CN115058397A - 一种牛肠道病毒分离株及其应用 - Google Patents

Abstract

一种牛肠道病毒分离株及其应用，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovine enterovirus（BEV），该病毒已于2020年7月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。本发明中的病毒HB1901可在MDBK细胞中高效增殖，病毒浓度可达10^6.0TCID₅₀/mL，无外源病毒污染；所构建的感染性克隆质粒可直接转染至真核细胞中，无需转录成RNA后再转染，操作简便，成本低廉；携带外源绿色荧光蛋白GFP，并可在细胞中稳定表达。

Description

一种牛肠道病毒分离株及其应用

技术领域

本发明属于病毒分子生物学和基因克隆技术领域，具体涉及一种牛肠道病毒分离株及其应用。

背景技术

牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，近年来在中国牛场中广泛传播。牛肠道病毒感染与牛的腹泻和呼吸道疾病相关。本发明中选用的牛肠道病毒HB1901毒株是在河北某牧场爆发严重腹泻的牛群中分离出来的，经基因分析后发现其属于BEV-F型。由于牛肠道病毒致病力较低，且稳定性好，是构建病毒载体的理想毒株。此外反向遗传系统是研究病毒复制机制、致病机理和疫苗研发的重要工具。

BEV的反向遗传方面，2013年于力等人通过在5’端引入T7 RNA聚合酶进行细胞外转录，构建了牛肠道病毒cDNA感染性克隆。随后在牛肠道病毒VP1基因B-C loop和D-E loop中分别插入口蹄疫病毒(O型)的保守中和表位8E8，得到的重组病毒可以拯救成功，并且可以稳定传代。肌肉接种小鼠后，可在小鼠体内引起抗口蹄疫病毒的IgG抗体，该结果表明BEV可作为疫苗载体。此外张海丽等人，张姗等人以及刘丹等人均通过引入T7启动子构建了BEV的反向遗传操作系统。在已有的BEV感染性克隆中都是以T7启动子体外转录的操作系统，而本发明中构建的系统是基于CMV真核表达启动子的，该系统的优势在于不需要在体外将质粒转录成RNA后再转染至细胞，可直接将质粒转染至细胞中，此操作过程大大简便且极大地节约了成本。此外，本发明是国内外首次成功将绿色荧光蛋白GFP插入到BEV中，这不仅可以对病毒进行可视化分析，同时也表明BEV可容纳更大的外源基因片段，这对研发BEV 的基因工程疫苗提供了支持。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种牛肠道病毒分离株及其应用，为研究BEV复制机制、致病机理和疫苗研发提供了重要工具，还可为其他肠道病毒属或者RNA病毒的反向遗传学系统的构建和研究提供科学参考。

技术方案:一种牛肠道病毒分离株HB1901，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovine enterovirus(BEV)，该病毒已于2020年7月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

上述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，序列如SEQ ID NO.1所示。

上述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，所述病毒的基因序列中插入有GFP。

含有上述牛肠道病毒分离株HB1901的载体。

上述牛肠道病毒分离株HB1901基因翻译的氨基酸序列，序列如SEQ ID NO.2所示。

含有上述载体的重组菌或重组细胞。

上述重组细胞为牛肾细胞。

上述牛肠道病毒分离株HB1901在构建病毒载体中的应用。

具体内容为：

1、从牛粪便样品中分离出牛肠道病毒。

2、对病毒粒子进行电镜观察(图1)。

3、在感染病毒的细胞上清液中提取BEV的基因组。

4、通过PCR扩增了覆盖整个病毒基因组的三个片段，然后组装到低拷贝载体pBluescript skII。同时在病毒基因组5'端有CMV启动子，此元件主要用于在真核细胞中启动DNA转录。随后在此基础上，在基因组5’UTR和VP4基因之间利用SOE PCR引入外源绿色荧光蛋白GFP，构建了p-GFP-HB1901的全长感染性克隆(图2图3)。

5、将构建好的重组质粒进行全长测序，与原毒株HB1901全长序列相比发现存在6个核苷酸突变(表1)。随后将质粒转染至BHK-21细胞中，转染后48h即可见到绿色荧光(图4)，测定病毒滴度达到10^5.1TCID50/mL。转染得到的重组病毒r-GFP-HB1901在BHK-21细胞中传代三次后得到第三代病毒，提取病毒上清RNA并进行测序，未发现新的突变，表明 r-GFP-HB1901重组病毒可以在细胞中传代后保持遗传稳定。

表1

6、将重组的r-GFP-HB1901病毒和原毒株HB1901在MDBK细胞中进行噬斑试验，发现重组病毒在体外感染细胞系后，滴度略低于亲代病毒(图5)。

7、将重组的r-GFP-HB1901病毒在BHK-21细胞中的复制曲线和亲代病毒在细胞上的复制曲线进行比较，发现重组病毒在体外感染细胞系后，病毒的复制效率略低于亲代病毒(图 9)。

有益效果：本发明中的病毒HB1901可在MDBK细胞中高效增殖，病毒浓度可达10^6.0TCID₅₀/mL，无外源病毒污染；所构建的感染性克隆质粒可直接转染至真核细胞中，无需转录成RNA后再转染，操作简便，成本低廉；携带外源绿色荧光蛋白GFP，并可在细胞中稳定表达。

附图说明

图1为本发明中牛肠道病毒细胞病变图(左为细胞病变，右为阴性细胞)；

图2为本发明中病毒粒子电镜图(左为100nm电镜图，右为50nm电镜图)；

图3为本发明中感染性克隆构建示意图；

图4为本发明中PCR扩增图；(M为MARKER；1为CMV启动子；2为分段1；3为分段2；4为分段3；N为阴性对照)；

图5为本发明中克隆株绿色荧光表达图；

图6为间接免疫荧光图；

图7为Western Bloting图；

图8为空斑图(左图为亲本株，右图为克隆株)；

图9为克隆株与亲本株生长曲线图。

具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

构建方案：通过选择BstZ17 I和EcoR V这两个个酶切位点将整个病毒分为3个部分，利用同源重组的方式将3个片段连接在一起，随后通过重叠PCR在病毒5’端前引入CMV启动子。拯救成功后，在5’UTR和VP4基因之间插入GFP，最终得到p-GFP-HB1901全长感染性克隆。

实施例1

病毒的分离：自2019年河北省某牛场收集腹泻小牛的粪便标本，经处理后接种至牛肾传代细胞(MDBK)上，培养两代后细胞出现细胞病变，进一步空斑纯化后，获得牛肠道病毒 HB1901，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovine enterovirus(BEV)，该病毒已于2020年7 月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

病毒的序列分析：对该病毒的基因组序列进行分析，全基因序列为SEQ ID NO.1所示的序列(见序列表)，其与GenBank中已有的牛肠道病毒的序列相比，核苷酸的同源性在83％以上。

病毒的电镜检查：在电镜下观察牛肠道病毒HB1901，如图1所示，病毒颗粒直径范围在 25-30nm，表面无囊膜。

无菌、支原体检测：按照《中国兽药典》方法对该病毒进行无菌、支原体检查，结果表明无支原体和其它微生物污染。

病毒滴度检测：采用微量滴定法测定该株病毒的病毒浓度，采用方法如下：采用MDBK 细胞进行病毒滴度的测定。用96孔细胞培养板培养MDBK细胞，将病毒用细胞维持液从10^-1倍比稀释至10^-8，分别将每个稀释度的病毒液接种100μL/孔，每个稀释度接种8孔，将对数生长期的MDBK细胞稀释至2×10⁶个细胞/mL，每个细胞空中接种100μL，同时设细胞对照孔。置37℃，5％CO₂培养箱中培养，4-6天观察细胞感染病毒情况，计算病毒浓度，病毒浓度达10^6.5TCID₅₀/mL。

传代稳定性实验：将病毒HB1901在MDBK细胞上连续传代，每代进行细胞病变观察和 qRT-PCR检测，传代至20代，病毒培养仍可出现典型的细胞病变。qRT-PCR检测结果呈牛肠道病毒阳性，证实该病毒可稳定传代。

使用TRIzol法从病毒液中提取病毒RNA。取200μL病毒液加入无RNase EP管，加入750μL TRIzol试剂，轻轻混匀，室温孵育10分钟后，加入200μL氯仿，振荡混匀，室温静置 3分钟。4℃条件下，12000离心15分钟。取离心后上清至新的无RNase EP管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置10分钟。4℃条件下，12000rpm离心10分钟。弃去上清，加入l mL75％乙醇，振荡混匀后，4℃条件下，7500rpm离心5分钟。弃去上清，静置离心管等待RNA干燥后，加入20μL无RNase水。测定浓度后，在超低温冰箱保存。

取出Rnase free 0.2mL八连管每孔中分别加入1μL Oligo(dT)和Randomhexamers，再加入 6μL RNA模板，共8μL体系。取上0.2mL八连管短暂离心置于65℃水浴锅加热5min，后迅速置于冰上2min。在以上体系中加入10μL 2×RT Mix和2μL Hiscript EnzymeMix，构成20μL 体系。轻微震荡混匀短暂离心后进行反转录，程序为：25℃5min，50℃40min，85℃2min。反应结束得到的即为转录产物样品模板反cDNA，放于-20℃冰箱保存，备用。在病毒cDNA 基础上进行分段PCR，对PCR产物进行测序，根据测序结果组装完整病毒基因组序列。

转化质粒与扩增。取连接产物5μL，溶于100μL感受态DH5a细胞，冰浴30分钟。42℃热激45秒后置于冰上恢复2min，加无抗性LB培养基450μL，37℃220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心3分钟，留约100μL上清重悬菌体，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB 固体培养基上，37℃培养16小时。挑取单菌落，加入含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养16小时，用于菌落鉴定。对于pBluescript skII等质粒，取2μL 质粒，溶于100μL感受态细胞，冰浴30分钟。42℃热激45秒后置于冰上恢复2分钟，加无氨苄LB培养基450μL，37℃220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心3分钟，留约100μL 上清重悬菌体，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养16小时。挑取单菌落，加入含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养16小时，用于质粒提取。

细胞培养及转染。当细胞生长达到密度80％左右即进行传代。洗掉培养基后，用lmL PBS 溶液冲洗1次，弃PBS，加l mL 0.25胰蛋白酶，37℃静置2分钟。加2mL含10％FBS的培养基终止消化，按1:4比例传代，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。转染前将6孔板中每一孔的细胞完全培养基弃去，并用PBS进行清洗。将2μg质粒加入250μL Opti-MEM培养基，将5μL Lipofectamine 2000加入250μL Opti-MEM培养基，在室温条件下孵育10分钟。将含质粒的Opti-MEM培养基加入到含Lipofectamine 2000的培养基中，室温条件下孵育20分钟。将转染溶液加入到6孔板中，37℃下孵育6小时。弃去混有转染溶液的Opti-MEM培养基，每孔加入2mL含有2％FBS的DMEM培养基。

间接免疫荧光。进行间接免疫荧光测定法来检测BEV全长感染性克隆质粒转染的BHK-21细胞中的病毒蛋白表达。在6孔板中，用BEV全长感染性克隆质粒转染的BHK-21 细胞。在指定的时间点，吸取细胞上清，细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。在含有 1％BSA的PBS封闭缓冲液中温育1小时后，加入含有2％Anti-VP2小鼠多克隆抗体的封闭缓冲液，室温孵育2小时。吸去含有抗体的封闭缓冲液后，用PBS洗涤5分钟，共3次。加入含有2％Alexa Fluor 488抗小鼠IgG的封闭缓冲液，室温孵育1小时。吸去含有抗体的封闭缓冲液后，用PBS洗涤5分钟，共3次。在荧光显微镜下观察。

取拯救的重组毒p-GFP-HB1901与亲本病毒HB1901按1个MOI感染24h后的MDBK 细胞培养物进行SDS-PAGE电泳后，用半干转印法将蛋白转印到PVDF膜上。然后将PVDF 膜置于含有50g/L脱脂奶粉的PBS封闭液中封闭过夜，用PBS-T洗膜三次，每次5min；加入鼠抗HB1901-VP2(1:1000)作为一抗，室温孵育2h，用PBS-T洗三次，每次5min；再与HRP 标记的羊抗鼠Ig G为二抗，室温孵育1h用PBST彻底洗涤后进行成像系统分析。

噬斑形成实验。使用噬斑测定来确定BEV的感染性滴度。感染实验前24小时，将MDBK 细胞按照每孔2×10⁵铺到6孔板中。将含有病毒的培养物上清液在DMEM中连续稀释10倍，从10¹至10⁶倍。对于每种稀释液，将500μL稀释的病毒液加入培养至约90％汇合度的MDBK细胞的12孔板的孔中。将加有病毒液的细胞在37℃和5％CO₂条件下孵育2小时，并每15 分钟摇动孔板以确保病毒稀释液完全覆盖细胞单层以获得均匀感染。孵育后，用PBS洗涤细胞单层以去除未吸附的病毒后，每孔加入2mL含低熔点琼脂的培养基(2％低熔点琼脂糖和 2×DMEM 1:1混合)，并将孔板在37℃和5％CO₂条件下培养48-72h。每孔加入500μL结晶紫染色液对其进行固定并染色，并在室温下静置60分钟。用水轻轻冲洗掉琼脂。计数可见斑块，并据此计算病毒滴度。

将亲本毒和重组毒株按照0.05MOI分别接种于MDBK细胞上，37℃感作2h，用PBS洗去未吸附的病毒，加入含有2％FBS的DMEM培养基，再接毒后6，12，24，36和48h取样，反复冻融3次，收获病毒液，测定取样时间的病毒TCID50。并制作病毒的生长曲线。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种牛肠道病毒分离株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttgttccc acccctgggg cccacgcggc gccagtactc tggtacgtta gtacctttgt 60

acgcctgttt tcccttccct taaacaaatt aagattacca ctactgaggg gagtagtccg 120

actccgctcc agcactgctg caccagtgaa ttggtacgcc agtacctctg cacggagtag 180

atggtattcc cgccccgtaa cttagaagca aagcacataa ccgaccaata gcggcaccgc 240

atccagctgt gcaacggtca agcacttctg tctccccggt ctacaaggat cgttacccgc 300

ccgggccact acgagaagcc tattaactac tgaagcagtc tagaggttgc gcccaaccac 360

aaccccagtg gtagctctga gtgatggggc tcgcagttcc cccatggtaa catggttgct 420

tgcccgcgcg tgcactcggg ttcggccttg tgccgttcac ctcaaaactg tctaagtagc 480

caagagccta ttgtgctggt ctggttttcc tccggagccg tgaatgctgc taatcccaac 540

ctccgagcgt gtgcgcacaa tccagtgttg ctacgtcgta acgcgtaagt tggaggcgga 600

acagactact ttcggtactc cgtgtttcct ttgttttaat tctcaaactt tatggtgaca 660

attgttgaga tttgcaactt agcgacttta ccgttgaaca tcgccttgta ttacctagtt 720

gcattccaca agacttctaa tattcccagc ccttacattg atttgctagt ctttctcaac 780

ctcaagcaca aattggagaa gttaagatgg gagcacaagt gagcaagaac actgctggat 840

cccacaccac tggaacatat gccaccggtg gctccaacat ccactacact aacatcaatt 900

actatgagaa tgctgcttca aacagcttga acaagcagga tctaactcag gacccagaaa 960

agttcactag gcctgtggtt gatgtcatga aggaggcagc tgtccccctc aagagccctt 1020

ctgctgaagc ctgtggatac agtgacagag tggctcaatt gactctaggc aactccacca 1080

taacgaccca agaggcggcc aatattgtgg ttgcgtatgg taagtggcca acaacccttc 1140

gggatgatga tgctacggca gttgataagc ccaccgaacc cggggtcagc gctgaacgct 1200

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ccgacgctct caccgaattg gggatgttcg ggcaaaactt acagttccac tacctctaca 1320

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caaatccagg tgagaatggg tttcaattcc agtttccttt cacccttgag gatgggtcgg 1500

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attggacgct agcagttata cccctcgtgc ctcttatgta cgctgaggga tccaccacct 1680

acgttccaat cacagtcact atagcaccaa tgtgcactga gttcaatggg ttgaggagag 1740

cggtagcgca gggggttccc acaatgttca cacccggttc aggacaattt ctgactacgg 1800

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ctggtgaggt gaaaaacatt ctagagattg ttcaggttga gagccttgtc gaaatccaga 1920

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tggaccaaca aatcatggcg ctcagggtgg acccagggac caatgggcca ctgcagtcta 2040

ctctgcttgg tgtgttcact cgctactaca cgcagtggtc ggggtcgatt gaatttacgt 2100

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gcgggaccgc accaactagc aggagagagg caatgcttgg tactcacata gtatgggatt 2220

ttgggctcca gtcgtcaatc accctagtgg taccatggat ctcttcgggt catttccgcg 2280

cggcagacat caacgccaca ctctttaagt acaagtacta tgaggcggga tttgtaacta 2340

tgtggtacca gaccaacctc gtagtgccgc cccagttccc aaatgaggcg tccattctga 2400

tgtttgtggc agcacaaccc aatttctcaa tgcgcatcat gaaggaccga cctgagattg 2460

cccagaccgc ggctctccag ggcgagacgg gacttgcaat caaagatgct gttcataaaa 2520

ctgttaagga cacagtggaa tcccaccata ccattagcac agagagtacc cccgcgctac 2580

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atgtcgtcaa cacgcacggt gtggaggaga cctcgatcga ggcattcttc gggcgctctg 2700

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agtttgttca ggtacgcgca aaacttgaga tgttcacata tgtgcgcttt gacattgagc 2820

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tatccatccc cttcatgagc actgcgaatg cgtattcaat gtcctacgat gggtacgcaa 3060

cctttgatga caaggcgggt tcaaattatg gaatggtgcc atcaaattat cttggaacaa 3120

ttgtgtttcg cacaatggaa gatctcgacc gaaaactgct gaaggtgcgg ttttatgcca 3180

aaccgaagca tgtgcggtgt tggatcccac gcgctccacg cgcggtgccc tataaaagca 3240

ggtacactgg tgtctacgac accgttgaga agttctgtga caatcgtgct aatattaaaa 3300

cagcaggggc ttttggccaa caaagcgggg cggcctacgt cggaaactac aagatcatga 3360

accgacacct ggccgagaag caagactggg acaatcttgt gtgggattct tatgagaggg 3420

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ctagcctcgt tcatattgac aagaacggtt attaccctga gaggtaccag tcacacgtgg 3600

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gcgtgatggg gattcttacc gccggtggga ataacctggt ggcctttgca gatgttagag 3720

atcttctttg gattgaagat gatgttatgg agcaggggct tactgactat gttcaaagcc 3780

tgggcaacgc ctttggcgct ggtttcactg atgaaatttc caattacgtt ggtcaagtca 3840

gggacatgat gattgggagt gataccgtgg tggagaagat agttagaaat atcattaaac 3900

ttctttccgc cttagtcatt gtggtgagga accgtgccga catcatcact gtcaccgcca 3960

ctctgtctct cctcgggtgt tccggttcac cctggcgttg gttgaaatct aaaatttgct 4020

ccattctagg catcaatatg gcccaaaaac aggcagatag ctggatcaaa aagttcactg 4080

aggctgtgaa cgctttcaag ggactcgatt ggattgcagc taagttttcc aagttccttg 4140

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tgaggcagct cccgcttctt gaggcccaga ttaccactct cgaacattcc aatccgaacc 4260

aggagaccca ggagaccctg ttttcaaatg tacagtatct tgcccaccat tgtaggaaga 4320

acgccccact gtacgcagct gaggcccgca gggtcttcgc tctggagaag cgtgtgctgg 4380

gggcaatgca gttcaagacc aagaatcgaa ttgaacctgt ttgctgccta atccacggta 4440

ctccaggcac cggtaagtct cttgcaacca ccattattgg cagaaagatc gctgagtatg 4500

aaaacagcgg tgtctacagt ctaccacccg accctgatca ctttgatggt taccaagaac 4560

aggctgttgt gataatggat gatctccatc aaaacccaga tggtaaggat atgagcttat 4620

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gcaggctttt cacttccaag tatgtgcttg catcgacaaa cgccaaccac atccaccccg 4740

tcaccgtcgc tgatgggaaa gctcttcagc gcaggtttca ttttgacacc gatattgaga 4800

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aggattgctc acccatcaac ttccaaaagt gcatgccctt gatttgtgga aaggccctcc 4920

aactccgcag caagaaaggt gatggcatga ggtatagcat tgacaccatg atcacagaaa 4980

tgcgccgtga gtctgctagg cgttataaca ttggaaatgt gattgaggca cttttccagg 5040

gacccccgga gttcaagccc ctcaggatag atgtgagcga ggagaccccg gcaccgcctg 5100

ccatcgcaga tcttcttgct agtgtggact ccgaggaggt cagggagtat tgcagaagca 5160

agggctggat cgtgcaagag aaaattacca aggagagcct cgagcgcaac gtcaaccgtg 5220

ctctcattgt cctgcaatcg gcaactctta tcgcaaccat ttgtggtgtc atctacatag 5280

tgtacaaact gtttgcgggt ctccagggtc cctactctgg cattcacaca aattaccaaa 5340

aagtcaagcc cgttgtcaga caggtcacta cacaggggcc tctcgtggac ttcgctgttt 5400

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gcgtctacga cacttttatg gtgctcccca ggcacgccat ggctcacgat gaaatccaaa 5520

ttgatggaaa gacagtgaag attgaggatg cctacgatct caatgacacc acccaaactt 5580

ccctggagct aaccatcata aaacttaaac agaatgagag gtttagggat atcagggcaa 5640

tgatcccaga gaacatcacg gaaaccagtg aagccctggt tattgtgaac acctcggctt 5700

acccaaatct gttcatgccc gttggcgccg tcaaagatta cggctatctc aacctggccg 5760

gcagacccac ccaccgcacg ctgatgtaca actttccaac cagggctggg cagtgtggtg 5820

gtgttgccat ctctatgggc aaaatcattg gcatccacat cggtggaaac ggtgcgcaag 5880

gctttagcgc cgcgctcctg cgccgctatt tcacccaacc ccaaggggag attgagttca 5940

tggagaagag caaggacgcg ggctacccaa tcatcaatgc tcccacaagg accaagctcc 6000

accccagcgt cttttacgat gtgttcccag gagagaagga gccggccgtg ctacataaga 6060

aagatcccag gctagaggtg gactttgagg aagctctctt ctcgaagtac atcgggaata 6120

agcacatcgc tgttactgag gagatggaga tcgcaattga ccactacgca aatcaactta 6180

agcagttgga cattgacccc agccccatta gcatggagga tgccatttat ggaacagaag 6240

gtctggaggc tttggacctt ggtactagtg caggttaccc ctatgtagca ttgggaatta 6300

agaagaggga catcctcaac aaggagacgc gcgacgtctc caaaatgcaa cagtgcatag 6360

acaagtacgg gcttaacctt cccatggtca cttatgtgaa ggatgagctc cgctcaaagg 6420

agaaagtgaa gaagggcaaa agccggctca ttgaggcgtc gagtctaaac gactccgtcg 6480

cgatgagatg cgccttcgga aatctctata aggcatttca caccaaccct ggaaccctta 6540

ccgggtgcgc cgtgggttgc aatcctgaga ccttttggag caagattcct gtgatgatgg 6600

atggggagct ttttggcttt gactacacag cgtatgatgc cagtctctcc cctgtttggt 6660

ttcagtgtct atatctcctc cttgaaaaga taggattcgg gcactgcaag cattttattg 6720

accaactctg ctgctccaac catctattta tggacaaaag gtacgtcgtt gtcggcggca 6780

tgccttcagg ctgctcgggt actagcatct ttaacagcat gattaacaac atcataatta 6840

gaacactagt ccttacagtc tacaagaata ttgaccttga tgatctcaag atcatcgcat 6900

atggtgatga tgtgattgcc tcttacccgt tcgagctcga tgcaaaactg ctcgccgatg 6960

cggggaagag ctttggtctc atcatgacac caccagacaa aagtgcagag tttgttaaat 7020

tgacctggga taatgtgacc tttttgaaga ggtcgttcgt taaagacgag cgatttccat 7080

tccttatcca tccggttatg aagatgtcag atattcatga gtccatccgt tggaccaagg 7140

atgctaaatc tacccaggat catgttaggt ccctgtgtct attggcttgg cactgtggac 7200

aagaacagta tgaagaattt ctggagaaaa tccggagtgt gcccgtgggc cgggcacttt 7260

cgctgccttc ttttaaagca ctgcagcgct cctggtatga ctccttttaa ctctattcca 7320

atttgaatta tccggtctaa tcagattcta attggc 7356

<210> 2

<211> 2167

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Ala Gln Val Ser Lys Asn Thr Ala Gly Ser His Thr Thr Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Thr Gly Gly Ser Asn Ile His Tyr Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Glu Asn Ala Ala Ser Asn Ser Leu Asn Lys Gln Asp Leu Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Glu Lys Phe Thr Arg Pro Val Val Asp Val Met Lys Glu Ala

50 55 60

Ala Val Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Val Ala Tyr Gly Lys Trp Pro Thr Thr Leu Arg

100 105 110

Asp Asp Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Glu Pro Gly Val Ser

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Ala Glu Arg Phe Tyr Thr Leu Pro Ser Val Gln Trp Thr Gly Thr Phe

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Lys Gly Gln Phe Trp Lys Leu Pro Asp Ala Leu Thr Glu Leu Gly Met

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Phe Gly Gln Asn Leu Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Gly Gly Trp Ala

165 170 175

Ile His Val Gln Cys Asn Ala Thr Lys Phe His Gln Gly Thr Leu Leu

180 185 190

Val Val Ala Ile Pro Glu His Lys Ile Gln Ser Gln Gln Thr Pro Asp

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Phe Asn Lys Thr Asn Pro Gly Glu Asn Gly Phe Gln Phe Gln Phe Pro

210 215 220

Phe Thr Leu Glu Asp Gly Ser Ala Leu Gly Asn Ala Leu Val Tyr Pro

225 230 235 240

His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Leu Ile Leu

245 250 255

Pro Tyr Val Asn Ala Val Pro Met Asp Ser Gly Ile Arg His Asn Asn

260 265 270

Trp Thr Leu Ala Val Ile Pro Leu Val Pro Leu Met Tyr Ala Glu Gly

275 280 285

Ser Thr Thr Tyr Val Pro Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Thr

290 295 300

Glu Phe Asn Gly Leu Arg Arg Ala Val Ala Gln Gly Val Pro Thr Met

305 310 315 320

Phe Thr Pro Gly Ser Gly Gln Phe Leu Thr Thr Asp Asp Tyr Gln Ser

325 330 335

Pro Cys Ile Leu Pro Lys Phe Lys Pro Thr Pro Met Ile Asp Ile Pro

340 345 350

Gly Glu Val Lys Asn Ile Leu Glu Ile Val Gln Val Glu Ser Leu Val

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Glu Ile Gln Asn Val Glu Asn Val Asn Gly Val Glu Arg Tyr Arg Ile

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Pro Leu Ser Val Gln Asp Glu Met Asp Gln Gln Ile Met Ala Leu Arg

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530 535 540

Met Lys Asp Arg Pro Glu Ile Ala Gln Thr Ala Ala Leu Gln Gly Glu

545 550 555 560

Thr Gly Leu Ala Ile Lys Asp Ala Val His Lys Thr Val Lys Asp Thr

565 570 575

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Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Leu Ile

595 600 605

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610 615 620

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660 665 670

Thr Ile Val Ala Glu Val Leu Thr Gln Asp Gly Asn Lys Val Ala His

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Leu Lys Val Arg Phe Tyr Ala Lys Pro Lys His Val Arg Cys Trp Ile

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Pro Arg Ala Pro Arg Ala Val Pro Tyr Lys Ser Arg Tyr Thr Gly Val

805 810 815

Tyr Asp Thr Val Glu Lys Phe Cys Asp Asn Arg Ala Asn Ile Lys Thr

820 825 830

Ala Gly Ala Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ala Tyr Val Gly Asn Tyr

835 840 845

Lys Ile Met Asn Arg His Leu Ala Glu Lys Gln Asp Trp Asp Asn Leu

850 855 860

Val Trp Asp Ser Tyr Glu Arg Asp Leu Leu Val Thr Arg Val Asp Ala

865 870 875 880

His Gly Val Asp Gln Ile Ala Arg Cys Asn Cys Arg Ala Gly Val Tyr

885 890 895

Tyr Cys Lys Ser Arg Met Arg His Tyr Pro Val Val Val Thr Pro Pro

900 905 910

Ser Leu Val His Ile Asp Lys Asn Gly Tyr Tyr Pro Glu Arg Tyr Gln

915 920 925

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Gly Leu Leu Arg Cys Glu His Gly Val Met Gly Ile Leu Thr Ala Gly

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Gly Asn Asn Leu Val Ala Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Ile

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Glu Asp Asp Val Met Glu Gln Gly Leu Thr Asp Tyr Val Gln Ser Leu

980 985 990

Gly Asn Ala Phe Gly Ala Gly Phe Thr Asp Glu Ile Ser Asn Tyr Val

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1010 1015 1020

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Arg Asn Arg Ala Asp Ile Ile Thr Val Thr Ala Thr Leu Ser Leu Leu

1045 1050 1055

Gly Cys Ser Gly Ser Pro Trp Arg Trp Leu Lys Ser Lys Ile Cys Ser

1060 1065 1070

Ile Leu Gly Ile Asn Met Ala Gln Lys Gln Ala Asp Ser Trp Ile Lys

1075 1080 1085

Lys Phe Thr Glu Ala Val Asn Ala Phe Lys Gly Leu Asp Trp Ile Ala

1090 1095 1100

Ala Lys Phe Ser Lys Phe Leu Asp Trp Ile Lys Ser Lys Ile Ile Pro

1105 1110 1115 1120

Glu Leu Arg Glu Arg Thr Glu Phe Val Lys Asn Leu Arg Gln Leu Pro

1125 1130 1135

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Glu Thr Gln Glu Thr Leu Phe Ser Asn Val Gln Tyr Leu Ala His His

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1170 1175 1180

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1300 1305 1310

Thr Val Ala Asp Gly Lys Ala Leu Gln Arg Arg Phe His Phe Asp Thr

1315 1320 1325

Asp Ile Glu Ile Met Asp Gly Tyr Val Gln Asn Gly Lys Leu Asn Ile

1330 1335 1340

Gln Lys Ala Thr Glu Ser Cys Glu Asp Cys Ser Pro Ile Asn Phe Gln

1345 1350 1355 1360

Lys Cys Met Pro Leu Ile Cys Gly Lys Ala Leu Gln Leu Arg Ser Lys

1365 1370 1375

Lys Gly Asp Gly Met Arg Tyr Ser Ile Asp Thr Met Ile Thr Glu Met

1380 1385 1390

Arg Arg Glu Ser Ala Arg Arg Tyr Asn Ile Gly Asn Val Ile Glu Ala

1395 1400 1405

Leu Phe Gln Gly Pro Pro Glu Phe Lys Pro Leu Arg Ile Asp Val Ser

1410 1415 1420

Glu Glu Thr Pro Ala Pro Pro Ala Ile Ala Asp Leu Leu Ala Ser Val

1425 1430 1435 1440

Asp Ser Glu Glu Val Arg Glu Tyr Cys Arg Ser Lys Gly Trp Ile Val

1445 1450 1455

Gln Glu Lys Ile Thr Lys Glu Ser Leu Glu Arg Asn Val Asn Arg Ala

1460 1465 1470

Leu Ile Val Leu Gln Ser Ala Thr Leu Ile Ala Thr Ile Cys Gly Val

1475 1480 1485

Ile Tyr Ile Val Tyr Lys Leu Phe Ala Gly Leu Gln Gly Pro Tyr Ser

1490 1495 1500

Gly Ile His Thr Asn Tyr Gln Lys Val Lys Pro Val Val Arg Gln Val

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1525 1530 1535

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1540 1545 1550

Val Tyr Asp Thr Phe Met Val Leu Pro Arg His Ala Met Ala His Asp

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Glu Ile Gln Ile Asp Gly Lys Thr Val Lys Ile Glu Asp Ala Tyr Asp

1570 1575 1580

Leu Asn Asp Thr Thr Gln Thr Ser Leu Glu Leu Thr Ile Ile Lys Leu

1585 1590 1595 1600

Lys Gln Asn Glu Arg Phe Arg Asp Ile Arg Ala Met Ile Pro Glu Asn

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1620 1625 1630

Pro Asn Leu Phe Met Pro Val Gly Ala Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Leu

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Thr Arg Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Ala Ile Ser Met Gly Lys Ile

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Leu Leu Arg Arg Tyr Phe Thr Gln Pro Gln Gly Glu Ile Glu Phe Met

1700 1705 1710

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Thr Lys Leu His Pro Ser Val Phe Tyr Asp Val Phe Pro Gly Glu Lys

1730 1735 1740

Glu Pro Ala Val Leu His Lys Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe

1745 1750 1755 1760

Glu Glu Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Ile Gly Asn Lys His Ile Ala Val

1765 1770 1775

Thr Glu Glu Met Glu Ile Ala Ile Asp His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys

1780 1785 1790

Gln Leu Asp Ile Asp Pro Ser Pro Ile Ser Met Glu Asp Ala Ile Tyr

1795 1800 1805

Gly Thr Glu Gly Leu Glu Ala Leu Asp Leu Gly Thr Ser Ala Gly Tyr

1810 1815 1820

Pro Tyr Val Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asn Lys Glu

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Thr Arg Asp Val Ser Lys Met Gln Gln Cys Ile Asp Lys Tyr Gly Leu

1845 1850 1855

Asn Leu Pro Met Val Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Lys Glu

1860 1865 1870

Lys Val Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn

1875 1880 1885

Asp Ser Val Ala Met Arg Cys Ala Phe Gly Asn Leu Tyr Lys Ala Phe

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His Thr Asn Pro Gly Thr Leu Thr Gly Cys Ala Val Gly Cys Asn Pro

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Glu Thr Phe Trp Ser Lys Ile Pro Val Met Met Asp Gly Glu Leu Phe

1925 1930 1935

Gly Phe Asp Tyr Thr Ala Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe

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Gln Cys Leu Tyr Leu Leu Leu Glu Lys Ile Gly Phe Gly His Cys Lys

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1970 1975 1980

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2005 2010 2015

Thr Val Tyr Lys Asn Ile Asp Leu Asp Asp Leu Lys Ile Ile Ala Tyr

2020 2025 2030

Gly Asp Asp Val Ile Ala Ser Tyr Pro Phe Glu Leu Asp Ala Lys Leu

2035 2040 2045

Leu Ala Asp Ala Gly Lys Ser Phe Gly Leu Ile Met Thr Pro Pro Asp

2050 2055 2060

Lys Ser Ala Glu Phe Val Lys Leu Thr Trp Asp Asn Val Thr Phe Leu

2065 2070 2075 2080

Lys Arg Ser Phe Val Lys Asp Glu Arg Phe Pro Phe Leu Ile His Pro

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Val Met Lys Met Ser Asp Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp

2100 2105 2110

Ala Lys Ser Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp

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His Cys Gly Gln Glu Gln Tyr Glu Glu Phe Leu Glu Lys Ile Arg Ser

2130 2135 2140

Val Pro Val Gly Arg Ala Leu Ser Leu Pro Ser Phe Lys Ala Leu Gln

2145 2150 2155 2160

Arg Ser Trp Tyr Asp Ser Phe

2165

Claims (8)

1.一种牛肠道病毒分离株HB1901，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovineenterovirus（BEV），该病毒已于2020年7月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。

2.权利要求1 所述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2 所述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，其特征在于，所述病毒的基因序列中插入有GFP。

4.含有权利要求1-3任一所述牛肠道病毒分离株HB1901的载体。

5.权利要求2所述牛肠道病毒分离株HB1901基因翻译的氨基酸序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO.2 所示。

6.含有权利要求4所述载体的重组菌或重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为牛肾细胞。

8.权利要求1所述牛肠道病毒分离株HB1901在构建病毒载体中的应用。

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