPTG，20℃，180rpm诱导表达8～12小时，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
⑶分离纯化目的蛋白：采用快速蛋白纯化仪及镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤⑵所得的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
(二)多酶耦合的荧光酶法检测TMAO：
①配制混合液：
配制5mM的刃天青，20mM的NAD+，100mM HEPES溶液，备用；
根据上述溶液配制混合液，其中每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，40μl；刃天青，10μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，180μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，240μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，240μl；黄递酶，2mg；添加HEPES溶液补足至10ml；
②制作标准曲线
配制一系列浓度的TMAO标准品溶液，浓度分别为0.5μM、2μM、6μM、10μM、20μM、30μM和50μM，双蒸水作为对照，每个浓度分别取25μl滴入黑色96孔板(OptiPlate-96F，PerkinElmer)中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm，然后以荧光强度为纵坐标，TMAO标准品浓度为横坐标绘制标准曲线；
(三)尿液或血液的TMAO检测：
⒈尿液的处理及检测：
使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本，离心获得上清液的速率是14000～16000g，尿液样本保存于-80℃；检测时取25μl尿液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定尿液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据尿液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到尿液的TMAO浓度；
⒉血液的处理及检测
血液分离血清，置于-80℃保存，使用时，100ul血清中加入1ul浓度为40mg/ml的蛋白酶K溶液孵育10～12小时，然后利用去蛋白试剂盒除去蛋白，得到血液样本；检测时取25μl血液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定血液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据血液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到血液的TMAO浓度。
实施例3
除了每10ml混合液的比例组成以外，其余条件和实施例2一致；
每10ml混合液的比例组成为NAD+，60μl；刃天青，20μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，220μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，260μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，260μl；黄递酶，4mg；添加HEPES溶液补足至10ml。
实施例4
除了每10ml混合液的比例组成以外，其余条件和实施例2一致；
每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，50μl；刃天青，15μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，200μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，250μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，250μl；黄递酶，3mg；添加HEPES溶液补足至10ml。
进行荧光检测后，以荧光强度为X轴，TMAO浓度为Y轴，通过Excel等软件绘制标准曲线，结果发现0～50μMTMAO浓度下具有良好的线性关系，因此选择TMAO浓度0-50μM作为主要的测量范围，如图2所示0～50μM TMAO浓度下的标准曲线；因此，当样品中TMAO浓度大于此范围时，样品要进行适当稀释。
使用实施例4所得的0～50μM TMAO浓度下的标准曲线进行血清TMAO浓度的测定，具体操作如下：
(1)按照医院伦理规范要求，收集15例慢性肾病患者5ml外周血，10例正常人5ml外周血；
(2)常规方法利用血清分离胶管，分离获得血清，置于-80℃保存；
(3)使用时，每个样本取100μl血清，加入1μl的蛋白酶K(40mg/ml)溶液，37℃孵育过夜；
(4)利用去蛋白试剂盒(美国Biovision品牌)，按照操作说明进一步除去蛋白；
(5)将获得的上清置于-80度保存；
(6)测定时，取步骤5的25μl上清加入到滴入黑色96孔板(OptiPlate-96F，PerkinElmer)，然后加入75μl混合液(实施例4)；
(7)避光反应30min后，利用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长：555nm；发射波长：590nm。
(8)根据标准曲线及样品荧光强度数值，可计算获得样品中TMAO的浓度，健康人组血清中的TMAO浓度平均值为4.12±1.86μM，慢性肾病组的TMAO浓度平均值为35.64±8.83μM。
使用实施例4所得的0～50μM TMAO浓度下的标准曲线进行糖尿病肾病小鼠尿液中TMAO浓度的测定，具体操作如下：
(1)构建糖尿病肾病模型：
a.配置柠檬酸钠缓冲液：将2.10g柠檬酸加入双蒸水100ml配成柠檬酸母液，称为A液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸水100ml配成柠檬酸钠母液，称为B液；将A、B液按1:1.32比例混合，pH计测定pH值，调定溶液pH＝4.0，即是所需配制STZ的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液。
b.配置链脲佐霉素(STZ)溶液：将STZ溶于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成10mg/mL浓度的STZ溶液，并用0.22μm滤菌器过滤除菌。注意避光配制，现用现配。
c.实验动物的饲养：选用8周的雄性野生型C57BL/6小鼠16只，随机等分为对照组和糖尿病肾病组。SPF级动物房饲养，所有器具及食物均消毒，标准饮食。
d.造模：按照50mg/kg腹腔注射STZ，连续注射三天，尾静脉取血测空腹血糖，超过大于等于13.6mmol/L，证明造模成功。小鼠单侧肾切除后可以明显缩短成模周期。标准饮食，继续饲养四周左右出现明显的蛋白尿，则认为糖尿病肾病模型构建成功。
(2)小鼠摄入三甲胺后，三甲胺在体内会转变为TMAO。两组小鼠饮水中均添加TMAO的前体物质三甲胺(0.5g/l)；
(3)4周左右后，饮水中停止加入三甲胺，待3天后，取小鼠尿液，利用去蛋白试剂盒(美国Biovision品牌)，按照操作说明除去蛋白；15000g离心获取上清，存于-80℃；
(4)测定时，取步骤3的25μl上清加入到滴入黑色96孔板(OptiPlate-96F，PerkinElmer)，然后加入75μl混合液(实施例4)；
(7)避光反应30min后，利用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长：555nm；发射波长：590nm。
(8)根据标准曲线及样品荧光强度数值，可计算获得样品中TMAO的浓度。对照组小鼠尿液中TMAO的浓度平均值为24.12±7.61μM，糖尿病肾病小鼠尿液中TMAO的浓度150.24±43.35μM。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能理解为对发明专利范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，另外，本发明没有详细解释的内容均属于现有技术的内容。
序列表
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2286
<212> PRT
<213> Methylocella silvestris BL2(Methylocella silvestris BL2)
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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<211> 761
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<213> Methylocella silvestris BL2(Methylocella silvestris BL2)
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<211> 1089
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<213> Ogataea parapolymorpha DL-1(Ogataea parapolymorpha DL-1)
<400> 4
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115 120 125
Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly
130 135 140
Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys
165 170 175
Gly Gly Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr Cys Ala Thr Cys
180 185 190
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195 200 205
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Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys
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485 490 495
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515 520 525
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595 600 605
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930 935 940
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945 950 955 960
Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly
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Ala
Claims (8)
1.一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：利用TMAO脱甲基酶tdm、甲醛脱氢酶fadh、甲酸脱氢酶fdh和黄递酶的多酶组合体系，实现TMAO的荧光测定；
其中TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列为：
ATGAATGTTAATGCGGCGGCCCCAAAGGGGTCGTTCGACCTGGACGCGCCC
CGGCGCGTCCAGACCCTTTCGGCGGCGGGCGGCGGCGGGGTTCAGTTCGA
CCTTTCGGCCGGCGACGAAGCGATCATTACAAATCTCGAGGGGGGCCAGG
CCGGCGAATTGCTGACCGCCTCCGGCGAGCCACTCCGGCTCACGCCGGGG
TCGGCGCCGACCGACGAGGCCGGCGTCCGCGCCGTCGCGGGCGATCTCGC
CGCCGCGTTCCTCGCCGCGCGGCAGGGAACCGAACGGTTTCTGGCGACGC
CGCTTTTTCATGCCGCCGCGGAGCCGGGCGAAACCTTCCGCTTCAAGGCCG
AGGCCGATATGCGCTGCCTTCTATTGGCGCCCGGCGAGCCGATGGCCCCCG
ACGCGCAGAATCCACCGACGGAACTGCGCCTCGATATTTTCTCAAGCCGGC
CGACGGGCGGCGCCGCGCCGCCTTCGCTTGCCCCAGTAAAGCTCGATCTCA
GGGTCGACGCCGCAACCGCGCGCGCTTATCGCGTCAGCGCCGGCGATTATA
TCCAGATCATCGACGTGGACGGCCGGCAATGCTCCGATCTCGTCGCCTTCG
ACGCCAGGGCCCTGGCTGAGGGCCGCGAGCTTGGCGTCGATCCGACAGTA
ACGCGCACGCTGATGGGCTCGGCGACGCCGGGCCCCGGCCTCCACGCGAA
ATATTTCGACCAGGACATGAATCCTCTCTTTGAGATCGTCCGCGACACCGTC
GGGCGGCACGACACATTCATGCTCGCCTGCAACGCGAAATATTACGACGAC
ATGGGCTATCCCGGCCACGCCAATTGCACCGACAATTTCAACGCCGCGCTT
GCGCCCTTTGGCGTCGCGCCGCGTCGCGGCTGGCCGGCAATCAATTTTTTC
TACAACACCTTCGTCGCCGAAGACAACACGATCGGCCTTGACGAGCCCTG
GTCGCGACCGGGCGACTATGTGTTGCTGCGCGCTTTGACCGACCTCGTCTG
CGCGTCCTCGTCCTGCGCCGACGACATTGATCCGGCCAATGGTTGGATGCC
GACCGACATACATGTGCGCGTCTATGACGCCGCCGCCAGCTTCTCCAAAGG
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CGGTTTCCATTCAAGGACTTCCGCGCTGACTCGGTCCTTCGCCGACTATCG
CGGCTTCTGGACGCCGCAATGCTACGCCTCCGAGGGACCCATCGCCGAATA
TTGGGCCTGTCGCGAGCGCGCCGTCCTCATCGATCTGTCGGCGCTGCGCAA
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CGCGCAACATTCGCAAGCTTGCGGTGGGTCAGATCGTCTACACAGCGATTT
GCCACGAACATGGCGGCATGCTGGATGACGGAACGGTGTTCCGTCTCGGCGACAATAACTTCCGGCTCGTCTGCGGCGAGGATTATTGCGGCGTCTTTCTG
CGCGAGCTCGCGGCGCGTCAGGGTTTGAGGGCCTTTGTCAGATCCTCGAC
CGATCAGCTGCATAATGTCGCCCTGCAAGGCCCAAAATCGCGCGACATCCT
GCGCGAAATATTGGTCACGCCGCCCCATCGCGCCTCAGCCGACGAGTTAAA
ATGGTTCCGCTTTACCGTCGGCAAGATCGCGGGCCTGCCTGTGCTTGTTTCC
CGCACGGGCTACACCGGCGAGCTCGGATATGAGATCTGGCTGCACCCTGGC
TCCGCCGTGGCGGTCTGGGACGCGCTTATGGCGGCGGGGAAGCCCTATGG
GATCGCGCCCTTCGGTTTCGCCGCGCTTGACATGGTGCGCATCGAGGCCGG
CCTGATCTTCGCCCATCACGAGTTTTGTGACGAGACCGATCCCTTCGAGGC
CGGCATCGGCTTTGCCGTTCCCGCCGAGAAGGCGGACCCCTATGTCGGGTC
GGAGGCGCTGGCGCGCCGGCGCGCCAGCCCGATTCGCCGGCTCGCCGGGC
TCGACGTCGCCGGCAATGAAGCGGTCGCCCATGGCGATCCGGTCTTTGCCG
GCCGCGCCCAGGTGGGAGTCGTCACCAGCGCGATGCGCTCGCCTGTCCTC
GGCCGCACCATCGCCCTCGCCCGCCTCGACGCCGCTTGCGCCTCGATCGGG
ACCGACCTCGAGATCGGCAAGCTGGACGGACGTCAAAAGCGCATCGCCGC
AACTGTGGCGCGATTCCCACACTATGATCCAGAAAAGGCGCGAGTCAGGG
CATAG；
TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列为：
MNVNAAAPKGSFDLDAPRRVQTLSAAGGGGVQFDLSAGDEAIITNLEGGQA
GELLTASGEPLRLTPGSAPTDEAGVRAVAGDLAAAFLAARQGTERFLATPLFH
AAAEPGETFRFKAEADMRCLLLAPGEPMAPDAQNPPTELRLDIFSSRPTGGAA
PPSLAPVKLDLRVDAATARAYRVSAGDYIQIIDVDGRQCSDLVAFDARALAEG
RELGVDPTVTRTLMGSATPGPGLHAKYFDQDMNPLFEIVRDTVGRHDTFMLA
CNAKYYDDMGYPGHANCTDNFNAALAPFGVAPRRGWPAINFFYNTFVAEDN
TIGLDEPWSRPGDYVLLRALTDLVCASSSCADDIDPANGWMPTDIHVRVYDA
AASFSKGIAHRMTADAAPRLTRESGFHSRTSALTRSFADYRGFWTPQCYASEG
PIAEYWACRERAVLIDLSALRKFEITGPDAEILLQSAVTRNIRKLAVGQIVYTAI
CHEHGGMLDDGTVFRLGDNNFRLVCGEDYCGVFLRELAARQGLRAFVRSST
DQLHNVALQGPKSRDILREILVTPPHRASADELKWFRFTVGKIAGLPVLVSRTG
YTGELGYEIWLHPGSAVAVWDALMAAGKPYGIAPFGFAALDMVRIEAGLIFA
HHEFCDETDPFEAGIGFAVPAEKADPYVGSEALARRRASPIRRLAGLDVAGNE
AVAHGDPVFAGRAQVGVVTSAMRSPVLGRTIALARLDAACASIGTDLEIGKL
DGRQKRIAATVARFPHYDPEKARVRA；
甲醛脱氢酶fadh的编码基因序列为：
ATGTCTGGCAATCGTGGAGTGGTGTATCTCGGCGCTGGCAAGGTCGAAGTA
CAGAAGATCGACTACCCGAAAATGCAGGACCCGCGCGGCAAGAAAATCGAA
CACGGCGTCATCCTGAAGGTGGTCTCCACCAACATCTGCGGTTCTGACCAG
CACATGGTCCGTGGCCGCACTACTGCCCAGGTCGGCCTGGTCCTGGGCCAC
GAAATCACCGGTGAAATCGTCGAGAAGGGCCGCGACGTCGAGCGCATGCAG
ATCGGCGACCTGGTATCGGTCCCGTTCAACGTCGCCTGCGGCCGCTGCCGC
TCCTGCAAAGAGATGCACACCGGTGTCTGCCTCACCGTCAACCCGGCCCGC
GCCGGCGGTGCCTACGGCTACGTCGACATGGGCGACTGGACCGGTGGCCAG
GCCGAATACGTGCTGGTGCCATACGCCGACTTCAACCTGCTGAAGCTGCCT
GAGCGCGACAAGGCCATGGAAAAGATCCGTGACCTGACCTGCCTGTCCGAC
ATCCTGCCCACCGGCTATCACGGTGCCGTGACTGCTGGCGTTGGTCCAGGC
AGCACTGTCTACGTTGCCGGTGCTGGCCCGGTCGGCCTGGCCGCCGCTGCC
TCGGCGCGCCTGCTGGGCGCCGCCTGTGTAATCGTCGGTGACCTGAACCCG
GCCCGCCTGGCCCACGCCAAGTCGCAAGGCTTCGAAGTGGTCGACCTGTCC
AAGGACACCCCGCTGCACGAGCAGATCGTCGACATTCTCGGCGAGCCGGAA
GTGGACTGCGCTGTCGACGCCGTCGGCTTCGAGGCCCGTGGCCATGGCCAC
GAAGGTGCCAAGCACGAGGCCCCGGCCACCGTGCTGAACTCGCTGATGCAA
GTGACCCGCGTGGCCGGCAACATCGGTATCCCGGGCCTGTACGTGACCGAA
GACCCGGGCGCGGTGGATGCCGCTGCCAAGATCGGCGCGCTGAGCATCCGC
TTCGGCCTGGGCTGGGCGAAATCGCACAGCTTCCACACCGGCCAGACCCCG
ACCATGAAATACAACCGCCAGCTGATGCAGGCGATCATGTGGGACCGCATC
AACATTGCTGAAGTGGTAGGTGTGCAGGTGATCAACCTGGATCAGGCGCCG
GAAGGGTATGGCGAGTTTGATGCAGGTGTGCCGAAGAAATTCGTTATCGAC
CCGCACAAAATGTGGGGTGCGGCGTAA；
甲酸脱氢酶fdh的编码基因序列为：
ATGAAGGTTGTACTAGTTCTCTACGACGCAGGAAAACACGCCCAAGACGA
GGAAAGACTCTACGGTTGCACCGAAAACGCCCTTGGTATCAGGGACTGGC
TTGAGAAGCAGGGCCACGAGCTCGTTGTCACCAGTGACAAGGAGGGCGA
GAATTCTGTGCTCGAGAAGAACATCCCGGACGCAGATGTCATCATCTCCAC
TCCTTTCCACCCGGCCTACATCACTAAGGAAAGAATTGACAAGGCCAAGA
AGCTCAAGTTGCTGGTGGTTGCCGGAGTGGGATCCGACCACATCGACCTTG
ACTACATCAACCAGTCCGGCAGAGACATTTCTGTGCTGGAGGTGACCGGTT
CGAACGTGGTTTCCGTTGCCGAGCACGTCGTGATGACGATGCTGGTGCTGG
TCAGAAACTTTGTTCCTGCCCACGAGCAAATCATCTCTGGCGGCTGGAACG
TGGCCGAGATTGCCAAGGACTCCTTCGATATCGAGGGTAAGGTCATTGCCA
CCATCGGAGCAGGCAGAATCGGCTACCGTGTGTTGGAGAGACTTGTCGCCT
TCAACCCTAAGGAGCTGCTCTACTACGACTACCAGTCGCTGTCCAGAGAGG
CCGAGGAGAAAGTCGGAGCCCGCAGAGTTCACGACATCAAGGAGCTGGTT
GCCCAGGCCGACATTGTCACAATCAACTGTCCACTGCACGCCGGCTCGAA
GGGCCTGGTCAACGCAGAGTTGCTCAAGCACTTCAAGAAGGGTGCCTGGC
TCGTTAACACCGCCAGAGGTGCCATTTGTGTGGCCGAGGACGTTGCAGCA
GCCGTCAAGAGCGGACAGCTCAGAGGATACGGTGGAGATGTGTGGTACCC
ACAGCCAGCTCCAAAGGACCACCCATGGAGATCTATGGCCAACAAGTACG
GTGCTGGTAATGCCATGACTCCGCACTACTCGGGCTCTGTCATTGACGCCC
AGGTCAGATACGCCCAGGGTACCAAGAACATCCTGGAGTCATTCTTCACTC
AGAAGTTCGACTACAGACCTCAGGACATCATTCTGCTGAACGGTAAGTACA
AGACCAAGTCGTACGGTGCCGACAAATGA。
2.根据权利要求1所述的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（一）蛋白的外源表达及分离纯化：
⑴结合序列比对分析手段，选择TMAO脱甲基酶tdm的编码基因、甲醛脱氢酶fadh的编码基因和甲酸脱氢酶fdh的编码基因，然后分别通过全基因合成目的基因，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因；
⑵将步骤⑴所得的TMAO脱甲基酶tdm目的基因、甲醛脱氢酶fadh目的基因和甲酸脱氢酶fdh目的基因分别采用分子克隆连入pETDuet-1表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，待OD600=0.6时，加入1 mM IPTG，20℃， 180 rpm诱导表达8~12小时，分别得到TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
⑶分离纯化目的蛋白：采用快速蛋白纯化仪及镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤⑵所得的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
（二）多酶耦合的荧光酶法检测TMAO：
①配制混合液：
配制5mM的刃天青，20 mM的NAD+，100 mM HEPES溶液，备用；
根据上述溶液配制混合液，其中每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，40~60μl；刃天青，10~20μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，180~220μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，240~260μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，240~260μl；黄递酶，2~4mg；添加HEPES溶液补足至10ml；
②制作标准曲线：
配制一系列浓度在0~50μM之间的TMAO标准品溶液，每个浓度分别取25μl滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm，然后以荧光强度为纵坐标，TMAO标准品浓度为横坐标绘制标准曲线；
（三）尿液或血液的TMAO检测：
1.尿液的处理及检测：
使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25μl尿液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定尿液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据尿液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到尿液的TMAO浓度；
2.血液的处理及检测
血液分离血清，使用时，100 ul血清中加入1 ul浓度为40 mg/ml的蛋白酶K溶液孵育10~12小时，然后利用去蛋白试剂盒除去蛋白，得到血液样本；检测时取25μl血液样本滴入黑色96孔板中，再向其中加入75μl混合液，避光反应30min，使用多功能酶标仪测定血液样本荧光强度，激发波长555nm，发射波长590nm；
根据血液样本的荧光强度数值和标准曲线计算得到血液的TMAO浓度。
3.根据权利要求2所述的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：步骤（三）中，离心获得上清液的速率是14000~16000g，尿液样本保存于-80℃。
4.根据权利要求2所述的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：步骤（三）中，血液分离血清后，置于-80℃保存。
5.根据权利要求2所述的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：每10ml混合液的比例组成包括：NAD+，50μl；刃天青，15μl；10mg/ml的纯化后的TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白，200μl；20mg/ml的纯化后的甲醛脱氢酶fadh目的蛋白，250μl；20mg/ml的纯化后的甲酸脱氢酶fdh目的蛋白，250μl；黄递酶，3mg；添加HEPES溶液补足至10ml。
6.根据权利要求2所述的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：分离纯化目的蛋白的步骤为：
A．将目的蛋白11000~13000rpm离心5分钟，去除上清液，收集菌体，重悬于Buffer A中，调节菌体浓度OD600=30~40，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至终浓度为1mM；其中BufferA的pH为7.4，组成为20mM磷酸钠，20mM咪唑，500mM氯化钠和10%甘油；所述目的蛋白为TMAO脱甲基酶tdm目的蛋白、甲醛脱氢酶fadh目的蛋白和甲酸脱氢酶fdh目的蛋白；
B．使用超声波破碎仪或高压细胞破碎仪破碎细胞后，11000~13000rpm离心40min，将上清液用0.22μm滤膜过滤；
C．利用快速蛋白纯化仪及镍柱，通过改变Buffer B的浓度及仪器监测280nm下的紫外吸收，收集含目的蛋白的流出液；其中Buffer B的pH为7.4，组成为20mM磷酸钠，500mM咪唑，500mM氯化钠和10%甘油；
D．将脱盐柱用脱盐缓冲液平衡后，将步骤C所得的含目的蛋白的流出液上样收集脱盐后含目的蛋白的流出液；然后置于超滤浓缩管中，以3900g离心，至超滤浓缩管上方液体中的目的蛋白浓度≥20mg/ml；然后用脱盐缓冲液将目的蛋白浓度调节为20mg/ml，分装后置于液氮中迅速冷冻，放入-80℃贮存；所述的脱盐缓冲液为pH为8.0的100mM的HEPES。
7.根据权利要求1所述的一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法，其特征在于：所述的酶法检测氧化三甲胺TMAO采用以下编码基因序列：第一，与TMAO脱甲基酶tdm的编码基因序列同源相似性大于50%，且编码蛋白具有TMAO脱甲基酶活性的基因序列；第二，与TMAO脱甲基酶tdm蛋白的氨基酸序列一致性大于40%，且编码蛋白具有TMAO脱甲基酶活性。
8.权利要求1~6的任一种酶法检测氧化三甲胺TMAO的方法的应用，其特征在于：用于开发TMAO检测试剂盒。
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