KR20100121823A - 소 엔테로바이러스를 이용한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법 - Google Patents

소 엔테로바이러스를 이용한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비병원성인 소 엔테로바이러스(BEV: Bovine enterovirus)를 이용하여 유용 유전자 또는 항원 등 외부 유래의 단백질을 발현시킬 수 있도록 제작한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법에 관한 것이다.
소 엔테로바이러스, 마커 단백질, 유전자 증폭, 전달 벡터

Description

소 엔테로바이러스를 이용한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법{Recombinant viral vector using Bovine enterovirus and the method for producing thereof}
본 발명은 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비병원성인 소 엔테로바이러스(BEV: Bovine enterovirus)를 이용하여 유용 유전자 또는 항원 등 외부 유래의 단백질을 발현시킬 수 있도록 제작한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법에 관한 것이다.
바이러스 유전자의 재조합 방법을 통해 제조된 재조합 바이러스를 전달벡터로서 사용하기 위해서는, 1) 작성된 바이러스가 증식성이 왕성하여 높은 바이러스 역가가 유지되어야 하며, 2) 병원성이 없어야 하고, 3) 항체의 분포가 적어야 항체에 의한 간섭의 영향을 받지 않을 수 있다. 또한 다양한 숙주영역에 도입될 수 있는 넓은 숙주 영역을 갖는 것이라면 충분히 생 전달벡터로서 사용할 수 있다. 이러한 방법들을 통해 많은 연구자들이 생체 내 적용 가능한 전달 벡터로서, 아데노바 이러스, 폭스바이러스, 파라믹소바이러스 및 허피스바이러스 등을 이용한 바이러스 벡터 개발을 위한 노력을 경주해 왔으며, 특히 폴리오바이러스(poliovirus)를 이용한 전달벡터도 많은 보고가 있다(John et al, 2002, Yokoyama et al, 1977).
피코나바이러스과에 속해 있는 병원체는 사람의 소아마비 바이러스가 대표적이며, 동물 전염병 병원체는 구제역, 돼지수포병, 돼지뇌심근염 또는 돼지텟센병 등 축산 경제에 있어서 중요한 전염병들이 많이 속해 있다(Gillespie and Tomoney, 1981). 1985년 이전까지 국제 분류기준상 7개의 혈청형으로 분류되었던 소 엔테로바이러스를 1985년 Knowles 등(Knowles et al., 1985)이 2종류의 혈청형, 즉 BEV-1 및 BEV-2로 재분류하였으며, 이것이 현재까지 표준분류법으로 사용되고 있다. 그 이후 소 엔테로바이러스 게놈의 전체 염기서열 분석을 통한 계통분류에서 A, B 2개의 종으로 또는 2-3개 정도의 유전형/혈청형으로 더 자세히 구분하기도 하였다(Zell et al., 2006). 이 바이러스는 환경오염의 지표로도 널리 알려져 있다(Ley et al, 2002). 또한, 병원성이 거의 없는 바이러스이나 감염 시 세포를 파괴하는 현상 때문에 암치료제로 연구가 수행되어 왔으며(Shingn et al 1991., Modes et al, 1973., Taylor et al, 1971), 빠른 증식성 및 높은 역가의 바이러스를 생산할 수 있어 외부유전자를 발현할 수 있도록 생체 내 살아있는 전달벡터로서의 가능성에 더욱 관심을 갖고 있는 바이러스 중의 하나이다.
현재까지는 생바이러스의 병원성 유도 문제로 인하여 생바이러스 형태가 아닌 일반 세포 또는 동물에서 증식이 결손되는 리플리콘(replicon) 형태의 발현시스템을 통해 제조된 바이러스 벡터가 주로 개발되어 왔다. 그러나 이러한 바이러스 벡터는 실험실에서 일정 증식에 도움을 주는 특수한 세포가 필요한 경우이거나, 다른 바이러스 또는 발현 형태를 동시에 감염 또는 발현하는 경우라서 개발이 되어도 특수 상황에서만 배양이 가능한 한계를 보여 왔다. 그러나, 비병원성 생바이러스 형태로 제작이 된다면 바이러스의 성상에 따라 특성화되는 숙주영역 및 바이러스의 증식력 등의 특성은 생바이러스의 특성을 지니게 되므로 벡터로서 사용되는 바이러스가 병원성만 없다면 생바이러스 벡터의 사용은 리플리콘 형태의 불완전한 한계를 극복할 수 있을 것이다. 그러므로, 생바이러스를 이용한 벡터의 개발이 중요하며, 그 벡터를 이용한 시스템에서 외부 단백질을 발현하기 위한 절차가 상당히 복잡하고 까다롭다. 따라서, 쉬운 방법으로 외부 단백질이 발현되도록 하고 야외 바이러스가 오염되지 않도록 정확한 재조합 바이러스를 생산하는 시스템의 필요성이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 정상 소의 분변으로부터 분리되고 병원성이 거의 없는 것으로 알려진 소 엔테로바이러스 혈청형 1(LC-R4)을 이용하여(Kunin et al, 1985) 엔테로바이러스의 실험실에서의 숙주영역을 확인하고 생 바이러스를 이용한 유전자 전달벡터로서 가능한지 여부를 판단하기 위하여 실험실 내에서 재조합 실험 방법을 통해 재조합 바이러스를 생성시키는 실험을 수행하였고, 소 엔테로바이러스를 통해 외부 유전자를 전달, 발현하는 것이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 외부 유전자의 전달 또는 발현이 가능한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 각종 특이 프라이머(유전자 시발체)를 사용하는 유전자 중합효소반응법으로 증폭된 서열번호 7의 BEV1 DNA를 기초로 하여, 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 갖고, 소 엔테로바이러스의 구조단백질(VP1 내지 VP4)과 외부유전자 도입부(3D 뒷부분)에 외부도입 서열인 히스티딘 마커(6개의 히스티딘 아미노산 구성)를 포함하며, 도 1에 도시된 구조를 갖는 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제공한다.
또한 본 발명에서는 1) 소 엔테로바이러스의 RNA 유전자를 추출하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 추출한 RNA를 이용하여 서열번호 7의 cDNA를 작성하는 단계;
3) 상기 2) 단계에서 작성한 cDNA를 증폭시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계에서 증폭시킨 유전자의 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 도입하고, 외부도입서열 6개의 히스티딘을 도입하여 도 1에 도시된 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 재조합 소 엔테로바이러스를 클로닝 등의 번거로운 방법을 거치지 않고 손쉽게 제작하는 방법을 제공하였고, 실험실에서 유전자 증폭기 등 일반 실험 기구만으로도 간단한 방법으로 재조합 바이러스를 제작할 수 있었으며, 본 발명에서 제조한 바이러스 벡터는 감수성 동물인 소를 비롯하여 여러 축종에 상관없이 동일한 방식으로 적용이 가능할 수 있기 때문에 필요한 항원 단백질의 발현, 항암물질의 발현 또는 면역증강 효과 등을 갖고 있는 유전자를 발현시키는데 효과적인 활용이 가능하다.
먼저, 본 발명에서는 소 엔테로바이러스의 RNA를 추출하고 그 유전자를 기초로 한 특수한 프라이머를 이용하여 전체유전자를 DNA 형태로 증폭하였다. 또한 재조합 바이러스 형태로 3D와 융합된 단백질로서의 재조합 바이러스를 제공함으로써 원래의 바이러스를 오염시키지 않고 새로운 바이러스 제작을 원활히 할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명자들은
(1) 소 엔테로바이러스의 유전자를 추출하는 단계;
(2) 상기 추출된 유전자를 이용하여 서열번호 7의 cDNA를 작성하는 단계;
(3) 상기 작성된 cDNA와 특수 프라이머를 이용하여 바이러스 DNA를 많은 양으로 증폭하는 단계;
(4) 증폭한 바이러스 유전자를 세포에 도입하는 단계;
(5) 도입된 세포에서 바이러스가 회복되는 것을 확인하는 단계; 및
(6) 확인된 바이러스가 단백질을 제대로 발현하는지 여부를 확인하는 단계;
를 거쳐 본 발명에서 사용한 소 엔테로바이러스가 생 바이러스 벡터 제조에 적합한 것임을 확인하였고, 이를 기초로 하여 본 발명에 의한 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 소 엔테로바이러스를 이용하여 제작한 재조합 바이러스 벡터 및 야외바이러스와는 구분되는 마커 유전자가 삽입된 재조합 바이러스를 이용하여 손쉽게 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 생체 내에서 필요한 유전자를 전달하거나 항원을 발현시키기 위하여, 동물 및 사람에서 병원성이 없는 안전한 소 엔테로바이러스 혈청형 1 바이러스의 전체유전자를 확보하고 그 확보된 전체유전자를 실험실 내에서 증폭하여 재조합 바이러스를 손쉽게 제작하는 방법에 관한 것이며, 그 중 마커 유전자인 꼬리 단백질(tag protein)의 일부 유전자를 삽입하여 재조합 바이러스만을 선택적으로 살아나오게 제작하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 재조합 바이러스 벡터의 제조방법은 재조합 소 엔테로바이러스를 클로닝 등의 번거로운 방법을 거치지 않고 손쉽게 제작하는 방법으로서, 실험실에서 유전자 증폭기 등 일반 실험 기구만으로도 간단한 방법으로 재조합 바이러스를 제작할 수 있으며, 감수성 동물인 소를 비롯하여 여러 축종에 상관없이 동일한 방식으로 적용이 가능할 수 있기 때문에 필요한 각종 항원 단백질의 발현, 항암물질의 발현 또는 면역증강 효과 등을 갖고 있는 유전자를 발현할 경우 효과적인 활용이 가능할 것이다.
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 실시예에서 본 발명에 의한 소 엔테로바이러스 재조합 벡터는 도 1에 도시된 개열지도의 구성을 갖는 것일 수 있다. 도 1에 도시된 소 엔테로바이러스 재조합 벡터는 유전자 중합효소반응을 이용하여 증폭된 서열번호 7의 BEV1 DNA를 기초로 하여, 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 갖고, 소 엔테로바이러스의 구조단백질(VP1 내지 VP4) 및 외부유전자 도입부(3D 뒷부분)에 히스티딘 마커(6개의 히스티딘 아미노산 구성)를 포함한다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 본 발명에 의한 소 엔테로바이러스 재조합 벡터는 도 2에 도시된 개열지도의 구성을 갖는 것일 수 있다. 도 2에 도시된 소 엔테로바이러스 재조합 벡터는 유전자 중합효소반응을 이용하여 증폭된 서열번호 7의 BEV1 DNA를 기초로 하여, 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 갖고, 소 엔테로바이러스의 구조단백질(VP1 내지 VP4) 및 외부유전자 도입부(3D 뒷부분)에 히스티딘 마커(6개의 히스티딘 아미노산 구성)와 루미오(lumio) 서열이 첨가되고 SwaI 제한효소부위를 포함한다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터에 삽입 가능한 외부 유전자로는 당업계에서 통상적으로 사용하는 GFP(Green fluorescent protein) 및 루시퍼라아제(luciferase)를 포함하는 유용한 마커유전자; 항암물질로 알려진 인터류킨, 인터페론; 및 구제역 방어항원 및 돼지의 장감염증 방어항원을 포함하는 외래성 면역항원을 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 하기 단계들을 거쳐 도 1에 도시된 재조합 소 엔테로바이러스 벡터의 제조방법에 관한 것이다:
1) 소 엔테로바이러스의 RNA 유전자를 추출하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 추출한 RNA를 이용하여 서열번호 7의 cDNA를 작성하는 단계;
3) 상기 2) 단계에서 작성한 cDNA를 증폭시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계에서 증폭시킨 유전자의 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 도입하고, 외부유전자 및 6개의 히스티딘을 도입하는 단계.
상기 3) 단계에서는 2) 단계에서 작성한 cDNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6 중 한 쌍의 프라이머를 사용하여 94℃에서 2분간 초기 변성반응(denaturation)을 거치고, 94℃에서 30초간 변성반응(denaturation)을 거친 후 68℃에서 15분간 결합반응(annealing)과 연장반응(extension)을 동시에 수행하는 사이클을 14회 거친 다음, 94℃에서 30초간 변성반응(denaturation), 68℃에서 15분, 매 반응 회마다 15초씩 시간을 연장하여 결합반응(annealing)과 연장반응(extension)을 동시에 수행하는 사이클을 16회 거쳐 cDNA를 증폭시킬 수 있다.
또한 상기 4) 단계에서, 증폭시킨 유전자의 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 도입하고, 6개의 히스티딘-루미오 마커 및 SwaI 제한효소부위를 도입하여 도 2에 도시된 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 소 엔테로바이러스의 실험실 내 각 축종별 세포에서의 증식능 확인
소 엔테로바이러스의 숙주 영역을 알아보기 위하여 각종 세포에서의 바이러스 증식력을 측정하였다. 먼저, 소 신장 세포(MDBK: Madin-Darby bovine kidney), 돼지 신장 세포(IBRS-2), 햄스터 신장세포(BHK-21), 사람 배아 신장세포(293A), 마 우스 골수종 세포(SP2), 흑염소 태아폐 세포(BgFL), 개 신장 세포(MDCK) 및 흑염소 신장 세포(BGK)를 준비하였다. 각 세포는 3×106 TCID50/㎖으로 96 웰 플레이트에 준비하였고, 소 엔테로바이러스 혈청형 1 및 2를 200 TCID50/0.1 ml가 되도록 접종하였다. 접종한 후 2일에서 3일 동안 세포변성 효과를 관찰하였고, 그 상층액을 3.5×106의 소 신장 세포(MDBK: Madin-Darby bovine kidney), 돼지 신장 세포(IBRS-2), 햄스터 신장세포(BHK-21), 사람 배아 신장세포(293A), 마우스 골수종 세포(SP2), 흑염소 태아폐 세포(BgFL), 개 신장 세포(MDCK) 및 흑염소 신장 세포(BGK)가 주입된 96 웰 플레이트에 접종하여 역가를 조사하였으며, 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다. 바이러스 역가는 어린 햄스터 신장세포(BHK/T7-9, T7 RNA 폴리머라제를 지속적으로 발현하는 세포)에서 결정되었다.
도 3a는 여러 축종 유래의 숙주세포에서 소 엔테로바이러스 혈청형 1의 증식능을 보여주는 그래프이며, 도 3b는 여러 축종 유래의 숙주세포에서 소 엔테로바이러스 혈청형 2의 증식능을 보여주는 그래프이다. 상기 도 3a 및 3b의 결과를 통하여 본 발명에서 사용한 소 엔테로바이러스가 소, 돼지 및 햄스터 유래 세포에서는 강력한 증식력을 보였고, 마우스 및 염소 유래 세포에서는 그 증식력이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 결과들은 본 발명에 의한 소 엔테로바이러스가 소, 돼지 및 햄스터 등의 축종에 적용이 가능하다는 것을 암시한다.
[실시예 2] 소 엔테로바이러스 전체 유전자 증폭
소 엔테로바이러스는 미국 ATCC(American Tissue Culture Collection)에서 구입한 LC-R4주(혈청형-1) 및 M2주(혈청형-2)를 사용하였고, RNA 추출은 미니킷트(미국 캘리포니아주 칼스배드(Carlsbad) 소재, 인비트로젠)를 이용하여 추출하였다. 추출한 RNA는 슈퍼스크립트 킷트(SuperScript III RT kit; 인비트로젠)를 이용, 올리고 dT(oligo dT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 중합효소연쇄반응(PCR)은 킷트(LA Taq Polymerase Mix; 일본 소재, 타카라(TaKaRa))를 이용하여 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 4의 프라이머 쌍으로 각각 증폭하였다. 프라이머 내부에는 사용한 벡터와 결합할 수 있도록 제작되었다.
소 엔테로바이러스 유전자를 증폭하기 위해 사용된 올리고 프라이머
서열번호 프라이머 프라이머방향 서열 (5' → 3') 목적서열
바이러스
1 PacT7BEV1F2 전향 GTTAATTAA (a) TAATACGACTCACTATA GGG (b)TTAAAACAGCCTGGGGGTTGTACCCA 소 엔테로바이러스1형
2 PacBEV1pAR2 후향 GTTAATTAA (a)TTTTTTTTTTTTTTTTACACCCCATCCGGTGGGTGTATTCGGG 소 엔테로바이러스1형
3 PacT7BEV2F2 전향 GTTAATTAA (a) TAATACGACTCACTATA GGG (b)TTTAAACAGCCTGGGGG 소 엔테로바이러스2형
4 PacBEV2pAR2 후향 GTTAATTAA (a)TTTTTTTTTTTTTTTTACACCCCATCCGGCGGGTGTA 소 엔테로바이러스2형
5 BEV1.6X.his 후향 ACACCCCATCCGGTGGGTGTATTCGGGCCAAATTGAAGCTAATTAAACCGGATCATCAAGTTGGCAATTTAATGGTGATGGTGATGATG (c) GAAAGAGTCGTACCATTTCCTCTCGAGTGCCTTA 6-His 서열만을 포함하는 소 엔테로바이러스 1형
6 BEV1HLSR 후향 TTTTTTTTTTACACCCCATCCGGTGGGTGTATTCGGGCCAAATTGAAGCTAATTAAACCGGATCATCAAGTTGGCAATATTTAAATT (d) TTA GCAACAGCCAGGACAACA (e) ATGGTGATGGTGATGATG (c) GAAAGAGTCGTACCATTTCCTCTCGAGTGCCTTA 6-His 및 루미오(Lumio) 서열을 포함하는 소 엔테로바이러스 1형
(a) 밑줄은 PacI 제한효소인식 부위.
(b) 밑줄은 구아닌(Guanine)을 나타냄
(c) 6×히스티딘(histidine).
(d) SwaI 제한효소 인식부위
(e) 루미오-Tag 염기서열
* 이탤릭체는 T7 RNA 폴리머라제 결합부위를 표시함.
상기 증폭과정을 보다 자세히 살펴보면, LA Taq(타카라) 1 ㎕, 10×완충액(free) 5 ㎕, 25 mM MgCl2 5 ㎕, dNTP 혼합물 8 ㎕, 프라이머는 10 pmoles로 희석하여 각각 1 ㎕, 추출된 바이러스(BEV-1과 BEV-2)의 cDNA 1 ㎕를 각각 사용하여 모두 50 ㎕가 되도록 하였다. 유전자 중합 효소연쇄반응 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성반응(denaturation)을 하였고, 14회와 16회로 두 번으로 나누어 증폭하였고, 첫 번째 반응에서는 94℃에서 30초간 변성반응(denaturation)을 거치고 68℃에서 15분간 결합반응(annealing)과 연장반응(extension)을 동시에 수행하였다. 두 번째 반응은 94℃에서 30초간 변성반응(denaturation), 68℃에서 15분, 매 반응 회마다 15초씩 시간을 연장하여 결합반응(annealing)과 연장반응(extension)을 동시에 실시하였다.
도 4는 소 엔테로바이러스의 혈청형 1(2 레인: 서열번호 7) 및 혈청형 2(4 레인)의 유전자를 PCR로 한번에 증폭한 후 그 유전자 산물을 전기영동한 결과를 보여준다. 도 4의 결과를 통하여 증폭된 유전자들의 크기가 모두 약 7.3 kb임을 확인하였고, 현재까지 알려진 소 엔테로바이러스 혈청형에 해당되는 2종의 바이러스(혈청형 1 및 2)의 전체 유전자가 모두 성공적으로 증폭된 것을 확인하였다.
[실시예 3] 히스티딘 꼬리가 삽입된 재조합 바이러스 제작
히스티딘 유전자를 삽입하기 위하여 상기 실시예 2에서 증폭한 서열번호 7의 소 엔테로바이러스 혈청형 1의 유전자에 상기 표 1에 기재된 서열번호 5의 6개의 히스티딘 유전자가 삽입된 후향프라이머를 이용하였다. 즉, 증폭된 실시예 2의 바이러스 유전자와 6×히스티딘이 증폭된 산물을 연결하기 위하여 6×히스티딘 산물을 BEV-1의 끝 부분인 3D 부분과 연결하기 위한 3D의 일정 염기서열이 포함된 서열번호 5의 후향프라이머로 증폭하였다. 마지막 중합 효소연쇄반응 단계로 바이러스의 유전자와 6×히스티딘의 유전자를 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 반응하여 서열번호 8의 증폭산물을 얻었다.
또한 히스티딘 및 루미오(lumio-Tag) 꼬리가 동시에 삽입된 재조합 바이러스 제작을 위하여 T7 RNA 폴리머라제 결합 부위가 삽입되어 있는 프라이머 전향방향의 서열(표 1)과 서열번호 6의 히스티딘(histidine) 및 루미오(lumio-Tag) 꼬리서열을 삽입한 후향 서열을 이용하여 상기 실시예 2와 같이 바이러스 유전자를 증폭하여 서열번호 9의 증폭산물을 얻었다. 증폭된 유전자를 세포에 실시예 5와 같이 형질도입하여 바이러스를 얻었다.
[실시예 4] 새로운 재조합 바이러스의 제작방법
새로운 재조합 바이러스 제작은 그 바이러스의 RNA를 새로운 바이러스 제작을 위한 RNA 및 cDNA 합성의 주형으로 이용하였다. 새로운 프라이머(원하는 유전자는 프라이머 합성에 의한 방법으로 고안 또는 연쇄중합효소에 의한 증폭 후 리가제(ligase)에 의해서 유전자를 연결하는 작업을 실시하여 고안)에 의하여 외부 유래 단백질 코딩 유전자서열을 삽입되도록 고안된 서열이 삽입되도록 프라이머 또는 유전자 단편을 삽입하도록 디자인한 후, 재조합 바이러스 이외의 바이러스가 오염되지 않도록 증폭된 유전자가 전체서열임을 유전자의 사이즈(약 7.3 kb)로 확인하여 증폭산물을 점검하고, 히스티딘-루미오가 삽입된 유전자 뒤쪽에 삽입된 제한효소인 SwaI으로 처리하였다. 따라서 원래의 재조합 바이러스 이외에는 바이러스가 회복되어 혼입되는 것을 방지하였다.
도 5a 및 5b는 소 엔테로바이러스의 유전자 5’부위에 G의 부가되는 수를 차등화하여 1개에서 5개를 삽입하여 바이러스의 역가를 측정한 결과로서, 도 5a는 구아닌 수에 따른 바이러스 역가의 차이를 보여주고, 도 5b는 구아닌 수에 따른 바이러스 플라크의 수를 보여준다. T7 RNA 폴리머라제(polymerase) 결합 부위와 바이러스 유전자의 시작부위에서 구아닌의 첨가 및 반복서열이 중요한 것으로 확인되었으며, 그 구아닌의 반복서열이 3개인 것이 가장 재조합 바이러스로 회생가능성이 뛰어난 것으로 확인되어 구아닌의 3개 반복인 서열을 인위적으로 삽입하는 것이 중요하다.
[실시예 5] 증폭된 바이러스 유전자의 형질도입
바이러스의 중합효소 연쇄반응 산물은 아가로스 겔에서 증폭여부(약 7.3Kb)를 확인하고, 햄스터 신장 유래주인 어린햄스터 신장세포(BHK/T7-9)를 6 웰 플레이트로 준비하여 형질도입 반응을 실시하였다.
유전자의 형질도입은 먼저 실험 전날 5×106의 어린 햄스터 신장 세포(BHK/T7-9)를 6 웰 플레이트에 부착하고 다음날 90% 이상의 단일층이 형성되면 유지배지(Opti-MEM; 스코틀랜드 소재, GIBCO, BRL) 2 ㎖로 배지를 교환하였다. 그 다음 두 개의 1.5 ㎖ 시험관 내에 유지배지(Opti-MEM; GIBCO, BRL) 250 ㎕를 분주하고, 각각의 시험관 내에 서열번호 7의 바이러스(BEV-1) 증폭 유전자 산물 10 ㎕와 리포펙타민(Lipofectamine 2000; 인비트로젠)을 10 ㎕ 혼합한 후, 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 후 두 개의 시험관을 혼합한 다음, 상온에서 20분간 반응시켰다. 그리고 준비해 둔 6 웰에 넣었다. 37℃ 탄산가스 인큐베이터에서 배양시키고, 최초 형질도입한지 4시간 후 소혈청(FBS 5%; GIBCO, BRL)과 유지에 사용되는 항생제가 포함된 배지(D-MEM; GIBCO, BRL) 2.5 ㎖로 교환해 주었다. 그 후 2일에서 3일 동안 세포변성 효과를 관찰하였다.
증폭된 6×히스티딘 유전자가 포함된 서열번호 8 및 9의 증폭산물도 유사한 방법으로 형질도입을 실시하였다. 어린 햄스터 신장세포(BHK/T7-9)에서 증폭된 서열번호 8 및 9의 바이러스 전체유전자를 위와 같이 도입하는 방법으로 실시하였다. 세포변성 효과가 확인된 후 그 웰의 상층액을 종독(seed virus)으로 이용하여 바이러스를 제작하였다. 소 신장 유래주인 소 신장유래(MDBK) 세포 175 ㎠ 배양접시에 80% 정도 단층이 형성되도록 준비하였다. 배지 성분은 배지(D-MEM; GIBCO, BRL)에 10% 소 태아혈청(GIBCO, BRL)과 항생제가 포함되도록 하였다. 소 신장유래(MDBK) 세포에서 6×히스티딘 및 6×His-루미오 마커가 포함된 재조합 바이러스를 계대하여 바이러스를 각각 배양하였다. 그 감염 세포는 웨스턴블롯을 위해 -70℃에 보관하였다.
[실시예 6] 면역염색법에 의한 단백질 발현의 확인
6웰 플레이트에 5×106의 어린 햄스터 신장세포(BHK/T7-9) 세포를 준비하여 단층이 형성되었을 때, 상기 실시예 5에서 배양한 5×107의 바이러스를 각각 접종한 후 세포변성 효과가 50% 이상 보이면 배지를 제거한 다음 80% 아세톤 1 ㎖를 넣고 실온에서 5분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 5분 후에 웰에 있는 80% 아세톤을 버리고 37℃에서 30분 정도 건조하였다. 고정된 6 웰 플레이트에 각각 마우스 항히스티딘(mouse anti-histidine; 인비트로젠) 항체를 인산완충용액(PBS)에 3,000배 희석하여 각 웰에 1 ㎖씩 넣어 준 다음 1시간 반응하였다. 반응 후 PBS로 3회 세척한 다음 항마우스 형광(anti-mouse FITC; 인비트로젠) 항체를 인산완충용액(PBS)에 50배 희석하여 각 웰에 1 ㎖씩 넣어준 후 1시간 반응시킨 다음 인산완충용액(PBS)으로 3회 세척한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다. 또한 루미오의 발현은 루미오 그린(인비트로젠) 시약을 30분 동안 실온에서 반응하고 형광현미경으로 관찰하였다.
도 6a 및 6b는 간접형광항체법을 통하여 본 발명의 소 엔테로바이러스가 6×히스티딘(histidine)과 융합된 소 엔테로바이러스 폴리머라제(3D 단백질)를 발현하는 결과의 도면이다. 사용된 항체는 항히스티딘-형광(anti-histidine-FITC) 항체로서 폴리머라제(3D 단백질)에 융합된 형태로 발현된 형광물질로 염색된 마커단백질이다. 도 6a는 히스티딘만 삽입된 바이러스에서 검출되었으며, 도 6b는 히스티딘-루미오(lumio)에서 발현되는 루미오 융합단백질을 형광에서 발현되는 것을 형광현미경으로 검출한 것이다.
[실시예 7] 전기영동에 의한 정확한 단백질의 발현 확인
소 신장유래(MDBK) 세포의 175 ㎠ 배양플라스크에 감염시킨 후 수확한 세포를 용해완충용액(lysis buffer)과 초음파(sonication)를 이용하여 분쇄시킨 다음 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 사용하였다. 단백질 분석은 SDS(sodium dodecyl sulface) 12% 폴리아크릴아미드 겔(polyarylamide gel; 인비트로젠)에서 220 볼트(volt)로 70분간 전기영동을 실시하였고, 겔의 단백질을 전기영동을 통해 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 부착시켰다. 그리고 항히스티딘항체(anti-histidine antibody; 인비트로젠)를 5% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 완충용액(PBST)에 2,000배로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 완충용액(PBST)으로 10분간 3회 세척한 다음, 항히스티딘 퍼옥시다제(anti-histidine HRP) 항체(인비트로젠)를 5% 스킴 밀크가 포함된 완충용액(PBST)에 5,000배 희석하여 넣어준 후 상온에서 1시간 반응시킨 다음 완충용액(PBST)으로 10분간 3회 세척하였다. 발색제(Opti-CNTM Substrate kit; 미국 캘리포니아주 소재, BIO-RAD)를 이용하여 상온에서 30분간 반응시켜 발색하였다.
도 7은 웨스턴블롯팅법을 통하여 소 엔테로바이러스 3D 단백질과 융합된 형태인 6×히스티딘을 검출한 결과의 도면이다. 1차 항체로는 항 히스티딘(anti-histidine) 항체와 2차 항체로는 항 마우스 호스레디쉬 퍼옥시다제(anti-mouse HRP)를 염색하고 발색하여 약 52 kDa의 단백질이 발현되는 것으로 확인하였다. 이는 본 발명에 의한 발현 벡터가 마커 꼬리 단백질인 루미오와 히스티딘 단백질을 공동으로 발현시킬 수 있음을 확인한 것이며, 이 결과를 통해 본 발명에 의한 발현 벡터를 이용하여 기타 다른 융합단백질의 발현 역시 가능하다는 것을 알 수 있었다.
도 1은 6X 히스티딘 마커서열이 삽입된 소 엔테로바이러스의 게놈 모식도이다.
도 2는 6X 히스티딘, 루미오 마커발현 부위 및 제한효소(Sal I) 절단부위가 삽입된 소 엔테로바이러스 게놈 모식도이다.
도 3a 및 3b는 소 엔테로바이러스의 숙주 영역을 알아보기 위하여 각종 세포에서의 바이러스 증식력을 측정한 결과로서, 도 3a는 소 엔테로바이러스 혈청형 1의 증식력을, 도 3b는 소 엔테로바이러스 혈청형 2의 증식력을 각각 보여준다.
도 4는 소 엔테로바이러스의 유전자를 유전자 연쇄반응법에 의하여 한번에 증폭하여 전기영동하여 나타낸 도면이다.
도 5a 및 5b는 소 엔테로바이러스의 유전자 5’-영역에 부가된 구아닌(G)의 수를 1-5개로 차등화하여 삽입한 후 바이러스의 역가를 측정한 결과로서, 도 5a는 역가별 차이를, 도 5b는 바이러스 플라크의 수를 각각 보여준다.
도 6a 및 6b는 간접형광항체법을 통하여 본 발명의 소 엔테로바이러스가 6X 히스티딘과 융합된 소 엔테로바이러스 3D 단백질을 발현하는 결과를 보여준다(6X 히스티딘 유전자를 발현하는 재조합 소 엔테로바이러스의 소 유래 신장세포(MDBK)에서 보이는 세포변성 효과와 6X 히스티딘 항체에 의한 형광항체염색).
도 7은 웨스턴블롯팅법을 통하여 소 엔테로바이러스 3D 단백질과 융합된 형태인 6X 히스티딘을 검출한 결과를 보여준다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research) <120> Recombinant viral vector using Bovine enterovirus and the method for producing thereof <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PacT7BEV1F2 primer <400> 1 gttaattaat aatacgactc actatagggt taaaacagcc tgggggttgt accca 55 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PacBEV1pAR2 primer <400> 2 gttaattaat tttttttttt tttttacacc ccatccggtg ggtgtattcg gg 52 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PacT7BEV2F2 primer <400> 3 gttaattaat aatacgactc actatagggt ttaaacagcc tggggg 46 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PacBEV2pAR2 primer <400> 4 gttaattaat tttttttttt tttttacacc ccatccggcg ggtgta 46 <210> 5 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BEV1.6X.his primer <400> 5 acaccccatc cggtgggtgt attcgggcca aattgaagct aattaaaccg gatcatcaag 60 ttggcaattt 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gctgttgcta aaatttaaat attgccaact tgatgatccg 7440 gtttaattag cttcaatttg gcccgaatac acccaccgga tggggtgtaa aaaaaaaaaa 7500 aaaattaatt aac 7513

Claims (7)

  1. 서열번호 7의 BEV1 DNA를 기초로 하여 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 갖고, 소 엔테로바이러스의 구조단백질(VP1 내지 VP4)및 외부유전자 도입부(3D 뒷부분)에 히스티딘 마커(6개의 히스티딘 아미노산 구성)를 포함하며, 도 1에 도시된 구조를 갖는 재조합 소 엔테로바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 외부유전자 도입부(3D 뒷부분)에 히스티딘 마커 대신에 6×His-루미오가 삽입되고, SwaI 제한효소부위를 더 갖는 도 2에 도시된 구조를 갖는 것임을 특징으로 하는 재조합 소 엔테로바이러스 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 외부유전자는 GFP(Green fluorescent protein) 및 루시퍼라아제(luciferase)를 포함하는 유용한 마커유전자; 항암물질로 알려진 인터류킨, 인터페론; 및 구제역 방어항원 및 돼지의 장감염증 방어항원을 포함하는 외래성 면역항원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 재조합 소 엔테로바이러스 벡터.
  4. 1) 소 엔테로바이러스의 RNA 유전자를 추출하는 단계;
    2) 상기 1) 단계에서 추출한 RNA를 이용하여 서열번호 7의 cDNA를 작성하는 단계;
    3) 상기 2) 단계에서 작성한 cDNA를 증폭시키는 단계; 및
    4) 상기 3) 단계에서 증폭시킨 유전자의 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 도입하고, 외부유전자 및 6개의 히스티딘을 도입하여 도 1에 도시된 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 4) 단계에서 증폭시킨 유전자의 5’- 및 3’- 말단에 PacI 제한효소부위를 도입하고, 외부유전자, 6×His-루미오 마커 및 SwaI 제한효소부위를 도입하여 도 2에 도시된 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조하는 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 3) 단계에서는 2) 단계에서 작성한 cDNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2; 1 및 5; 1 및 6; 또는 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하여 94℃에서 2분간 초기 변성반응(denaturation)을 거치고,
    94℃에서 30초간 변성반응(denaturation)을 거친 후 68℃에서 15분간 결합반응(annealing)과 연장반응(extension)을 동시에 수행하는 사이클을 14회 거친 다음, 94℃에서 30초간 변성반응(denaturation), 68℃에서 15분, 매 반응 회마다 15초씩 시간을 연장하여 결합반응(annealing)과 연장반응(extension)을 동시에 수행하는 사이클을 16회 거쳐 cDNA를 증폭시키는 것임을 특징으로 하는 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조하는 방법.
  7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 외부유전자는 GFP(Green fluorescent protein) 및 루시퍼라아제(luciferase)를 포함하는 유용한 마커유전자; 항암물질로 알려진 인터류킨, 인터페론; 및 구제역 방어항원 및 돼지의 장감염증 방어항원을 포함하는 외래성 면역항원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 재조합 소 엔테로바이러스 벡터를 제조하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559754A (zh) * 2011-12-23 2012-07-11 中国科学院武汉病毒研究所 带有荧光素酶标签的ev71型全长感染性克隆的制备方法及应用
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